一種黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法及其鑑別試劑盒的製作方法

2023-08-13 10:51:51

專利名稱：一種黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法及其鑑別試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方 法及其鑑別試劑盒。
背景技術：
白蛉(Sandfly)是一種較小的雙翅吸血昆蟲，屬於雙翅目、白蛉科。本科白蛉特 徵是遍體生毛，體軀多作灰褐色，隨種類與環境的變異而有深淺的不同，蛉體長約1.5 5. 0mm，依種類而異。頭部有1對大而黑的複眼；有長而分節的觸角1對。蛉的胸背板上有 1對翅狹而細長多毛呈桃葉狀，停息時兩翅向上展開，和它體軀成45°的角度。在胸腹板下 附有3對長足，足上亦多毛，足呈銀灰色閃光，印度的銀足白蛉即以此特徵而命名。雄蛉外 生殖器顯而易見。根據Lewis (1977)和Lane (1993)，白蛉科下含6個屬，其中有2個屬的白蛉僅限分 布拉丁美洲，在我國白蛉科下有3個屬，即白蛉屬、司蛉屬和異蛉屬。白蛉傳播人及動物的 各種利什曼病、白蛉熱、東方癤、卡利翁氏病等，與人類密切相關的蛉種主要是白蛉屬種類， 在醫學上極為重要。我國傳播人際間利什曼病的白蛉媒介主要有四種，即中華白蛉、吳氏白 蛉、亞歷山大白蛉和長管白蛉。流行在華東、華北、陝西關中平原地區的人源性黑熱病，系由 家棲型中華白蛉作為傳播媒介。在陝北、隴南川北、東北遼西等地區犬源性內臟利什曼病， 系由野棲型或近野棲型中華白蛉為傳播媒介。在新疆和內蒙古荒漠內黑熱病自然疫源地， 系由吳氏白蛉為傳播媒介。在吐魯番黑熱病疫區內以亞歷山大白蛉為傳播媒介。在新疆南 部人源性黑熱病流行區內由長管白蛉為傳播媒介。此外，在克拉瑪依荒漠內吳氏白蛉還可 以作為由嬰兒利什曼原蟲引起的皮膚利什曼病的傳播媒介。在大砂鼠體內寄生著對人不致 病的大砂鼠利什曼分布區內，其傳播媒介在甘肅為蒙古白蛉和亞歷山大白蛉；在新疆為蒙 古白蛉和高加索白蛉。在新疆蜥蜴利什曼原蟲分布區內則以微小司蛉新疆亞種為傳播媒 介。白蛉的生活史是屬於完全變態，除成蟲吸血外，其卵、幼蟲、蛹均在土壤內孳生，幼 蟲的越冬期很長。陰暗、潤溼、富含有機物質的土壤內均適於白蛉的孳生。家棲種類的白 蛉幼蟲以屋內土壤為其主要孳生場所；野棲蛉種則以野外各種齧齒動物洞穴為其理想的孳 生場所。白蛉偏野習性，除極少數蛉種可在實驗室內建立循環、繁殖後代，絕大多數白蛉很 難在實驗室內長期傳代循環。白蛉的分類主要是白蛉成蟲的分類。長期以來，白蛉的分類 鑑定工作主要是以成蟲內、外部形態特徵為依據進行的，已形成其傳統的分類體系。由於 白蛉個體微小、種間形態近似以及種下多型現象，現用形態分類方法對其鑑別需要較高的 解剖技能，以及研究者的多年經驗，因此常受標本狀態、環境條件，研究者主觀經驗的影響 較大。同時在黑熱病媒介監測調查中，常常需要人工大量解剖白蛉，從白蛉內部的咽甲、受 精囊、尾器等形態學特徵來判別該地區的白蛉種類及其組成，不僅費時費力，對於保存不善 的白蛉標本常常無法確定其種類。根據遺傳本質DNA為依據來闡明物種間的差別，從分子 水平上鑑別物種，其結果客觀，靈敏準確度高，能彌補傳統形態學一些重要不足。近年來分子鑑別技術在同屬雙翅目的蚊科中已得到廣泛應用，主要的技術有隨機擴增多態(random amplified polymorphism DNA，RAPD)、限制性酶切片斷多態(restrictionfragment length polymorphism, RFLP), DNA 單鏈構象多態(single strand conformationpolymorphism, SSCP)，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)和DNA測序等技術，這些技術 方法目前已經日趨成熟和穩定，經過科學家們廣泛研究證實，核糖體基因(ribosome DNA, rDNA)是分子鑑別和分子系統學研究的較理想的分子指標。本發明以我國白蛉屬四種白蛉(中華白蛉，吳氏白蛉，長管白蛉和亞歷山大白蛉) 為材料，依據分子特徵核糖體DNA第2內轉錄間隔區(rDNA-ITS2)序列，提供一種有效的分 子鑑別方法及鑑別試劑盒。

發明內容
