除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途

2023-09-18 01:03:15

除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途
【專利摘要】本發明涉及一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，除草劑抗性蛋白質包括：（a）具有SEQ?ID?NO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或（b）在（a）中的胺基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且具有除草劑抗性活性的由（a）衍生的蛋白質。本發明除草劑抗性蛋白質特別適合在植物中表達，對除草劑抗性廣，尤其苯氧基生長素除草劑。
【專利說明】除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，特別是涉及一種對2，4-D具有抗性的蛋白質、其編碼基因及用途。
【背景技術】
[0002]雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其它目的植物所需要的有價值的養分。目前有許多類型的除草劑用於控制雜草，一種特別流行的除草劑是草甘膦。已經開發了對草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麥和水稻等。因此可以對種植草甘膦抗性作物的田地噴灑草甘膦以控制雜草而不顯著損害作物。
[0003]草甘膦已經在全球廣泛使用超過20年，由此導致對草甘膦和草甘膦耐性作 物技術的過度依賴，並在野生雜草物種中對草甘膦天然更具耐受性或已經發展出抗草甘膦活性的植物施加了高選擇壓。已報導有少數雜草已發展出對草甘膦的抗性，包括闊葉雜草和禾本科雜草，如瑞士黑麥草、多花黑麥草、牛筋草、豚草、小飛蓬、野塘蒿和長葉車前。此外，在廣泛使用草甘膦耐性作物之前並不是農業問題的雜草也逐漸盛行，並且難於用草甘膦耐性作物控制，這些雜草主要與(但不僅與)難於控制的闊葉雜草一起出現，如莧屬、藜屬、蒲公英屬和鴨蹠草科物種。
[0004]在草甘膦抗性雜草或難於控制的雜草物種的地區，種植者可以通過罐混或換用能控制遺漏雜草的其它除草劑來彌補草甘膦的弱點。在多數情況下控制闊葉雜草的一種流行且有效的罐混伴侶為2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。2，4-D已經在農業和非作物條件下用於廣譜闊葉雜草控制超過65年，仍是全球最廣泛使用的除草劑之一。對進一步使用2，4-D的限制在於它在雙子葉植物(如大豆或棉花)中的選擇性非常低，因此2，4-D—般不用於(且一般不靠近)敏感性雙子葉作物。此外，2，4-D在禾本科作物中的用途在某種程度上受限於可能出現的作物損傷的性質。2，4-D和草甘膦的組合已經用於在種植免耕大豆和棉花之前提供更強的滅生處理，然而，由於這些雙子葉物種對2，4-D的敏感性，這些滅生處理必須在種植前14-30天進行。
[0005]和MCPA、2-甲-4-氯丙酸和2，4-D丙酸一樣，2，4-D是苯氧酸類除草劑。2，4-D用於在許多單子葉作物(如玉米、小麥和水稻)中選擇性控制闊葉雜草而不嚴重損傷目的作物。2，4-D是合成的植物生長素衍生物，其作用為使正常的細胞激素內穩態失調，並阻礙平衡的受控生長。
[0006]2，4-D對某些植物具有不同水平的選擇性(如雙子葉植物比禾本科植物更敏感)。不同植物對2，4-D的不同代謝是不同水平選擇性的一種解釋。通常植物緩慢代謝2，4-D，因此靶位點的不同活性更可能解釋植物對2，4-D不同的應答。2，4-D的植物代謝一般通過兩
步代謝實現，一般是羥基化後接著與胺基酸或葡萄糖綴合。
[0007]隨著時間的發展，微生物種群已經發展出降解此特定外來物的有效的替代途徑，所述途徑引起2，4-D的完全礦化。對微生物連續應用除草劑可用來選擇能利用除草劑作為碳源用於生長(從而使其在土壤中具有競爭優勢)的微生物。因為這個原因，目前將2，4-D配製為具有相對短的土壤半衰期，並且對其後的作物沒有遇到明顯的遺留效應。這促進了2,4-D的除草劑應用。
[0008]已經廣泛研究了其降解2，4-D能力的一種生物是真養雷氏菌(Ralstoniaeutropha)。編碼礦化途徑中的第一個酶促步驟的基因為tfdA。TfdA通過α酮戍二酸依賴性雙加氧酶反應催化2，4-D酸轉化成二氯苯酚(DCP)。DCP與2，4-D相比幾乎不具有除草劑活性。TfdA在轉基因植物中用於向通常對2，4-D敏感的雙子葉植物(如棉花和菸草)中輸入2，4-D抗性。
[0009]已在環境中鑑定了大量編碼能降解2，4-D的蛋白質的tfdA型基因。許多同系物與tfdA類似(胺基酸同一性>85%)並具有與tfdA相似的酶活性。然而，不是所有具有TauD等結構域的蛋白質都具有2，4-D降解功能，並且有大量同系物與tfdA具有顯著更低的 同一性(25-50%)，但卻具有與α酮戊二酸依賴性雙加氧酶Fe+2雙加氧酶相關的特徵殘基。因此這些不同的雙加氧酶的底物特異性是什麼並不明確。與tfdA具有低同源性(胺基酸同一性28%)的獨特實例是來自Sphingobium herbicidovorans的rdpA。已經顯示此酶催化(R) -2，4-D丙酸(和其它(R)-苯氧丙酸)以及2，4-D (苯氧乙酸)礦化的第一步。
[0010]隨著草甘膦抗性雜草的出現和2，4-D除草劑的擴大應用，需要對2，4-D敏感的目的植物中輸入2，4-D抗性。目前未發現AADSP3除草劑抗性蛋白在植物中的表達水平和對除草劑的耐受性報導。

【發明內容】

[0011]本發明的目的是提供一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，本發明旨在提供一種新的AADSP3基因，所述AADSP3蛋白在植物中對除草劑具有較高的耐受性。
[0012]為實現上述目的，本發明提供了一種除草劑抗性蛋白質，包括:
[0013](a)具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或
[0014](b)在(a)中的胺基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
[0015]為實現上述目的，本發明提供了一種除草劑抗性基因，包括:
[0016](a)編碼所述除草劑抗性蛋白質的核苷酸序列；或
[0017](b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的蛋白質的核苷酸序列；或
[0018](c)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0019]所述嚴格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然後用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0020]為實現上述目的，本發明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控下的所述除草劑抗性基因。
[0021]為實現上述目的，本發明還提供了一種包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒的
重組載體。
[0022]為實現上述目的，本發明還提供了一種產生除草劑抗性蛋白質的方法，包括:
