配對末端測序的製作方法

2023-08-14 01:42:11 2

專利名稱：：配對末端測序的製作方法
技術領域：
：本發明涉及核酸測序、基因組測序以及測序結果組裝成連續序列的領域。
背景技術：
：一種測序大的目標核酸(如人基因組)的方法是使用鳥槍法測序。在鳥槍法測序中，目標核酸被片段化或亞克隆，以產生一系列重疊的核酸片段，並測定這些片段的序列。基於各個片段的序列的重疊和信息，可構建目標核酸的完整序列。鳥槍法測序的一個缺點是，如果目標核酸序列包含眾多小重複片段(串聯重複或反向重複)，則組裝可能很難。沒有在重複區中組裝基因組序列的能力導致在組裝序列中出現空位。因此，在核酸序列的初始組裝後，序列範圍中的空位必須要填補，組裝中的不確定性必須要解決。一種解決這些空位的方法是使用較大的克隆或片段進行測序，因為這些較大片段應長得足以覆蓋重複區。但是，在目前的測序裝置中大核酸片段的測序更難且更耗時。另一種覆蓋序列中空位的方法是測定大片段的兩個末端的序列。與鳥槍法測序片段一個末端的單個讀出序列相比，兩個末端的一對讀出序列具有已知的間距和方向。使用相對長的片段還有助於組裝#布重複元件的序列。該類型的方法(Smith,M.W.等，NatureGenetics7:40-47(1994))在本領域被稱為配對末端測序。本發明包括可用於配對-末端測序法和其它核酸技術的新方法、系統和組合物。發明筒述本發明的一個實施方案涉及一種獲得DNA構建物的方法，所述DNA構建物包含目標核酸的兩個末端區域，所述目標核酸可為生物基因組的大節段。所述方法包括以下步驟(a)片段化大核酸分子，以產生目標核酸；(b)將捕捉元件連接至目標核酸，以形成第一環形核酸分子；(c)用切割目標核酸但不切割捕捉元件的限制性內切核酸酶消化第一環形核酸，以產生含目標核酸的兩個末端的線性核酸，所述兩個末端由捕:R元件分隔；(d)將線性核酸與分隔元件連接，以形成第二環形核酸；(e)將第二環形核酸轉變為環形單鏈核酸；(f)使第一寡核苷酸與環形單鏈核酸退火，並通過滾環擴增來擴增環形單鏈核酸，以產生單鏈滾環擴增產物；(g)使第二寡核苷酸與單鏈滾環擴增產物退火，以在單鏈滾環擴增產物中形成多個雙鏈區；和(h)使用切割多個雙鏈區的限制性內切核酸酶將單鏈滾環擴增產物消化為小片段，以產生含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物。本發明的另一個實施方案涉及獲得含目標核酸兩個末端區的DNA構建物的第二種方法。所述方法包括以下步驟(a)片段化大核酸分子，以產生目標核酸；(b)將連接物連接至目標核酸的每個末端；(c)將特徵標籤連接至目標核酸，以形成環形核酸分子；(d)用切割目標核酸但不切割連接物或特徵標籤的限制性內切核酸酶消化環形核酸，以產生含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物。本發明方法可對大量目標DNA片段同時實施，以產生含大DNA片段末端的DNA構建物文庫。本發明的一個優勢在於可體外構建文庫，無需使用原核或真核宿主細胞。這些和其它實施方案由以下詳述^^開，或者由以下的詳述顯而易見，並由以下詳述包含。附圖簡述以下詳述以實施例給出，但無意將本發明限於所述具體實施方案，此詳述可連同附圖一起理解，這些附圖通過引用結合到本文中，其中圖1圖示了配對末端測序策略的一個實施方案的示意圖。數字標註表示核酸起點。"101"表示捕^t足元件的一個側翼區，例如顯示在圖3A的左側。"102"表示捕才足元件的第二個側翼區，例如顯示在圖3A的右側。"103"表示捕捉元件。"104"表示片段化的(以及任選按大小分級分離的)起始核酸。"105"表示分隔元件。"106"表示聚圖2圖示了配對末端測序策略的第二個實施方案的示意圖。圖3圖示了捕捉片段的序列和設計。序列的標識如下配對末端捕捉片段產物寡核苷酸1寡核苷酸2寡核苷酸3SEQIDNO:lSEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7SEQIDNO:8寡核苷酸4配對末端捕捉片段產物(IIS型，Mmel)短連接物配對末端捕捉片段短連接物配對末端捕捉片段(IIS型，Mmel)圖4圖示了RE片段的一個實施方案。圖5圖示了RE片段的另一個實施方案。圖6圖示了使用髮夾連接物的配對末端讀出方法。髮夾連接物具有以下序列AA/\AAACCCG——-GAATTC——AAACCCTTTCGGT——TCCAAC-3'〇HT/TTTGGGC---CTTAAG——TTTGGGAAAGCCA—-AGGTTG-5'P04T(SEQIDNO:27)髮夾連接物是一個連續的核酸序列，其圖示被分隔為以上的4個區。4個區由左至右為髮夾區、限制性內切核酸酶識別位點、生物素化區和IIS型限制性內切核酸酶識別位點。"601"表示髮夾連接物。"603"表示基因組DNA。Met表示曱基化DNA。"602"表示髮夾連接物二聚體。"604"表示由限制性內切核酸酶切割的髮夾連接物。"605"表示由限制性內切核酸酶切割並再連接的兩個髮夾連接物。SA表示鏈黴抗生物素蛋白珠。Bio表示生物素(例如生物素化DNA)。圖7圖示了配對末端方法的改進。圖8圖示了採用突出端連接物的配對末端讀出法。圖9圖示了"標記觸發的"雙末端測序，其是一種測序本發明產物的方法。圖10圖示了連接物相接的環化。圖11圖示了基於ssDNA的環化。圖12圖示了配對末端測序策略的另一個實施方案一配對讀出序列PET隨機片段化的示意圖。SPRI指固相可逆的固定化。圖13圖示了測序大腸桿菌K12得到的配對-讀出序列PET隨機片段化測序數據。圖14圖示了由大腸桿菌內切核酸酶V進行雙鏈DNA切割的各種方法。加框的核苷酸T，代表脫氧肌苷。圖14A圖示了一種方法，其中，雙鏈DNA的核苦酸序列以產生3'單鏈回文突出端的方式引導大腸桿菌內切核酸酶V的雙鏈切割。注意，3'單鏈突出端含脫氧肌苷殘基。圖14B圖示了一種方法，其中，雙鏈DNA的核芬酸序列以產生3'單鏈非回文突出端的方式引導大腸桿菌內切核酸酶V的雙鏈切割。注意，3'單鏈突出端含脫氧肌苷殘基。圖14C圖示了一種方法，其中，雙鏈DNA的核香酸序列以產生5'單鏈回文突出端的方式引導大腸桿菌內切核酸酶V的雙鏈切割。注意，5'單鏈突出端不含脫氧肌苷殘基。圖]4D圖示了一種方法，其中，雙鏈DNA的核苷酸序列以產生5'單鏈非回文突出端的方式引導大腸桿菌內切核酸酶V的雙鏈切割。注意，5'單鏈突出端不含脫氧月幾苷殘基。圖4E圖示了一種方法，其中，雙鏈DNA的核苷酸序列以產生平端的方式引導大腸桿菌內切核酸酶V的雙鏈切割。圖15圖示了配對末端測序策略的另一個實施方案的示意圖，其採用大腸桿菌內切核酸酶V雙鏈切割在相反鏈上含脫氧肌苷的髮夾連接物(脫氧肌苦髮夾連接物)。圖16圖示了使用示於圖15的脫氧肌苷髮夾連接物法測序大腸桿菌Kl2基因組DNA獲得的配對-讀出序列距離的分布。圖17圖示了本發明的配^寸末端測序法的另一個實施方案的示意圖。髮夾連接物、配對末端連接物("A"和"B")以及PCR引物"F-PCR"和"R-PCR"的核普酸序列示於圖18。各個配對末端連接物都具有如圖18所示的雙鏈和單鏈部分。"Bio"表示生物素。"Met"表示甲基化鹼基。"SA-珠"表示鏈黴抗生物素蛋白包被的微粒。"EcoRT和"MmeI"分別表示限制性內切核酸酶EcoRI和Mmel的識別位點。圖18圖示了示於圖17的連接物和引物寡核苷酸的核苷酸序列和修飾。圖18A圖示了髮夾連接物序列。"iBiodT"表示內部生物素標記的脫氧胸腺嘧啶。"Bio"表示生物素。"EcoRI"和"MmeI"分別表示限制性內切核酸酶EcoRI和Mmel的識別位點。圖18B圖示了配對末端連接物和PCR引物核苷酸序列。各個配對末端連接物("A"和"B")通過退火兩個單鏈寡核苷酸"Atop"和"Abottom"、"Btop"和"Bbottom"產生。示於圖18B的多核苷酸序列的5'末端未被磷酸化。圖19圖示了用於在油包水乳液中進行多核苷酸連接的方法的一個實施方案的示意圖。圖20圖示了在有或沒有舍MmeI-位點的載體DNA的情況下，通過獲得的配對末端測序數據實現的大腸桿菌K12基因組DNA的覆蓋深度。發明詳述除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都與本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義相同。儘管可使用與本文描述的方法和材料相似或等價的眾多方法和材料來實施本發明，但本文描述了優選的材料和方法。本發明涉及一種分離和測序核酸大片段的兩個末端的快速且節約成本的方法。該方法快速且能自動化，使得可以對DNA大片段進行測序和連接。與常規逐克隆鳥槍測序相比，配對末端測序保留了眾多重要優勢，實際上與常規逐克隆鳥槍測序互補。這些優勢中最重要的是即便在基因組插入重複元件時也快速產生大基因組骨架的能力。本發明方法可用於產生DNA片段文庫，其中所述片段包含較大DNA片段的末端。第一種方法在一個實施方案中，配對末端測序可以下列步驟實施步驟1A起始材料可為任意核酸，包括例如基因組DNA、cDNA、RNA、PCR產物、附加體等。儘管本發明方法對長序列段的核酸起始材料特別有效，但本發明也可應用於小核酸，例如粘粒、質粒、小PCR產物、線粒體DNA等。DNA可來自任意來源。例如，DNA可來自其DNA序列未知或不完全已知的生物的基因組。作為另一個實例，DNA可來自其DNA序列已知的生物的基因組。測序已知基因組的DNA使研究者可以搜集基因組多態性的數據以及關:tt因型與疾病。核酸起始材料可為已知大小或已知大小範圍。例如，起始材料可為平均插入大小和分布已知的cDNA文庫或基因組文庫。或者，核酸起始材料可通過眾多常用方法中的任一種片段化(圖1A)，所述方法包括霧化、超聲、HydroShear、超聲片段化、酶切(例如DNA酶處理，包括限制性DNA酶處理、RNA酶處理(包括限制性RNA酶處理)和用限制性內切核酸酶消化)、預片段化文庫(例如在cDNA文庫中)和化學(例如NaOH)誘導片段化、熱誘導片段化和轉座子介導的突變一其可在整個DNA樣品中導入切割位點，例如限制性內切核酸酶剪切位點。參見GoryshinI.Y.和ReznikoffW.S.,JBiolChem.1998年3月27日；273(13):7367-74;ReznikoffW.S.等，MethodsMolBiol.2004;260:83-96;OscarR.等，JournalofBacteriology,2001年4月，2384-2388頁，183巻，第7期；Pelicic,V.等，JournalofBacteriology,2000年10月，5391-5398頁，182巻。諸如霧化的一些片段化方法可產生大小僅相差2倍的目標DNA片段群。其它片段化方法如限制酶消化產生大範圍的片段。如果期望大核酸片段，則可能偏向於諸如HydroShearing的其它方法。在HydroShearing(GenomicSolutions,AnnArbor,Mich.,USA)中,溶液中的DNA通過具有突然縮小的管。在其接近縮小處時，流體加速，以保持體積流速通過豐交'J、面積的縮小處。在此加速過程中，戈力拉伸DNA，直至其突然折斷。DNA片段化，直至片段對剪切力來說太小以至於不能斷裂化學鍵。流體的流速和縮小處的大小決定了最終的DNA片段大小。其它製備核酸起始材料的方法可見於國際專利申請號WO04/070007,該專利申請通過引用整體結合到本文中。根據使用的片段化方法，DNA末斷可能需要精修(pohshing)。即，雙鏈DNA末端可能需要處理，以使其平端化，並適於連接。該步驟將根據片段化方法以本領域已知的方式改變。