基因載體的製作方法

2023-08-13 23:29:51 2

專利名稱：：基因載體的製作方法基因載體發明領域本發明涉及用於基因轉移和治療應用的基因載體，並且涉及用於製備它們的方法及其用途。發明背景慢病毒載體(LVs)和其它病毒載體是用於基因治療的有吸引力的工具(Thomasetal.，2003)。LVs可以轉導廣泛的組織，包括非分裂細胞，如肝細胞、神經元和造血幹細胞。此外，LVs整合到乾細胞基因組中，並且提供長期的轉基因表達。儘管LVs可以提供有效和穩定的基因轉移，將表達靶定於特定細胞類型，或從特定細胞類型解除表達的靶定，仍然是困難的。在體內施用載體後，該問題特別相關，其中轉基因表達可能僅僅在特定細胞群，如肺瘤細胞或肝細胞中是需要的，但轉導了廣泛細胞類型。當轉導前體或幹細胞時，表達的解除靶定也是重要的，但必須使轉基因表達限制於分化細胞群的僅僅一種特定細胞系。目前，解決該問題的最多的努力依賴於靶定載體包膜或工程化組織特異性啟動子。但是，這兩種方法都存在限制。耙定的包膜可以減少載體滴度，並且導致載體感染力降^f氐(Sandrmetal.,2003)。基於但不等同於天然存在的啟動子/增強子元件構建的組織特異性啟動子與普遍表達的啟動子相比通常在靶組織中弱表達。此外，這些組織特異性啟動子不總是實現絕對的細胞特異性(Follenzietal.,2002)。由於多種原因可以發生非靶細l包中的轉基因表達，包括"滲漏的"啟動子活性和啟動子/增強子捕獲(DePalmaetal.,2005)。捕獲現象是由於載體優先在活性轉錄位點整合而發生，這隨後驅動不依賴於載體的啟動子的轉基因轉錄。為了避開這些問題，並且製備可以維持高感染力和強表達的載體，而使轉基因在特定細胞類型的表達受到緊密限制，我們開發了受到外源表達的樣iRNA(miRNA)調節的載體。WO03/020931描述了展示miRNA的報導系統測定系統，提供了測量容易測定的基因的敲除的方法。該系統用於確定siRNAs和嵌合RNAs可以減少容易測定的螢光素酶基因的表達。美國專利申請20050266552描述了報導構建體的構建，所述構建體適於導入哺乳動物細胞以建立可以用於鑑定參與miRNA翻譯阻抑途徑和/或所述途徑的化學調節劑的細胞系。MansfieldJHetal(2004)NatGenet36(10):1079-83Epub,erratuminNatGenet(2004)36(11):1238;和BrenneckeJetal(2005)PloSBiol3(3):e85描述了含有報導基因和miRNA靶序列的質粒。在兩篇報導中，設計了構建體，用於監測內源miRNAs的表達，並且不是為了調節轉基因和/或將表達限制在特定細胞類型的目的。應該強調我們的發明的一個重要特徵是我們描述了如何設計載體，以受到內源miRNAs調節，用於控制轉基因表達，以實現載體的特定表達譜。儘管已經存在報導證明miRNA靶序列可以導入報導構建體(表達標記基因如螢光素酶的質粒)以對miRNA的表達進行示蹤，它們沒有描述特別利用miRNAs進行載體調節。它們特別沒有描述利用本發明的載體進行基因治療方法，以預防感興趣的轉基因的免疫介導的排斥，或增加表達毒性基因的病毒顆粒滴度的製造方法，所述毒性基因對產生病毒顆粒的細胞通常是有毒性的。發明描述根據本發明的一方面，提供了適用於基因工程方法的基因轉移載體，所述基因工程方法例如基因治療、基因轉移和/或包含miRNA序列靶的轉基因的表達的調節。miRNA"可操作性連接"於轉基因。術語"可操作性連接"表示描述的成分處於允許它們以其預期方式起作用的關係。在一種實施方案中，載體是包含miRNA序列靶的病毒載體顆粒。在一種實施方案中，顆粒包含載體顆粒的基因組(DNA或RNA)，所述基因組包含miRNA序列靶。在一種實施方案中，顆粒包含載體顆粒的基因組，所述RNA基因組包含miRNA序列靶。在一種實施方案中，顆粒包含載體顆粒的RNA基因組，所述RNA基因組包含多個miRNA序列靶，它們可以是串聯的。在一種實施方案中，顆粒包含載體顆粒的RNA基因組，所述RNA基因組包含多個不同的miRNA序列靶，它們可以是串聯的。載體中包含的一個拷貝以上的miRNA耙序列可以增加系統的效力。我們也預見到可以包含不同的miRNA耙序列。例如，表達一個以上轉基因的載體可以具有一個以上miRNA靶序列控制下的轉基因，所述把序列可以相同或不同。miRNA靶序列可以是串聯的，但也可以預見其它排列方式，如採用反義方向。反義方向在生產病毒顆粒中可能是有用的，以避免原本可能對生產細胞有毒的基因產物的表達。在另一實施方案中，顆粒包含載體顆粒的基因組，所述RNA基因組包含轉基因。優選地，顆粒可來源於i曼病毒。在另一實施方案中，基因轉移載體是非病毒基因轉移載體形式。在該實施方案中，基因轉移載體可以包含表達載體或質粒，或可以是表達載體或質粒形式，所述表達載體或質粒包含miRNA靶序列，任選包含轉基因。本文描述的表達載體包含核酸區域，所述區域包含能夠被轉錄的序列。因此，編碼mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在該定義內。本發明的基因載體或基因轉移載體可以用於將轉基因送遞到感興趣的位點或細胞。本發明的載體可以通過病毒或非病毒載體送遞到革巴位點。載體是使一種實體能夠從一個環境轉移到另一個環境，或促進所述轉移的工具。例如，一些用於重組DNA^支術的載體^f吏得諸如DNA區段(如異源DNA區段，如異源cDNA區段)的實體能夠轉移到靶細胞中。任選地，一旦位於耙細l包中，載體可以用於^f吏異源DNA保持在細月包中，或可以作為DNA複製的單位。用於重組DNA衝支術的載體的實例包括質粒、染色體、人工染色體或病毒。非病毒送遞系統包括^旦不限於DNA轉染方法。本文中轉染包括利用非病毒載體將基因送遞到靶哺乳動物細胞中的過程。典型轉染方法包括電穿孔、DNA生物射彈、脂質介導的轉染、密集的DNA介導的轉染、脂質體、免疫脂質體、脂轉染、陽離子試劑介導的、陽離子表面兩性分子(CFAs)(NatureBiotechnology199614;556)，及其組合。病毒送遞系統包括但不限於腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰滲病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、杆狀病毒載體。載體的其它實例包括離體送遞系統，包括但不限於DNA轉染方法，如電穿孔、DNA生物射彈、脂質介導的轉染、密集的DNA介導的轉爭。術語"載體顆粒"是指包裝的逆轉錄病毒載體，其優選能夠結合併進入耙細胞。已經針對載體討論過的顆粒的成分可以根據野生型逆轉錄病毒而改變。例如，顆粒的蛋白外殼中的Env蛋白可以進行遺傳學修飾，從而改變它們的耙定特異性或實現一些其它的需要的功能。優選地，病毒載體優先轉導某種細胞類型或某些細胞類型。更優選地，病毒載體是被靶定的載體，即，它具有相對於天然病毒改變的組織親嗜性，因此載體被耙定到特定細胞。在另一種實施方案中，包含miRNA耙序列的顆粒是i皮mir-142as(也4爾"f乍hsa-mir-142-3p)、let-7a、mir陽15a、mir-16、mir-17-5p、mir-19、mir-142-5p、mir-145、mir畫218miRNA革巴定的顆粒。根據本發明的另一方面，提供了一組DNA構建體，用於製備包含編碼可包裝的載體基因組的DNA構建體的病毒載體顆粒，所述基因組包含miRNA序列粑，任選包含轉基因。可包裝的載體基因組表示載體基因組處於可以使其包裝到病毒載體顆粒中的環境中。這通常要求存在Gag-Pol和Env。根據本發明的另一方面，提供了製備病毒載體顆粒的方法，包括將要求保護的DNA構建體組導入宿主細胞，並且獲得病毒載體顆粒。根據本發明的另一方面，提供了通過本發明的方法生產的病毒載體顆粒。根據本發明的另一方面，提供了一種藥物組合物，包含本發明的基因載體或載體顆粒，以及可藥用的稀釋劑、賦形劑或載體。根據本發明的另一方面，提供了用本發明的載體顆粒感染或轉導的細胞。在一種實施方案中，該細胞包含相應miRNA。可以在體內或體外場合下轉導或感染細胞。細J包可以來源於動物，或形成動物的部分，所述動物優選是哺乳動物，如人或小鼠。因此，可以理解，本發明可以用於提供例如用於疾病模型的轉基因動物。在一種實施方案中，所述哺乳動物是非人哺乳動物。目前的載體轉錄控制方法大多數依賴於取自內源基因的增強子-啟動子元件的送遞(Thomasetal.,2003;VermaandWeitzman,2005)。採用這些方法，基因轉移和治療應用通常需要的高度特異性的基因表達模式的重建受到送遞系統、載體容量和插入的位置效應(用於整合載體)的限制。通過開發利用內源表達的miRNAs進行調節的新載體，發明人添加了以前不存在的一層對載體的控制。這種新方法使得基因表達在選定的細胞類型和細胞系中能夠受到特異性阻抑。採用該系統，相對於現有技術可能達到的程度，我們能夠實現對轉基因表達的更嚴格控制。當用於整合載體時，它可以避免可能由於插入位置效應(鄰接克服載體內部啟動子的轉錄控制的強啟動子/增強子序列的整合)導致的轉基因失調的問題，並且使得轉基因表達具有高度的細胞特異性模式。本發明的一些其它關鍵優點可以用miRNA粑序列對用於基因表達，從而進行基因轉移和治療的載體，如病毒載體，包括慢病毒載體進行工程化，以便;波細胞類型特異性的內源性miRNAs識別，由此調節一個細胞亞組中的轉基因表達。此外，可以用miRNA耙序列的組合獲得具有高度特異性的細胞表達模式的載體。發明人用9種不同的miRNAs證明了該優點，所述miRNAs包括let—7a、mir-15a、mir-16、mir陽17陽5p、mir-19、mir-142-3p、mir—142-5p、mir-145和mir-218。他們證明了細胞內miRNA的濃度可以用於預測載體的表達譜。因此，本專利申請描述的方法提供了設計具有高度特異性的細胞表達模式的載體的簡單方法。可以預見到本發明的多種用途。實際上，作為一個實例，發明人證明了通過使用如下圖中示出的在轉基因的3，UTR中展示mir-142-3p革巴序列的載體，可以在造血細胞系中準確防止,人普遍表達的啟動子進4亍轉基因表達，因為miR-142-3p在造血組織中具有細胞類型特異性表達模式。因此，該系統不減少其它細胞類型中的轉基因表達。發明人也證明了將mir-19a的耙序列摻入載體中，可以抑制293T生產細胞中的轉基因表達，所述細胞表達高水平mir-19a,並且這種抑制對載體的生產沒有不利的影響。該策略提供了重要的、迄今為止不能得到的生產高滴度的攜帶毒性轉基因的載體。我們的發明的進一步的用途是在設計表達兩種具有不同表達譜的轉基因的載體系統中。發明人通過將mir-142-3p的靶序列摻入雙向慢病毒載體的兩個基因之一而證明了這一點。在腎細胞中，兩種轉基因都表達，因為mir-142-3p不存在。但是，在造血細胞中，僅僅兩種轉基因之一被表達。該構建體提供了原理上的證據，表明miRNA調節可以用於趨異調節來自單個載體構建體的兩種轉基因。該載體設計的使用包括以下場合，即異質性細胞群將被轉導，並且在存在的細胞類型之一中需要基因1的表達，並且在另一細胞類型中需要基因2的表達。該設計可以用於同時需要特定細胞的陰性和陽性選擇的治療應用。例如，可以通過單個載體轉導胚胎幹細胞，在所述載體中，基因1是毒性轉基因，基因2是給細胞提供生長益處的轉基因。基因1應該包含對神經元特異的miRNA靶序列，基因2應該包含對胚胎幹細胞特異的miRNA靶序列。以此方式，可以指導轉導的胚胎幹細胞分化成神經元，胞。發明人證明，將miRNA靶序列轉移到細胞中，即使在高拷貝，也不幹擾耙定載體序列的內源miRNA的天然活性或表達。我們也可以添加miRNA靶序列的組合，以獲得具有高度特異性的細胞表達模式的載體。miRNA介導的限制基因表達的方法相對於其它調節轉基因的策略具有一些優點。迄今為止，大多數限制專門的抗原呈遞細胞(APCs)表達的努力都依賴於組織特異性啟動子(Brownetal.,2004b;Follenzietal.，2004;Mingozzietal.,2003)。儘管該方法可以成功將表達限制於輩巴細胞，觀察到一部分非耙細胞中的"滲漏"表達。這是由於進行修飾以便引入載體系統的重構啟動子常常失去一些細胞特異性，並且也是由於活性啟動子和增強子附近的載體整合可以激活組織特異性啟動子並且驅動轉基因表達。由於miRNA介導的沉默發生在轉錄後水平，啟動子和增強子捕獲是不相關的。因此，miRNA調節可以用於使轉基因表達從特定細胞類型有效解除靶定，而仍然允許廣泛的組織表達，如我們在本文中描述的。miRNA調節也可以用作通過啟動子/增強子調節轉基因的補充方法。通過將miRNA耙序列引入已經處於組織特異性啟動子控制下的表達盒，我們添加了額外的一層調節，將消除脫靶表達。作為miRNA可以用於使轉基因表達從特定細胞類型解除靶定的原理性證據，我們開發了LV,其可以提供在肝細胞和其它非造血細胞中的強表達，而防止造血細胞表達。該設計對於系統基因治療特別相關，其中抗轉基因的宿主免疫應答限制了療效(BrownandLillicrap，2002)。我們實驗室和其它實驗室的研究表明，導致基因轉移後轉基因特異性免疫應答誘導的主要因素與轉基因表達位點相關(Brownetal.,2004b;Follenzietal.,2004)。已知在造血系統的APCs,如巨噬細胞和樹突細胞中表達的載體有效引發抗轉基因的免疫應答(DeGeestetal.,2003)。