本發明所要解決的技術問題之一是克服傳統白蛉種類鑑別方法的不足提供一種 簡單快速、靈敏、特異的黑熱病媒介白蛉種類的分子鑑別方法。本發明所提供的白蛉種類的分子鑑別方法，包括下列步驟(1)白蛉 DNA 抽提；(2)所提取DNA進行PCR擴增擴增所用引物序列選自白蛉rDNA_ITS2的高度保守 區，引物的序列為上遊5' -CCT GGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T_3' SEQ ID N0:1，下 遊5' -CGC AGC TAA CTG TGT GAA ATC-3『 SEQ ID NO 2 ；PCR 擴增產物進行純化回收；(3)回收的PCR產物進行酶切反應所用限制性內切酶為Dra I ；(4)酶切後產物進行3. 0 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切條帶，判斷白蛉種類情況， 判斷方法如下經Dra I限制性內切酶後，中華白蛉由於沒有該酶的酶切位點，仍然是原 片段的大小，約為450bp大小；亞歷山大白蛉有4個酶切位點，分別在66bp ；76bp ；203bp ； 357bp處，有5個酶切片斷；吳氏白蛉有2個酶切片斷，分別在80bp，391bp處，有3個酶切 片斷；長管白蛉有一個酶切位點，在353bp處，有2個酶切片斷，在不完全酶切時，則有3個 酶切片斷。步驟(1)所述的白蛉DNA抽提包括如下步驟(1)單只白蛉置於1.5ml研磨管中，加入65°C裂解液120 μ 1，1.5 μ IRNAse Α，研 磨30秒，混勻，置於37°C水浴中60分鐘，再加入20mg/mL的蛋白酶K 3μ 1，50°C水浴1小 時至完全消化；(2)加入苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120-150 μ 1，充分混勻，常溫下14，OOOrpm 離心IOmin ；(3)取上清，加入2-3倍體積95%或無水乙醇，常溫下14，OOOrpm離心IOmin(4)棄上清，沉澱自然或37°C烘箱中烘乾；(5)加入Tris-EDTA緩衝液30-50 μ 1溶解，_20°C保持備用；所述的裂解液為DEB緩衝裂解液，該DEB緩衝裂解液含有0. 5 % SDS, 25m mol/ LEDTA,0. lmol/L pH 為 8. 0 的 Tris-OH和 0. 2mol/L NaCl。所述的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液比例為苯酚氯仿異戊醇25 24 1。所述的Tris-EDTA 緩衝液含有 10m mol/L Tris-Cl 和 Im mol/L EDTA，pH 為 8. 0。步驟(2)所述的引物濃度為25-50μπιΟ1/1。
步驟(2)所述的PCR擴增反應條件為將雙蒸滅菌水10μ l，2XMaster PCR mixl2. 5μ l，50ymol/L的引物1μ 1，獲取的DNA樣本1.5μ 1，充分混勻後進行PCR反應，反 應條件為951預變性51^11，941變性lmin、55°C退火lmin、72°C延伸Imin，35個循環後擴 增，72°C延伸 IOmin ；所用 2 XMaster PCR mix 含 MgC124mM ；dNTPs 0. 4mM ；TaqDNA 聚合酶 0. 05u/y 1。步驟(2)所述的PCR擴增產物進行純化回收後進行連接、轉化、篩選，測序，所得四 種白蛉ITS2序列，分別為中華白蛉見序列表SEQ ID NO 3 ；長管白蛉見序列表SEQ ID NO 4 ；亞歷山大白蛉見序列表SEQ ID NO 5 ；吳氏白蛉SEQ ID NO :6。步驟(3)所述的限制性內切酶濃度為lOu/μ 1。步驟(3)所述的酶切反應條件為將膠回收穫得的PCR產物10μ 1，雙蒸水18μ 1， IOXBuffer 2μ 1及限制線內切酶Dra I 2μ 1輕輕混勻，置於37°C水浴孵育IOh。本發明所要解決的另一技術問題是提供一種黑熱病媒介白蛉種類的鑑別試劑盒， 包括下列組成(1)白蛉DNA抽提液包括裂解液、苯酚、氯仿和異戊醇的混合液、Tris-EDTA緩衝 液、蛋白酶K;(2) PCR 反應液包括雙蒸滅菌水、2XMaster PCR mix、濃度為25-50 μ mol/L的引物；所述 2 X MasterPCR mix 含 MgC12 4mM、dNTPs 0. 4mM、Taq DNA 聚合酶 0. 05u/μ 1，所述引物 的序列為上遊5' -CCT GGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T_3' SEQ ID N0:1，下遊 5' -CGCAGC TAA CTG TGT GAA ATC-3' SEQ ID NO 2 ；(3)限制性內切酶Dra I及酶切緩衝液。