例如，可使用Bal31精修機械剪切的DNA,以剪切序列突出端，並可使用聚合酶如klenow、T4聚合酶和dNTP填平，以產生平端。步驟IB當片段大小的變化超出預期時，可分級分離核酸片段，以減小此尺度變化。大小分級分離是可通過眾多本領域已知方法實施的任選步驟。用於大小分級分離的方法包括凝l交方法，例如脈沖凝膠電泳，通過蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降，以及大小排阻層析(凝膠滲透層析)。選定大小範圍的選擇將基於配對末端測序覆蓋的區域長度。一種用於大小分級分離的優選技術是凝膠電泳(參見圖1B)。在一個優選實施方案中，大小分級分離的DNA片段具有彼此在25%以內的大小分布。例如，5Kb大小分級分離應包含為5Kb±1kb(即4Kb-6Kb)的片段，50Kb大小分級分離應包含為50Kb±10kb(即40Kb-60Kb)的片l爻。步驟1C在該步驟中，製備"捕捉元件"。捕捉元件是線性雙鏈核酸一其可具有用於連接前一步驟的核酸片段的單鏈末端或雙鏈末端。"捕捉元件，，可作為含正向和反向連接物末端(作為圓環的粗區示於圖1C)的環形核酸(例如示於圖1C的質粒)擴增。該環形質粒可在使用捕捉元件前被切割。這些連接物末端包含在隨後步驟中可用作潛在PCR引物和測序引物的雜交位點的核酸序列。捕捉元件可在兩個連接物末端之間包含額外的元件，例如限制性內切核酸酶識別位點和/或切割位點、抗生素抗性標記、原核或真核複製起點或這些元件的組合。這些抗生素抗性標記的實例包括但不限於賦予對氨苄青黴素、四環素、新黴素、卡那黴素、鏈黴素、博來黴素、zeocin、氯黴素等抗性的基因。原核複製起點可包括OriC和OriV等。真核複製起點可包括自主複製序列(ARS)，包括但不限於這些序列。另外，捕才足元件可包含限制性內切核酸酶識別和/或切割位點(例如優選獨特的和稀有的位點)，它們可用於將隨後的核酸產物(步驟L)消化為可擴增(通過PCR)小片段。捕捉元件還可包含標記或標籤，例如生物素，用於容易地純化或富集配對末端測序用核酸。步驟1D使用已知技術，例如限制性內切核酸酶消化(平端或粘性末端可用於不同片段的製備；參見下文和圖ID),線性化捕捉元件。為防止串聯體形成(即多個捕捉元件的;f皮此連接)，可用用於TA克隆的拓樸異構酶去磷酸化或修飾捕捉元件。步驟IE將捕捉元件連接至步驟A或B的片段(或大小分級分離片段)，以形成含一個捕捉元件和一個目標DNA片段的環形核酸(圖1E)。捕捉元件和目標DNA通過眾所周知的方法相接，例如通過DNA連接酶連接或通過拓樸異構酶克隆策略連接。步驟IF前一步驟的結果產生一群連接至可相當大的DNA片段的捕捉元件。本步驟用於去除目標DNA片段的大的內區，以產生大小可能更適於自動化DNA測序的克隆插入片段(圖IF)。在該步驟中，用在基因組DNA中可具有一個或多個切割位點的限制性內切核酸酶消化捕捉到的基因組DNA(即通過步驟E產生的環形核酸)。一般來說，任意限制性內切核酸酶都可用於"內部切割"，只要所述限制性內切核酸酶不在捕捉元件中切割。內部切割指處於目標DNA內部但不切割捕捉元件的切割。內部切割限制酶可通過消化捕捉元件選擇，使得其不包含選定限制性內切核酸酶的切割位點。限制性內切核酸酶及其應用在本領域眾所周知，可容易地應用於本方法。另外，各自限於內部切割的多種限制酶的組合可用於進一步減小目標DNA片段的大小。在一個優選實施方案中，基因組DNA由這些限制性內切核酸酶中的一種或多種切割成在50-150個鹼基之內的捕捉元件。步驟1G在該步驟中，將為已知序列的雙鏈核酸的"分隔元件"連接在前一步驟的已消化基因組材料的末端之間，以形成環形核酸(圖1G)。該"分隔元件"用於兩個目的。首先，分隔元件可包含用於滾環擴增小環的啟動位點(參見下文，步驟I)。其次，因為分隔元件的序列是已知的，所以其可用作標記配對基因組末端的末端的標識物(以能夠修整連接的末端和容易對連接的末端進行軟體分析)。即，在隨後的基因組片段測序過程中，分隔元件的序列會發出整個基因組片段已被測序的信號。這^f的分隔元件還可包含額外的元件，例如限制性內切核酸酶識別和/或切割位點、抗生素抗性標記、原核或真核複製起點或這些元件的組合。儘管抗生素抗性標記和複製起點之類的元件任選存在，但本發明方法的其中一個優勢在於所述方法不需要使用宿主細胞(例如大腸桿菌)進行核酸的克隆、擴增或其它操作。分隔元件還可被生物素化，或者用標記或標籤來標記，以^便易於純化或富集用於配對末端測序的核酸。步驟1H使上一步產生的環形核酸(即小環)單鏈化，以產生單鏈核酸。這使用標準DNA變性技術通過改變溶液的鹽、溫度或pH實施。其它DNA變性技術是本領域技術人員已知的。在變性後，來自相同小環的DNA環仍可連接，但這不影響本發明的方法(圖1H)。歩驟II使引物對分隔元件退火，所述分隔元件包含可對引物序列退火的序列。因此，此分隔元件用作滾環擴增的起始物(圖11)。步驟1J樣品通過滾環擴增來擴增，以產生長單鏈產物(圖1J)。此滾環擴增步驟的一個優勢在於無分隔元件的元件將不擴增，而不是閉合環形的元件擴增差。步驟1K一個或多個加帽寡核苷酸對側接正向和反向連接物的單鏈限制性位點退火(使它們在這些區域雙鏈化)(圖1L)。加帽寡核苦酸可與捕才足元件的至少一部分互補，或與連接物區的至少一部分互補，或與這二者互補。步驟1L在加帽位點將加帽的單鏈DNA切割為小片段(圖1M)。這些小片段具有已知序列的末端，可容易地使用常規擴增技術如PCR擴增。第二種方法在第二個實施方案中，配對末端測序可按照以下步驟實施步驟2A-片段化樣品DNA目標核酸的片段化和大小分級分離與前一實施方案相同。步驟2B-曱基化和末端精修如果有需要，片段化的目標核酸可通過任意甲基化酶曱基化。優選的甲基化酶應是影響限制性內切核酸酶消化的曱基化酶。甲基化酶可以至少兩種不同策略使用。在一個優選的實施方案中，甲基化酶能通過僅在曱基化限制位點切割的限制性內切核酸酶切割。在另一個優選的實施方案中，曱基化酶防止僅切割未曱基化DNA的限制性內切核酸酶切割。末端精修的步驟與第一種方法中所述相同。步驟2C-標籤連接物的連接在該步驟中，將連接物連接至目標核酸片段的末端(圖21)，以產生在兩個末端具有連接物的片段。連接物可為任意大小，但優選10-30個鹼基的大小，更優選12-15個鹼基的大小。為防止形成連接物和/或目標核酸片段的串聯體，連接物可包含平端和不匹配的粘性末端(即具有5'突出端或3'突出端的末端)。在連接物連接至DNA片段並已去除連接酶後，粘性末端可用聚合酶和dNTP填平。本章節的連接物可為捕捉片段。捕捉片段的實例示於圖4和5。為防止形成串聯體，連接物可為髮夾連接物(圖6A)。使用髮夾連接物(例如圖6)防止串聯體形成，因為髮夾連接物不能形成超過二聚體的任何多聚體。另一個防止串^:體的方法事使用其中一條鏈或兩條鏈的5'末端未4l酸化的連接物。其它可使用的連接物包括非磷酸化連接物，其具有使用較少的處理步驟的優勢，但其也需要使用激酶的磷酸化步驟。如在本文公開內容中的它處的論述，連接物可被曱基化或生物素化，或既被曱基化又被生物素化。步驟2D-外切核酸酶消化和凝I交純化可使用外切核酸酶純化連才妻至兩個髮夾連接物的DNA片段。該外切核酸酶純化利用以下事實以兩個末端連接至髮夾連接物的雙鏈DNA是沒有暴露的5'或3'末端的DNA分子。在連接混合物中的其它DNA，例如連接至僅一個髮夾連接物的雙鏈DNA片段、未連接的DNA片段和未連接的連接物對外切核酸酶敏感(圖6B)。因此，連接混合物暴露於外切核酸酶將去除大部分DNA,連接至兩個髮夾連接物的DNA片段和髮夾連接物二聚體除外。因為髮夾連接物二聚體明顯小於DNA片段，所以可使用已知^^支術除去它們，例如大小分級分離柱(例如離心柱)或瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或本領域已知的和/或本文公開內容中它處論述的其它多核苷酸大小辨識方法中的一種。在一個實施方案中，連接物可被生物素化，以利於攜帶標籤的片段的分離/富集。在另一個實施方案中，含連接物的片段可通過使與標籤序列互補的捕捉寡核苷酸對該片段退火來純化。步驟2E-用於環化的片段的製備在向目標核酸片段的兩個末端加入連接物後，該片l殳被環化。為製備用於自環化的目標核酸，可能由於各種理由而期望在連接物區域中的切割。例如，如果《吏用髮夾連接物，則DNA片段將不自環化，因為沒有游離的5'或3'末端。作為另一個實例，如果連接物使DNA片段留下平端，則切割會使連接物具有5'或3'突出端，這些突出端(所謂的"粘性末端，，)非常有利於連接效率。而且，在連接物區域中的消化應允許選擇具有兩個連接物的DNA片段，每個末端連接1個連接物。這是因為連接物可被消化，使得用限制性內切核酸酶切割會留下匹配的粘性末端。在連接物區域中切割後，僅具有l個連接物的DNA片段(不需要的物質)應具有1個粘性末端和1個平端，應在自環化方面有難度。因此，只有在兩個末端都具有連接物的DNA片段才應環化。對連接物的限制性切割可用眾多方法完成。在一種方法中，連接物被甲基化，並連接至未甲基化DNA。然後，用僅切割甲基化DNA的限制性內切核酸酶消化構建物。因為僅連接物被甲基化，所以只有連接物被切割。在另一種方法中，DNA片段可被甲基化，而連接物未被曱基化。用僅識別和切割未甲基化DNA的限制性內切核酸酶切割將把切割限於連接物。這可通過使用已被曱基化的起始DNA或通過體外甲基化完成。應理解，在某些情況下，不需要消化連接物。例如，如果先前步驟的片段僅包含平端，則連接物的消化可以是任選的。還應理解，可處理DNA片段，以利於連接/環化。例如，如果連接物被封閉，或者不包含5'磷酸酯，則封閉基團可被去除，或者可加入磷酸酯，以使片段易於連接。步驟2F-末端連接以形成環化片段可使用眾多方法進行環化。在一個實施方案中，將連4妾酶加至具有適宜連接酶緩衝液的反應混合物，使DNA片段再環化。在一個實施方案中，以稀DNA濃度進行連接，以促進自連接和阻礙串聯體形成。在另一個實施方案中，在油包水乳液中進行連接，其中水性液滴含約1個待環化片段，如在本文公開內容中的它處所描述的。在一個實施方案中，將特徵標籤連接至目標核酸片段，所述片段自環化(參見圖2)。特徵標籤是24-30個磁基對的雙鏈核酸序列。此"特徵標籤"類似於先前實施方案中的"分隔元件，，，即其可用作標記配對基因組末端的末端的標識物(以能夠修整連接的末端和容易對連接的末端進行軟體分析)。在隨後的基因組片段測序過程中，特徵標籤的序列發出目標核酸序列的兩個末端之間的邊界的信號。步驟2G在加入特徵標籤和自環化之後，進一步消化和片段化目標核酸片段。片段化可使用本文公開內容中列出的任意片段化方法實施。參見例如以上的步驟1A。或者，可使用一種或多種限制性內切核酸酶消化目標DNA,以產生片段。在一個優選實施方案中，使用霧化器片段化核酸，直至平均片段大小為約200-300bp。如在圖2中所示，這些片段中有一些應包含特徵標籤，而另一些片段應不包含特徵標籤。此時，可使用標準技術測序核酸片段。測序核酸片段的方法是已知的。一種優選的測序方法描述於2004年1月28日提交的國際專利申請號WO05/003375。步驟2H在任選的步驟中，可由無特徵標籤的片段富集含特徵標籤的片段。一種富集方法包括在樣品製備步驟中使用生物素化特徵標籤。在片段化後，含特徵標籤的片段應>^支生物素化，並可使用鏈黴抗生物素蛋白柱或在溶液中的鏈黴抗生物素蛋白珠純化。在富集後，可使用包括自動化技術在內的標準技術，諸如描述於2004年l月28日提交的國際專利申請號WO05/003375的技術，測序核酸片段。第三種方法配對末端測序可通過第三種方法實施。步驟3A-3E在該方法中，步驟A至步驟E可如在第二種方法中所述(即如步驟2A至2E—樣)實施。