[0023]獲得包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒的轉基因宿主生物的細胞；
[0024]在允許產生除草劑抗性蛋白質的條件下培養所述轉基因宿主生物的細胞；[0025]回收所述除草劑抗性蛋白質。
[0026]進一步地，所述轉基因宿主生物包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、杆狀病毒、線蟲或藻類。
[0027]優選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0028]為實現上述目的，本發明還提供了一種用於增加除草劑靶範圍的方法，包括:將所述除草劑抗性蛋白質或所述表達盒編碼的除草劑抗性蛋白質在植物中與至少一種不同於所述除草劑抗性蛋白質或所述表達盒編碼的除草劑抗性蛋白質的第二種核苷酸一起表達。
[0029]進一步地，所述第二種核苷酸可以編碼草甘膦抗性蛋白質、草銨膦抗性蛋白質、 4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙醯乳酸合酶、細胞色素類蛋白質或原卟啉原氧化酶。
[0030]在本發明中，AADSP3除草劑抗性蛋白質在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個草甘膦抗性蛋白質和/或草銨膦抗性蛋白質的表達。這種超過一種的除草劑抗性蛋白質在同一株轉基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含並表達所需的基因來實現。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達AADSP3除草劑抗性蛋白質，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達草甘膦抗性蛋白質和/或草銨膦抗性蛋白質。通過第I親本和 第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的後代植物。
[0031]為實現上述目的，本發明還提供了一種選擇轉化的植物細胞的方法，包括:用所述除草劑抗性基因或所述表達盒轉化多個植物細胞，並在允許表達所述除草劑抗性基因或所述表達盒的轉化細胞生長，而殺死未轉化細胞或抑制未轉化細胞生長的除草劑濃度下培養所述細胞，所述除草劑為苯氧基生長素。
[0032]為實現上述目的，本發明還提供了一種控制雜草的方法，包括:對種植作物的大田施用有效劑量的除草劑，所述作物包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載體。
[0033]優選地，所述除草劑為苯氧基生長素。
[0034]為實現上述目的，本發明還提供了一種用於保護植物免受由除草劑引起的損傷的方法，包括:將所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物，使導入後的植物產生足夠保護其免受除草劑損害量的除草劑抗性蛋白質。
[0035]優選地，所述除草劑為苯氧基生長素或芳氧基苯氧鏈烷酸酯。所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0036]為實現上述目的，本發明還提供了一種控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，包括:對種植草甘膦耐性植物的大田施用有效劑量的除草劑，所述草甘膦耐性植物包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載體。
[0037]優選地，所述除草劑為苯氧基生長素。所述草甘膦耐性植物為單子葉植物或雙子葉植物。
[0038]為實現上述目的，本發明還提供了一種賦予作物2，4-D除草劑抗性的方法，包括:將所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物。
[0039]優選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0040]將所述的除草劑抗性基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，在本發明中為將外源DNA導入植物細胞，常規轉化方法包括但不限於，農桿菌介導的轉化、微量發射轟擊、直接將DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須矽介導的DNA導入。
[0041]本發明所述的2，4-D抗性基因及其後的抗性作物提供用於在作物中控制草甘膦抗性(或高耐性和演替的)闊葉雜草物種的優良選擇。2，4-D是廣譜、相對便宜且強力的闊葉除草劑，如果在雙子葉和單子葉中同樣能提供更強的作物耐受性，則可為種植者提供優良的效用。2，4-D耐性轉基因雙子葉植物還可在應用時間和用量上具有更高的靈活性。2，4-D除草劑耐性性狀的另一用途是它可用於預防2，4-D漂移、揮發、轉化(或其它遠距離的移動現象)、誤用、破壞等對正常敏感性作物的損害。已經廣泛使用不同苯氧基生長素組合的多種混合物來處理不同地區特定的雜草譜和環境條件。在植物中使用AADSP3基因可以提供對更光譜的苯氧基生長素除草劑的防護，從而提高靈活性和可控制的雜草譜，提供 對全範圍市售苯氧基生長素的漂移或其它遠距離苯氧基除草劑損傷的防護。
[0042]對於苯氧基生長素除草劑通常製成活性酸，但也有一些商品化配製為多種相應酯製劑之一，由於一般的植物酯酶在植物中將這些酯轉換成活性酸，因此這些也同樣認為是在植物中AADSP3酶的底物。類似的還可以是相應酸的相應有機或無機鹽。當表示手性丙酸、丙酸鹽或丙酸酯除草劑時，即使不同的CAS號可能對應於光學純的化合物，在命名這些除草劑時仍認為外消旋(R，S)或光學純化的(R或S)對映體是同一除草劑。可能的用量範圍可以是作物或非作物用途中單獨處理或與其他除草劑組合。
[0043]現已鑑定了 AADSP3基因在遺傳改造用於植物表達後具有允許在植物中使用苯氧基生長素除草劑的特性，所述植物中固有耐性不存在或不足以允許使用這些除草劑。此外，AADSP3基因可以在天然耐性不足以允許選擇性時在植物中提供對苯氧基生長素除草劑的防護。現在可以連續或罐混地與一種、兩種或若干苯氧基生長素除草劑的組合處理僅含AADSP3基因的植物。用於控制廣譜雙子葉雜草的每種苯氧基生長素除草劑的用量範圍從25至4000g ae/ha,更通常從100至2000g ae/ha。在同一大田裡(連續或罐混組合地)組合這些不同化學類別和具有不同作用模式和範圍的除草劑可以提供對大多數需要除草劑控制的潛在雜草的控制。
[0044]草甘膦被廣泛地使用，因為它控制非常廣譜的闊葉和禾本科雜草物種。然而，在草甘膦耐性作物和非作物應用中重複使用草甘膦已經(而且仍將繼續)選擇使雜草演替為天然更具有耐性的物種或草甘膦抗性生物型。多數除草劑抗性管理策略建議使用有效用量的罐混除草劑伴侶作為延緩出現抗性雜草的方法，所述除草劑伴侶提供對同一物種的控制，但具有不同的作用模式。將AADSP3基因與草甘膦耐性性狀(和/或其他除草劑耐性性狀)疊加可通過允許對同一作物選擇性使用草甘膦和苯氧基生長素(如2，4-D)而實現對草甘膦耐性作物中草甘膦抗性雜草物種(被一種或多種苯氧基生長素控制的闊葉雜草物種)的控制。這些除草劑的應用可以是在含有不同作用模式的兩種或更多除草劑的罐混合物中同時使用、在連續使用(如種植前、出苗前或出苗後)中單個除草劑組合物的單獨使用(使用的間隔時間範圍從2小時到3個月)，或者備選地，可以在任何時間(從種植作物7個月內到收穫作物時(或對於單個除草劑為收穫前間隔，取最短者))使用代表可應用每種化合類別的任意數目除草劑的組合。