所述的白蛉DNA抽提液裂解液為DEB緩衝裂解液，含有0. 5% SDS, 25m mol/LEDTA, 0. lmol/L pH為8.0的Tris-OH和0. 2mol/L NaCl ；所述的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液比例 為苯酚氯仿異戊醇25 24 1 ；所述的Tris-EDTA緩衝液含有10m mol/L Tris-Cl 和Im mol/L EDTA, pH為8. 0 ；所述的的蛋白酶K濃度為20mg/mL。本發明的有益效果在於本發明的所用PCR-RFLP方法，在樣本保存不完整，鑑定 人員缺乏長期現場培訓情況下，能夠及時快速地進行白蛉種類鑑別，是對傳統形態學鑑別 技術的一種有益的補充和確認方法。為現場快速檢測白蛉種類提供了一種新的檢測手段。 本發明所提供的鑑別方法簡單實用，試劑盒敏感性高、特異性強、重複性好，為基層展開白 蛉分子學鑑定提供便利。本發明鑑別黑熱病主要媒介白蛉的方法及試劑盒在黑熱病流行病 學監測以及黑熱病暴發時進行快速調查確證白蛉種類和組成有著重要的作用，擁有較廣闊 的應用前景。


圖1實施例1的4種白蛉ITS2基因以Dra I酶切後的3. 0%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中，M-DNA分子量標準；1，2-中華白蛉ITS2酶切後結果；3，4-亞歷山大白蛉
7ITS2酶切後結果；5，6-吳氏白蛉ITS2酶切後結果；7，8，9-長管白蛉ITS2酶切後結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例1四種白蛉種類鑑別方法(1)白蛉DNA抽提1)9個樣本(其中包含2個中華白蛉樣本，2個亞歷山大白蛉樣本，2個吳氏白蛉 樣本和3個長管白蛉樣本)，單只白蛉置於1.5ml研磨管中，加入65°C DEB裂解液120 μ 1， 1. 5 μ IRNAse Α，研磨30秒，混勻，置於37°C水浴中60分鐘，再加入20mg/mL的蛋白酶K 3μ 1，50°C水浴1小時至完全消化；2)加入苯酚、氯仿和異戊醇的混合液150 μ 1，充分混勻，常溫下14，OOOrpm離心 IOmin ；3)取上清，加入3倍體積無水乙醇，常溫下14，OOOrpm離心IOmin4)棄上清，沉澱自然或37°C烘箱中烘乾；5)加入(E) Tris-EDTA緩衝液40 μ 1溶解，_20°C保持備用；(2)所提取DNA進行PCR擴增1)PCR反應體系準備將雙蒸滅菌水10 μ 1，2 XMaster PCR Mix 12. 5 μ 1，50 μ mol/L 的引物 1 μ 1，獲取 的DNA樣本1. 5 μ 1，充分混勻後，短暫離心，進行PCR反應；引物的序列為上遊5』 -CCT GGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T_3，，SEQ ID N0:1，下遊5』 -CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC-3，，SEQ ID NO 2 ；2)其PCR反應的條件為95°C預變性5min後進行94°C變性lmin、55°C退火lmin、 72°C延伸lmin的35個循環的擴增，72°C延伸IOmin後保存；3) PCR產物取5μ 1進行1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷ITS2目的基因擴 增情況；(3)限制性內切酶Dra I進行酶切反應，酶切反應條件是將步驟⑵獲得的PCR產物10 μ 1，雙蒸水18 μ 1，IOX BufferTangoTM μ 1 2 μ 1 和 Dra I 2 μ 1 輕輕混勻，置於 37°C水浴孵育 IOh ；(4)將酶切後的PCR產物進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切條帶，判斷白蛉種 類情況。酶切結果見附圖1，判斷結果如下經Dra I限制性內切酶後，中華白蛉由於沒有該 酶的酶切位點，仍然是原片段的大小，約為450bp大小；亞歷山大白蛉有4個酶切位點，分別 在66bp ；76bp ；203bp ；357bp處，有5個酶切片斷；吳氏白蛉有2個酶切片斷，分別在80bp， 391bp處，有3個酶切片斷；長管白蛉有一個酶切位點，在353bp處，有2個酶切片斷，在不 完全酶切時，則有3個酶切片斷。實施例2