實際上，在CMV啟動子控制下表達轉基因的LV的系統施用導致肝和脾的APCs中轉基因表達的高發生率，這導致表達轉基因的細胞的免疫介導的清除(Follenzietal.,2004)。相反，當CMV啟動子用肝特異性白蛋白啟動子取代時，存在免疫應答頻率和強度的減少。儘管通過使用白蛋白啟動子減少了免疫的發生率，仍然觀察到了一定水平的免疫應答。這可能是由於APCs中從白蛋白啟動子的低水平轉基因表達，這是滲漏的轉錄活性和啟動子/增強子捕獲的結果。因此，通過利用轉錄後起作用的基因調節miRNA系統，可以克服由於轉錄調節水平發生的事件導致的非靶細胞中的轉基因表達的問題。將轉基因表達限制於特定細胞類型，也可能通過限制表達轉基因的細胞庫，減少基因轉移的潛在效力。因此，我們假定，使基因表達解除靶定而不是靶定基因表達並且在轉錄後水平起作用的miRNA調節可能提供克服目前的基因送遞系統的限制的獨特手段。通過防止造血細胞系中的轉基因表達，同時允許非造血細胞中的高水平表達，我們推斷miRNA調節Y吏得在缺乏免疫應答的條件下能夠進行強和穩定的基因轉移。我們修飾以前存在的含有普遍表達的PGK啟動子控制下的綠色螢光蛋白(GFP)報導分子的LV,以便引入已知在造血源細胞中表達的miRNA的革巴序列。在通過系統載體施用我們的miRNA調節的LV後，幾乎排他地在肝細胞和肝內皮細胞中檢測到基因表達。在Kupffer細胞，即存在於肝內的巨噬細胞中的表達幾乎是不可檢測的。這些結果與施用不含miRNA靶序列的LV形成鮮明對比，其中大多數轉基因表達發生在Kupffer細胞中。在隨後的實驗中(其中將載體注射到具有免疫能力的Balb/c小鼠中)，到注射後兩周，我們在LV.PGK.GFP處理的小鼠肝內沒有觀察到GFP陽性細胞。形成鮮明對比的是，LV.PGK.GFP.142-3pT處理的小鼠在施用載體後2周具有顯著的GFP陽性肝細胞頻率。此外，發現GFP表達在注射後持續超過120天(分析了最後的時間點)。類似地，miRNA用表達人因子IX(hFIX)的慢病毒載體處理B型血友病小鼠，發現當在載體中引入mir-142-3pT序列時，hFIX表達保持穩定，而在不含mir-142-3pT序列的類似載體處理的小鼠中，注射後3周沒有檢測到hFIX表達。這些結果首次證明了miRNA可以用於重新耙定病毒載體的表達，並且導致疾病的長期持續治療。它們也提供了證據，表明載體的miRNA調節可以減少抗轉基因免疫應答。其類型中的第一種，即miRNA調節的LV,將對定向於肝的基因治療具有重要意義，其中造血細胞內的基因表達對治療目標可能是有害的。因此，本發明可以用於防止轉移基因的免疫介導的排斥。在體內施用載體時，本發明將避免作為造血系統的一部分的、免疫系統的抗原呈遞細胞中的載體表達，從而防止抗轉基因的免疫應答的起始。可以預見到，當應用於將表達靶定於肝細胞的組織特異性啟動子時，將允許抑制轉導的APC的異位表達。這將很可能解決基因轉移中的主要障礙和長期問題，即，轉移基因的免疫介導的排斥。在所附獨立和從屬權利要求中闡述了本發明的其它具體和優選的方面。從屬權利要求的特徵在合適時可以與獨立權利要求的特徵合併，並且以權利要求中特別闡述的方式之外的方式合併。除非另外指出，本發明的實施將採用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，它們都在本領域技術人員的能力之內。所述技術在文獻中解釋。參見例如J.Sambrook,E.F.Fntsch,andT.Maniatis,1989,Mo/ecw/arC7o//wg.'07^07Ma腺a/,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;Cwre/;1屍rafoc0/5z力A/o/ecw/a/*Bw/ogy，ch.9，13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,/so/a"owcmc/Segi/ewcz'wg.'7fec/w一M,JohnWileyJ.M.PolakandJamesO'D.McGee,1990，S〃wi/j^n.t^zahow../V/wc/p/esaw<i屍r"cfz'ce;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(Editor),1984,(9/z'gowwc/eC<ieS，^ze^.'J屍ra"鹿"//raac/z，IrlPress;D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,A/e/Aot^o/五/27mo/ogy.'5V/^cfwre屍aW爿.-jSyw7zew、屍/2yw.ca/爿""/戸、o/ZW」MethodsinEnzymology,AcademicPress;UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane，EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7》Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855.HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaSeethala,PmbhavathiB.Fernandes(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247陽0562-9);和LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。在此全文引入這些文獻作為參考。附圖簡述下文僅僅通過舉例進一步描述本發明，其優選實施方案在附圖中說明，其中圖la.miRNA調節的慢病毒載體系統的示意圖。此處示出的是普遍表達的人PGK啟動子的轉錄控制下的編碼增強的綠色螢光蛋白(eGFP)的親本慢病毒載體(LVPGK.GFP),和^修飾的載體，其含有內源miRNA靶定的序列的4個串聯拷貝(LV.PGK.GFP.mirT)。圖lb.利用miRNA調節進行趨異調節的慢病毒載體系統的示意圖。此處顯示的是雙向啟動子構建體(Bd丄V)的轉錄控制下的編碼eGFP和突變的低親和力神經生長因子受體(ALNGFR)的親本雙向慢病毒載體，其使得能夠協調轉錄兩種轉基因為不同的轉錄物。修飾了Bd丄V,以便在eGFP表達盒的3'非翻譯區(3，UTR)中引入mirT序列。圖lc.肝細胞特異性的、miRNA調節的慢病毒載體系統的示意圖。此處示出了合成的肝特異性啟動子/增強子元件的轉錄控制下的編碼人凝血因子IX(hFIX)的親本慢病毒載體(LV.ET.hFIX)，和修飾的載體，其含有內源miRNA靶定的序列的4個串聯拷貝(LVET.hFIX.mirT)。圖2a.miRNA譜分析。通過實時PCR進行的293T和U937細胞中選定的miRNAs的表達分析。表達水平是相對於let-7a報導的，所述let-7a是一種組成型表達的"管家"miRNA。圖2b.miRNA調節可以用於使表達從造血細胞系解除粑定。轉導後14天，用劑量匹配濃度的指出的LV轉導的293T(腎來源)、U937(單核細胞來源)和原代樹突細胞(外周血來源的)的FACS分析。示出了含有肝特異性白蛋白啟動子的LV(LV.ALB.GFP),用於比較該啟動子的脫耙活性。柱形圖代表三次獨立實驗。通過Taqman分析確定每個基因組的載體拷貝(C/G)。灰色示出的是未轉導的細胞。圖2c.可以利用miRNA調節來構建用於趨異調節兩種轉基因的載體。轉導後14天，用緊密匹配濃度的表達GFP(含有或不含mir-142-3pT)和ALNGFR的Bd丄V轉導的293T和U937細胞的GFP和ALNGFR表達的FACS分析。點圖代表兩次獨立實-驗。圖2d.miRNA調節的載體設計可以用於構建多種受到不同內源miRNA調節，並且介導多種載體表達譜的載體。轉導後14天，用緊密匹配濃度的表達GFP(含有或不含指出的mirT序列)和△LNGFR的Bd.LV轉導的293T和U937細胞的GFP和△LNGFR表達的FACS分析。圖3a.LV.PGK.GFP或LV.PGK.GFP.142-3pT轉導的293T和U937細胞的GFP表達的定量RT-PCR分析。所有樣品都標準化為GAPDH表達，所得的值是相對於從105TU/mLLV.PGK.GFP轉導的293T細胞檢測的轉錄物報導的，該轉錄物設定為校準物。圖3b.指出的Bd.LV轉導的U937細胞的GFP和ALNGFR表達的定量RT-PCR分析。從圖lc示出的細胞採集cDNA。所有值是相對於在105TU/mLBd丄V轉導的細l包中的△LNGFR轉錄物水平衝艮道的。圖3c.含有或不含mir-142-3pT的LV和BDd丄V(分別示於圖lb和lc)轉導的細胞的RNA印跡分析。每種樣品加入20微克總RNA,並JU笨測GFP。對於LV(上)和Bd丄V(下)，用箭頭表示GFP轉錄物的預期大小。圖3d.用LV.PGK.GFP.142-3pT重複感染U937細胞，以獲得增加的載體含量。通過FACS分析測量GFP。指出了細胞群的平均載體C/G。包括了顯示LV.PGK.GFP.142-3pT的增加的載體劑量和轉基因表達之間的關係的回歸分析。注意到在U937細胞中，單拷貝的LV.PGK.GFP(左下圖)以比175C/GLV.PGK.GFP.142-3pT更高的水平表達GFP。圖3e.通過用遞增濃度的LV.PGK.ALNGFR.mir-142-3pT超感染含有4C/GLVPGK.GFP.mir-142-3pT的U937細胞，測量mir-142-3p-介導RNA幹擾的強度。用Taqman分析檢測超感染的細胞的載體拷貝數，通過FACS分析測量GFP和△LNGFR表達的改變。圖4.可以利用miRNA調節防止生產細i包中的轉基因表達，而不減少載體滴度。比較了三種不同的慢病毒載體構建體的轉基因表達和生產滴度。柱形圖顯示了載體生產期間293T細;5包中的GFP表達。點圖代表用生產的載體轉導後293T細胞中的GFP表達。構建體pLV.PGKas.GFPas.CTEaspolyAas和pLV.PGKas.GFPas.l9aT.CTEas.polyAas具有反義方向的表達盒。如圖中所示，當表達盒以反義方向放置時(pLV.PGKas.GFPas.CTEas.polyAas)，與規範的pLV.PGK.GFP載體相比，載體滴度減少10倍。但是，在反義表達盒中引入mir-19aT序列，使滴度恢復為規範構建體的滴度。圖5a.可以設計miRNA調節的載體，以實現在體內從特定細胞系使表達選擇性解除靶定。兩周前用指定的LV通過尾靜脈注射的棵鼠肝臟的共焦顯微鏡分析。圖像代表3隻小鼠。通過直接螢光顯現GFP。4h對巨噬細;9包特異性標^4勿F4/80(左)和內皮細月包標記物CD31(右)對肝切片進行免疫染色。當採用mir-142-3pT載體時，F4/80+Kupffer細J包幾乎都不以可4企測水平表達GFP,而當用另一種載體轉導時，這些細胞中的許多都表達GFP。注意當通過所有載體，包括LVPGK.GFP.142-3pT(箭頭)轉導時，CD31+肝血竇內皮細胞表達GFP。圖5b.可以設計miRNA調節的載體，以實現在體內乂人特定細月包系使表達解除靶定。對與上文描述的小鼠相同的小鼠的脾切片進行針對全白細胞CD45標記物的免疫染色。LV.PGK.GFP.142-5pT有效從CD45+白細胞解除GFP表達的靶定，但允許邊緣區血竇的非造血基質細胞(CD45陰性)中的強GFP表達。圖5c.可以設計miRNA調節的慢病毒載體，以防止靜脈內載體注射後造血細胞中的轉基因表達。LV.PGK.GFP和LV.PGK.GFP.142-3pT處理的動物的脾細胞GFP表達的FACS分析。圖6a.可以設計miRNA調節的載體，以便甚至在高載體拷貝時也可以防止體內的造血細胞系中的轉基因表達。代表性的TgN.PGK.GFP.142-3pT(24C/G)和TgN.PGK.GFP(4C/G)轉基因小鼠的外周血和骨髓中的GFP表達的FACS分析顯示幾乎不可檢測的轉基因表達，儘管這些小鼠攜帶高數目的載體拷貝。圖6b.可以設計miRNA調節的載體，以區分轉基因小鼠的造血和非造血細胞系的基因表達。來自上述小鼠的指定器官的免疫螢光。通過直接螢光顯現GFP。通過分析的所有器官(除胸腺外)中的CD45免疫染色，標記造血細胞系的細胞，其中用CD3標記胸腺細胞。在TgN.PGK.GFP小鼠中，在所有器官的實質和基質中檢測到了全細胞GFP表達。造血細胞系的細胞看起來是黃色的，這是因為CD45染色和GFP表達之間的重疊。相反，PGK.GFP.142-3pT轉基因小鼠中的GFP表達在CD45+Kupffer細胞(肝)、肺泡(肺)和固有層(腸)巨噬細胞中受到選擇性抑制，其表現為紅色，並且用箭頭表示。在脾和胸腺中，GFP表達在所有造血系的細胞中也是陰性的，但在這些器官的基質中是強表達。圖7a.miRNA調節的LV使得能夠在具有免疫能力小鼠中進行穩定的基因轉移。施用指出的LV的Balb/c小鼠的肝和脾切片的共焦免疫焚光分析。通過直接螢光在肝中顯現GFP;分別通過用抗-F4/80、抗-CD8或抗-CD31染色，檢測Kupffer細胞、CD8+T細胞或內皮細胞。到2周時從LV.PGK.GFP和LV.ALB.GFP小鼠的肝清除GFP+細胞，其與CD8+T細胞浸潤物的存在相關。相反，在注射LV.PGK.GFP.142-3pT的小鼠中大量GFP+肝細胞和內皮細胞持續存在M20天(分析的最長時間點)。