而且，在第三種方法中，每個連接物均包含可引導距限制性內切核酸酶識別位點約15-25bp的DNA切割的IIS型限制性內切核酸酶位點。已知不同類型的IIS型限制性內切核酸酶在距內切核酸酶識別位點的不同距離切割，預期使用不同類型的IIS限制性內切核酸酶來調整這種距離。步驟3F末端連接以形成環化片段步驟3F可按照第二種方法(步驟2F)實施，例外之處是不使用特徵標籤(參見圖6D)。任選的富集歩驟在本發明的任何方法中，在連接後可使用外切核酸酶，以去除未環化片段和減少串聯化片段的存在。因為正確再環化的DNA片段沒有暴露的5'或3'末端，所以其抗外切核酸酶消化。此外，更大的串聯體由於缺口而應具有更高的具有暴露5'或3'末端的機會。外切核酸酶處理也應去除這些具有缺口的串聯體。任選的滾環擴增環化DNA可通過滾環擴增來擴增。筒而言之，可使用寡核苷酸與再環化DNA的一條鏈雜交。此寡核苷酸引物用聚合酶延伸。因為模板是環形的，所以聚合酶將產生具有多個重複的目標DNA的單鏈串聯體。可通過使第二種引物與此單鏈串聯體雜交並由此第二種引物延伸，將此單鏈串聯體變成雙鏈。例如，此第二種引物可與此單鏈串聯體的連接物序列互補。獲得的雙鏈串聯體可直接用於下一步。歩驟3GDNA的消化/片段化在該步驟中，用IIS型限制性內切核酸酶消化來自滾環擴增的環化核酸或串聯化核酸(圖6D)。如對步驟3A的陳述，每個連接物都包含至少一種類型的ns型限制性內切核酸酶切割位點。ns型限制性內切核酸酶將識別連接物上的IIS型限制性內切核酸酶切割位點，並切割相距約io-20個鹼基對的核酸。ns型限制性內切核酸酶的實例包括Mmel(約20bp)、EcoP151(25bp)或Bpml(14bp)。該步驟將產生含較大DNA片段的兩個末端的短DNA片段(10-100bp)，連接物區在兩個末端之間(圖6E)。產生相同結構的替代方法是使用任何如本文公開內容中它處描述的眾多DNA片段化方法(例如在步驟1A中描述的)隨機片段化環化核酸。這使得可製備任意大小(100bp、150bp、200bp、250bp、300bp或以上)的片段。用任一種方法還產生在中間沒有連接物區的其它DNA片段(圖6E)。但是，因為連接物區被生物素化，所以可使用對生物素具有親和性的固體支持體(例如鏈黴抗生物素蛋白珠、抗生物素蛋白珠、BCCP珠等)選擇性純化含連接物區的DNA。步驟3H.測序諸如Sanger測序或Maxam-Gilbert測序的方法進行人工測序是眾所周知的。例如可通過4吏用自動4匕觀'J序法i口454LifeSciencesCorporation(Branford,Conn.)開發的454Sequencing進行自動化測序，454SequencingTM還描述於2004年1月28日提交的申請WO/05003375和2004年l月28日提交的共同待審美國專利申請USSN:10/767,779、2003年6月6日提交的USSN:60/476,602、2003年6月6日提交的USSN:60/476,504、2003年1月29日提交的USSN:60/443,471、2003年l月6日提交的USSN:60/476,313、2003年6月6日提交的USSN:60/476,592、2003年4月23日提交的USSN:60/465,071以及2003年8月25日提交的USSN:60/497,985。簡而言之，在諸如454LifeSciencesCorp.開發的測序方法的自動化測序方法中，一種測序連接物(測序連接物A)可連接至DNA片段的一個末端，第二個測序連接物(測序連接物B)可連接至DNA片段的第二個末端。在連接後，可通過結合生物素至固體支持體將DNA片段與任意未連接的測序連接物純化開來。分離的核酸片段可處於單獨的反應室中，並使用對測序連接物A和測序連接物B特異性的引物通過PCR進一步擴增。通過將生物素部分連接至A或B連接物，可分離優選由A-B片段組成的單鏈DNA。可使用對測序連接物A、測序連接物B特異性的測序引物或對位於兩個末端之間的連接物(例如髮夾連接物)特異性的測序引物，測序此擴增核酸。一旦製備了含較大DNA片段末端的多個這些片段，就可對它們測序，並可組裝末端-配對序列信息，以產生部分或完整的基因組序列圖譜。第四種方法配對末端測序可使用上述方法的變體實施，該變體稱為配對讀出序列PET隨機片段化，概述於圖12。依據此第四種方法的實驗結果圖示於圖13。步驟4A至4E在該方法中，步驟A至步驟D可如在第二種方法或第三種方法中所述(即如步驟2A-2D或步驟3A-3D—樣)進行。作為替代，步驟4D可使用SPRI(固相可逆固定化)進行，以純化外切核酸酶處理的片段。例如，在圖12中的核酸片段連接至生物素化引物，並可例如使用鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、親和性降低的鏈黴抗生物素蛋白或親和性降低的抗生物素蛋白包被的珠純化。步驟4E可如在步驟2E或步驟3E中所述進行。步驟4F可如在步驟3F中所述進行。簡而言之，可使用如以上步驟2F或步驟3F所述的任意已知環化方法環化上一步產生的線性DNA片段。另外，可實施如以上步驟3F所述的任選富集步驟，以富集環形核酸。簡而言之，未環化的核酸可通過降解具有游離末端的核酸的外切核酸酶去除。共價閉合的環形核酸不具有游離末端，抗外切核酸酶的攻擊。有鑑於此，用外切核酸酶處理應富集環形核酸，同時去除線性核酸。步驟4G在自環化後，可使用列於本文公開內容的任意片段化方法實施片段化。一種優選方法是使用機械剪切片段化環形核酸。機械剪切例如可通過渦旋、迫使溶液中的核酸通過小節流孔或本文公開內容中它處描述的其它相似方法實施。機械剪切的一個優勢在於可產生不同長度的核酸(參見圖12中步驟G之後的核酸)。還產生在中間無連接物區的DNA片段。參見圖12。但是，因為連接物區被生物素化，所以可使用對生物素具有親和性的固體或半固體支持體(例如鏈黴抗生物素蛋白珠、抗生物素蛋白珠、BCCP珠等)選擇性純化含連接物區的DNA。步驟4H方法4的產物可使用任何可獲得的人工或自動化方法測序。這類方法詳述於以上的步驟3H。如上所述和在圖12中概迷的配對-讀出序列PET隨機片段化提供了眾多優勢。首先，方法4使組裝的置信度更高，因為機械剪切可產生更長的片段，而更長的片段又使讀出序列較長。較長的讀出序列可使得目標序列的組裝具有更高置信度。其次，有可能通過機械剪切製備的較長片段產生覆蓋更長核酸區的配對末端讀出序列。通過覆蓋更長的核酸區，方法4有利於空位連接(gapclosure),還具有覆蓋難以分析的核酸區的較高可能性。逸些難度大的區域可為例如重複區或高GC含量區。這樣，方法4提供了改善的空位連接性能的優勢。第三，由於方法4提供空位連接的能力，所以方法4可專用於測序完整基因組，因為每個單獨的末端都可用於建立組裝體。方法4優勢的一個實例可見於圖13。圖13圖示了使用方法4測序的大腸桿菌K12基因組DNA。由圖可見，使用該方法有可能獲得明顯較長的讀出序列長度分布，由不足50至約400。此外，可產生約3kb的片段長度，測序其末端。這表明方法4提供了優於其它方法的空位連接性能。第五種方法配對末端測序可使用如圖15中概述的上述方法的變體實施。在此方法中，連接物可被i殳計為在髮夾雙鏈區的相反鏈上摻入脫氧肌苷核苷酸(本文也稱為肌苷)的脫氧肌苷髮夾連接物。大腸桿菌內切核酸酶V(EndoV)在由肌苷核苷酸3'起的第2個和第3個核苷酸之間導入單鏈切口(缺口)。(YaoM和KowYW,JBiolChem.1995,270(48):28609-16;YaoM和KowYW,JBiolChem.1994，269(50):31390-6;YaoM等，AnnNYAcadSci.1994,726:315-6;YaoM等，JBiolChem.1994，269(23):16260-8)。如在圖14中所述，肌苷在髮夾連接物中的相對位置決定了在EndoV切割兩條鏈時是產生3'單鏈突出端(圖14A和圖14B)、5'單鏈突出端(圖14C和圖14D)還是平端(無突出端)(圖14E)。還可以設計髮夾連接物的序列，以在EndoV切割時產生非回文(圖14A和B)或回文(圖14A和C)單鏈突出端。在本領域眾所周知，脫氧肌苦與4種鹼基A、G、C和T中的任一種以及其自身配對(Watkins和SantaLucm,2005,NucleicAcidsRes.33(19):6258-67)。而且，連接物可包含如在本文公開內容它處論述的IIS型限制性內切核酸酶識別位點(例如Mmel)。步驟5A(圖15步驟A)在該方法中，可基本如步驟1A所述實施步驟A。可通過如上所述的任何本領域已知物理或生物化學方法片段化目標DNA。任選地，獲得的片段可通過在本文公開內容中它處描述的任何大小分級分離方法進行大小分級分離。歩驟5B和5C(圖15的步驟B+C)目標DNA的末端可通過本文描述的任何精修方法精修，並可連接至上述脫氧肌苷髮夾連接物，以形成連接物標記的目標DNA。步驟5D(圖15步驟D)連接反應可用一種或多種外切核酸酶處理(如本文它處論述)，並通過本文所述的任何方法進4亍大小分級分離，以富集期望的反應產物。步驟5E(圖15步驟E)用EndoV切割連接物標記的目標核酸。用於切割反應的條件可為Yao等(YaoM和KowYW,JBiolChem.1995,270(48):28609扁16;YaoM和KowYW,JBiolChem.1994,269(50):31390-6;YaoM等,AnnNYAcadSci.1994,726:315-6;和YaoM等，JBiolChem.1994,269(23):16260-8)所述的任何條件。技術人員會認識到，還可使用相似的條件。步驟5F-H(圖15的步驟F-H)在此第五種方法中，步驟F-H可如在第2、3或4種方法中所述(即和步驟2F-H或步驟3F-H或步驟4F-H—樣)實施。第五種方法的脫氧肌苷髮夾連接物是有利的，因為EndoV僅在DNA中存在肌苷或某些損傷或石威基錯配位點的情況下切割。因此，目標核酸將不會通過EndoV處理^皮切割。因此，由於EndoV位點是連接物特有的，所以目標DNA不需要如在某些上述實施方案中一樣通過甲基化被保護。該甲基化步驟的去除節省時間，並消除了與目標DNA的不完全曱基化相關的問題。而且，與EcoRI消化相比EndoV消化非常快，因此縮短了實施該方法所需要的時間。通過脫氧肌苦髮夾連接物法獲得的配對讀出序列結果的實例示於圖16。按照第五種方法製備和測序大腸桿菌K12基因組DNA(圖15)。配對讀出序列之間的平均距離為2070bp(標準偏差=594)。—■第六種方法在一個另外的實施方案中，可通過含一些或全部以下步驟的方法實施配對-末端測序，如圖17和18所示。歩驟6A—目標DNA的片段化(圖17A)按照第六種方法，目標DNA樣品的多核苷酸分子如基因組DNA被片段化為長於約500個鹼基、長於約1000個鹼基、長於約2000個鹼基、長於約5000個鹼基、長於約10000個鹼基、長於約20,000個鹼基、長於約50,000個鹼基、長於約100,000個》成基、長於約250,000個鹼基、長於約1,000,000個》鹹基或長於約5,000,000個》威基的分子。在優選的實施方案中，片段在長約1.5kb至約5kb的範圍內。片段化可通過本文公開內容中它處描述的任何物理和/或生物化學方法完成。在一個優選實施方案中，通過物理作用力隨機剪切目標DNA，例如通過使用HydroShear⑧裝置(GenomicSolutions)。然後可純化期望片段大小的剪切DNA。此任選的大小選擇可通過本領域已知的和本文公開的任何大小選擇方法實現，例如電泳和/或液相層析。在一個優選實施方案中，通過在SPRI⑧大小排阻珠(Agencourt;Hawkins等，NucleicAcidsRes.1995(23):4742-4743)上純化選擇剪切DNA樣品的大小。