[0045]在控制闊葉雜草中具有靈活性是很重要的，即使用時間、單個除草劑用量和控制頑固或抗性雜草的能力。作物中與草甘膦抗性基因/AADSP3基因疊加的草甘膦應用範圍可以從250至2500g ae/ha ;苯氧基生長素除草劑(一種或多種)可按照從25_4000g ae/ha。這些應用的時間的最佳組合取決於具體的條件、物種和環境。
[0046]除草劑製劑(如酯、酸或鹽配方或可溶濃縮劑、乳化濃縮劑或可溶液體)和罐混添加劑(如佐劑或相容劑)可顯著影響給定的除草劑或一種或多種除草劑的組合的雜草控制。任意前述除草劑的任意化學組合均在本發明的範圍內。
[0047]本領域技術人員所熟知的，兩種或更多作用模式的組合在提高受控雜草譜和/或天然更具耐性物種或抗性雜草物種上的益處還可擴展到通過人工(轉基因或非轉基因)在作物中產生除草甘膦耐性作物外的除草劑耐性的化學品。事實上，可以單獨或以多重組合疊加編碼以下抗性的性狀以提供有效控制或防止雜草演替對任意前述類別的除草劑的抗性的能力:草甘膦抗性(如抗性植物或細菌EPSPS、GOX、GAT)、草銨膦抗性(如PAT、Bar)、 乙醯乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑抗性(如咪唑啉酮、磺醯脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸和其它化學品抗性基因如AHAS、Csrl, SurA等)、溴草腈抗性(如Bxn)、對HPTO (4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶)酶抑制劑的抗性、對八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)抑制劑的抗性、對光系統II抑制性除草劑的抗性(如psbA)、對光系統I抑制性除草劑的抗性、對原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草劑抗性(如PP0-1)、對苯脲除草劑的抗性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。
[0048]關於其他除草劑，一些其它優選的ALS抑制劑包括三唑嘧啶磺苯胺(氯酯磺草胺、雙氯磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和嘧啶並三唑類磺胺)、嘧啶硫代苯甲酸和氟唑磺隆。一些優選的HPro抑制劑包括甲基磺草酮、異惡唑草酮和磺草酮。一些優選的PPO抑制劑包括丙炔氟草胺、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草靈和乙氧氟草醚)。
[0049]此外，可以將AADSP3基因單獨或與其它除草劑耐受作物特徵疊加後再與一種或多種其它輸入(如昆蟲抗性、真菌抗性或脅迫耐性等)或輸出(如提高的產量、改進的油量、提高的纖維品質等)性狀疊加。因此，本發明可用於提供以靈活且經濟地控制任何數目的農學害蟲的能力和提高作物品質的完整農學解決方案。
[0050]本發明AADSP3基因能降解2，4_D，是重要的除草劑耐受作物和選擇標記物特徵可能性的基礎。
[0051]本發明可進行轉基因表達，可以控制幾乎所有闊葉雜草的除草劑組合。AADSP3基因可作為優秀的除草劑耐受作物性狀與例如其它除草劑耐受作物性狀(如草甘膦抗性、草銨膦抗性、ALS抑制劑(如咪唑啉酮類、磺醯脲類、三唑並嘧啶磺醯胺類)抗性、溴草腈抗性、HPPD抑制劑抗性、PPO抑制劑抗性等)和昆蟲抗性性狀(CrylAb、CrylF、Vip3、其它蘇雲金芽孢桿菌蛋白質或非芽孢桿菌屬來源的昆蟲抗性蛋白等)疊加。此外，AADSP3基因可作為選擇標記物輔助選擇用另一個基因或基因群遺傳改造的植物的原代轉化體。
[0052]苯氧基鏈烷酸酯基團可用於將穩定的酸官能團引入除草劑。酸性基團可通過「酸捕獲」輸入韌皮部活性(除草劑作用所需的屬性)，從而可以為了活性目的而整合進新除草劑。存在很多可能為AADSP3底物的市售和實驗性除草劑。因此，使用本發明基因還可以得到對其它除草劑的耐性。
[0053]本發明的除草劑耐性作物性狀可用在與其它除草劑耐性作物性狀(包括但不限於草甘膦耐性)的新組合中。由於對除草劑(如草甘膦)的新獲得的抗性或固有的耐性，這些性狀組合產生控制雜草物種的新方法。因此，除了除草劑耐性作物性狀，本發明的範圍包括使用除草劑控制雜草的新方法，其中通過轉基因作物中的所述酶產生對所述除草劑的耐性。
[0054]本發明可應用於多種植物中，如擬南芥、菸草、大豆、棉花、稻、玉米和蕓薹。本發明還可用於多種其它單子葉(如牧草禾本科或草坪草禾本科)和雙子葉作物(如苜蓿、三葉草、喬木物種等)。類似的，2，4-D (或其它AADSP3底物)可更積極地用於耐性適中的禾本科作物中，由此性狀得到的提高的耐性將為種植者提供能以更有效的用量和更廣的施用時間來使用這些除草劑而無作物損傷風險的可能性。
[0055]本發明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內的任何遺傳物質， 且包括細胞核和質體和線粒體基因組。
[0056]本發明中所述「抗性」是可遺傳的，並允許植物在除草劑對給定植物進行一般除草劑有效處理的情況下生長和繁殖。正如本領域技術人員所認可的，即使植物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認為「抗性」。本發明中術語「耐性」比術語「抗性」更廣泛，並包括「抗性」，以及特定植物具有的抵抗除草劑誘導的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導致相同基因型野生型植物損傷。
[0057]本發明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整「基因」，在所需宿主細胞中編碼蛋白質或多肽。本領域技術人員很容易認識到，可以將本發明的多核苷酸和/或核苷酸置於目的宿主中的調控序列控制下。
[0058]本領域技術人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由於DNA在植物中複製產生了 DNA的其它互補鏈。這樣，本發明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領域常使用的「編碼鏈」指與反義鏈結合的鏈。為了在體內表達蛋白質，典型將DNA的一條鏈轉錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質。mRNA實際上是從DNA的「反義」鏈轉錄的。「有義」或「編碼」鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產生特定胺基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質或肽。本發明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0059]本發明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發明除草劑抗性基因雜交。