圖7b.LV.PGK.GFP.142-3pT處理第70天的小鼠肝中的GFP+糹田胞具有肝細胞的典型外形，或是CD31+內皮細胞(箭頭)。這證明該方法的一個新的方面，即從特定細胞類型對表達進行選擇性的解除耙定，同時允許在寬範圍的細胞系中進行轉基因表達。圖7c.蘇木精和伊紅(H&E)染色顯示注射後第42天，LV.PGK.GFP.142-3pT小鼠中的正常組織學和缺乏單核細胞浸潤。圖7d.5天前用指出的載體注射的具有免疫能力的小鼠脾的分析。主要在邊緣區血竇(MS)中觀察到從mir-142-3pT載體的GFP表達；這些GFP+細胞中的一些表達a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)，並且鑑定為成纖維細胞樣基質細胞(箭頭)。注意分散的GFP+細胞，包括一些CD45+造血細胞，存在於LV.ALB.GFP小鼠的脾中(箭頭)。這進一步證明相對於組織特異性啟動子，miRNA調節策略可以提供改進的轉基因調節手段。圖8a.miRNA調節的慢病毒載體介導小鼠模型中的B型血友病的穩定糾正。B型血友病小鼠(因子IX敲除)通過尾部注射編碼肝細胞特異性ET啟動子控制下的hFIX的慢病毒載體(LV.ET.hFIX)或在轉基因的3，UTR中含有mir-142-3pT序歹'J的修飾的LV.ET.hFIX(LV.ET.hFIX.142-3pT)。通過hFIX特異性ELISA確定hFIX抗原的血漿濃度(上圖)，而通過測量激活的部分促凝血酶原激酶時間而確定FIX凝血活性(下圖)。結果表示為每個載體處理的3隻小鼠的平均值+或-標準誤。圖9A顯示成熟的hsa-mir-142莖環序列。圖9B顯示作為革巴的mir-142的序列。微RNAs(miRNAs)miRNA是才直物和動物基因組中編碼的小RNA分子。這些高度保守的約21聚體RNAs通過結合於特定mRNAs調節基因表達(HeandHannon,20(M)。miRNAs是以序列特異性方式調節基因表達的非編碼RNAs。從microRNAs:SMALLRNASWITHABIGROLEINGENEREGULATION,LinHe&GregoryJ.HannonA^wre/evz'e潛Ge"e"CVS'5，522-531(2004)中概括微RNAs(miRNAs)是約21-25個核苷酸的小RNAs，其在轉錄後水平負調節基因表達。通過基因痛選鑑定miRNA家族的基本成員，即和以篩選秀麗新杆線蟲幼蟲發育的時間調節。由於基因組範圍的克隆努力，已經在幾乎所有的後生動物，包括蒼蠅、植物和哺乳動物中鑑定了數百種miRNAs。miRNAs在多種發育和生理過程過程中表現出時間和空間調節的表達模式。目前已經鑑定的大多數動物miRNAs影響從它們的粑mRNAs進行蛋白合成。另一方面，目前研究的大多數植物miRNAs指導它們的耙的切割。miRNA及其靶之間的互補程度至少部分決定調節機理。在動物中，通過兩種RNA酶-III,即Drosha和Dicer,將miRNAs的一級闢i錄物序貫處理為小的、不完美的dsRNA雙鏈體(miRNA:miRNA,,其含有成熟miRNA鏈及其互補鏈(miRNA*)。成熟miRNA的5'末端的相對不穩定性導致成熟miRNA不對稱組裝為效應物複合物，即RNAi秀導的沉默複合物(RISC)。Ago蛋白是RISC的關鍵成分。多種後生動物基因組中的多種Ago同源物表明存在行使相關但特異的生物功能的多種RISCs。miRNA靶的生物信息預測提供了探測miRNAs功能的重要工具。已經從小鼠、人、果蠅、秀麗新杆線蟲和擬南芥克隆了幾百種miRNAs並且測序。所述序列的實例可以參見www.sanger.ac.uk(Griffiths-Jonesetal.,2006)。其它miRNA靶序歹'J可以在www.miRNA.org檢索。類似於mRNAs,miRNA表達"i普似乎在組織之間不同，但對不同個體中的相同組織是類似的(BaskervilleandBartel,2005)。採用本領域技術人員已知的技術，可以確定具有需要的表達"i普的miRNA。一旦miRNA被鑑定，利用例如上文指出的資料庫，可以容易地確定相應的靶序列。例如，可以根據製造商的說明書，用從Ambion，Inc.得到的wzrVanaTMmiTNA探針組和wz>VanaTMmiTNA標記試劑盒比較人組織中的miRNA表達i普。鑑定組織特異性miRNAs的另一種常用途徑是利用RNA印跡。所述技術的一個實例描述於Lagos-QmntanaMetal,CurrentBiol(2002)12:735-739,其中他們通過,人小鼠進行了大約21個核苷酸的RNAs的組織特異性克隆，鑑定了34種新的miRNAs(Lagos-Qmntanaetal.,2002)。類似地，MichaelMetal,MolCanRes(2003)1:882-891描述了在結腸腺癌和正常黏膜中鑑定了28種不同的miRNA序列。ChenC-Zetal,Science(2004)303:83-86描述了三種miRNAs,即miR-181、miR-142和miR-223，它們在造血細胞中特異性表達(Chenetal.，2004)。SempereLetal,GenomeBiology(2004)5:R13公開了專門在特定小鼠器官中^f企測到的總共17種miRNAs;這些包括7種腦特異性miRNAs(miR-9、隱124a、-124b、-135、-153、-183、-219)、六種肺特異性miRNAs(miR-18、-19a、-24、-32、-130、-213)、兩種脾特異性miRNAs(miR-189、-212)、一種肝特異性miRNA(miR-122a)和一種心臟特異性miRNA(miR-208)。也在人的對應器官中檢測到了所有指出的小鼠腦、肝和心臟特異性miRNAs(在人腎、肺或脾中沒有4全測到miRNA表達)，例外是人腦中的miR-183。在兩個或多個小鼠器官中檢測到的75種miRNAs中，以比任《可其它器官高至少2倍的水平在特定小鼠器官中檢測到其中14種的水平；這些包括7種腦富集的miRNAs(miR-9*、-125a、-125b、-128、-132、-137、-139)、3種骨骼肌富集的miRNAs(miR-ld、-133、-206)、兩種腎富集的miRNAs(miR-30b、-30c)、和一種脾富集的miRNA(miR-99a)。所有腦富集的和骨骼肌富集的miRNAs在人對應器官中具有相似的升高的水平。小鼠和人之間這些器官特異性和器官富集的miRNAs的表達的高度保守表明它們可以在該特定器官的細胞或組織類型的建立和/或維持中起保守左右(Sempereetal.,2004)。Baskerville&Bartel，RNA(2005)11:241-247公開了跨24種不同人器官的175種人miRNAs的微陣列譜調查和表達模式。結果顯示通常共同表達最接近的miRNAs對(BaskervilleandBartel,2005)。此外，表達的miRNAs對之間的相關性的迅速轉變發生在50kb的距離，表明隔開開了miR-181,即一種在小鼠骨髓內的B細月包中特異性表達的miRNA(ChenandLodish,2005)。其中也/>開了一些人miRNAs與白血病相關；miR-15a/miR-16基因座在B細胞慢性淋巴細胞白血病患者中通常缺失或下調，並且miR-142位於迅速發展的B細胞白血病中存在的易位位點。其中指出，這些結果表明miRNA可能是哺乳動物造血的重要調節劑。採用計算方法鑑定新miRNAs及其靶序列的方法公開於WO2004/066183andBrenneckeJetal,PLoSBiology(2005)3(3):0404-0418(Brenneckeetal.，2005)。下表1概括了可以用於本發明的miRNA。tableseeoriginaldocumentpage20造血組織柳7層7S/,滅-2"和滅層"2b在肝中富集7w7-"2a,附/W-"2，w/i-"4,朋J-799和b在心臟中富集加H冊7-7c/,滅-7",滅-廁b和滅層"3在腎中富集加U朋，滅-鄧c，to7WS,raHw/i-24bra/W層32,w/A-74/,和ra7-20欣普遍表達wh7-76，w/i-26a，wj/i-27a，在腫瘤發生過程中的異常miRNA表達在慢性淋巴細胞白血病w/W層75和wW-7(5d中下調在肺癌細胞系中表達在結腸癌中下調f在伯基特淋巴瘤中上調gES細胞，胚胎千細刃包a-Houbaviyetal，Dev.Cell(2003)5:351-358.b隱Sempereetal,GenomeBiol.(2004)5,R13.c-Krichevskyetal,RNA(2003),9:1274-1281.d-Calmetal,ProcNatlAcadSci(2002)99:15524-15529.e-Calmetal,ProcNatlAcadSci(2004)101:2999-3004.f-Michaeletal,MolCancerRes(2003)1:882-891.g-Metzieretal,GenesChromosomesCancer(2004)39:167-169.儘管我們的數據證明了該方法限制造血細胞表達的用途，內源miRNA調節網將導致緊密限制轉基因表達的更大的可能性。表達研究已經揭示了對;f艮多細胞類型，包括神經元、胰島和脂肪組織特異的miRNAs。採用我們的設計，可以建立一種載體，其包含miR-21和miR-22的靶序列，即在胚胎幹細胞(ESCs)分化後上調的兩種miRNAs(Houbaviyetal.,2003),其束縛於自殺基因，如胸苷激酶。該載體可以用於選擇性殺傷ESC來源的組織中的未分化ESCs,這是將基於ESC的治療帶入臨床的更需要的安全控制。miRNA調節的載體設計的另一種可能用途是治療癌症。一些報導表明特定miRNAs在某些腫瘤中下調。例如，miR-15和mir-45在慢性淋巴細胞白血病和乳腺癌中下調(Calmetal.,2004a;Calmetal.,2004b;Iorioetal.,2005)。miR-15或mir-145靶序列可以包含在表達毒性轉基因的載體中。表達miR-15或mir-145的正常細胞，包括產生載體的細胞，將抑制毒素的產生，由此存活，而轉導的腫瘤細胞不再表達miR-15或mir-145,將容易地產生毒素基因並且死亡。miRNA調節的載體設計的另一種可能的用途是防止載體從野生型病毒超感染的轉導的造血細胞動員。miRNA靶序列也可以包含在與轉基因的表達盒不同的載體的區域中。miRNA載體可以與雙向啟動子聯合使用(Amendolaetal.,2005)。這些具有從單個啟動子產生兩種不同mRNA轉錄物的獨特特性的載體可以進行^奮飾，〗吏其包括位於一個或兩個表達盒的miRNA輩巴序列。因此，將mir-142-3pT加入轉基因1,而不是轉基因2，將使轉基因2普遍表達，同時防止轉基因1在造血細胞中的表達。該設計將使兩種轉基因能夠趨異調節，這是現有技術不能達到的技藝。可以用合適的基因載體使用miRNA,即適於送遞感興趣的基因(轉基因)的載體，如病毒載體。這些載體的實例描述於下文。逆專爭錄病毒在過去10年中，已經將基因治療用於在數百個臨床試驗中治療疾病。已經開發了多種工具，將基因送遞到人細胞中；其中，基因工程化的逆轉錄病毒，包括慢病毒，目前屬於用於基因送遞的最常見工具。大多數所述系統含有能夠容納感興趣的基因的載體和能夠提供病毒結構蛋白和酶的輔助細胞，使得能夠產生含有載體的感染性病毒顆粒。逆轉錄病毒科是一種逆轉錄病毒家族，它們的核苷酸和胺基酸序列、基因組結構、致病性和宿主範圍不同。這種多樣性提供了利用具有不同生物特徵的病毒來開發不同治療應用的機會。對於任何送遞工具，效力、靶定某些組織或細胞類型的能力、感興趣基因的表達和基於逆轉錄病毒的系統的安全性，對於成功應用基因治療是重要的。近年來在這些研究領域付出了重大的努力。對基於逆轉錄病毒的載體和輔助細胞進行了多種修飾，以改變基因表達、耙定送遞、改進病毒滴度和增加安全性。本發明代表了該設計過程的改進，因為它將感興趣的基因有效送遞到所述病毒載體中。病毒是用於基因送遞的合理工具。它們在細胞內複製，並且因此具有進化的機制，以進入細胞並且利用細胞機制表達它們的基因。基於病毒的基因送遞的概念是將病毒工程化，使得它能夠表達感興趣的基因。根據具體應用和病毒的類型，大多數病毒載體含有突變，該突變阻礙它們在宿主中作為野生型病毒自由複製的能力。已經修飾了來自一些不同科的病毒，以製備用於基因送遞的病毒載體。這些病毒包括逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰滲病毒、小核糖核酸病毒和曱病毒。本發明優選〗吏用逆轉錄病毒，包括慢病毒。用於基因送遞的理想逆轉錄病毒載體必須是有效的、細胞特異性的、受調節的和安全的。送遞的有效性是重要的，因為它能夠決定治療的效力。目前的努力致力於用逆轉錄病毒載體實現細胞類型特異性感染和基因表達。此外，正在開發逆轉錄病毒載體，用於調節感興趣基因的表達，因為該治療可能需要長期持續或受調節的表達。安全性是病毒基因送遞的主要問題，因為大多數病毒是病原體或具有致病潛能。重要的是在基因送遞過程中，患者也不會意外接受具有完全複製潛能的致病病毒。逆轉錄病毒是通過整合的DNA中間體複製的RNA病毒。逆轉錄病毒顆粒用殼體包裹兩個拷貝的全長病毒RNA,每個拷貝含有病毒複製所需的完整遺傳信息。逆轉錄病毒具有脂質包膜，並且利用包埋在細胞膜中的病毒編碼的包膜蛋白和細胞受體之間的相互作用進入宿主細胞。