例如，測序約2-2.5kb的片段末端(成對的)可用於在典型細菌基因組測序實驗中進行重疊群排序。較大的片段可能對真菌、植物和動物之類的高等生物基因組測序有利。步驟6B—某些限制性位點的甲基化(圖17B)如下文所述，在將連接物連接至目標DNA片段後，連接物可用一種或多種限制酶切割，為環化作準備。為防止選擇的限制酶消化目標DNA,通過用對應的曱基化酶修飾保護目標DNA免遭消化。在一個優選實施方案中，連接物M夾連接物，並具有EcoRI限制位點(圖18A)。因此，在一個優選實施方案中，使用EcoRI曱基化酶曱基化樣品DNA片段中存在的EcoRI限制位點，以在EcoRI粘性末端於髮夾連接物之外產生時保持其完整性，然後通過連接環化。步驟6C—片段末端精修和磷酸化(圖17C)水力剪切DNA產生某些具有缺損末端(frayedend)(單鏈突出端)的片段。平端對隨後的連接物連接是優選的。因此，任選地，通過用DNA聚合酶的"填平"和/或通過用外切核酸酶(例如綠豆核酸酶)的"切回(chewing-back)",可將任意缺損末端變成平端，容易用於酶促連接。有利的是，某些DNA聚合酶還具有外切核酸酶活性。或者，在平端化反應後，優選用多核普酸激酶磷酸化片段的5'末端。在一個優選的實施方案中，T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶(T4PNK)分別用於填平和磷酸化。T4DNA聚合酶用於經其5'—3'聚合酶活性"填平"DNA的3'-凹陷末端(5'-突出端)，而其單鏈3'—5'外切核酸酶活性去除3'-突出末端。T4PNK的激酶活性將磷酸基團加入至5'-羥基末端。步驟6D—髮夾連接物連接f圖17D和圖18A)按照本發明，雙鏈寡核苷酸連接物連接至目標DNA片段的末端。在一個優選實施方案中，連接物是髮夾連接物(圖18A)。髮夾連接物的一個優勢在於連接物-連接物連接事件僅產生連接物二聚體，即防止形成多聚體連接物串聯體。另外，其髮夾結構保護樣品片段免遭用於去除未連接片段的外切核酸酶消化(步驟6E)。示於圖18A的一個優選髮夾連接物設計包含EcoRI和Mmel限制位點。EcoRI可用於在每個片段的末端建立粘性末端(步驟6F)，使其環化(步驟6G),Mmel是距其識別位點20bp切割DNA的IIS型限制酶；其用於在環化樣品片段的末端切割，產生待測序的配對末端標籤。技術人員會認識到，EcoRI可由大量其它內切核酸酶中的任一種替代，同時伴隨著連接物寡核苦酸的核苷酸序列的改變和使用保護目標DNA片段的適宜甲基化酶。同樣，Mmel可用其它lis型限制酶替代，只要選定的酶在距其限制性一個優選實施方案中，髮夾連4妻物被生物素化，例如在示於圖18A的位點處。其它生物素化位點也是合適的，並可由技術人員選擇。生物素部分使得可以在配對末端連接物的連接過程中、填平反應(片段修復)過程中和配對末端文庫擴增過程中任選地選擇含連接物的配對末端片段和任選地固定配對末端文庫片段(在Mmel消化後)。步驟6E—外切核酸酶選擇〖圖17E)優選地，外切核酸酶消化在髮夾連接物連接後，以去除在兩個末端未用髮夾連接物正確裝配的任意DNA;在SPRI大小排阻珠上的純化去除不需要的小分子物質，例如連接物-連接物二聚體。外切核酸酶消化可用本領域眾所周知的各種外切核酸酶中的一種或多種進行。優選地，消化用組合活性完成，所述組合活性一起允許在3'—5'和5'—3'兩個方向消化單鏈和雙鏈DNA。在一個優選實施方案中，外切核酸酶混合物包含大腸桿菌外切核酸酶I(3'—5'單鏈外切核酸酶)、噬菌體入外切核酸酶(5'—3'單鏈和雙鏈外切核酸酶)和噬菌體T7外切核酸酶(5'—3'雙鏈外切核酸酶，可在空位和切口處啟動)。步驟6F—EcoRI消化(圖17F)在一個優選實施方案中，EcoRI的內切核苷酸切割用於通過切割髮夾連接物(圖18A)並允許片段環化，在每個片段的末端上建立粘性末端。用EcoRI消化將去除在片段末端的髮夾結構，留下粘性末端。存在於樣品DNA中的內部EcoRI位點通過先前在步驟6B中進行的曱基化被保護。步驟6G—環化(圖17G)然後通過其粘性EcoRI末端的分子內連接環化片段。因此，連接位點具有兩部分髮夾連接物(頭對頭，具有重構的EcoRI位點；共44bp)，每一側都側接樣品片段的末端。進行另一種外切核酸酶消化，以去除任意未環化的DNA。步驟6H—Mmel消化(圖17H)然後用Mmel限制環化DNA片段。該lis型限制酶距其限制位點約20bp切割(留下2個核芬酸的3'突出端，即在20/18核普酸處切割；該酶還產生一些具有距該位點19-22bp的切口的少量產物)。在連接至樣品DNA片段的髮夾連接物的末端有Mmel位點(圖18A);在這些位點的限制產生配對末端DNA文庫片段，每個片段均含有連接的"雙"髮夾連^^妄物(44bp)和樣品片段的兩個20bp末端，總長度為84bp。歩驟6I—用鏈黴抗生物素蛋白珠分離(圖171)在沒有生物素標籤的情況下，任選地可在該步驟去除無連接的"雙"髮夾連接物的MmeI限制片段。可通過使存在於髮夾連接物中的生物素標籤結合鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白珠，固定(以及由其它Mmel限制片段分離)配對末端片段的文庫。步驟6J—配對末端連接物連接(圖17J)在該步驟中，將在步驟6H中產生並任選地在步驟61中純化的配對末端文庫片段的末端連接至雙鏈連接物，該連接物稱為配對末端文庫連接物或配對末端連接物(圖18B)。這些配對末端連接物提供了支持擴增和核苷酸測序的啟動區，還可包含可用於在454Sequencing系統上進行良好探測的短(例如4個核香酸)"測序關4定"序列。連接物可具有"簡併的"2鹼基單鏈3'突出端。簡併意味著2個突出鹼基是隨機的，即它們均可為G、A、T或C。如果使用Mmel以外的酶，則技術人員應能夠容易地設計與該其它酶相適的配對末端連接物。示於圖18B的示例性連接物設計得強烈支持將配對末端文庫片段與在其3'末端包含簡併的2bp3'-突出端的各個連接物定向連接，這些連接物僅可連接至Mmel-產生的配對末端文庫片段的末端(前提是連接物的5'末端未被磷酸化，參見下文)。連接物可在含極大摩爾過量的連接物(15:1連接物:片段比率)的連接反應中與配對末端文庫片段組合，既最大化配對末端文庫片段的使用，又使形成配對末端文庫片段串聯體的潛力最小。連接物自身可為非磷酸化的，以使連接物二聚體的形成最小，儘管因而必須隨後通過填平反應修復連接產物(步驟6K)。步驟6K—填平反應(圖6K)如果在步驟6J中連接的配對末端連接物未-粦酸化，則在其與配對末端文庫DNA片段的3'-接合處將存在空位。這兩個"空位"或"缺口"可使用鏈置換DNA聚合酶修復，從而聚合酶識別缺口，置換有缺口的鏈(替換為各個連接物的游離3'-末端)，並以導致缺口修復和全長dsDNA形成的方式延伸該鏈。在一個優選實施方案中，使用B對DNA聚合酶(大片段)。本領域已知的其它鏈置換DNA聚合酶也適用於該步驟，例如phi29DNA聚合酶、DNA聚合酶I(Klenow片段)或VentDNA聚合酶。步驟6L—擴增f圖6L)任選地，可擴增"連接的"配對末端DNA文庫。優選地，擴增通過PCR進行，但也可使用本領域已知和/或本文描述的其它核酸擴增方法。優選地，示於圖18B的寡核苷酸F-PCR和R-PCR可用作PCR引物。然後測序"連接的"配對末端DNA文庫，無論其已擴增(如在以上段落中描述)還是未擴增，然後測序。優選地，測序文庫的各個分子。如果選定的DNA測序法在各個單獨的測序反應中需要大量相同的模板分子，則文庫的各個分子可克隆擴增。優選地，克隆擴增如國際專利申請號WO2005/003375、WO2004/069849、WO2005/073410所述通過珠乳化PCR進行，這些專利申請每個均通過引用整體結合到本文中。當然，還設想了上述6種方法的對應步驟的任意組合，並納入本發明中。由以上公開內容可見，在方法l、2、3、4、5和6之間有相似性。具體地說，方法2、3、4、5和6中的類似步驟尤其相似，並可在各方法之間組合和互換，以產生等價或有利的結果。現在，已描述了配對末端測序的通用方法，描述了這些方法的變體。在一個變體中，髮夾連接物可用突出端連接物替換(圖8)。突出端連接物可生物素化，或者例如具有以下序列5,OH-AATTC——AAACCCTTTCGGT——TCCAAC-3'OH(SeqIDNO:28)immimmmm3'OH一G——TTTGGGAAAGCCA——AGGTTG一5'P04(SeqlDNO:29)上部鏈(SeqIDNO:28)的6個3'末端核苷酸，即TCCAAC,連同下部鏈(SeqIDNO:29)的互補核苦酸形成IIS型限制性酶MmeI的識別位點。所述變體以類似於方法3的方式實施。第一個基因組DNA(圖8A)被片段化和精修(圖8B),將突出端連接物連接至片段末端(圖8C)。突出端連接物的二聚體可通過大小排阻層析(即離心柱)或基於電荷的層析去除。由於在5'突出端沒有石粦酸酯而不能形成突出端連接物的更高串聯體。在去除突出端引物二聚體(圖8D)後，通過用激酶處理使片段自連接(圖8E)。實施自連接(即環化)，隨後可實施外切核酸酶消化，以去除未連接的非環形DNA。因為未連接至突出端連接物的DNA片段由於精修而具有平端，所以預期它們無法和具有每側各連接一個的兩個突出端連接物的片段的5'突出端(粘性末端)一樣有效連接。在環化後，使用Mmel消化去除突出端連接物遠端的DNA(參見圖8F)，在連接的突出端連接物的每一側上留下約20個鹼基的原基因組DNA(圖8G)。使用結合生物素化連接物的鏈黴抗生物素蛋白珠純化具有突出端連接物的片段(圖8H)。獲得的片段可通過任一種可用方法測序，例如本文公開內容中提供的方法(例如步驟3H)。通過本發明方法產生的核酸可使用一種或多種與序列末端互補的引物測序。也就是說，按照步驟3H描述的測序方案，將測序連4妄物A和測序連接物B連接至片段末端，然後對它們測序。因為已知片段的末端序列是測序連接物A或B，所以可使用與測序連接物A或B互補的測序引物測序片段。而且，在各個片段中部含已連接的連接物的序列是已知的(參見例如圖7中的703)。測序還可使用與該中部區域互補的引物由中部開始。而且，末端區域的測序引物和中部區域的測序引物可同時與待測序的片段雜交(參見圖9)。一個引物4皮保護，而另一個引物沒有被保護。在圖9中，與末端雜交的引物被磷酸酯基團保護。第一輪測序將由未被保護的引物開始(圖9，中部引物)。在第一輪測序後，任選地可終止第一種引物的延伸，例如通過摻入互補雙脫氧核苷酸。或者，第一種引物的延伸可進行至模板鏈的末端，使得無須終止。第二種受保護的引物可去保護，並在第二輪測序中延伸，以測定片段末端的序列。該方法能由可為單鏈的單個^^莫板獲得兩個長的配對末端測序讀出序列。在第二個變體中，將片段化的起始DNA(圖IOA)連接至具有3'CC突出端和任選的內部IIS型限制性內切核酸酶位點的連接物。連接的片段自身不能自連接或自環化，因為其末端不匹配(不互補)。但是，這些片段可使用在兩側均具有5'GG突出端的接頭連接(圖10B)。在連接後，可通過以上論述的標準^:膠和柱層析或通過切割未環化分子的外切核酸酶消化，由非環形DNA純化核酸片段。獲得的環形DNA(圖IOD)可如在其它方法中一樣用Mmel切割，並可測序獲得的DNA。在另一個變體中，本發明方法可用於生產A/B連接的ssDNA(圖11，步驟l)。該單鏈片段可通過與含A/B連接物互補序列的寡核苷酸雜交環化(圖11,步驟2)，並在連接酶存在下連接。除了有利於連接以外，所述寡核普酸可用作引物，以利於環化ssDNA的滾環擴增(圖11,步驟3)。滾環擴增的DNA可如方法1的步驟1K和L所述(圖1L和M)切割。在擴增後，可對產物應用標準文庫製備和測序技術(圖11，步驟4)。