任何常規的核酸雜交或擴增方法都可以用於鑑定本發明除草劑抗性基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結構，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的「互補物」。本發明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出「完全互補性」。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在至少常規的「低度嚴格」條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子為「最低程度互補」。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩定性相互雜交從而使它們在常規的「高度嚴格」條件下退火且彼此結合，則稱這兩個核酸分子具有「互補性」。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結構。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所採用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩定的雙鏈結構。
[0060]本發明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然後在50°C條件下用
2.0 X SSC洗滌，這些條件對本領域技術人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0XSSC、50°C到高度嚴格條件的約0.2XSSC、50°C。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發生改變。優選地，本發明所述嚴格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:1發生特異性雜交，然後用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。
[0061]因此，具有除 草劑耐受性活性並在嚴格條件下與本發明序列I雜交的序列包括在本發明中。這些序列與本發明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0062]本發明提供功能蛋白質。「功能活性」(或「活性」)在本發明中指本發明用途的蛋白質/酶(單獨或與其它蛋白質組合)具有降解或減弱除草劑活性的能力。產生本發明蛋白質的植物優選產生「有效量」的蛋白質，從而在用除草劑處理植物時，蛋白質表達的水平足以給予植物對除草劑(若無特別說明則為一般用量)完全或部分的抗性或耐性。可以以通常殺死靶植物的用量、正常的大田用量和濃度使用除草劑。優選地，本發明的植物細胞和植物被保護免受除草劑處理引起的生長抑制或損傷。本發明的轉化植物和植物細胞優選具有2，4-D除草劑的抗性或耐性，即轉化的植物和植物細胞能在有效量的2，4-D除草劑存在下生長。
[0063]本發明中所述的基因和蛋白質不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質的除草劑抗性活性特徵的部分和/片段(包括與全長蛋白質相比在內和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代胺基酸的蛋白質)、嵌合體和融合蛋白。所述「變體」或「變異」是指編碼同一蛋白或編碼有除草劑抗性活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述「等價蛋白」是指與權利要求的蛋白具有相同或基本相同的除草劑耐受性的生物活性的蛋白。
[0064]本發明中所述的DNA分子或蛋白序列的「片段」或「截短」是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或胺基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，包括臨近片段和與全長分子相比內部和/或末端的缺失，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質為除草劑抗性蛋白質。在一些情況下(特別是植物中的表達)，使用編碼截短蛋白質的截短基因可能是有利的。優選的截短基因一般編碼全長蛋白質的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。
[0065]由於遺傳密碼子的豐餘性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的胺基酸序列。產生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領域技術人員的技術水平內。這些不同的DNA序列包括在本發明的範圍內。所述「基本上相同的」序列是指有胺基酸取代、缺失、添加或插入但實質上不影響除草劑抗性活性的序列，亦包括保留除草劑抗性活性的片段。
[0066]本發明中胺基酸序列的取代、缺失或添加是本領域的常規技術，優選這種胺基酸變化為:小的特性改變，即不顯著影響蛋白的摺疊和/或活性的保守胺基酸取代；小的缺失，通常約1-30個胺基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0067]保守取代的實例是在下列胺基酸組內發生的取代:鹼性胺基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸(如穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸(如穀氨醯胺、天冬醯胺)、疏水性胺基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香胺基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子胺基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些胺基酸取代在本領域內是眾所周知的，並且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年紐約學術出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
[0068]對於本領域的技術人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區域之外發生，而且仍產生活性多肽。對於由本發明的多肽，其活性必需的並因此選擇不被取代的胺基酸殘基，可以根據本領域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑑定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science244:1081_1085)。後一技術是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的除草劑抗性活性，從而確定對該分子活性而言重要的胺基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結構的分析來測定，這種三維結構可由核磁共振分析、結晶學或光親和標記等技術測定(參見，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ；Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899_904 ；fflodaver 等，1992，FEBS Letters309:59_64)。