利用存在於病毒體中的病毒編碼的酶-逆轉錄酶，病毒RNA逆轉錄為DNA拷貝。該DNA拷貝通過整合酶整合到宿主基因組中，整合酶是另一種病毒編碼的酶。這種整合的病毒DNA稱作前病毒，並且成為宿主基因組的7;K久部分。該細月包轉錄和翻i奪才幾制進4亍病毒基因的表達。宿主RNA聚合酶II使前病毒轉錄，產生RNA,另一種細胞過程修飾RNA,並且將其轉運到細胞核外。對一部分病毒RNAs進行剪接，使一些基因表達，而其它病毒RNAs保持全長。宿主翻譯機制合成並且《奮飾病毒蛋白。新合成的病毒蛋白和新合成的全長病毒RNAs組裝在一起，形成新的病毒，出芽到宿主細胞外。基於基因組結構，可以將逆轉錄病毒分類成簡單和複雜逆轉錄病毒。筒單和複雜逆轉錄病毒編碼gag(組特異性抗原)、pro(蛋白酶)、pol(聚合酶)和env(包膜)基因。除了這些基因，複雜逆轉錄病毒也編碼一些輔助基因。逆轉錄病毒也可以分類為腫瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。大多數腫瘤病毒是簡單逆轉錄病毒。慢病毒、泡沫病毒和一些腫瘤病毒是複雜逆轉錄病毒。目前，正在將所有三種類型的病毒開發為基因治療工具。下文將討論每種類型的實例。鼠白血病病毒(MLV)是腫瘤病毒的實例，人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是慢病毒的一個實例，人泡沫病毒是泡沫病毒的一個實例。當能夠複製的逆轉錄病毒感染天然宿主細胞時，它能夠在宿主細胞中形成前病毒，表達病毒基因，並且釋放新的感染性顆粒，以感染其它宿主。在大多數基因治療應用中，不需要將能夠複製的病毒送遞到患者中，因為病毒可能播散超過靶定的組織，並且導致不利的致病作用。因此，在大多數設計用於基因送遞的逆轉錄病毒系統中，使病毒成分分成載體和輔助構建體，以限制病毒自由複製的能力。術語載體通常是指修飾的病毒，其含有感興趣的基因(或轉基因)和基因表達和複製所需的順式作用元件。大多數載體含有一些或全部病毒蛋白編碼序列的缺失，使它們不能複製。設計了輔助構建體，以表達載體中缺乏的病毒基因，並且支持載體的複製。輔助功能最通常以輔助細胞形式提供，但也可以作為輔助病毒或共轉染的質粒形式提供。輔助細胞是工程化的培養細胞，其表達逆轉錄病毒載體增殖所需的病毒蛋白；這通常是通過將表達病毒蛋白的質粒轉染到培養細胞中而實現的。大多數輔助細胞系來源於細胞克隆，以確保支持逆轉錄病毒載體複製的統一性。不經常使用輔助病毒，這是因為可以通過高頻重組產生能夠複製的病毒的可能性。也可以通過輔助構建體的瞬時轉染提供輔助功能，以實現逆轉錄病毒載體的迅速增殖。大多數逆轉錄病毒載體作為細菌質粒維持，以促進載體DNA的操作和增殖。這些雙鏈DNA載體可以通過諸如DNA轉染、脂轉染或電穿孔的常規方法導入輔助細胞。輔助細胞表達所有病毒蛋白(Gag、Gag-Pol和Env)，但缺乏含有包裝信號的RNA。病毒RNA是感染性病毒顆粒形成和釋放所必須的，但對於形成"空的，，非感染性病毒顆粒不是必須的。當載體DNA導入輔助細胞時，含有包裝信號的載體RNA被轉錄，並且有效包裝成病毒顆粒。病毒顆粒含有從輔助構建體表達的病毒蛋白和從載體轉錄的RNA。這些病毒顆粒可以感染耙細胞，逆轉錄載體RNA,形成雙鏈DNA拷貝，並且將DNA拷貝整合到宿主基因組中，形成前病毒。這種前病毒編碼感興趣的基因，並且由宿主細胞機制表達。但是，由於載體不表達任何病毒蛋白，它不能產生能夠播散到其它靶細胞的感染性病毒顆粒。設計輔助細胞，用於支持逆轉錄病毒載體的增殖。輔助細胞中的病毒蛋白從轉染到哺乳動物細胞中的輔助構建體表達。輔助構建體的表達模式和編碼的基因不同。一個基因組的輔助構建體在最初開發的輔助細胞系中，所有病毒基因都是從一個輔助構建體表達。這些輔助細胞的實例是C3A2和-2。這些細胞系的輔助構建體是缺乏包裝信號的克隆的前病毒DNAs。這些輔助細胞能夠支持逆轉錄病毒載體的有效增殖。但是，這些輔助細胞的主要問題是在病毒載體增殖過程中會頻繁產生能夠複製的病毒。輔助構建體含有病毒基因組的大部分，並且因此與逆轉錄病毒載體具有顯著的序列同源性。序列同源性能夠促進輔助構建體和逆轉錄病毒載體之間的重組，產生能夠複製的病毒。儘管輔助RNA缺乏包裝信號，它仍然能夠低效包裝為病毒體(比含有包裝信號的RNA低約100到1000倍)。逆轉錄病毒重組在兩個共同包裝的病毒RNAs之間頻繁發生，產生含有來自兩個親本的遺傳信息的DNA拷貝。如果輔助RNA和載體RNA包裝為相同的病毒體，兩個RNAs之間的大的序列同源區能夠促進逆轉錄期間的同源重組，以產生能夠複製的病毒。在輔助RNA和來源於內源病毒的RNA之間也能夠以低效發生相似的重組事件，產生能夠複製的病毒。分裂基因組輔助構建體與能夠複製的病毒的產生相關的安全性考慮促進了用"分裂基因組，，設計4艮多輔助細胞系，包括CRIP、GP+envAm12和DSN。在這些輔助細胞中，從一個質粒表達病毒Gag/Gag-Pol多蛋白，從另一個質粒表達Env蛋白。此外，這兩種輔助構建體也含有病毒順式作用元件的缺失，以減少或消除與逆轉錄載體之間的序列同源性。在這些輔助細胞中，將編碼病毒蛋白的基因分離到兩個不同的構建體中，病毒順式作用元件位於載體中。因此，發生了一些重組事件，以重建病毒基因組。此外，減少同源性區域，減少了這些重組事件發生的可能性。因此，含有分裂基因組輔助構建體的輔助細胞被認為比含有一個基因組的輔助構建體的輔助細J包更安全。誘導型輔助構建體與上文描述的組成型表達病毒蛋白的輔助細月包系相反，設計了一些輔助細胞系，用於以誘導型方式表達病毒蛋白。製備誘導型輔助細胞系的一個原理是一些病毒蛋白是細胞毒性的，並且不能容易地以高水平表達。通過採用誘導型系統，細胞毒性蛋白的表達可以限於病毒增殖的階段。通過控制細胞毒性蛋白的表達，可以達到高病毒滴度。誘導型輔助細胞的實例包括293GPG細胞和HIV-1輔助細胞系。瞬時轉染系統隨著有效轉染方法的開發，也開發了瞬時轉染系統，用於增殖逆轉錄病毒載體。在這些系統中，通常從兩個不同的構建體表達輔助功能，所述構建體中的一個表達gag-pol,另一個表達env。這兩個構建體通常具有很小的序列同源性。該逆轉錄病毒載體和輔助構建體轉染到細胞中，在轉染後幾天收穫病毒。產生假型病毒的系統假型是指含有來自一種病毒的病毒基因組和來自一種不同病毒的部分(或全部)病毒蛋白的病毒顆粒。假型的最常見形式包括利用另一種病毒的包膜蛋白的病毒。一些輔助細胞系含有從一種病毒表達gag-pol並且從另一種病毒表達env的輔助構建體。由於Gag多蛋白選擇病毒RNA,要增殖的病毒載體含有被這些細胞中表達的Gag多蛋白識別的RNA。但是，產生的病毒顆粒含有來源於另一病毒的Eiw蛋白。因此，這些病毒顆粒僅僅能夠感染表達與異源包膜蛋白相互作用的報導物的細胞。例如，輔助細胞系PG13從MLV表達gag-pol,並且從長臂猿白血病病毒(GaLV)表達env。由於PG13細胞系表達MLVGag多蛋白，它能夠有效包裝基於MLV的逆轉錄病毒載體。也表明了一些來源於不同科的病毒的包膜也能夠使逆轉錄病毒假型化，並且產生感染性病毒顆粒。例如，可以用皰滲性口炎病毒(VSV),即一種杆狀病毒的G蛋白產生假型逆轉錄病毒載體。這些VSVG假型病毒表現出非常寬的宿主範圍，並且能感染多種正常條件下不能被逆轉錄病毒感染的細胞。其它可以用於載體假型化的包膜是以下病毒的包膜有效靶定造血細胞的RD114內源性貓逆轉錄病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、狂犬病病毒、Ebola和Mokola病毒、Ross河病毒牙口Semliki森林病毒和杆狀病毒gp64包膜。假型化可以涉及例如基於諸如HIV的慢病毒的逆轉錄病毒基因組或馬感染性貧血病毒(EIAV),並且包膜蛋白可以例如是稱作4070A的兩親包膜蛋白。或者，包膜蛋白可以是來自於另一種病毒的蛋白如流感病毒血凝素。在另一種替代方案中，包膜蛋白可以是修飾的包膜蛋白，如突變的、截短的或工程化的包膜蛋白(如工程化的RD114包膜)。可以進行修飾或選擇修飾，以誘導靶定能力或減少毒性或用於其它目的。含有遺傳l'務飾的env,用於細胞或組織耙定的系統病毒包膜蛋白和細胞受體之間的相互作用決定了病毒的宿主範圍。開發了一些策略，用於通過改變病毒Env將病毒靶向送遞到某些細胞類型中。翻譯和修飾後，Env的SU部分與細胞受體相互作用。Env的SU部分的修飾通常通過去除SU的編碼區的一部分並且用其它蛋白的區域替代而實現。用於修飾Env的SU部分的蛋白包括紅細胞生成素、heregulm、胰島素樣生長因子和抗多種蛋白的單鏈可變片段抗體。雜交系統一些最近開發的系統利用雜交方法使逆轉錄病毒載體增殖。用輔助細胞系組成型表達一些病毒蛋白，而通過瞬時轉染將其他病毒蛋白導入輔助細胞系。例如，可以將逆轉錄病毒載體導入組成型表達MLVgag-pol的輔助細胞系。為了增殖逆轉錄病毒載體，設計用於表達VSVG的質粒可以通過瞬時轉染導入系統中。作為該方案的另一變化，逆轉錄病毒自身可以編碼一些病毒蛋白(例如Gag/Gag-Pol)，並且輔助細胞系可以提供其他病毒蛋白(Env)(Boerkoeletal.,1993)。利用其4也病毒送遞逆轉錄病毒輔助構建體的方法也可以使用。例如，製備了修飾的單純皰滲病毒，使其含有逆轉錄病毒gag、pol和env，以便形式輔助功能。類似地，也採用了腺病毒載體和Semliki森林病毒來源的表達載體將編碼MLV病毒蛋白的基因送遞到輔助細胞中。基於不同逆轉錄病毒的載體已經修飾了很多逆轉錄病毒，用於產生能夠攜帶感興趣的基因(轉基因)的載體。病毒載體通常含有病毒複製和基因表達所需的全部順式作用元件。在來源於一些病毒的載體中也可能需要其它元件，用於確保成功的基因送遞。這些順式作用元件的要求通常由於對這些病毒的生物學的理解更強而變得明顯。此外，為了允許細菌細胞中的簡單操作，大多數逆轉錄病毒載體是質粒形式，並且具有含有細菌複製起點和抗生素抗性基因的主鏈。典型地進行以下步驟，產生來自逆轉錄病毒載體的病毒顆粒。首先通過轉染、電穿孔或脂轉染將載體DNA導入輔助細胞。將DNA導入輔助細胞後，將載體DNA整合到輔助細胞中，並且表達。從5'LTR表達病毒RNA,並且組成兩個R區域之間的所有序列。該病毒RNA含有包裝信號，並且有效包裝到病毒顆粒中。在逆轉錄病毒複製期間，兩個LTRs外的質粒主鏈序列不轉移到靶細胞中。下文描述了來源於不同逆轉錄病毒的一些逆轉錄病毒載體的基本結構。來源於腫瘤病毒的載體本文將描述來自三種不同腫瘤病毒的載體，用於代表一些最廣泛使用的逆轉錄病毒載體。腫瘤病毒僅僅能夠感染分裂的細胞；因此，來源於肺瘤病毒的載體僅僅能夠用於有效將基因送遞到分裂的細胞中。細胞增殖的要求有時可以用作選擇性靶定迅速分裂的細胞(例如癌細力包)的優點。l.基於鼠白血病病毒的載體。目前，基於MLV的逆轉錄病毒載體和輔助細胞是最常用的基因送遞系統。工程化載體和輔助細胞系的開發和可獲得性促進了基於MLV的載體的普及。載體含有基因表達和病毒複製所需的順式作用病毒序列，如LTRs、PBS、PPT和att。包裝信號可以是最小信號或延伸到gag開放讀碼框(+)的更長的信號。當載體中存在+時，必須使gag的翻譯起始密碼子突變，以防止截短的Gag蛋白表達。設計了一些載體，使其含有位於包裝信號和3，非翻譯區之間的多個限制酶位點。這些克隆位點的存在促進了能夠表達感興趣基因的載體的構建。基於MLV的載體可以在所有MLV輔助細胞系中有效增殖。存在一些MLV包膜蛋白，其決定MLV載體的宿主範圍。利用親嗜性包膜的病毒可以感染小鼠細胞，但是不能感染來源於其它物種的病毒。利用雙嗜性包膜的病毒可以感染小鼠細胞和來源於其它物種的細胞，包括人細胞。利用異種包膜的病毒不能感染小鼠細胞，但是能夠感染來源於其它物種的細胞。此夕卜，MLV載體也能夠在基於脾壞死病毒(SNV)的輔助細胞系中增殖。SNV是與MLV遠相關的鳥類病毒。出乎意料地，SNV蛋白保留了以下能力與MLV順式作用序列相互作用和包裝MLVRNA、逆轉錄MLV基因組，和將MLVRNA整合到宿主中。2.基於脾壞死病毒的載體。這些載體中需要的病毒序列與MLV載體的序列非常相似。稱作E的SNV的包裝信號不延伸到gag開放讀碼框中；因此，大多數基於SNV的載體不含有gag編碼區。類似於MLV載體，感興趣的基因插入接頭區，該接頭區含有多個位於包裝信號和3，非翻譯區之間的限制位點。基於SNV的載體可以在基於SNV的輔助細胞系如C3A2、DSDH、DSH134G和DSN中增殖。3.基於勞斯肉瘤病毒和禽類白血病病毒的載體。RSV是唯一已知的能夠複製的急性致癌逆轉錄病毒。除了gag-pol和env,RSV也編碼env和3'LTR之間的致癌基因v-src。v-src上遊的剪接受體位點使得基因能夠以剪接形式表達。RSV具有編碼其它基因的能力。已經進行了多種修飾，以製備能夠複製的病毒載體，其一個實例是用剪接受體位點和一些限制酶位點替代v-src。可以將DNA片段插入限制位點，以製備能夠複製的載體，該載體表達感興趣的基因。已經修飾了ALV,以製備需要輔助細胞進行增殖的載體。類似於上文描述的MLV和SNV載體，ALV載體的基本結構也包含5'和3'LTRs、att、PBS、PPT和包裝信號。ALV的包裝信號延伸到gag開放讀碼框中，並且gag的相關部分包含在基於ALV的載體中，以獲得有效包裝。來源於慢病毒的載體與胂瘤病毒相反，一些慢病毒表現出感染非分裂的靜止細胞。慢病毒是複雜逆轉錄病毒，可能需要表達用於調節它們的複製周期的輔助蛋白。