本發明的某些實施方案基於令人驚奇的發現在其中實驗方案包括使用依據本文描述方法的Mmel切割的大腸桿菌菌株K12基因組配對末端測序實驗中，覆蓋基因組的讀出序列的深度變化極大(圖20,"無載體(。")。所述深度指作圖至基因組的基本相同區域的讀出序列的數量。該深度變化與基因組內Mmel位點的密度相關聯(圖20)。出乎意料且令人驚奇的是，發明人發現，加入已知含MmeI位點的雙鏈DNA(在圖20中稱為"(+)")，即大腸桿菌B菌抹DNA("EcoliBStrain(+)")、鮭魚精DNA("SalSprmDNA(+)")，或已知含Mmel位點的PCR擴增產物("AmpPosMmel(+)"),極大地降低和隨機化覆蓋基因組的深度變化。但是，與"無載體"的對照相比，加入沒有MmeI位點的雙鏈DNA(在圖20中稱為"(-)"),即poly(dldC)("dldC(-)"),或已知不含MmeI位點的PCR擴增產物("AmpNegMmeI(-)"),不改變覆蓋基因組的深度變化模式。因此，使用Mmel-陽性載體DNA提供了在基因組中更均勻分布的配對末端讀出序列，這是有利的。這些令人驚奇的發現由示於下表的數據進一步證實表1.Mmel載體DNA對配對-末端讀出序列的深度分布和長度的影響tableseeoriginaldocumentpage39表1顯示了大腸桿菌K12的覆蓋深度統計。上部3個樣品(行)具有加入的Mmel-陽性載體DNA，而底部3個樣品具有加入的Mmel-陰性載體DNA。行標題代表"DepthAve"=平均深度；"D印thSTDEV"=深度的標準偏差；"Depth。/。CV"=DepthSTDEV除以DepthAve(該商代表經平均深度校正的深度變化)；"LengthAve"=基因組中配對讀出序列的平均距離；"LengthSTDEV"=基因組中配對讀出序列的距離的標準偏差；"Length%CV"=LengthSTDEV除以LengthAve。表1表明，依據圖20,加入MmeI-陽性載體DNA極大降低了大腸桿菌K12基因組內的覆蓋深度變化(參見DepthSTDEV和Depth%CV值，較小的DepthSTDEV和Depth。/。CV值是有利的)。這導致基因組內配對末端讀出序列的更均一分布。這種均一分布是有利的。表2.採用MmeI-陽性載體DNA的配對末端測序對大腸桿菌K12基因組骨架拼接(scaffolding)的影響tableseeoriginaldocumentpage4098.07%表2顯示了用Mmel-P曰性載體DNA獲得的配對末端測序數據對鳥槍重疊群的骨架拼接的影響。當用配對末端測序讀出序列組裝在GS20測序裝置(454LifeSciences,Bmnford，Conn.,USA)上通過鳥槍測序大腸桿菌K12基因組DNA獲得的121個大重疊群時，與不用載體DNA或用沒有Mmel位點的載體DNA產生的配對末端測序讀出序列(48-56個骨架)相比，由用MmeI-陽性載體DNA(行"StratageneSSdsDNA(+)"、"E.ColiBstrain(+)"和"AmplifiedPositive(+)")產生的配對末端讀出序列獲得的骨架數較低(19-25個)(即較大的骨架)。因此，使用Mmel陽性載體DNA改善了按照本發明實施的通過配對末端測序獲得的基因組組裝性能。在某些實施方案中，本發明的方法包括在包含利用限制性內切核酸酶Mmel進行DNA切割的任意步驟中使用雙鏈"載體DNA"。載體DNA必須包含Mmel位點。當Mmel酶分子的摩爾數大約等於DNA樣品中存在的Mmel位點的摩爾數時(NewEnglandBiolab的產品目錄，Ipswich,Mass.,USA),Mmel的內切核苦酸切割最有效發生。在本發明的方法中，Mmel位點數可能難以估計，這歸因於可信檢測難且耗時的低DNA濃度(典型地為ng至10ng數量級)，還歸因於基於待測序的目標DNA的Mmel位點數的變化。因此，精確計算加入反應的Mmel酶的量(以獲得化學計量濃度)成問題。為了克服該難題並滿足Mmel位點數與Mmel酶分子數平衡的需要，本發明的某些方法包括加入過量的載體DNA(相對於樣品DNA)。這樣，可基於已知量的載體DNA計算加入反應的Mmel酶量，而(環形)樣品DNA中的Mmel位點數變得可忽略。因此，樣品DNA的DNA濃度的檢測變得不必要。這提升了速度，並降j氐了所述方法需要的成本和時間。載體DNA的量可多達樣品DNA量的幾倍至約10倍、至約100倍、至約1000倍或更高。在一個優選實施方案中，將2iug超聲過的雙鏈鮭魚精DNA和2單位Mmel以及所有需要的試劑(例如IXNEBuffer4(NewEnglandBiolabs)和50|iMS-腺苦甲硫氨酸(SAM))以100pi體積加入樣品DNA,於約37。C溫育約15分鐘。技術人員將認識到，反應溫度和持續時間可在實際範圍內調整。如上所述含過量Mmel-位點的載體DNA連同大約化學計算量的Mmel酶在Mmel限制性消化中的用途，任選地可加入到在本文^^開內容中(例如在第6種方法的步驟6H中(圖17H))描述的含Mmel消化的任何方法中。技術人員還知曉，加入含Mmel位點的"載體DNA"的策略在任意Mmel限制性消化反應中都是有用的，尤其是其中樣品DNA量低和/或樣品DNA中的Mmel位點數未知的反應。在油包水乳液中連接本發明還包括環化核酸分子的方法。通常，通過在低核酸濃度連接實現核酸分子的環化。相對於符合二級(或更高級)反應動力學的分子間事件，低濃度偏向於符合一級反應動力學的期望的分子內連接反應(即環化)(F.M.Ausubel等(編輯)，2001,Q^reW屍ratoco/sA^/ecw/w說o/ogv,JohnWiley&SonsInc.)。但是，即便在高稀釋度，分子間事件也不可^t阻止，極端稀釋度的核酸不可行。分子間連接(串聯體、雙環等)的發生降低了期望的分子內環化事件的發生率。在某些情況下，分子間連接產物可對下遊應用有害。總之，常規方法具有至少兩個主要缺點。首先，需要稀釋起始核酸增加了反應體積和相關的試劑成本。高稀釋度還使反應產物難以有效回收。其次，確實發生大量的分子間連接事件，降低了期望的分子內連接產物的得率。本發明包括基本上消除了與上述常規環化方法相關的問題的方法。.例如，按照本發明，不需要以高稀釋度、即以低核酸濃度進行連接反應。在一個實施方案中，將具有匹配的可連接末端(例如平端或交錯("粘性")末端)的各個線性雙鏈DNA分子在物理分隔的反應環境中連接。含待連接DNA和連接反應所有必需試劑(例如DNA連接酶、連接酶緩沖液、ATP等)的水性溶液在油中乳化，優選在起穩定乳液的表面活性劑存在下。產生乳液的適宜組合物和方法在下文更詳細地論述。獲得的油包水乳液包含^(鼓滴(微反應器)，每個均包含0、l或多個DNA分子。每個微反應器的DNA分子數可通過改變DNA濃度和微滴大小來調整。對於技術人員來說，基於核酸濃度、多核苷酸大小(依據鹼基數檢測的長度)和微滴平均體積計算適宜的條件是常規優化問題。理想的微滴含單個可連4妾DNA分子。但是，要理解的是，在微反應器群中，每個微反應器的DNA分子數將部分地依據微反應器的尺度可變性和DNA分子的隨機分布而變化。因此，某些反應器可不包含DNA分子，某些可包舍l個DNA分子，可包含某些2個或更多個DNA分子。本領域技術人員會認識到，可根據需要通過改變每個微反應器的平均DNA分子lt平衡收率和成本(試劑使用)。優選地，連接混合物在組裝時保持冷卻(例如於0-4。C)，直至乳化過程完成。這將在形成期望的乳化環境之前阻止連接反應繼續進行，因此將阻止不需要的分子間鍵的形成。隨後，乳化的連接反應物將在容許連接反應的溫度溫育。溫育時間可由幾分鐘至1小時、幾小時、過夜或24小時或超過1天。在此溫育後，但在破壞乳化前、期間和之後，可停止連接反應，以防止組合的連接反應中不期望的分子間連接。可通過將溫度降低至約0-4。C(水水)、通過加熱失活連接酶、通過加入EDTA、加入連接酶抑制劑等，或任意這些方法的組合，停止連接反應。技術人員容易將上述的本發明方法應用於單鏈或雙鏈RNA或單鏈或雙鏈DNA的環化。例如，線性單鏈多核苦酸分子的末端可通過對加帽寡核苷酸(也稱為橋接寡核苷酸)退火產生直接並列，所述加帽寡核苷酸具有對所述線性單鏈多核苷酸分子的每個末端互補的部分，如在方法1的步驟1K中所述(參見圖1L和圖11)。然後可於合適的溫度溫育乳化的連接反應物。例如，對於釆用T4DNA連接酶的"粘性末端"連接，合適的溫育溫度是16。C，但一定寬度範圍的溫度是可以接受的。DNA和其它分子的連接條件在本領域是廣為人知的。在乳液中進行環化反應的一個優勢在於延長的反應時間對所述方法的成功是中性的，甚至是有益的。例如，在每個微反應器不超過1個DNA分子的理想情況下，溫育時間可延長，直至大部分DNA分子已被環化。相比之下，通過使用上述的常規非乳化法，延長的溫育可產生更高比例的分子間連接產物。基於乳化的本發明連分子間連接的發生的能力。這種增加的溫育時間使環化產物的數量更高，而沒有增加發生分子間連4矣的風險。而且，因為分子通過物理方法而不以濃度依賴性方式分離，所以對於相同的連接事件數而言反應體積可能低得多(即水相中核酸的核酸濃度可能高得多)，降低了試劑成本，並增加了處理樣品的簡易性。技術人員會理解，為在給定微滴中發生連接，所述微滴必須含足量的試劑，包括至少一個連接酶分子。破乳和環化DNA的分離在連接後，可終止連接反應，並"破壞"乳化(在本領域也稱為"反乳化，，)。有許多破壞乳化的方法(參見例如美國專利第5,989,892號和其中提及的參考文獻)，本領域技術人員應能夠選擇合適的方法。反乳化之後可為核酸分離步驟，該步驟可通過任意合適的核酸分離方法進行。一旦分離出核酸，就可通過任意適於該任務的方法去除未連接的物質，其中一種方法是對樣品進行外切核酸酶消化。使用的具體外切核酸酶部分取決於要一皮作用的分子類型(單鏈或雙鏈DNA或RNA)以及其它考慮因素，例如便利地納入過程中的反應溫度。在外切核酸酶處理後環化物質必須通過本領域已知的眾多方法中的一種純化，例如苯酚/氯仿提取或適用於此用途的任意市售純化試劑盒。業已觀察到，使用上述基於稀釋度的常規環化方法，期望的環化產物的回收隨著線性輸入DNA分子的長度增加而降低。本發明的乳化連接法對環化長多核苷酸分子特別有用，例如長於約500個石成基、長於約1000個鹼基、長於約2000個鹼基、長於約5000個鹼基、長於約10000個鹼基、長於約20,000個減基、長於約50,000個鹼基、長於約100,000個鹼基、長於約250,000個鹼基、長於約1,000,000個鹼基或長於約5,000,000個鹼基的分子，或實際上在目標實驗方案中認為期望的任意大小的分子。本文描述的乳化連接方法可用於各種各樣的連接反應，無論它們產生環化還是不產生環化。因此，上述乳化連接方法可在本文所述各種方法的任意連接步驟中使用，尤其是其中期望輸入核酸環化的連接反應。乳化乳液兩個不混溶的液相的多相體系，其中一相作為顯微或膠質大小的液滴分布在另一相中。本發明的乳液必須能形成微嚢(微反應器)。乳液必須由任意合適的不混溶液體組合產生。本發明的乳液具有親水相(含生物化學組分)和疏水的不混溶液體("油")，親水相為以細分液滴形式存在的相(分散相、內相或不連續相)，疏水的不混溶液體為這些液滴懸浮在其中的基質(非分散相、連續相或外相)。這種乳液稱為"油包水"(W/0)。其具有以下優勢含生物化學組分的整個水相在離散的液滴(內相)中被區室化。為疏水油的外相一般不含生物化學組分，因此是惰性的。在某些實施方案中，微反應器包含核酸連接必需的試劑。多個微反應器每個恰好可包含l個多核普酸分子。在某些實施方案中，需要熱穩定的油包水乳液，例如如果在反應後將進行連接酶的熱失活，或者如果使用熱穩定連接酶(例如TaqDNA連接酶)在提升的溫度進行連接。