[0069]因此，與序列2所示的胺基酸序列具有一定同源性的胺基酸序列也包括在本發明中。這些序列與本發明序列類似性/相同性典型的大於60%，優選的大於75%，更優選的大於80%，甚至更優選的大於90%，並且可以大於95%。也可以根據更特定的相同性和/或類似性範圍定義本發明的優選的多核苷酸和蛋白質。例如與本發明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
[0070]本發明中所述調控序列包括但不限於啟動子、轉運肽、終止子，增強子，前導序列，內含子以及其它可操作地連接到所述AADSP3基因的調節序列。
[0071]所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的「植物中可表達的啟動子」是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導植物內組成型表達的啟動子的示例包括但不限於，來源於花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內如在綠色組織中指導編碼序列的表達水平高於植物的其他組織(可通過常規RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創傷誘導啟動子。創傷誘導啟動子或指導創傷誘導的表達模式的啟動子是指當植物經受機械或由昆蟲啃食引起的創傷時，啟動子調控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創傷誘導啟動子的示例包括但不限於，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因 (Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。[0072]所述轉運肽(又稱分泌信號序列或導向序列)是指導轉基因產物到特定的細胞器或細胞區室，對受體蛋白質來說，所述轉運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉運肽序列靶向葉綠體，或者利用『KDEL』保留序列靶向內質網，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0073]所述前導序列包含但不限於，小RNA病毒前導序列，如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5』非編碼區)；馬鈴薯Y病毒組前導序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導序列；人類免疫球蛋白質重鏈結合蛋白質(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質mRNA的不翻譯前導序列(AMV RNA4);菸草花葉病毒(TMV)前導序列。
[0074]所述增強子包含但不限於，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風化環病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨蹠草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。
[0075]對於單子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限於，玉米hsp70內含子、玉米泛素內含子、Adh內含子1、蔗糖合酶內含子或水稻Actl內含子。對於雙子葉植物應用而言，所述內含子包含但不限於，CAT-1內含子、pKANNIBAL內含子、PIV2內含子和「超級泛素」內含子。
[0076]所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限於，來源於農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂鹼合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源於蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源於豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源於α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
[0077]本發明中所述「有效連接」表示核酸序列的聯結，所述聯結使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發明中所述「有效連接」可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉錄受到該啟動子控制和調控。當感興趣的序列編碼蛋白並且想要獲得該蛋白的表達時「有效連接」表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉錄物融合併且想要實現編碼的蛋白的表達時，製造這樣的連接，使得得到的轉錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合併且想要實現編碼的蛋白的表達時，製造這樣的連接，使得5』非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結，並且連接方式使得得到的翻譯產物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關係是符合讀碼框的。可以「有效連接」的核酸序列包括但不限於:提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5』非翻譯區域、內含子、蛋白編碼區域、3』非翻譯區域、聚腺苷化位點和/或轉錄終止子)、提供DNA轉移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內協助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供複製功能的序列(即細菌的複製起點、自主複製序列、著絲粒序列)。
[0078]本發明可賦予植物新除草劑抗性性狀，並且未觀察到對表型包括產量的不良影響。本發明中植物能耐受住如至少一 種受試除草劑2X、3X、4X或5X —般應用水平。這些耐性水平的提高在本發明的範圍之內。例如可對本領域已知的多種技術進行可預見到的優化和進一步發展，以增加給定基因的表達。
[0079]本發明中，所述除草劑抗性蛋白質為AADSP3胺基酸序列，如序列表中SEQ ID NO:2所示。所述除草劑抗性基因為AADSP3核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示。所述除草劑抗性基因為用於植物，除了包含由AADSP3核苷酸序列編碼的蛋白質的編碼區外，也可包含其他元件，例如編碼轉運肽的編碼區、編碼選擇性標記的蛋白質或賦予昆蟲抗性的蛋白質的編碼區。