這些輔助蛋白中的一些結合於病毒基因組的區域，以調節基因表達。因此，基於慢病毒的載體需要摻入額外的順式作用元件，使得能夠發生有效病毒複製和基因表達。作為基於慢病毒的載體的實例，下文描述了基於HIV-1和HIV-2的載體。含有順式作用元件的HIV-1載體也存在於筒單逆轉錄病毒中。已經表明這些序列延伸到對HIV-1的包裝重要的gag開放讀碼框中。因此，HIV-1載體通常含有gag的相關部分，其中翻譯起始密碼子進4亍了突變。此外，大多數HIV-1載體也含有一部分env基因，其包含RRE。Rev結合於RRE,其允許全長或單獨剪接的mRNAs從細胞核轉運到細胞質中。在缺乏Rev和/或RRE的條件下，全長HIV-1RNAs在細胞核中積累。或者，來自某些簡單逆轉錄病毒，如Mason-Pfizer猴病毒的組成型轉運元件可以用於解除對Rev和RRE的需要。從HIV-1LTR啟動子的有效轉錄需要病毒蛋白Tat。因此，重要的是如果需要從HIV-1LTR有效轉錄，則Tat在靶細胞中表達。可以通過從逆轉錄病毒載體表達Tat基因滿足對Tat表達的需要。或者，從異源的內部啟動子表達感興趣的基因能夠避開對Tat表達的需要。大多數基於HIV-2的載體在結構上與HIV-1載體非常相似。類似於基於HIV-1的載體，HIV-2載體也需要RRE,用於有效轉運全長或單獨剪接的病毒RNAs。也已經證明了利用來自猿猴免疫缺陷病毒的病毒蛋白，HIV-1載體可以增殖到高病毒滴度。在一個系統中，載體和輔助構建體來自兩種不同的病毒，減少的核苷酸同源性可以減少重組的可能性。除了基於靈長類動物慢病毒的載體，也已經開發了基於貓免疫缺陷病毒的載體，作為來源於致病HIV-1基因組的載體的替代。這些載體的結構也類似於基於HIV-1的載體。來源於泡沫病毒的載體泡沫病毒是非常規的逆轉錄病毒，因為它們的複製周期中的很多特徵與肺瘤病毒和慢病毒不同。儘管這些病毒對培養的細胞可能是有毒的，^旦這些泡沫病毒在宿主中都不導致疾病。泡沫病毒載體的一個實例含有典型的逆轉錄病毒順式作用序列。除了5，非翻譯區中的序列，gag開放讀碼框的5，部分和pol開放讀碼框的3，部分中的序列對於有效包裝是重要的。類似於慢病毒，從人泡沫病毒啟動子的表達由病毒蛋白Tas激活。逆轉錄病毒載體的設計逆轉錄病毒載體可以含有很多不同的修飾，其對基因治療起多種作用。可以導入這些修飾，以便允許一個以上基因表達，調節基因表達，激活或滅活病毒載體，並且去除病毒序列，以避免能夠複製的病毒的產生。下文描述了這些修飾的一些實例。A.標準載體1.U3啟動子驅動的基因表達。從位於5'LTR的U3區中的逆轉錄病毒啟動子表達全長病毒RNA。病毒RNA含有R、U5、5'非翻譯區、感興趣的基因、3'非翻i奪區、U3和R。可以/人全長RNA翻譯插入在5'和3，非翻譯區之間的基因，所述RNA/人U3啟動子轉錄。在病毒原種增殖期間，通常需要表達載體中的選擇標記基因，使得能夠選擇病毒載體轉染或感染的輔助細胞。因此，通常需要設計表達選擇標記基因和感興趣基因的逆轉錄病毒載體。通常將藥物抗性基因用作選擇標記，但其它標記基因，如綠色螢光蛋白基因也可以用於選擇轉染或感染的細胞。可以通過採用內部啟動子、RNA剪接或內部核糖體進入位點(IRES)實現逆轉錄病毒載體內兩種基因的表達。2.利用內部啟動子表達其它基因的載體。基因表達的一個實例來自含有內部啟動子的逆轉錄病毒載體，其中例如採用從病毒U3啟動子表達的全長RNA來翻譯第一個感興趣的基因。從內部啟動子表達的亞基因組RNA用於翻譯第二種感興趣的基因。3.利用剪接來表達其它基因的載體。逆轉錄病毒通過受調節的剪接表達env。用於表達env的剪接供體位點位於逆轉錄病毒的5，非翻譯區。在複製過程中，剪接了一些全長病毒RNAs,以產生用於表達Env蛋白的亞基因組病毒RNAs。通過採用病毒剪接供體和剪接受體位點，採用相同原理表達兩種不同基因，從而開發剪接載體。剪接載體的優點是僅僅需要一個啟動子，並且消除了啟動子幹擾的任何可能。4.利用翻譯控制信號表達其它基因的載體首先在小核衝唐核酸病毒中證明了mRNA中的序列可以作為4吏核糖體能夠結合mRNA的中部，並且翻譯遠離mRNA的5'末端基因。這些序列(稱作IRES)目前通常用於逆轉錄病毒載體。除了在小核糖核酸病毒中鑑定了IRES序列，也在一些逆轉錄病毒，如MLV、SNV和內源性病毒樣顆粒(VL30)的5'非翻譯區鑑定了IRES序列。因此，也能夠利用這些逆轉錄病毒IRES序列表達第二基因。其它允許從單個轉錄物表達多個蛋白的序列是自我切割的2A樣肽(也稱作CHYSEL,即順式作用的水解酶元件)，其來源於口^帝疫病毒和其它picoRNA病毒。或者，可以用雙向啟動子從相同的啟動子表達兩種基因。B.雙拷貝載體利用了LTR序列在逆轉錄病毒載體中複製的事實構建了含有兩個拷貝的感興趣基因的載體。例如，第一組雙拷貝載體含有病毒上遊U3區中的感興趣基因。採用RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子表達這些基因。已經證明了這種策略成功增加基因表達水平。在雙拷貝載體的另一個實例中，載體含有R區中部的感興趣基因。C.自滅活載體與用逆轉錄病毒載體進行基因治療相關的一個安全性考慮是在載體增殖期間會產生能夠複製的病毒，這會導致治療載體意外傳播到非耙組織。為了解決這一問題，設計了一類載體，進行自滅活。其原理是在基因送遞後，載體將去除一些完成另一輪複製所需的順式作用元件。因此，即使存在能夠複製的病毒，這些載體不能有效轉移到其它靶細胞。能夠複製的病毒的產生有時涉及缺陷性輔助質粒和編碼感興趣基因的載體之間的重組。因此，自滅活載體的另一個可能的益處是它可以減少產生能夠複製的病毒的可能性。1.U3—載體。U3—載體是要開發的第一種自滅活逆轉錄病毒載體。這些載體設計為在逆轉錄過程中去除了病毒U3啟動子，使得靶細胞中的前病毒缺乏病毒啟動子。在這些載體中，5'LTR的U3是完整的，而3'LTR的U3由於大的缺失而滅活。從該載體產生的RNA含有R、U5、5'非翻譯區、感興趣的基因、3'非翻譯區、缺失的U3和R。在逆轉錄過程中，病毒RNA的3'末端處的U3通常用作模板，產生LTR。因此，通過逆轉錄從U3—載體合成的病毒DNA在兩個LTRs中都含有缺失的U3序列。由於在逆轉錄過程中缺失了病毒啟動子，感興趣的基因處於內部啟動子的控制下。U3—載體的優點是它可能更安全，因為產生能夠複製的病毒的可能性減少。但是，DNA轉染過程中的重組可以以低頻率發生，以重新產生3'LTR處的U3。如果發生這種情況，得到的載體仍然在U3中含有啟動子，因此保留兩個完整的LTRs。在一些113-載體中進行了其它修飾，以減少5'和3'LTRs之間的同源性，其減少了DNA轉染過程中重組和再次產生完整LTR的可能性。2.Cre/loxP載體。Cre重組酶，即噬菌體Pl的一種天然存在的定點重組酶，識別一種32bp的序列，稱作loxP。採用由不同長度的序列分隔的兩個loxP位點，Cre可以有效介導定點重組。重組事件包括loxP位點之間的序列的缺失、插入和倒置。已經利用該系統開發自滅活的逆轉錄病毒載體(Choulikaetal.,1996;Russetal.，1996)。這種載體的一個實例包含完整的5'LTR和逆轉錄病毒複製所需的所有順式作用元件。該載體含有採用內部啟動子表達的cre重組酶基因。通過在U3中插入一些序列，包括loxP位點、啟動子和感興趣的基因，修飾了3'LTR;此外，3'U3通常含有缺失，以減少啟動子活性。全長病毒RNA包裝到病毒體中，在感染粑細胞後，對病毒RNA進行逆轉錄。3'U3序列用作才莫板，合成兩個LTRs;因此，兩個LTRs中的序列含有一個拷貝的loxP位點、啟動子和感興趣的基因。表達cre基因，並且在感染的輩巴細胞中合成Cre重組酶。Cre重組酶然後介導病毒DNA中兩個loxP^立點之間的序列缺失，其導致5'LTR、5'非翻i奪區、內部啟動子和cre的缺失。因此，耙細胞中的前病毒僅僅含有一個表達感興趣的基因的LTR。採用相同的原理，可以用Cre/loxP系統去除逆轉錄病毒載體中的不同序列，以及去除包裝細胞中輔助構建體的部分。Cre/loxP系統的另一種應用是其可以用於在病毒DNA整合到靼細胞的染色體內之後乂人逆轉錄病毒去除選擇標記。選擇標記包含在載體中，使得可以選擇載體DNA轉染的輔助細胞。選擇標記的去除是需要的，因為選擇標記的存在能夠導致啟動子幹擾或抗轉導細胞的免疫應答。選擇標記的去除是通過插入側翼於選擇標記基因的兩個loxP位點而實現的。通過感染將載體導入把細胞後，用另一種表達Cre重組酶的載體感染靶細胞。然後Cre重組酶去除兩個loxP位點之間的包含選擇標記的序列。因此，最終的前病毒僅僅表達感興趣的基因。D.自滅活和自激活載體根據基因產物的性質和作用，可能需要在輔助細胞中引入滅活的感興趣基因，並且在將其送遞到靶細胞之後滅活該基因。例如，如果來自感興趣的基因的產物是細胞毒性的，那麼，在輔助細胞中表達基因，將導致細胞毒性，並且最可能減少或消除病毒產生。製備了一系列載體，用於在基因送遞期間同時激活基因和滅活載體。這是通過逆轉錄期間頻繁去除直接重複的序列而實現的。如果病毒中存在直接重複的序列，一個拷貝的直接重複序列和兩個重複序列之間的所有序列可以在逆轉錄期間以高頻去除。已經利用逆轉錄酶的這種特性製備了自激活和自滅活逆轉錄病毒載體。E.靶定於特定細胞的載體基因治療的一個重要目的是開發將基因送遞靶定到特定細胞類型或組織的方法。在一種嘗試中採用了至少兩種策略，用逆轉錄病毒載體靶定基因送遞。一種策略設計為通過採用與細胞類型特異性受體相互作用的天然或基因工程化包膜蛋白，在病毒進入宿主細胞的點控制基因送遞。另一種策略設計用於通過利用組織特異性啟動子控制治療基因在特定細胞類型中的表達。F.利用細胞類型特異性啟動子的載體啟動子在某些組織中有活性，或者反應於某些可以用於調節感興趣基因表達的試劑。這些啟動子可以插入逆轉錄病毒載體的LTRs之間。或者，受調節的啟動子可以用於替代U3區中的病毒啟動子。用內部組織特異性啟動子設計逆轉錄病毒載體，類似於其它含有內部啟動子的逆轉錄病毒載體的設計。病毒宿主範圍l.包膜選擇和病毒宿主範圍的考慮。病毒包膜蛋白的性質決定某種病毒是否能夠進入靶細胞。因此，重要的是考慮靶細胞在選擇用於病毒生產的包膜蛋白之前是否具有正確的細胞表面受體(如上文的討論)。本發明的逆轉錄病毒載體顆粒也能夠轉導緩慢分裂、並且諸如MLV的非慢病毒不能有效轉導的細胞。緩慢分裂的細胞每3-4天分裂一次，包括某些腫瘤細胞。儘管腫瘤含有迅速分裂的細力包，一些腫瘤細胞，特別是腫瘤中心的那些，不經常分裂。或者，靶細胞可以是能夠進行細胞分裂的生長停滯的細胞，如腫瘤團塊中部的細胞或諸如造血幹細胞或CD34陽性細胞的幹細胞。作為進一步的替代，耙細胞可以是分化細胞的前體，如單核細胞前體、CD33陽性細胞或骨髓前體。作為進一步的替代，耙細胞可以是分化細胞，如神經元、星形細胞、膠質細胞、小膠質細胞、巨噬細胞、單核細胞、表皮細胞、內皮細胞或肝細胞。可以在從人個體分離後體外轉導粑細胞，或可以體內直接轉導。來源於腺病毒的載體腺病毒是一種雙鏈的線性DNA病毒，其不經過RNA中間體。存在超過50種不同的腺病毒的人血清型，基於基因序列同源性分為6個亞組，所有亞組都表現出相似的基因組構。人C組腺病毒血清型2和5(具有95%序列同源性)最常用於腺病毒載體系統，並且通常與年輕人的上呼吸道感染相關。本發明的腺病毒/腺病毒載體可以來源於人或動物。對於來源於人的腺病毒，優選的腺病毒是分類到C組的那些，特別是2(Ad2)、5(Ad"、7(Ad7)或12(Adl2)型的腺病毒。更優選地，它是Ad2或Ad5腺病毒。在來源於動物的各種腺病毒中，可以使用犬腺病毒、小鼠腺病毒或禽類腺病毒，如CELO病毒(CottonWa/.,1993,JVirol67:3777-3785)。至於動物腺病毒，優選採用來源於犬類的腺病毒，特別是CAV2腺病毒的病毒抹[例如曼哈頓抹或A26/61(ATCCVR-800)]。其它來源於動物的腺病毒包括申請WO-A-94/26914中提到的那些，在此引入該申請作為參考。如上文提到的，腺病毒基因組的組構在所有腺病毒組中是類似的，特定功能通常位於研究的每種血清型的相同位置。腺病毒基因組包含位於每個末端的倒置的末端重複序列UTR)、包殼序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要的早期基因分類為中間早期(Ela)、延遲早期(Elb、E2a、E2b、E3和E4)和中間區的系列。其中，包含在El區中的基因對於病毒增殖是特別需要的。主要的晚期基因包含在L1-L5區中。已經對Ad5腺病毒的基因組進行了完全測序，並且在資料庫中可獲得(特別參見Genbank登錄號M73260)。同樣，也已經對部分或甚至全部其它腺病毒基因組(如Ad2、Ad7、Adl2)進行了測序。為了用作重組載體，典型地對腺病毒進行了修飾，使其不能在感染的細胞中複製。因此，現有技術描述的構建體包括缺失了對病毒複製來說關鍵的El區，其中插入了異源DNA序列(Levrero"a/.,1991,Gene101:195;Gosh-Choudhury"a/.，1986,Gene50:161)。此外，為了改進載體的性質，提出了在腺病毒基因組中建立其它缺失或修飾。因此，將熱敏性點突變導入了tsl25突變體，使其能夠滅活72kDaDNA結合蛋白(DBP)。優選地，用於本發明的重組腺病毒載體在其基因組的El區包含缺失。更具體地，其在Ela和Elb區包含缺失。