乳液可按照本領域已知的^f壬意合適方法形成。下文描述了一種建立乳液的方法，但任意製備乳液的方法都可使用。這些方法在本領域是已知的，包括佐劑法、逆流法、錯流法、振搖、轉鼓法和膜法。而且，可通過改變組分的流速和速度調整微嚢的大小D例如，在逐滴加入時，液滴的大小和傳遞總時間可變。在某些實施方案中，微滴可在微射流裝置中產生，例如描述於Link等(Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,2556-2560),該文獻通過引用整體結合到本文中。至少一些微反應器應大得足以包含足量的核酸和其它連接試劑。但是，至少一些微反應器應足夠小，使得部分微反應器群包含單個可自連接的多核苷酸分子。在某些實施方案中，乳液是熱穩定的。優選地，形成的液滴直徑大小在約100nm至約500pm的範圍內，更優選為約1pm至約100pm。有利地，任選與電場組合的錯流流體混合允許控制液滴形成和液滴大小的均一度。適於生物反應的各種乳液參見Griffiths和Tawfik,EMBO，22,24-35頁(2003);Ghadessy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98,4552-4557頁(2001);美國專利第6,489,103號和WO02/22869，這些文獻每個均完整通過引用結合到本文中。在一個優選實施方案中，所述油為矽油。表面活性劑可通過加入一種或多種表面活性劑(乳液穩定劑；表面活性劑)穩定本發明的乳液。這些表面活性劑也稱為乳化劑，在水/油交界面起防止(或至少延遲)各相分離的作用。許多油和許多乳化劑可用於產生油包水乳液；最新的彙編列出了超過16,000種表面活性劑，其中許多用作乳化劑(Ash,M.和Ash,I.(1993)//a"必oc^o/zWw咖'a/raz/actowte.Gower,Aldershot)。用於本發明方法的乳液穩定劑包括Atlox4912、山梨糖醇酐單油酸酯(Span80;ICI)、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween80;ICI)和其它已知和市售的適宜穩定劑。在各種實施方案中，表面活性劑以在乳液的油相中0.5-50%、優選10-45%、更優選30-40%的體積/體積濃度提供。在某些實施方案中，使用化學惰性的基於有機矽的表面活性劑，例如有機矽共聚物。在一個實施方案中，使用的有機矽共聚物是聚矽氧烷-聚鯨蠟基-聚乙二醇共聚物(鯨蠟基聚二甲基矽氧烷共聚多元醇)，例如AbilEM90(Goldschmidt)。表面活性劑提供，或者可作為幾種表面活性劑中的一種提供。因此，可使用不同表面活性劑的混合物。在具體的實施方案中，使用的一種表面活性劑是DowComing749Fluid(以1-50%、優選10-45%、更優選25-35%重量/重量使用)。在其它具體的實施方案中，使用的一種表面活性劑是DowComing5225CFormulationAid(以1-50%、優選10-45%、更優選35-45%重量/重量使用)。在一個優選實施方案中，油/表面活性劑混合物由以下組成40%(重量/重量)DowCorning5225CFormulationAid、30%(重量/重量)DowComing749Fluid和30%(重量/重量)矽油。本發明的方法提供了超越現有方法的大量利益和優勢。所述方法超越現有技術的一個優勢在於不需要在真核或原核宿主中克隆和增殖製備的片段。這在其中目標序列含多個重複序列的情況下特別有用，這些重複序列在宿主細胞中作為附加體增殖的過程中可重排。所公開方法的另一個優勢在於其不僅提供重疊群序列，而且提供長重疊群的末端序列和末端序列的方向，由此可促進基因組組裝，所述長重疊群可具有超過100bp、超過300bp、超過500bp、超過1kb、超過5kb、超過10kb、超過100kb、超過1Mb、超過10Mb或更長的長度。該序列信息和方向信息可用於促進基因組組裝，並提供空位連接。而且，配對末端讀出序列在基因組組裝中提供了第二個置信度水平。例如，如果關於某DNA序列的配對末端測序和規則重疊群測序一致，則該序列的置信度水平增加。換句話說，如果兩個序列數據彼此相矛盾，則置信度下降，必需更多的分析和/或測序來定位矛盾源。框位置的指示。例如，如果兩個測序的重疊群末端均舍可讀框，則有可能整個重疊群是一個可讀框。這可通過標準測序技術證實。或者，藉助兩個末端的信息，可構建特異性PCR引物，以擴增兩個末端，並可測序擴增區，以確定可讀框的存在。本發明方法還將改善對基因組組織和結構的理解。因為配對末端測序具有覆蓋難以測序區域的能力，所以可推斷基因組結構，即便這些區域未被測序。測序區域的困難可能為例如重複區和二級結構區。在此情況下，這些困難區域的數量和位置可作圖在基因組中，即便這些區域的序列是未知的。本發明的方法還允許在延長的距離內對基因組進行單體型分析。例如，可製備特異性引物，以擴增含長距離連接的兩個SNP的基因組區域。此擴增區域的兩個末端可使用本發明方法測序，以確定單體型，無需測序兩個SNP之間的核酸。該方法對其中兩個SNP覆蓋測序不經濟區域的情況尤其有用。這些區域包括長區域、具有重複序列的區域或二級結構區域。所述方法的生物素化連接物提供了額外的優勢(圖7)。圖7A顯示了以準備用於測序的形式連接至測序引物A和B的核酸。其中一些核酸汙染了不含單個重疊群區的兩個末端的核酸(701)。含重疊群的兩個末端的核酸片段稱為702。因為核酸702是唯一含生物素的核酸物質，所以該物質可使用鏈黴抗生物素蛋白珠純化(圖7B)。該物質在純化後準備用於測序。通過使用親和純化，產生有用信息的序列片段可顯著增力口。這在汙染DNA(701)長時特別有用，例如圖7D中的每個汙染核酸(701)都長几kb的情況。測序這些汙染物應消耗相當一部分供項目用的試劑、人力和計算機能力。在此情況下，先前通過親和層析純化適當的片段(圖7E)應提供顯著的勞力和試劑節約。技術人員會馬上認識到，EndoV對含反向鏈肌苷的任意雙鏈DNA的內切核苷酸切割(如圖14所示，有或沒有髮夾)可產生單鏈突出端(粘性末端)，其中突出端實際上可具有任意核苷酸序列。本發明還包括基本類似於圖14的多核苷酸設計和方法，但沒有髮夾。而且，顯而易見，如上所述，示於圖14的有或沒有髮夾的本發明方法和組合物可用於其中期望導入獨特內切核酸酶位點的大量分子生物學和重組DNA技術。這種技術包括但不限於構建DNA和cDNA文庫、各種亞克隆策略或由引物、連接物或4妄頭中的獨特內切核酸酶位點獲益的任意方法。通過本文所述的任何方法產生的配對末端核酸構建物可通過本領域已知的任意測序技術測序。諸如Sanger測序獲Maxam-Gilbert測序的標準測序法在本領域廣為人知。測序例如還可使用稱為454Sequencing"的自動化測序方法進行，其由454LifeSciencesCorporation(Bmnford,Conn.,USA)開發，描述於例如2004年1月28日提交的國際申請號WO/05003375和2004年l月28日提交的美國專利申請序號10/767,779、2003年6月6曰提交的美國專利申請序號60/476,602、2003年6月6日才是交的美國專利申請序號60/476,504、2003年l月29日提交的美國專利申請序號60/443,471、2003年6月6曰提交的美國專利申請序號60/476,313、2003年6月6日提交的美國專利申請序號60/476,592、2003年4月23日提交的美國專利申請序號60/465,071以及2003年8月25日提交的美國專利申請序號60/497,985。還i殳想了本領域已知的其它測序方法，例如Metzger(GenomeRes.2005Dec;15(12):1767-76),通過引用結合到本文中)綜述的任意合成測序或連接測序方法，這些方法可用於本發明的配對末端測序法。在整個本文公開內容中，術語"生物素"、"抗生物素蛋白"或"鏈黴抗生物素蛋白，，用於描述結合對的一員。當然，這些術語僅說明使用結合對的一種方法。因此，術語生物素、抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白可由結合對的任意一個成員替換。結合對可為顯示出彼此特異性結合的任意兩種分子，至少包括結合對例如FLAG/抗FLAG抗體、生物素/抗生物素蛋白、生物素/鏈黴抗生物素蛋白、受體/配體、抗原/抗體、聚組氨酸/鎳、A蛋白/抗體及其衍生物。其它結合對是已知的，公開於文獻中。在本文公開內容中的任意處提及的所有專利、專利申請和參考文獻都通過？1用整體結合到本文中。現在將利用以下的非限制性實施例進一步描述本發明。實施例實施例1:寡核苷酸設計如下設計和合成實驗中使用的寡核苷酸。示於圖3A頂部的捕捉元件寡核苷酸設計得包含UA3連接物和關鍵序列。Notl位點位於連接物之間。完整構建物(捕捉元件)可使用嵌套寡核苷酸和PCR建立。合成並克隆終產物序列。示於圖3A底部的IIS型捕捉片段寡核苷酸類似於上述捕捉片段，只是代表IIS型限制性內切核酸酶位點(例如MmeI)的序列包含在關鍵序列之後的捕捉片段中。這些IIS型限制性內切核酸酶切割位點允許用IIS型限制性內切核酸酶切割由這些要切下的捕捉元件製備的任意構建物。正如本領域所知，ns限制性內切核酸酶在距識別位點的不同距離切割DNA，就Mmel而言，在20/18鹼基處切割。短連接物捕捉片段寡核苷酸設計得包含SAD1連接物和關鍵序列(圖3B)。Notl位點也位於連接物之間。可合成該寡核苷酸，其在關鍵序列後具有MmeIIIS型限制性內切核酸酶切割位點(參見圖3B,短連接物捕捉片段Cns型))。實施例2:用於髮夾連接物配只於末端測序的方案使用標準HydroShear裝置(GenomicSolutions,AnnArbor,Mich.，USA)以速度10對大腸桿菌K12DNA(20pg)的100jil溶液進行20個循環的水力剪切。通過加入50piDNA(5jag)、34.75H20、10pi曱基化酶緩衝液、0.25pl32mMSAM和5plEcoRI曱基化酶(40，000單位/ml,NewEnglandBiolabs(NEB),Ipswich,Mass.,USA)對剪切過的DNA實施甲基化反應。反應物於37。C溫育30分鐘。在甲基化反應後，使用QiagenMinElutePCR純化柱按照生產商的說明純化剪切過的甲基化DNA。用lOnlEB緩衝液由柱洗脫純化的DNA。對剪切過的甲基化DNA進行精修，以產生具有平端的剪切物質。將lOjalDNA加入反應混合物中，反應混合物含13|ilH20、5|Lill0x精修緩衝液、5pi1mg/ml牛血清白蛋白、5pi10mMATP、3|ul10mMdNTP、5Jul10U/plT4多核苦酸激酶以及5pi3U/plT4DNA聚合酶。將反應物於12。C溫育15分鐘，此後將溫度升至25°C,再溫育15分鐘。隨後在QiagenMinElutePCR純化柱上按照生產商的說明純化反應物。通過加入10pi的5剪切DNA、17.5piH20、50|ul2xQuick連接酶緩衝液、20^的10jiM髮夾連接物和2.5piQuick連接酶(T4DNA連接酶，NEB),將髮夾連接物連接至剪切過的平端DNA片段。將反應物於25。C溫育15分鐘，此後通過向混合物加入2piX外切核酸酶、1RecJ(30,000單位/ml,NEB)、1)ilT7外切核酸酶(10,000單位/ml,NEB)和1|ul外切核酸酶I(20,000單位/ml,NEB)選擇連接的片段。將反應物於37。C溫育30分鐘，此後將樣品在QiagenMinElutePCR純化柱上純化。