[0080]本發明中AADSP3除草劑抗性蛋白質對大多數苯氧基生長素除草劑具有耐性。本發明中的植物，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含AADSP3核苷酸序列，通過表達有效量的該蛋白而保護其免受除草劑的威脅。有效量是指未損傷的或輕微損傷的劑量。同時，植物在形態上應是正常的，且可在常規方法下培養以用於產物的消耗和/或生成。
[0081]植物材料中除草劑抗性蛋白質的表達水平可通過本領域內所描述的多種方法進行檢測，例如通過應用特異引物對組織內產生的編碼除草劑抗性蛋白質的mRNA進行定量，或直接特異性檢測產生的除草劑抗性蛋白質的量。
[0082]本發明提供了一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，具有以下優點:
[0083]1、對除草劑抗性強。本發明除草劑抗性蛋白質AADSP3對除草劑的抗性強，尤其是針對苯氧基生長素除草劑，特別是2，4-D。
[0084]2、對除草劑抗性廣。本發明除草劑抗性蛋白質AADSP3蛋白可以對多種苯氧基植物生長素除草劑表現出較高的抗性，因此在植物上應用前景廣闊。
[0085]下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0086]圖1為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有AADSP3核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構建流程圖；
[0087]圖2為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有AADSP3核苷酸序列的重組表達載體DBN100302構建流程圖；
[0088]圖3為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有對照序列的重組表達載體DBN100302N構建流程圖；
[0089]圖4為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的轉基因擬南芥T1植株除草劑抗性效果圖；
[0090]圖5為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有AADSP3核苷酸序列的重組表達載體DBN100765構建流程圖；
[0091]圖6為本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的含有對照序列的重組表達載體DBN100765N構建流程圖。
【具體實施方式】
[0092]下面通過具體實施例進一步說明本發明除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途的技術方案。
[0093]第一實施例、 AADSP3基因序列的獲得和合成[0094]1、獲得AADSP3基因序列
[0095]AADSP3除草劑抗性蛋白質的胺基酸序列(292個胺基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；依據植物偏好性密碼子獲得編碼相應於所述AADSP3除草劑抗性蛋白質的胺基酸序列(292個胺基酸)的核苷酸序列(879個核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示。
[0096]2、合成上述AADSP3核苷酸序列
[0097]所述AADSP3核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述AADSP3核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的5』端還連接有SpeI酶切位點，所述AADSP3核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的3』端還連接有KasI酶切位點。
[0098]第二實施例、擬南芥重組表達載體的構建及重組表達載體轉化農桿菌
[0099]1、構建含有AADSP3核苷酸序列的擬南芥重組克隆載體DBNOl-T
[0100]將合成的AADSP3核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨苄青黴素抗性基因；fl表示噬菌體fl的複製起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；AADSP3為AADSP3核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ；MCS為多克隆位點)。
[0101]然後將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態細胞、10 μ I質粒DNA(重組克隆載體DBNO1-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(IOOrpm轉速下搖床搖動)，在表面塗有IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青黴素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨苄青黴素100mg/L，用NaOH調pH至7.5)中於溫度37°C條件下培養過夜。鹼法提取其質粒:將菌液在12000rpm轉速下離心Imin,去上清液,沉澱菌體用100 μ I冰預冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50禮葡萄糖，？!18.0)懸浮；加入20(^1新配製的溶液11 (0.2M NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;於溫度4°C、轉速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻後室溫放置5min ;於溫度4V、轉速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉澱用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌後晾乾；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉澱；於溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;於溫度_20°C保存備用。
[0102]提取的質粒經SpeI和KasI酶切鑑定後，對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述AADSP3核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即AADSP3核苷酸序列正確插入。
[0103]2、構建含有AADSP3核苷酸序列的擬南芥重組表達載體DBN100302