根據特別優選的方式，通過Ad5腺病毒序列(GenbankAccessionNo.M73260)中的核苦酸454-核苷酸3328的PvuII-BglII片l殳的缺失，滅活El區。在另一種優選實施方案中，通過缺失核苷酸382-核苷酸3446的Hinfll-Sau3A片l殳，滅活El區。其它腺病毒載體包含對於病毒複製和/或增殖來說關鍵的另一個區域，即E4區的缺失。E4區參與調節晚期基因的表達、晚期核RNAs的穩定性、宿主細胞蛋白表達的減少和病毒RNA的複製效率。因此，缺失E1和E4區的腺病毒載體具有極度減少的病毒基因表達和轉錄背景噪音。所述載體描述於例如申請WO-A-94/28152、WO-A-95/02697、WO-A-96/22378。此外，也已經描述了攜帶IVa2基因的修飾的載體(WO-A-96/10088)。根據優選的變體，用於本發明中的重組腺病毒載體還包含其基因組E4區中的缺失。更具體地，E4區中的缺失影響所有開放讀碼區。通過精確的實例可以提到的是核苷酸33466-35535或33093-35535的缺失。具體地，優選的載體包含整個E4區的缺失。這可以實施相應於核苷酸35835-32720的MaeII-MscI片l殳的缺失或切除。E4區中其它類型的缺失描述於申請WO-A-95/02697和WO-A-96/22378,在此引入作為參考。或者，^U叉缺失了E4的一個功能部分。該部分至少包含ORF3和ORF6框。例如，這些編碼框可以分別以PvuII-AluI和BglII-PvuII片段的形式從基因組缺失，分別相應於核苷酸34801-34329和34115-33126。病毒Ad2dl808或病毒Ad5d11004、Ad5d11007、Ad5d11011或Ad5d11014的E4區的缺失也可以在本發明的範圍內使用。上文給出的位置是指公開並且在資料庫中可以讀取的野生型Ad5腺病毒序列。儘管不同腺病毒血清型之間可以存在小的變異，這些位置通常適用於從任何血清型，特別是腺病毒Ad2和Ad7構建本發明的重組腺病毒。此外，產生的腺病毒可以在基因組中有其它改變。具體地，可以去除其它區域，以增加病毒的容量並且減少其與病毒基因表達相關的副作用。因此，特別是E3或IVa2區的全部或部分可以去除。但是，至於E3區，保留編碼gpl9K蛋白的部分是特別優選的。這種蛋白實際上使其能夠防止腺病毒載體成為免疫反應的對象，所述免疫反應(i)將限制其作用，和(ii)具有不需要的副作用。根據特定模式，去除了E3區，並且重新導入編碼gpl9K蛋白的序列，受異源啟動子的控制。本發明的多核苷酸/NOI可以插入重組基因組的多個位點。可以插入E1、E3或E4區，作為缺失或多餘序列的替代。也可以將其插入任何其它位點，順式位於生產病毒所需的序列(ITR序列和包殼序列)外。E2區是必須的，因為它編碼72kDaDNA結合蛋白、DNA聚合酶和引發起始DNA合成的蛋白必須的55kDa末端蛋白(TP)的80kDa前體。作為製備更具有缺陷的病毒的一種替代方法是完全"摧毀病毒的內部結構"，僅僅留下病毒複製所需的末端重複序列。"摧毀內部結構的"或"無內部結構的"病毒可以在293細月包系中用第一4戈輔助病毒生長到高滴度。重組腺病毒典型地在包殼細胞系中產生，這種細胞系是能夠反式補充重組腺病毒基因組中缺乏的一個或多個功能的細月包系。所述細胞系之一是例如細胞系293,其中整合了部分腺病毒基因組。更精確地，細胞系293是一種人腎胚細胞系，其含有血清型5腺病毒(Ad5)基因組的左端(約11-12%),其中包含左ITR、包殼區、El區，包括Ela和Elb、編碼蛋白pIX的區域、和編碼蛋白plVa2的區域的一部分。這種細胞系能夠反式補充E1缺陷，即缺乏所有或部分E1區的重組腺病毒，並且能夠產生具有高滴度的病毒原種。這種細胞系也能夠在允許的溫度下(32。C)產生病毒原種，其額外包含熱敏性E2突變。已經特別基於人肺癌細胞AM9(WO-A-94/28152)或人成一見網膜細胞(Hum.Gen.Ther.(1996)215)描述了能夠補充El區的其它細胞系。此外，也已經描述了能夠反式補充一些腺病毒功能的細胞系，例如補充El牙口E4區的糹田胞系(YehWa/.，1996,J.Virol.70:559;Krougliak1995,Hum.Gen.Ther.6:1575)和補充El和E2區的細胞系CWO-A-94/28152,WO-A-95/02697,WO畫A畫95/27071)。通常通過將病毒DNA導入包殼細胞系，然後在大約2或3天後裂解細胞(腺病毒周期的動力學是24-36小時)而製備重組腺病毒。為了執行該程序，導入的病毒DNA可以是完整的重組病毒基因組，任選在轉染到細胞中細菌(WO-A-96/25506)或酵母(WO-A-95/03400)中構建。它也可以是用於感染包殼細胞系的重組病毒。病毒DNA也可以以攜帶部分重組病毒基因組的片段和同源區形式導入，所述同源區使在導入包殼細胞後，能夠通過各個片段之間的同源重組重建重組病毒基因組。能夠複製的腺病毒也能夠用於基因治療。例如，Ela基因可以在腫瘤特異性啟動子的調節下插入第一代病毒。理論上，將病毒注射到腫瘤後，它能夠特別在腫瘤中而不是在周圍的正常細胞中複製。這種類型的載體可以用於通過裂解直接殺傷腫瘤細胞或送遞"自殺基因"，如單純皰滲病毒胸苷激酶基因(HSV其能夠在更昔洛韋處理後殺傷受感染的細胞和旁MJ田胞。因此，考慮到本發明的HRE構建體可以由於很多實體瘤團塊中存在的低氧條件而在某些腫瘤組織中優先有活性，本發明提供了包含本發明的多核苷酸的載體，所述多核苷酸任選與編碼腺病毒Ela多肽的核酸序列可操作性連接。HRE增強子控制下的Ela多肽僅僅在低氧條件下表達，因此腺病毒僅僅在低氧條件下能夠複製。腺病毒缺乏內源性E1基因，優選也缺乏內源性E3基因。上文描述了可以缺失的腺病毒基因組的其它區域。也可能需要引入低氧反應元件控制下的全部或部分E3基因，使得宿主細胞免疫調節平衡，獲得病毒在腫瘤內的正確傳播和對感染的細胞的免疫應答。僅僅Elb缺陷的腺病毒已經特別用於抗腫瘤治療的1期臨床試驗。Elb編碼的多肽能夠阻斷p53介導的凋亡，防止細胞反應於病毒感染而自身殺傷。因此，在正常非腫瘤細胞中，在缺乏Elb的條件下，病毒不能夠阻斷凋亡，並且因此不能夠產生感染性病毒並傳播。在p53缺陷的胂瘤細胞中，Elb缺陷病毒能夠生長並且傳播到鄰近的p53缺陷腫瘤細胞，而不是正常細胞。再次，這種類型的載體能夠用於送遞治療基因，如HSVA。因此，優選的是本發明的表達Ela的腺病毒缺乏功能性Elb基因。其它必須的病毒基因也可以置於低氧反應性調節元件的控制下。來源於單純皰滲病毒的載體1.病毒抹本發明的HSV載體可以來源於例如HSV1或HSV2抹，或其衍生物，優選HSV1。衍生物包括含有來自於HSV1和HSV2抹的DNA的型間重組體。衍生物優選與HSV1或HSV2基因組具有至少70%序列同源性，更優選具有至少90%,甚至更優選95%同源性。HSV抹在治療程序中的應用將需要對病毒抹進行減毒，使得它們不能建立裂解周期。特別地，如果HSV載體用於人類中的基因治療，多核苷酸應該優選插入必須基因。這是由於如果載體病毒遇到野生型病毒，可以通過重組，發生異源基因向野生型病毒的轉移。但是，只要多核苷酸插入必須基因，這種重組轉移也將去除受體病毒中的必須基因，並且防止異源基因"逃離"到能夠複製的野生型病毒群體中。減毒抹也可以用於產生本發明的HSV抹，在此僅僅是舉例，包括在ICP34.5或ICP27具有突變的4朱，例如1716抹(MacLean"a/.,1991,JGenVirol72:632-639)、R3616和R4009抹(ChouandRoizman,1992,PNAS89:3266-3270)以及R930(Chou"a/.,1994,J.Virol68:8304-8311),它們都在ICP34.5中具有突變，和d27-l(RiceandKmpe,1990，J.Virol64:1704-1715),它在ICP27中具有缺失。或者，缺失ICP4、ICPO、ICP22、ICP6、ICP47、由或gH,在VMW65中具有滅活突變，或具有上述任何組合的病毒抹也可以用於生產本發明的HSV株。用於描述多種HSV基因的術語參見CoffinandLatchman,1996.Herpessimplexvirus-basedvectors.In:LatchmanDS(ed).Geneticmanipulationofthenervoussystem.AcademicPress:London,pp99-114。2.補充細胞系在表達ICP27的細胞系,例如V27細胞(RiceandKmpe,1990,J.Virol64:1704匿1715)或2陽2細胞(SmithWa/.,1992,Virology186:74-86)中增殖ICP27缺陷的HSV病毒。也可以用包含能夠在哺乳動物細胞，例如Vero或BHK細胞中表達的功能性HSVICP27基因的載體，優選質粒載體，和編碼選擇標記，例如新黴素抗性的載體，優選質粒載體，共轉染上述細胞，從而製備表達ICP27的細胞系。然後利用本領域技術人員已知的方法(例如RiceandKnipe,19卯中的描述)，基於支持ICP27—突變HSV株生長的能力，進一步篩選具有選擇標記的克隆，從而確定哪些克隆也表達功能性ICP27。按照上文的描述生產了不允許ICP27-突變HSV抹轉變為具有功能性ICP27的病毒株的細胞系，確保包含功能性ICP27基因的載體不包含與保留在ICP27-突變病毒中的序列重疊(即同源)的序列。當本發明的HSV4朱在其它必須基因中包含滅活4奮飾，如ICP4時，補充細胞系將進一步包含功能性HSV基因，其以上文對ICP27描述的相同方式補充修飾的必須基因。3.突變方法可以通過本領域公知的一些技術使HSV基因變得功能上無活性。例如，可以通過缺失、取代或插入，優選通過缺失，使它們功能上無活性。缺失可以除去部分基因或完整基因。插入的序列可以包括上文描述的表達盒。通過本領域技術人員公知的同源重組方法，在HSV抹中產生突變。例如，與包含側翼於同源HSV序列的突變序列的載體，優選質粒載體一起轉染HSV基因組DNA。突變的序列可以包含缺失、插入或取代，所有這些可以通過常規技術構建。插入可以包含選擇標記基因，例如/Z，用於通過例如|3-半乳糖苷酶活性篩選重組病毒。也可以在其它HSV基因，例如諸如ICP0、ICP4、ICP6、ICP22、ICP47、VMW65、gH或Ww的基因中產生突變。在VMW65基因的情況下，不去除完整基因，因為它編碼必須的結構蛋白，但進行小的滅活插入，其消除VMW65轉錄激活IE基因的能力(AceW,1989,JVirol63:2260-2269)。4.包含本發明的轉基因和miRNA的HSV抹本發明的轉基因和mircoRNA可以在任何位置插入HSV基因組，前提是病毒仍然可以增殖，如果NOI插入必須基因，其可能需要利用攜帶另一HSV必須基因的細胞系(如2.部分的描述)。可以通過HSV抹與例如攜帶側翼於HSV序列的表達盒的質粒的同源重組將本發明的序列插入HSV基因組，所述質粒如上文所述，用於導入突變。可以採用本領域公知的克隆技術，將多核苷酸導入包含HSV序列的合適的質粒載體。其它病毒載體可以用於本發明的其它病毒載體包括腺伴隨病毒、皰滲性口炎病毒、痘苗病毒和基於SV-40的病毒載體。施用miRNA和轉基因可以施用於患者，或用於製備轉基因植物或非人動物。術語"施用"包括通過病毒或非病毒技術送遞。病毒送遞機制包括但不限於上文描述的腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰滲病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體和杆狀病毒載體等。非病毒送遞機制包括脂質介導的轉染、脂質體、免疫脂質體、脂轉染、陽離子表面兩性分子(CFAs)及其組合。疾病通過本發明的載體系統對一種或多種治療基因的送遞可以單獨使用或與其它治療或治療組分組合。例如，本發明的載體可以用於送遞一種或多種用於治療WO-A-98/05635中列出的病症的轉基因。為了容易參考，現在提供該列表的一部分癌症、炎症或炎性疾病、皮力夫病、發熱、心血管作用、出血、凝血和急性期反應、惡病質、食名大減退、急性感染、HIV感染、休克狀態、移植物抗宿主反應、自身免疫病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿司匹林依賴性抗血栓形成；腫瘤生長、^f曼入和傳^番、血管發生、轉移、惡性腫瘤、腹水和惡性胸膜滲出；腦血管缺血、缺血性心臟病、骨關節炎、類風溼關節炎、骨關節炎、哮喘、多發性硬化、神經變性、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、卒中、血管炎、克隆氏病和潰瘍性結腸炎；牙周炎、牙齦炎；牛皮癬、特應性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮鬆解；角膜潰瘍、視網膜病和手術傷口癒合；鼻炎、過敏性結膜炎、溼瘮、過敏；再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內膜異位、動l^》更4匕或內皮石更4匕(endosclerosis)。此外，或替代地，本發明的載體可以用於送遞一種或多種用於治療WO-A-98/07859中列出的病症的轉基因。