然後按照生產商的說明使處理的DNA穿過InvitrogenPurelink柱，並由柱洗脫在50)ul體積中。用EcoRI對已連接的外切核酸酶處理的DNA進行消化。將含50filDNA、30piH20、10piEcoRI緩沖液和10jilEcoRI(20,000單位/ml)的反應物於37°C過夜溫育。使用QiagenQiaQuick柱按照生產商的說明純化切割產物。在含50julDNA、20|LilBuffer4(NewEnglandBiolabs)、2pi100mMATP、123jliIH20和5jliI連接酶(同上)的反應物中再次連接切割的產物，以產生閉合環形DNA。將連接反應物於25。C溫育15分鐘，此後通過加入混合物1|il人外切核酸酶(5,000單位/ml，NEB)、0.5|ulRecJ(同上)、0.5plT7外切核酸酶(同上)和0.5jil外切核酸酶I(同上)對它們進行另一輪外切核酸酶處理。外切核酸酶反應物於37。C溫育30分鐘，此後用QiagenMinElutePCR純化柱純化樣品。然後在含10piDNA、78.75piH20、10piBuffer4(NewEnglandBiolabs)、0.25SAM和0.5fxlMmel(2,000單位/ml,NEB)的反應混合物中對處理的DNA進行Mmel消化。用Mmel於60°C消化反應物達60分鐘，然後在用終濃度0.1%的3M乙酸鈉緩沖的QiagenQiaQuick柱上純化。該柱用700jal8.0M鹽酸胍洗滌，按照生產商的說明將樣品加至柱。將DNA洗脫在30^ilEB緩沖液中，並稀釋至100jil終體積。通過用2x珠結合緩沖液清洗，並將珠懸浮在100jil2x珠結合緩沖液中，製備鏈黴抗生物素磁性珠(50pl)(DynalDynabeadsM270,Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA),此後將100jxlDNA樣品加入珠中，於室溫混合20分鐘。在清洗緩衝液中清洗珠兩次。SAD7連接物組(A/B組，其中單鏈寡核苷酸SAD7Ftop和SAD7Fbot退火，形成A連接物，單鏈寡核苷酸SAD7Rt叩和SADRFbot退火，形成B連接物)(SAD7Ftop:5'-CCGCCCAGCATCGCCTCAG麗-3'(SEQIDNO:51);SAD7Fbot:5'畫CTGAGGCGATGCTGG-3'(SEQIDNO:52);SAD7Rtop:5'國CCGCCCGAGCACCGCTCAG麗-3'(SEQIDNO:53);SAD7Rbot:5'-CTGAGCGGTGCTCGG-3'(SEQIDNO:54)，其中N是4種鹼基A、G、T或C中的任一種)連接至與鏈黴抗生物素蛋白珠結合的DNA，其中將含15piH20、25jilQuick連接酶緩衝液、5plSAD7連接物組和5piQuick連接酶(同上)的連接反應混合物加入到珠-DNA混合物中。連接反應物於25。C溫育15分鐘，然後用珠清洗緩沖液清洗珠兩次。通過將含40piH20、5pl10x填平緩衝液、2pl的10mMdNTP和3pl填平聚合酶(BstDNA聚合酶，8,000單位/ml，NEB)的混合物加入珠中進行核苷酸填平反應。反應物於37。C溫育20分鐘，珠用清洗緩衝液清洗兩次。然後將珠懸浮在25^TE緩衝液中。然後在含30H20、5pi10xAdvantage2緩衝液、2pl10mMdNTPs、1iul100pM正向引物(SAD7FPCR:5'-Bio-CCGCCCAGCATCGCC-3'(SEQIDNO:55))、1jil100pM反向引物(SAD7RPCR:5'-CCGCCCGAGCACCGC誦3'(SEQIDNO:56)、10|ul結合珠的DNA和1piAdvantage2聚合酶混合物(Clontech,MountainView，Calif.,USA)的反應混合物中，對結合珠的DNA進行PCR。使用以下程序進行PCR:(a)94。C、4分鐘；(b)94。C、15秒；(c)64。C、15秒，其中步驟(b)和(c)進行19個循環，(d)68。C、2分鐘，此後將反應物保持在14°C。使用QiagenMinElutePCR純化柱純化PCR產物，然後純化產物在1.5%瓊脂糖凝膠上以5V/cm電泳，以檢測120bp產物的存在情況。由凝膠切下120bp片段，並使用QiagenMinElute凝膠提取方法回收。將120bp片^a洗脫在18ialEBH衝液中。雙鏈產物結合鏈黴抗生物素蛋白珠，並用i朱清洗緩衝液清洗兩次。將單鏈產物洗脫在125mMNaOH中，並在QiagenMinElutePCR純化柱上純化。然後使用標準454LifeSciencesCorporation(Bmnford,Conn.,USA)測序法在454LifeSciencesCorporation自動化測序系統上測序該物質。實施例3:用於非髮夾連接物配對末端測序的方法使用標準裝置(HydroShear，同上)以速度11對100pi體積的大腸桿菌K12DNA(5fxg)進行20個循環的水力剪切。剪切的DNA在QiagenMinElutePCR純化柱上按照生產商的說明純化，並用23jliIEB緩衝液洗脫。純化的剪切DNA在含23piDNA、5pilOx精修緩衝液、5|ul1mg/ml牛血;)青白蛋白、5jal10mMATP、3pi10mMdNTP、5jul10U/plT4多核苷酸激酶和5pi3U/plT4DNA聚合酶的反應混合物中進行平端精修。反應物於12。C溫育15分鐘，此後溫度升至25。C,再溫育15分鐘。隨後在QiagenMinElutePCR純化柱上按照生產商的說明純化反應物。使用2昭剪切過的純化DNA在含25pl2xQuick連接酶緩沖液、18.5pl10nM非髮夾連接物和2.5fxlQuick連接酶(同上)的反應混合物中進行非髮夾連接物的連接。連接反應物於25。C溫育15分鐘，此後使樣品通過SephacrylS-400離心柱，之後通過QiagenMinElutePCR純化柱。然後用10plEB緩衝液由柱洗脫DNA。然後對純化的已連接DNA進行激酶反應，其中混合物含13)LilH20、25jil2x緩衝液、10|JDNA和2p110U/plT4多核苷酸激酶。反應物於37。C溫育60分鐘，此後樣品在1%瓊脂糖凝膠上以5V/cm進行電泳。由凝膠切下1500-4000bp的條帶，並使用QiagenMinElute凝膠提取方法回收。在含18piDNA、20piBuffer4(NewEnglandBiolabs)、2jilATP、150piH20和10|il連接酶(同上)的反應混合物中對純化的DNA進行另一輪連接，以產生環形DNA。反應物於25。C溫育15分鐘，此後將含2^X外切核酸酶(同上)、1piRecJ(同上)、1piT7外切核酸酶(同上)和1|al外切核酸酶I(同上)的混合物於37。C溫育30分鐘。在外切核酸酶反應後，在QiagenMinElutePCR純化柱上純化DNA，並用20plEB緩衝液洗脫。然後將純化的已連接DNA加入到含68.6piH20、10filBuffer4(NewEnglandBiolabs)、0.2jliISAM和1filMmel限制性內切核酸酶(同上)的混合物中。於37。C切割DNA達30分鐘，此後使用QiagenQiaQuick柱純化DNA,該柱用終濃度0.1%的3M乙酸鈉預緩衝，並用700pi8.0M鹽酸胍洗滌。然後用30)nlEB緩衝液洗脫純化的DNA，並調整至100pl體積。用2x珠結合緩衝液清洗鏈黴抗生物素磁性珠(50fil)(同上)，並重懸浮在100inl珠結合緩沖液中。然後，將珠與lOO(alDNA樣品混合，並使其於室溫彼此結合20分鐘。此後，用清洗緩衝液清洗珠兩次，並與SAD7連接物組(A/B組)(同上)進行連接反應。將含15piH20、25filQmck連接酶緩衝液、5plSAD7連接物和5Quick連接酶(同上)的混合物加至結合至珠的DNA中，於25。C溫育15分鐘，此後，用清洗緩衝液清洗珠兩次。在含40piH20、5pl10x填平緩沖液、2pl10mMdNTP和3jil填平聚合酶(同上)的混合物中對結合至珠的DNA進行填平反應。反應於37。C發生20分鐘，此後用清洗緩衝液清洗珠兩次，並懸浮在25^1TE緩沖液中。在含30piH20、5pl10xAdvantage2緩衝液、2)ildNTP、0.5iullOOpM正向引物(同上)、0.5^1100fiM反向引物(同上)、10jil結合至珠的DNA和1^Advantage2酶(同上)的反應混合物中擴增結合至珠的DNA。在以下條件下發生PCR反應(a)94。C、4分鐘；(b)94°C、15秒;(c)64。C、15秒;其中步驟(b)和(c)重複24個循環；(d)68。C、2分鐘，此後將PCR反應物保持於14°C。在QmgenMinElutePCR純化柱上純化PCR產物，並在1.5%瓊脂糖凝膠上以5V/cm進行電泳。由凝膠切下120bp產物，並使用QiagenMinElute凝膠提取方法回收。隨後在18fxlEB緩沖液中洗脫DNA。雙鏈DNA結合至鏈黴抗生物素蛋白珠，並用清洗緩衝液清洗珠兩次。然後用125mMNaOH洗脫單鏈DNA,隨後使用QiagenMinElutePCR純化柱純化。對純化物質實施標準454乳化和測序方法。使用上述方法，我們獲得以下結果由4輪60x60個實驗的標準454測序產生大腸桿菌重疊群(約130萬個讀出序列)產生303個大於1000bp的重疊群，其具有16,858bp的平均大小，最大為94,060bp。表3包含使用以上方法獲得的其它結果。表3:配對末端測序方法的結果tableseeoriginaldocumentpage5414x4371,822多+14x43髮夾11420,302bp3,330,963bp20,5712個14x43突出端19243,197bp1,512,859bp首先通過對由Genbank獲得的大腸桿菌K12基因組blast檢索所有配對讀出序列進行分析。保留以低於0.1的期望值匹配參比基因組的讀出序列。對於含以內部連4妄序列分隔的兩個獨立blast命中結果的所有讀出序列，分析其基因組中相隔的blast檢索距離，只有在距離小於5,000bp的情況下才保留。然後，依據基因組中第一個和第二個位置的命中結果排序這些讀出序列，並測試，以觀察重疊是否發生在下一個揀選的配對序列中。然後以和上述相同的方式測試這些排序重疊群中每一個與454測序重疊群重疊的配偶體的情況。由此已詳細描述了本發明的有利實施方案，要理解的是，以上段落闡釋的本發明不限於在以上描述中陳述的具體細節，因為有可能存在其許多明顯變更，而不偏離本發明的精神或範圍。本文描述方法的修改和變更對本領域技術人員是顯而易見的，包含在以下的權利要求中。權利要求1.一種獲得DNA構建物的方法，所述DNA構建物包含目標核酸的兩個末端區域，所述方法包括以下步驟(a)片段化大核酸分子，以生產目標核酸；(b)將捕捉元件連接至所述目標核酸，以形成第一環形核酸分子；(c)用切割所述目標核酸但不切割所述捕捉元件的限制性內切核酸酶消化所述第一環形核酸，以產生含所述目標核酸的兩個末端的線性核酸，所述兩個末端由所述捕捉元件分隔；(d)將所述線性核酸與分隔元件連接，以形成第二環形核酸；(e)將所述第二環形核酸轉變為環形單鏈核酸；(f)使第一寡核苷酸對所述環形單鏈核酸退火，並通過滾環擴增來擴增所述環形單鏈核酸，以產生單鏈滾環擴增產物；(g)使第二寡核苷酸對所述單鏈滾環擴增產物退火，以在所述單鏈滾環擴增產物中形成多個雙鏈區；和(h)使用切割所述多個雙鏈區的限制性內切核酸酶將所述單鏈滾環擴增產物消化為小片段，以產生含目標核酸的兩個末端區的所述DNA構建物。2.權利要求1的方法，所述方法還包括在所述片段化步驟後大小分級分離所述目標核酸片段並選擇優選大小的目標核酸片段的步驟。