[0104]用限制性內切酶SpeI和KasI分別酶切重組克隆載體DBNO1-T和表達載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構可以提供))，將切下的AADSP3核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-01的SpeI和KasI位點之間，利用常規的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，構建成重組表達載體DBN100302，其構建流程如圖2所示(Spec:壯觀黴素基因；RB:右邊界；AtUbilO:擬南芥Ubiquitin (泛素)10基因啟動子(SEQ IDNO:3) ；AADSP3:AADSP3核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ；Nos:胭脂鹼合成酶基因的終止子(SEQID NO:4);prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID NO:5);PAT:草丁膦乙醯轉移酶基因(SEQ ID NO:6) ;tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID NO:7) ;LB:左邊界)。
[0105]將重組表達載體DBN100302用熱激方法轉化大腸桿菌Tl感受態細胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態細胞、10 μ I質粒DNA (重組表達載體DBN100302)，42 °C水浴30秒；37°C振蕩培養I小時(IOOrpm轉速下搖床搖動)；然後在含50mg/L壯觀黴素(Spectinomycin)的LB固體平板(胰蛋白腖10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調pH至 7.5)上於溫度37°C條件下培養12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，壯觀黴素50mg/L，用NaOH調pH至7.5)中於溫度37°C條件下培養過夜。鹼法提取其質粒。將提取的質粒用限制性內切酶SpeI和KasI酶切後鑑定，並將陽性克隆進行測序鑑定，結果表明重組表達載體DBN100302在SpeI和KasI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即AADSP3核苷酸序列。
[0106]3、構建含有對照序列的擬南芥重組表達載體DBN100302N
[0107]按照本發明第二實施例中I所述的構建含有AADSP3核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T的方法，利用對照序列(SEQ ID N0:8)構建含有對照序列的重組克隆載體DBNOlR-T0對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組克隆載體DBNOlR-T中插入的天然序列為序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，即對照序列正確插入。
[0108]按照本發明第二實施例中2所述的構建含有AADSP3核苷酸序列的重組表達載體DBN100302的方法，利用天然序列構建含有天然序列的重組表達載體DBN100302N，其構建流程如圖3所示(載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構可以提供)；Spec:壯觀黴素基因；RB:右邊界；AtUbilO:擬南芥Ubiquitin (泛素)10基因啟動子(SEQ ID NO:3) ；mN:對照序列(SEQ ID NO:8) ;Nos:胭脂鹼合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:4) ;prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQ ID N0:5);PAT:草丁膦乙醯轉移酶基因(SEQ ID NO:6)；tCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQ ID N0:7);LB:左邊界)。對陽性克隆進行測序驗證，結果表明重組表達載體DBN100302N中插入的對照序列為序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，即對照序列正確插入。
[0109]4、擬南芥重組表達載體轉化農桿菌
[0110]對己經構建正確的重組表達載體DBN100302和DBN100302N (對照序列)用液氮法轉化到農桿菌GV3101中，其轉化條件為:100μL農桿菌GV3101、3μL質粒DNA (重組表達載體);置於液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉化後的農桿菌GV3101接種於LB試管中於溫度28°C、轉速為200rpm條件下培養2小時，塗於含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的壯觀黴素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養並提取其質粒，用限制性內切酶StyI和PvuII酶切DBN100302後進行酶切驗證，用限制性內切酶StyI和BglI酶切DBN100302N (對照序列)後進行酶切驗證，結果表明重組表達載體DBN100302和DBN100302N (天然序列)結構完全正確。
[0111]第三實施例、轉入AADSP3核苷酸序列的擬南芥植株的獲得
[0112]將野生型擬南芥種子懸浮於0.1%瓊脂糖溶液中。將懸浮的種子在4°C下保存2天以完成對休眠的需要以保證種子同步萌發。用蛭石混合馬糞土並用水地下灌溉至溼潤，使土壤混合物排水24小時。將預處理後的種子種在土壤混合物上並用保溼罩覆蓋7天。使種子萌發並在恆溫(220C )恆溼(40-50%)光強度為120-150 μ mol/m2秒的長日照條件(16小時光照/8小時黑暗)下在溫室中培養植物。開始用霍格蘭營養液灌溉植物，接著用去離子水灌溉，保持土壤潮溼但不溼透。
[0113]使用花浸泡法轉化擬南芥。用選取的農桿菌菌落接種一份或多份15_30ml含壯觀黴素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培養液的預培養物。以220rpm將培養物在28°C恆速搖動孵育過夜。每個預培養物用於接種兩份500ml含壯觀黴素(100mg/L)和利福平(10mg/L)的YEP培養液的培養物並將培養物在28°C持續搖動孵育過夜。室溫以約8700Xg離心10分鐘沉澱細胞,棄去得到的上清液。將細胞沉澱輕柔重懸於500ml滲透培養基中，所述滲透培養基含有1/2 XMS鹽/B5維生素、10% (w/v)蔗糖、0.044 μ M苄氨基嘌呤(10 μ I/升(lmg/ml DMSO中的原液))和300 μ I/升Silvet L-77。將約I月齡的植物在培養基中浸泡15秒，確保浸沒最新的花序。接著將植物側面放倒並覆蓋(透明或不透明)24小時，接著用水洗滌並豎直放置。在22°C以16小時光照/8小時黑暗的光周期培養植物。浸泡約4周後收穫種子。
[0114]將新收穫的(AADSP3核苷酸序列和天然序列)T1種子在室溫乾燥7天。將種子種在26.5 X 51cm萌發盤中，每盤接受ZOOmgT1種子(約10000個種子),所述種子事先已懸浮於40ml0.1%瓊脂糖溶液並在4°C下保存2天以完成對休眠的需要以保證種子同步萌發。