為了容易參考，現在提供該列表的一部分細胞因子和細胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如，用於治療免疫缺陷，包括人免疫缺陷病毒感染；調節淋巴細胞生長；治療癌症和4艮多自身免疫病，以及防止移植物排斥或誘導腫瘤免疫)；調節造血，如治療骨髓或淋巴疾病；促進骨、軟骨、腱、韌帶和神經組織的生長，例如用於創傷癒合、治療燒傷、潰瘍和牙周病以及神經退化；抑制或激活卵泡刺激激素(調節不育)；趨化/化學動力活性(例如用於動員特定細胞類型到達損傷或感染位點)；止血和溶栓活性(如用於治療血友病和卒中)；抗炎活性(用於治療例如膿毒性休克或克隆氏病)；作為抗微生物劑；例如代謝或行為的調節劑；作為鎮痛劑；治療特定缺陷病症；用於治療例如牛皮癬、用於人或獸醫藥物。此外，或替代地，本發明的逆轉錄病毒載體可以用於送遞一種或多種用於治療WO-A-98/09985中列出的病症的轉基因。為了容易參考，現在提供該列表的一部分巨噬細胞抑制和/或T細胞抑制活性，以及因此產生的抗炎活性；抗免疫活性，即抗細^^和/或體液免疫應答的抑制作用，包括與炎症無關的應答；抑制巨噬細胞和T細胞粘附細胞外基質成分和纖連蛋白的活性，以及上調T細胞中的fas受體表達；抑制不需要的免疫反應和炎症，包括關節炎，包括類風溼關節炎、與過敏相關的炎症、過壽丈反應、哮喘、系統性紅斑狼瘡、月交原疾病和其它自身免疫病、與動脈粥樣硬化、動脈硬化、動脈粥樣硬化性心臟病、缺血再灌注損傷、心臟驟j亭、心力幾梗塞、血管炎性病症、呼吸窘迫症候群或其它心肺疾病相關的炎症、與胃潰瘍、潰瘍性結腸炎和其它胃腸道疾病、肝纖維化、肝硬化或其它肝臟疾病相關的炎症、曱狀腺炎或其它腺體疾病、腎小球腎炎或其它腎和泌尿疾病、耳炎或其它耳鼻喉科疾病、皮炎或其它皮膚病、牙周病或其它牙科疾病、睪丸炎或附睪-睪丸炎、不育、睪丸創傷或其它免疫相關睪丸疾病、胎盤功能障礙、胎盤不全、習慣性流產、驚厥、驚厥前狀況或其它免疫和/或炎症相關婦科疾病、後葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、前葡萄膜炎、結膜炎、脈絡視網膜炎、葡萄膜視網膜炎、—見神經炎、眼內炎症，如視網膜炎或嚢樣黃斑水肺、交感神經性眼炎、鞏膜炎、色素性視網膜炎、退化性顏色疾病的免疫和炎症部分、眼腫瘤的炎症部分、感染導致的眼炎、增生性玻璃體-視網膜病、急性缺血性視神經病、斑痕過量，如青光眼過濾手術後的斑痕過量、抗眼移植物的免疫和/或炎症反應和其它免疫和炎症相關眼病、中樞神經系統(CNS)或任何其它器官中從免疫和/或炎症抑制獲益的與自身免疫疾病或狀況或病症相關的炎症、帕金森病、帕金森病治療導致的併發症和/或副作用、愛滋病相關痴呆合併HIV相關腦病、Devic病、小舞蹈病、阿爾茨海默病和CNS的其它變性疾病、狀況或病症、卒中的炎症部分、脊髓灰質炎後症候群、精神病的免疫和炎症部分、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化性全腦炎、腦脊髓炎、急性神經病、亞急性神經病、慢性神經病、Gmllaim-Barre症候群、小舞蹈病、重症"幾無力、假腦瘤、唐氏症候群、亨廷頓病、力幾萎縮性側索硬化、CNS壓縮損傷或CNS創傷或CNS感染的炎症部分、肌萎縮和營養不良的炎症部分、以及中樞和周圍神經系統的免疫和炎症相關疾病、狀況或病症、創傷後炎症、膿毒性休克、傳染病、手術的炎症合併症或副作用、骨髓移植或其它移植合併症和/或副作用、例如由於病毒載體感染導致的基因治療的炎症和/或免疫合併症和副作用、或與愛滋病相關的炎症、用於阻抑或抑制體液和/或細胞免疫應答、用於通過減少單核細胞或淋巴細胞的量治療或改善單核細胞或白血病增生性疾病例如白血病、用於預防和/或治療天然或人工細胞、組織和器官，如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人工皮膚移植情況下的移植物排斥。本發明也提供了用於通過基因療法治療個體的藥物組合物，其中該組合物包含治療有效量的本發明的載體或由其製備或獲得的病毒顆粒，所述載體包含一種或多種可送遞的治療性和/或診斷性轉基因。所述藥物組合物可以用於人或動物。典型地，醫生確定最適於個體受試者的實際劑量，該劑量隨著特定個體的年齡、體重和反應而改變。組合物可以任選包含藥學可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑。可以才艮據預期的施用途徑和標準藥學實踐選藥學載體、賦形劑或稀釋劑。藥物組合物可以包含以下成分作為載體、賦形劑或稀釋劑，或除載體、賦形劑或稀釋劑還包含以下成分任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑和其它可以輔助或增加病毒進入靶位點的載體試劑(例如脂質送遞系統)。合適的時候，可以通過以下方式中的一種或多種方式施用藥物組合物吸入，以栓劑或陰道栓形式，以洗液、溶液、霜、油膏或爽身粉形式表面施用，採用皮膚貼片，以含有賦形劑如澱粉或乳糖的片劑形式，或以單獨存在或與賦形劑混合的膠嚢或珠形式、或以含有調味劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮液形式口服，或它們可以腸胃外注射，例如海綿體內注射、靜脈內注射、肌內注射或皮下注射。對於腹膜內施用，組合物最好以含有使溶液與血液等滲的其它物質，如足夠的鹽或單糖的無菌水溶液形式使用。對於經頰或舌下施用，組合物可以以常規方式製劑化的片劑或錠劑形式施用。通過本發明的載體系統對一種或多種治療基因的送遞可以單獨使用，或與其它治療或治療成分組合。可以治療的疾病包括-f旦不限於癌症、神經系統疾病、遺傳疾病、心臟病、卒中、關節炎、病毒感染和免疫系統的疾病。合適的治療性基因包括編碼腫瘤阻抑蛋白、酶、前藥激活酶、免疫調節分子、抗體、工程化的免疫球蛋白樣分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、細胞因子、趨化因子、抗病毒蛋白、反義RNA和核酶的基因。實施例質粒構建從miRNA庫獲得本文採用的所有miRNAs的序列(Griffiths-Jonesetal.,2006)(http:〃www,sanger.ac.uk/Software/Rfam/miRNA/index.shtml)。按照下文構建miRNA革巴(mirT)序列對於4x.mir-142-3p.耙(mir-142-3pT),使以下寡核苷酸退火AAAGTAGGAAACACTACAACCGGT(SI)ATGGAGTCGACT(ASl)，5，CACTACAC(S2),TACTTTATGGAACCGGT(AS2)。連接這些寡核普酸，產生具有Xbal和Xhol粘端的雙鏈RNA片段'加下劃線的序列設計為與特定miRNA完全互補。將退火的寡核苷酸亞克隆到pBluescriptII.KS的Xbal和Xhol位點。隨後用SacII和Kpnl、Nhel和Agel、或Sail消化得到的載體，並且分離mirT片段，用於連接到接受載體的合適位點中pCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE，得到pCCL.sin.cPPT.PGK.GFRWPRE.mirTpCCL.sin.cPPT.PGKas.GFPas.CTEas.polyAas,得到pCCL.sin.cPPT.PGKas.GFPas.mirTas.CTEas.polyAaspCCL.sin.cPPT.PGK.△LNGFR.WPRE,得到pCCL.sin.cPPT.PGK.△LNGFR.mirT.WPREpRRL.sin.cPPT.CMVhFIX.WPRE,得到pRRL.sin.cPPT.CMVhFIX.WPRE.mirT。pRRL.sin.cPPTET.hFIX.WPRE,得到pRRL.sin.cPPT.ET.hFIX.WPRE.mirT。Wpre。用MarlingenBiosciences不含內毒素的高純度質粒最大製備系統，進行大規才莫DNA製備。載體製備和滴定通過瞬時四質粒共轉染到293T細胞，製備VSV假型化的第三代LVs,並且按照上文通過超速離心純化(DePalmaandNaldmi,2002)。通過有限稀釋在293T細胞上估計GFP的表達滴度。通過HIV-1gagp24抗原免疫捕獲測量載體顆粒(NENLifeScienceProducts)。對於所有載體，濃縮的載體表達滴度範圍是0.15-1.5xlO"轉導單位，T(TU)/ml。細胞培養物在補充了10。/。胎牛血清(FBS;Gibco)以及青黴素-鏈黴素和穀氨醯胺的組合的Iscove修飾的Dulbecco培養基(IMDM;Sigma)中維持293T細胞。在按照上文補充的RPMI(完全RPMI)中維持U937單核細胞系。按照以前的描述從外周血分離人樹突細胞的原代培養物，並且在補充GM-CSF和IL-4的完全RPMI中維持(Benderetal.,1996)。DNA和RNA提取才艮據製造商的說明書，採用"血液和細胞培養物DNAMidi試劑盒"(Qiagen,Hilden，Germany)提取來自細胞和組織的DNA。根據製造商的說明書，採用"Tri試劑，，(Sigma，SaintLouis，Missoun)提取來自細胞的RNA。RNA印跡才妄照以前的描述進4亍RNA印跡(DePalmaandNaldini,2002)。加入20微克總RNA,並且採用lOOng32P標記的GFP探針。載體拷貝數定量從提取自小鼠組織的100ng模板DNA或提取自細胞系的200ng才莫板DNA開始，通過實時PCR對載體C/G進行定量。用於分析的引物和探:4十組如下LV主鏈750nmol正向引物(F):5，TGAAAGCGAAAGGGAAACCA3，，200nmo1反向引物(R):5，-CCGTGCGCGCTTCAG-3',200nmo1探針(P):5，-VIC-CTCTCTCGACGCAGGACT-MGB-3，；鼠基因組DNA:(3-月幾動蛋白300nmo1F:5'—AGAGGGAAATCGTGCGTGAC—3',750nmolR:5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3',200nmo1P:5，-VIC-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-MGB-3';人基因組DNA:hTERT:200nmo1F:5'-GGCACACGTGGCTTTTCG-3',600nmolR:5'-GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA-3',200nmo1P:5'-6FAM-TCAGGACGTCGAGTGGACACGGTG-TAMRA-3，。對於標準曲線，採用了來自具有已知數目的LV整合(通過DNA印跡確定)的轉基因小鼠或人細胞系的DNA的系列稀釋液。在ABIPrism7900HT序列才全測系統(AppliedBiosystems)中以三次重複進4亍反應。如下計算C/G:(ngLV/ng內源性DNA)X(標準曲線中LV整合的n。)。基因表達分析用RT-PCR的SuperscriptIII第一鏈合成系統(Invitrogen,Carlsbad,CA)的隨機六聚體方案，在2jag總RNA上進行逆轉錄。進行了定量PCR分析，以便對GFPmRNA濃度進行定量，將GAPDH表達用於標準化。採用了兩組引物和探針只于于GFP,3姿需進4亍20次觀'J定(AppliedBiosystems),F:5'-CAGCTCGCCGACCACTA-3',R:5'-GGGCCGTCGCCGAT-3'和P:5'-6FAM-CCAGCAGAACACCCCC-MGB-3',對於GAPDH:200nmolF:5-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3，，900nmo1R:5'-GGCCATCACGCCACAGSTT-3'和200nmo1P:5'-TET-CCACCCAGAAGACTGTGGATGGCC-TAMRA-3，。在ABIPrism7900HT序列檢測系統(AppliedBiosystems)中以三次重複進行反應。miRNA表達分析根據製造商的說明書，用AppliedBiosystemsTaqman微RNA測定系統進行miRNA檢測。針對has-mir-16對結果進行標準化，並且將let-7a用作才交準物。相對於let-7a的表達才艮道數值。流式細胞術在FACS分碎斤前至少4吏轉導的293T細胞生長14天，達到穩態GFP表達，並且排除假轉導。FACS前，用0.05yo胰蛋白酶-EDTA分離貼壁的細胞，洗滌並且重懸於含有2%FBS的PBS。洗滌懸浮液中生長的細胞，重懸於含有2%FBS的OBS中。為了進行免疫染色，4。C下在PBS，5%人血清，2%FBS中阻斷105個細胞15分鐘。阻斷後，加入R-藻紅素(RPE)綴合的抗體(抗-ALNGFR或抗-CD45，BDPharmingen,SanDiego,CA),4。C下將細胞溫育30分鐘，洗滌，並且在BeckmanCoulterCytomicsFC500(BeckmanCouler,Miami,FL)上通過兩色流式細胞術進行分析。體內載體施用從CharlesRiversLaboratories(Milan,Italy)購買6-8周齡的棵鼠和Balb/c小鼠，保持在無特異性病原體的條件下。從SalkInstitute(LaJolla,CA)獲得B型血友病(凝血因子IX敲除)小鼠，繁殖，並且保持在無特異性病原體的條件下。通過對小鼠的尾靜脈注射，進行載體施用。