4種白蛉的ITS2序列測定1)取四種白蛉樣本，單只白蛉置於1.5ml研磨管中，加入65°CDEB裂解液120μ 1， 1. 5 μ 1 RNAse Α,研磨30秒，混勻，置於37°C水浴中60分鐘，再加入20mg/mL的蛋白酶K 3μ 1，50°C水浴1小時至完全消化；2)加入苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120 μ 1，充分混勻，常溫下14，OOOrpm離心 IOmin ；3)取上清，加入2倍體積無水乙醇，常溫下14，OOOrpm離心IOmin ；
4)棄上清，沉澱自然或37°C烘箱中烘乾；5)加入Tris-EDTA緩衝液30 μ 1溶解，_20°C保持備用；6)將步驟5)的樣本進行PCR反應將雙蒸滅菌水10μ l，2XMaster PCR Mix 12. 5μ 1，25μπι01/1的引物1μ 1，步驟5)獲取的DNA樣本1.5 μ 1，充分混勻後，短暫離心， 進行PCR反應；其PCR反應的條件為95°C預變性5min後進行94°C變性lmin、55°C退火 lmin、72°C延伸Imin的35個循環的擴增，72°C延伸IOmin後保存；引物的序列為上遊 5，-CCT GGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T_3，，SEQID N0:1，工遊5，_CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC-3，，SEQ ID NO :2。7) PCR產物取5μ 1進行1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷ITS2目的條帶擴 增情況。8)切膠回收純化按照「B型小量DNA片斷快速膠回收試劑盒」所提供的操作指南 回收靶標PCR片斷。9)連接將回收純化的PCR產物與質粒載體(pGEM-T easy Vectors)進行連接， 其操作程序按照「pGEM-T easy Vectors」供應商提供的protocol進行。10)轉化轉化程序按照「DH5 α感受態細胞」供應商提供的轉化程序進行。11)篩選，測序將重組的陽性質粒挑出後擴增送樣，由上海英駿生物技術有限公 司進行測序，測序結果見序列表SEQ ID Ν0:3-6。
權利要求
一種黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於包括下列步驟(1)白蛉DNA抽提；(2)所提取DNA進行PCR擴增擴增所用引物序列選自白蛉核糖體DNA第2內轉錄間隔區(rDNA ITS2)的高度保守區，引物的序列為上遊5′ CCT GGT TAG TTT CTT TTCCTC CGC T 3′，SEQ ID NO1，下遊5′ CGC AGC TAA CTG TGT GAAATC 3′，SEQID NO2；PCR擴增產物進行純化回收；(3)回收的PCR產物進行酶切反應所用限制性內切酶為Dra I；(4)酶切後產物進行3.0％瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切條帶，判斷白蛉種類情況，判斷方法如下經Dra I限制性內切酶後，中華白蛉由於沒有該酶的酶切位點，仍然是原片段的大小，約為450bp大小；亞歷山大白蛉有4個酶切位點，分別在66bp；76bp；203bp；357bp處，有5個酶切片斷；吳氏白蛉有2個酶切片斷，分別在80bp，391bp處，有3個酶切片斷；長管白蛉有一個酶切位點，在353bp處，有2個酶切片斷，在不完全酶切時，則有3個酶切片斷。
2.根據權利要求1所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於步驟(1)所 述的白蛉DNA抽提包括如下步驟(1)單只白蛉置於1.5ml研磨管中，加入65°C裂解液120μ1，1.5μIRNAse Α，研磨30 秒，混勻，置於37°C水浴中60分鐘，再加入20mg/mL的蛋白酶K 3 μ 1，50°C水浴1小時至完 全消化；(2)加入苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120-150μ 1，充分混勻，常溫下14，OOOrpm離心 IOmin ；(3)取上清，加入2-3倍體積95%或無水乙醇，常溫下14，OOOrpm離心IOmin；(4)棄上清，沉澱自然或37°C烘箱中烘乾；(5)加入Tris-EDTA緩衝液30-50μ 1溶解，_20°C保持備用。