[0115]用蛭石混合馬糞土並用水地下灌溉至溼潤，利用重力排水。用移液管將預處理後的種子(每個40ml)均勻地種在土壤混合物上，並用保溼罩覆蓋4-5天。在使用出苗後噴灑草銨膦(選擇共轉化的PAT基因)進行最初轉化體選擇前I天移去罩。
[0116]在7個種植天數後(DAP)並於IlDAP再次使用DeVilbiss壓縮空氣噴嘴以IOml/盤(703L/ha)的噴灑體積用Liberty除草劑(200g ai/L的草銨膦)的0.2%溶液噴灑T1植物(分別為子葉期和2-4葉期)，以提供每次應用280g ai/ha有效量的草銨膦。在最後噴灑後4-7天鑑定存活株(生長活躍的植物)，並分別移植到用馬糞土和蛭石製備的7cmX7cm的方盆中(每盤3-5棵)。用保溼罩覆蓋移植的植物3-4天，並如前置於22°C培養室中或直接移入溫室。接著移去罩並在測試AADSP3基因提供苯氧基生長素除草劑抗性的能力之前至少I天將植物栽種到溫室(22±5°C，50±30%RH，14小時光照:10小時黑暗，最小500 μ E/Iii2S1天然+補充光)。
[0117]第四實施例、轉基因擬南芥植株的除草劑抗性效果檢測
[0118]用AADSP3基因進行首次擬南芥轉化。首先使用草銨膦選擇方案從未轉化種子背景中選擇T1轉化體。篩選了約20000個T1種子中並鑑定了 235株T1代陽性轉化子(PAT基因)，約1.2%的轉化效率。將轉入AADSP3核苷酸序列的擬南芥T1植株、轉入對照序列的擬南芥T1植株和野生型擬南芥植株(播種後18天)分別對2，4-D 二甲銨鹽和二甲四氯進行除草劑抗性效果檢測。
[0119]分別將轉入AADSP3核苷酸序列的擬南芥T1植株、轉入對照序列的擬南芥T1植株和野生型擬南芥植株分別用2，4-D 二甲銨鹽(560g ae/ha，l倍大田濃度)、二甲四氯(560gae/ha, I倍大田濃度)和空白溶劑(水)噴灑。噴施7天和14天後統計植株抗性情況-J天后生長狀況和空白溶劑(水) 一致的劃為高抗植株，7天後有蓮座葉捲曲的劃為中抗植株，14天後仍不能抽苔的劃為低抗植株，14天後死亡的劃為不抗植株。由於每株擬南芥T1植株是獨立的轉化事件，可以預計在給定劑量內個體T1應答的顯著差異。結果如表1和圖4所示。
[0120]表1、轉基因擬南芥T1植株除草劑抗性實驗結果
[0121]
【權利要求】
1.一種除草劑抗性蛋白質，其特徵在於，包括: (a)具有SEQID NO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或 (b)在(a)中的胺基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.一種除草劑抗性基因，其特徵在於，包括: Ca)編碼權利要求1所述除草劑抗性蛋白質的核苷酸序列；或 (b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的蛋白質的核苷酸序列；或 (c)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
3.—種表達盒，其特徵在於，包含在有效連接的調控序列調控下的權利要求2所述除草劑抗性基因。
4.一種包含權利要求2所述除草劑抗性基因或權利要求3所述表達盒的重組載體。
5.一種產生除草劑抗性蛋白質的方法，其特徵在於，包括: 獲得包含權利要求2所述除 草劑抗性基因或權利要求3所述表達盒的轉基因宿主生物的細胞； 在允許產生除草劑抗性蛋白質的條件下培養所述轉基因宿主生物的細胞； 回收所述除草劑抗性蛋白質。
6.根據權利要求5所述產生除草劑抗性蛋白質的方法，其特徵在於，所述轉基因宿主生物包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、杆狀病毒、線蟲或藻類。
7.根據權利要求6所述產生除草劑抗性蛋白質的方法，其特徵在於，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
8.一種用於增加除草劑靶範圍的方法，其特徵在於，包括:將權利要求1所述除草劑抗性蛋白質或權利要求3所述表達盒編碼的除草劑抗性蛋白質在植物中與至少一種不同於權利要求1所述除草劑抗性蛋白質或權利要求3所述表達盒編碼的除草劑抗性蛋白質的第二種核苷酸一起表達。
9.根據權利要求8所述用於增加除草劑靶範圍的方法，其特徵在於，所述第二種核苷酸可以編碼草甘膦抗性蛋白質、草銨膦抗性蛋白質、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙醯乳酸合酶、細胞色素類蛋白質或原卟啉原氧化酶。
10.一種選擇轉化的植物細胞的方法，其特徵在於，包括:用權利要求2所述除草劑抗性基因或權利要求3所述表達盒轉化多個植物細胞，並在允許表達所述除草劑抗性基因或所述表達盒的轉化細胞生長，而殺死未轉化細胞或抑制未轉化細胞生長的除草劑濃度下培養所述細胞，所述除草劑為苯氧基生長素。
11.一種控制雜草的方法，其特徵在於，包括:對種植作物的大田施用有效劑量的除草劑，所述作物包含權利要求2所述除草劑抗性基因或權利要求3所述表達盒或權利要求4所述重組載體。
12.根據權利要求11所述控制雜草的方法，其特徵在於，所述除草劑為苯氧基生長素。
13.一種用於保護植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特徵在於，包括:將權利要求2所述除草劑抗性基因或權利要求3所述表達盒或權利要求4所述重組載體導入植物，使導入後的植物產生足夠保護其免受除草劑損害量的除草劑抗性蛋白質。
14.根據權利要求13所述用於保護植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特徵在於，所述除草劑為苯氧基生長素。
15.根據權利要求13或14所述用於保護植物免受由除草劑引起的損傷的方法，其特徵在於，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
16.一種控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其特徵在於，包括:對種植草甘膦耐性植物的大田施用有效劑量的除草劑，所述草甘膦耐性植物包含權利要求2所述除草劑抗性基因或權利要求3所述表達盒或權利要求4所述重組載體。
17.根據權利要求16所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其特徵在於，所述除草劑為苯氧基生長素。
18.根據權利要 求16或17所述控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性雜草的方法，其特徵在於，所述草甘膦耐性植物為單子葉植物或雙子葉植物。
19.一種賦予作物2，4-D除草劑抗性的方法，其特徵在於，包括:將權利要求2所述除草劑抗性基因或權利要求3所述表達盒或權利要求4所述重組載體導入植物。
20.根據權利要求19所述賦予作物2，4-D除草劑抗性的方法，其特徵在於，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
【文檔編號】A01K67/033GK103740664SQ201310722071
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】陶青, 牛曉廣, 鮑曉明, 王登元, 吳業春 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心