根據HospitalSanRaffaele機構動物管理和使用委員會的方案進行所有動物操作。轉基因3妄照以前的描述(Loisetal.,2002)用LVs製備轉基因小鼠。簡言之，用懷孕的母馬血清和人絨毛膜促性腺激素的組合使雌性FVB小鼠超數排卵。每隻雌鼠收集平均20-30個胚胎，在同一天用10x100pi5xlO7TU/mlLV原種微量注射到卵周隙中。立即將操作的胚胎植入假孕CD1小鼠的輸卵管中。通過PCR對幼鼠進行基因型分析，以分析GFP序列的存在。繁殖陽性小鼠，以測試轉基因的種系傳遞。從尾部提取DNA,用於在建立者小鼠和Fl孕鼠中通過實時PCR對載體拷貝數進行定量。免疫組化對於免疫螢光，在4%低聚甲醛中固定組織，4°120天，圖7a、b)。形態分4斤表明10-20。/o的肝細胞是GFP+(r^10)，並且，重要的是，陽性細胞的頻率保持穩定。載體C/Gs最初對於所有的處理組都是相似的，但到第14天，它們在LV.PGK.GFP和LV.ALB.GFP小鼠中迅速減少，並且在LVPGK.GFP.142-3pT處理的動物中保持在容易檢測的水平。在最長的隨訪中觀察到了C/G的緩慢減少，但這種減少不與GFP+肝細胞中的減少相符，很可能是由於正常造血細胞更新過程中轉導的K叩ffer細胞的更替。儘管在肝中有廣泛GFP表達，我們沒有檢測到任何GFP+Kupffer細胞。此外，儘管我們確實觀察到脾邊緣區中的GFP+網狀成纖維細胞，但在造血系細胞中沒有檢測到轉基因表達。與持續的GFP表達一致，我們沒有觀察到肝中的顯著CD8+浸潤或病理指徵(圖7c)。作為我們的方法在建立長期轉基因表達中的用途的進一步證明，我們利用我們的系統治療B型血友病。B型血友病小鼠完全缺乏凝血FIX，並且因此具有<1%的正常凝血活性。此外，由於它們天然不表達FIX，他們在引入FIX抗原後高度容易發生抗FIX免疫。為了避開這種問題，很多研究組，包括我們，構建了肝細胞特異性FIX表達載體，以便防止APCs中的基因表達，並且避免引入抗FIX免疫(Brownetal.,2004a;Brownetal.,2004b;Follenzietal.,2004;Mingozzietal.,2003)。但是，如圖8中所示，肝細胞特異性LV.ET.hFIX載體在靜脈內施用後不能提供在B型血友病小鼠中的長期FIX表達。相反，在FIX表達盒的3，UTR中含有mir-142-3pT序列的LV.ET.hFIX.142-3pT載體的注射，導致長期FIX表達，並且保留〉40%正常水平的凝血活性。總體上，這些結果表明，利用miRNA調節的LV,在具有免疫能力的小鼠中可以成功建立細胞內或細胞外的新抗原的高水平穩定表達，並且甚至可以用於4交正該疾病的表型，如在B細I包血友病小鼠中所i正實的。在此我們描述了第一種病毒基因轉移系統，其利用內源性miRNA機制進行轉基因調節。通過使用LV介導的送遞，體內基因轉移是可能的，因此，我們提供了成年哺乳動物內miRNA活性的第一批原位數據中的一些。類似於在4氐等後生動物中的研究(Brenneckeetal.,2005;Reinhartetal.,2000),我們觀察到miRNA調節非常有效。在轉基因小鼠以及靜脈內施用LV的小鼠中，我們觀察到了所有造血細胞中的一致的mir-142-3p活性。通過在轉基因中加入mir-142-3pT序列，在造血細胞系中存在轉基因表達的高至100倍的減少，對非造血細胞中的表達沒有影響。在我們的系統中，內源性miRNA調節提供了用於防止載體在造血細胞系的細胞中表達，以及利用肝細胞特異性白蛋白啟動子的更好手段。這最可能發生，因為轉錄後調節可以克服由於插入的位置效應和/或組織特異性啟動子的不完美重建導致的脫靶表達。這種現象可能類似於提出的miRNA調節的天然功能之一，其防止以以前的細胞狀態轉錄或由於滲漏表達導致的mRNAs的翻譯(BartelandChen,2004;Farhetal.，2005)。因此，在載體中摻入miRNA調節，可以提供對轉基因表達的一層重要控制，無論使用普遍存在的啟動子還是與組織特異性轉錄元件組合。通過使用miRNA調節從造血細胞系解除轉基因表達的靶定，我們能夠防止免疫介導的載體清除，並且能夠進行基因轉移，從而克服臨床基因治療的最顯著障礙之一(Thomasetal.，2003)。特別相關的是，我們證明了該方法對細胞內和細胞外循環抗原的用途。採用該miRNA調節策略，我們能夠實現穩定和高水平的B型小鼠凝血表型校正。據我們所知，這是第一次證明利用內源性miRNA調節的治療用途。本文描述的研究也首次提供了證據，證明miRNA介導的調節是用於基本消除強的組成型活性載體啟動子的表達，或甚至改進組織特異性啟動子的性能的強和高度有效手段。總體上，從該研究可以明確，miRNAs可以提供有力的途徑來調節轉基因，並且通過利用該複雜網絡，我們開闢了載體設計的新規範，其對於治療性基因轉移具有重要意義。通過我們的允許組合mirT排列的方法，可以建立多種體外或體內用於基因治療或用於動物轉基因的基因送遞構建體，以實現精密的基因表達模式，包括趨異調節兩種不同轉基因的能力。由於我們繼續發現新的組織特異性和發育及腫瘤特異性miRNAs,可以構建條件性反應於生長或分化，甚至是腫瘤發生的載體。在此引入本文件中提到的每個申請和專利，以及在上述每一申請和專利，包括在上述每一申請和專利的審查過程中("申請引用的文件")引用或參考的每篇文件，以及在每一申請和專利中和在任何申請引用的文件中引用或提到的製造商說明書或目錄作為參考。此外，在此引入在本文中引用的所有文件，和在本文中引用的文件中引用或參考的文件，和本文中引用或提到的任何產品的任何製造商說明書或目錄作為參考。對本發明描述的方法和系統的各種修飾和改變將是本領域技術人員能夠理解的，而不背離本發明的範圍和精神。儘管聯繫特定的優選實施方案描述了本發明，應該理解，要求保護的本發明不應過度限制為所述特定實施方案。實際上，對於描述的實施本發明的方式的各種權利要求的範圍內。y'，''''參考文獻Amendola,M.,Venneri,M.A.，Biffi,A.,Vigna,E.，andNaldini,L.(2005).Coordinatedual-genetransgenesisbylentiviralvectorscarryingsyntheticbidirectionalpromoters.NatBiotechnol23,108-116.Barad，O.,Meiri,E.,Avniel,A.,Aharonov,R.，Barzilai,A.,Bentwich，I.,Einav,U.,Gilad,S.，Hurban,P.,Karov,Y.，"a/.(2004).M扁RNAexpressiondetectedbyoligonucleotidemicroarrays:systemestablishmentandexpressionprofilinginhumantissues.GenomeRes",2486-2494.Bartel，D.P.,andChen,C.Z.(2004).Micromanagersofgeneexpression:thepotentiallywidespreadinfluenceofmetazoanmicroRNAs.NatRevGenet5,396-400.Baskerville，S.,andBartel,D.P.(2005).MicroarrayprofilingofmicroRNAsrevealsfrequentcoexpressionwithneighboringmiRNAsandhostgenes.Rna",241-247.Bender,A.,Sapp,ML,Schuler,G.,Steinman，R.M.,andBhardwaj,N.(1996).Improvedmethodsforthegenerationofdendriticcellsfromnonproliferatingprogenitorsinhumanblood.JImmunolMethods79(5,121-135.Bre騰cke，J.,Stark,A.,Russell,R.B.,andCohen，S.M.(2005).PrinciplesofmicroRNA-targetrecognition.PLoSBiol3，e85.Brown,B.D.,andLillicrap,D.(2002).Dangerousliaisons:theroleof"danger"signalsintheimmuneresponsetogenetherapy.Blood700,1133-1140.Brown，B.D.,Shi,C.X.,Powell,S.，Hurlbut,D.,Graham,F.L.，andLillicrap,D.(2004a).Helper-dependentadenoviralvectorsmediatetherapeuticfactorVIIIexpressionforseveralmonthswithminimalaccompanyingtoxicityinacaninemodelofseverehemophiliaA.Blood肌804-810.Brown,B.D.,Shi,C.X.,Rawle,F.E.,Tmlin，S.,McKi謂n，A.,Hough,C.,Graham,F.L.，andLillicrap，D.(2004b).Factorsinfluencingtherapeuticefficacyandthehostimmuneresponsetohelper-dependentadenoviralgenetherapyinhemophiliaAmice.JThrombHaemost2，111-118.Calin,G.A.，Liu，C.G.,Sevignam,C.,Ferracin,M.，Felli,N.,Dumitru,C.D.,Shimizu,M.,Cimmino，A.,Zupo，S.，Dono,M.，a/.(2004a).MicroRNAprofilingrevealsdistinctsignaturesinBcellchroniclymphocyticleukemias.ProcNatlAcadSciUSA,11755-11760.Calin,G.A.,Sevignani,C.,Dumitru,C.D.,Hyslop,T.，Noch,E.,Yendamuri,S.,Shimizu,M.,Rattan,S.，Bullrich,F.,Negrmi,M.,andCroce,C.M.(2004b).HumanmicroRNAgenesarefrequentlylocatedatfragilesitesandgenomicregionsinvolvedincancers.ProcNatlAcadSciUSA/0/,2999-3004.Chen,C.Z.,Li,L.,Lodish,H.F.,andBartel,D.P.(2004).MicroRNAsmodulatehematopoieticlineagedifferentiation.Science鄧3,83-86.Chen,C.Z.，andLodish,H.F.(2005).MicroRNAsasregulatorsofmammalianhematopoiesis.SeminImmunol/7,155-165.DeGeest,B.R.,VanLinthout,S.A.,andCollen,D.(2003).Humoralimmuneresponseinmiceagainstacirculatingantigeninducedbyadenoviraltransferisstrictlydependentonexpressioninantigen-presentingcells.Blood2551-2556.DePalma,M.，Montini,E.，deSio,F.R.，Benedicenti,F.,Gentile,A.,Medico,E.,andNaldini,L.(2005).PromotertrappingrevealssignificantdifferencesinintegrationsiteselectionbetweenMLVandHIVvectorsinprimaryhematopoieticcells.Blood705,2307-2315.DePalma,M.,andNaldini,L.(2002).Transductionofageneexpressioncassetteusingadvancedgenerationlentiviralvectors.MethodsEnzymol346,514-529.Doench,J.G.,Petersen,C.R,andSharp,P.A.(2003).siRNAscanfunctionasm涯As.GenesDev/7,438-442.Farh,K.K.,Grimson,A.,Jan，C,，Lewis,BR,Johnston,W.K.，Lim,L.P.,Burge,C.B.,andBattel,D.P.(2005》ThewidespreadimpactofmammalianMicroRNAsonmRNArepressionandevolution.Science3/0,1817-1821.Follenzi,A.,Battaglia,M.,Lombardo,A.,Annoni，A.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