3.權利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸對所述捕捉元件或所述分隔元件退火。4.權利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸對所述捕捉元件或所述分隔元件退火。5.權利要求i的方法，其中所述限制性內切核酸酶是i型或ns型限制性內切核酸酶。6.權利要求l的方法，其中所述目標核酸為至少50kb、至少20kb、至少10kb或至少5kb。7.權利要求l的方法，其中所述目標核酸在50kb和3kb之間、在20kb和3kb之間或在10kb和3kb之間。8.權利要求1的方法，其中所述捕捉元件或所述分隔元件包含標記基因。9.權利要求8的方法，其中所述標記基因是抗生素抗性基因。10.權利要求1的方法，其中所述捕捉元件或所述分隔元件包含真核或原核複製起點。11.權利要求1的方法，其中所述捕捉元件或所述分隔元件被生物素化。12.權利要求11的方法，所述方法還包括在所述消化步驟後分離含捕捉元件的核酸片段的步驟。13.—種獲得含目標核酸兩個末端區的DNA構建物的方法，所述方法包括以下步驟(a)片段化大核酸分子，以產生目標核酸；(b)將連接物連接至所述目標核酸的每個末端；(c)將特徵標籤連接至所述目標核酸，以形成環形核酸分子；(d)用切割所述目標核酸^f旦不切割所述連接物或所述特徵標籤的限制性內切核酸酶消化所述環形核酸，以產生含目標核酸的兩個末端區的所述DNA構建物。14.權利要求13的方法，所述方法還包括在所述片段化步驟後大小分級分離所述目標核酸片段並選擇優選大小的目標核酸片段的步驟。15.權利要求13的方法，所述方法還包括在所述步驟(d)後擴增所述DNA構建物的步驟。16.權利要求15的方法，其中所述擴增如下實施(e)將連接物連接至所述DNA構建物的末端；和(f)通過PCR擴增所述DNA構建物。17.權利要求13的方法，其中所述限制性內切核酸酶是I型或IIS型限制性內切核酸酶。18.權利要求13的方法，其中所述目標核酸為至少50kb、至少20kb、至少10kb或至少5kb。19.權利要求13的方法，其中所述目標核酸在50kb和3kb之間、在20kb和3kb之間或在10kb和3kb之間。20.權利要求13的方法，其中所述特徵標籤包含標記基因或複製起點。21.權利要求1的方法，其中所述連接物或所述特徵標籤^C生物素化。22.權利要求21的方法，所述方法還包括在所述消化步驟後分離含特徵標籤或連接物的核酸片段的步驟。23.—種獲得包含目標核酸兩個末端區域的DNA構建物的方法，所述方法包括以下步驟(a)片段化大核酸分子，以生產目標核酸；(b)將第一連接物連接至所述目標核酸的一個末端，將第二連接物連接至所述目標核酸的第二個末端，以形成連接物標記的目標核酸；(c)通過將所述第一連接物連接至所述第二連接物環化所述連接物標記的目標核酸，以形成含目標核酸區和連接物區的環形核酸分子；(d)在目標核酸區片段化所述環形核酸分子，以產生含目標核酸的兩個末端區的所述DNA構建物。24.權利要求23的方法，其中在步驟(b)前所述大核酸或所述目標核酸用曱基化酶甲基化。25.權利要求24的方法，其中所述甲基化防止一種或多種限制性內切核酸酶對目標核酸的限制性內切核酸酶切割。26.權利要求23的方法，其中所述連接物是髮夾連接物。27.權利要求26的方法，所述方法在步驟(b)之後還包括以下步驟(bl)用外切核酸酶處理所述連接物標記的目標核酸，以消化兩個末端沒有均連接至髮夾連接物的任意目標核酸；(b2)由所述連接物標記的目標核酸去除所述外切核酸酶。28.權利要求23的方法，所述方法在步驟(b)和步驟(c)之間還包括以下步驟(b3)用切割所述第一和第二連接物且不切割所述目標核酸的限制性內切核酸酶消化所述連接物標記的目標核酸，以產生在兩個末端均具有切割過的連接物的連接物標記的目標核酸。29.權利要求23的方法，所述方法在步驟(c)之後還包括去除未環化目標核酸的步驟。30.權利要求29的方法，其中去除未環化目標核酸包括使所述目標核酸與外切核酸酶接觸。31.權利要求23的方法，其中步驟(d)通過機械剪切實施。32.權利要求23的方法，其中所述連接物被生物素化。33.權利要求32的方法，所述方法還在步驟(b)之後包括採用抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白包被的固體支持體通過親和純化來純化所述連接物標記的目標核酸的步驟。34.權利要求32的方法，所述方法還在步驟(d)之後包括採用抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白包被的固體支持體通過親和純化來純化所述DNA構建物的步驟。35.權利要求23的方法，其中所述目標核酸為至少50kb、至少20kb、至少10kb或至少5kb。36.權利要求23的方法，其中所述目標核酸在50kb和3kb之間、在20kb和3kb之間或在10kb和3kb之間。37.權利要求23的方法，其中所述目標核酸在至少500bp到1kb之間、在1kb和3kb之間或在500bp和3kb之間。38.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於10kb。39.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於20kb。40.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於40kb。41.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於5kb。42.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於3kb。43.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於1kb。44.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於500bp。45.權利要求23的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於300bp。46.—種獲得含目標核酸兩個末端區的DNA構建物的方法，所述方法包括以下步驟(a)片段化大核酸分子，以產生目標核酸；(b)將捕捉元件連接至所迷目標核酸，以形成環形核酸分子；(c)用切割所述目標核酸^旦不切割所述捕捉元件的限制性內切核酸酶消化所述環形核酸，以產生含目標核酸的兩個末端區的所述DNA構建物，所述兩個末端區由所述捕捉元件分隔。47.權利要求46的方法，其中所述捕捉元件是含結合對的一個成員的核酸。48.權利要求47的方法，其中所述結合對選自FLAG/抗FLAG抗體、生物素/抗生物素蛋白和生物素/鏈黴抗生物素蛋白。49.權利要求47的方法，其中所述捕捉元件被生物素化。50.權利要求47的方法，所述方法還包括使用含所述結合對的第二個成員的固體支持體通過親和純化富集所述DNA構建物的步驟。51.權利要求46的方法，其中在步驟(b)之前所述大核酸或所述目標核酸用曱基化酶甲基化。52.權利要求51的方法，其中所述甲基化防止一種或多種限制性內切核酸酶對目標核酸的限制性內切核酸酶切割。53.權利要求46的方法，所迷方法在步驟(b)之後還包括去除未環化目標核酸的步驟。54.權利要求53的方法，其中去除未環化目標核酸包括使所述目標核酸與外切核酸酶接觸。55.權利要求46的方法，其中所述目標核酸為至少50kb、至少20kb、至少10kb或至少5kb。56.權利要求46的方法，其中所述目標核酸在50kb和3kb之間、在20kb和3kb之間或在10kb和3kb之間。57.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於5kb。58.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於3kb。59.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於1kb。60.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於500bp。61.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於300bp。62.權利要求46的方法，其中所述目標核酸在至少500bp到1kb之間、在1kb和3kb之間或在500bp和3kb之間。63.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於10kb。64.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於20kb。65.權利要求46的方法，其中所述包含目標核酸的兩個末端區的DNA構建物的大小低於40kb。66.—種環化線性多核苷酸分子的方法，所述方法包括a)提供在水性溶液中的線性多核苷酸分子；b)將所述水性溶液乳化在油中；和c)共價接合線性多核苦酸分子的末端，由此環化所述線性多核苦酸分子。67.權利要求66的方法，其中所述線性多核苷酸分子選自單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA和雙鏈RNA。68.權利要求66的方法，其中所述線性多核苷酸分子的兩個末端具有適於連接的相容末端。69.權利要求66的方法，其中所述線性多核苷酸分子的末端通過連接接合。70.權利要求66的方法，其中所述油與一種或多種表面活性劑混合。71.—種環化線性多核苦酸分子的方法，所述方法包括a)提供在水性溶液中的線性多核苷酸分子群；b)將所述水性溶液乳化在油中，以產生多個含水微反應器；和c)在至少一個微反應器中共價接合線性多核普酸分子的末端，由此環化所述線性多核普酸分子。72.權利要求71的方法，其中多個微反應器恰好包含一個多核苦酸分子。73.權利要求71的方法，其中多個微反應器包含油包水乳液。74.權利要求23的方法，其中在步驟(d)中，所述環形核酸分子通過用限制性內切核酸酶消化-支片段化。75.權利要求17、46或74中任一項的方法，其中所述限制性內切核酸酶是MmeL76.權利要求75的方法，其中在MmeI消化過程中加入含MmeI限制性位點的載體DNA。77.權利要求76的方法，其中加入的所述載體DNA的量摩爾數超過環形核酸。78.權利要求76的方法，其中Mmel酶和載體DNA中的Mmel位點以化學計算量存在。79.權利要求26的方法，所述方法在步驟(b)和步驟(c)之間還包括以下步驟(b4)用切割所述第一和第二髮夾連接物且不切割所述目標核酸的內切核酸酶消化所述連接物標記的目標核酸，以產生在兩個末端均具有切割過的連接物的連接物標記的目標核酸。80.權利要求79的方法，其中所述髮夾連接物在其雙鏈區的每條鏈中具有至少一個脫氧肌苷，其中所述內切核酸酶是內切核酸酶V。全文摘要本發明提供一種製備目標核酸片段的方法，以生產含目標核酸的兩個末端的較小核酸。具體地說，本發明提供克隆和DNA操作策略，以將大目標核酸的兩個末端分離到單個小DNA構建物中，用於快速克隆、測序或擴增。文檔編號C12Q1/68GK101351552SQ200680028181公開日2009年1月21日申請日期2006年6月6日優先權日2005年6月6日發明者B·C·戈德溫,G·J·薩基斯,J·F·西蒙斯,J·H·利蒙,J·伯卡,M·埃格霍姆,S·K·哈奇森,Z·陳申請人:454生命科學公司