3.根據權利要求2所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於所述的裂解 液為DEB緩衝裂解液，該DEB緩衝裂解液含有0. 5% SDS, 25m mol/L EDTA，0. lmol/L pH為 8. 0的Tris-OH和0. 2mol/L NaCl ；所述的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液比例為苯酚氯 仿異戊醇 25 24 1 ；所述的 Tris-EDTA 緩衝液含有 IOm mol/L Tris-Cl 和 Im mol/L EDTA，pH 為 8. 0。
4.根據權利要求1所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於步驟(2)所 述的引物濃度為25-50ymol/L。
5.根據權利要求4所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於所述的引物 濃度為50ymol/L。
6.根據權利要求1所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於步驟(2)所 述的PCR擴增為將雙蒸滅菌水10μ l，2XMaster PCR mix 12. 5 μ 1，50 μ mol/L的引物1μ 1，獲取的DNA樣本1. 5 μ 1，充分混勻後進行PCR反應，反應條件為95°C預變性5min， 94°C變性lmin、55°C退火lmin、72°C延伸lmin，35個循環後擴增，72°C延伸IOmin ；所述2XMaster PCR mix 含 MgC124mM ;dNTPs 0. 4mM ；Taq DNA 聚合酶 0. 05u/μ 1。
7.根據權利要求1所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於步驟(2)所 述的PCR擴增產物進行純化回收後進行連接、轉化、篩選，測序，所得四種白蛉ITS2序列，分別為中華白蛉，SEQ ID NO 3CGCAGCTAACTGTGTGAAATCGTGTGAACTGCAGGACACATGAACATCGACATTTTGAACGCACATTGCGGTCCATGCTAATGTTTAACTTGTTAGACTGCATGGACCACGTATGGTTGAGTGTCGTAAATAATAAGCAAAACAAATTGTTTTTTTTTTTGATAAAAAACATTGGGGCTATGACAGTCTAGTACTATCATGCTCTTAAGTTGTGTTTATATATGTTGTACATTTGAATGTACCCAATAAAATGTAATATTACATTAAAAGGTATATATCATAGTCATTGGATTATTATTTTACTTTGATCATTGTTATATATTCTTGCGTAATATTACTAGGGGTTATTTGTTAATAATGTACAAAAAAAAAAACACATATAAAGCGACCTCAACTCATGCGTGACTACCCCCTAAATTTAAGCATATTAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGG長管白蛉，SEQ ID NO 4CGCAGCTAACTGTGTGAAATCGTGTGAACTACAGGACACATGAACATCGACATTTTGAACGCACATTGCGGTCCATGCTAATGTTTAACTTGTTAGACTGCATGGACCACGTATGGTTGAGTGTCGTAAATGATAAGCAAAACAAATTGTTTTTATTAAAAACATTGGGGCTATGATAGTCTAGTACTTTCATGCTTTTAAGTTTTGTGTAAGAAAAGTACATTTGAATGTACCCAATAAAATGTAATATTTACATTAATAGAGGTATATATCATAGTCATTGAATTATATTACTTTGATCATTGTTATATATTCTCGCGTAATATTACTAGGGATTATTCTTTAATAATGTACAATAAACAAAAAAACATTTAAAGCGACCTCAACTCATGCGTGACTACCCCCTGAATTTAAGCATATTAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGG亞歷山大白蛉，SEQ IDNO 5CGCAGCTAACTGTGTGAAATCGTGTGAACTGCAGGACACATGAACATCGACATTTTGAACGCATATTGCGGTCCATGCAAAAGTTTAAACTTGTTTAAACTGCATGGACCACGTATGGTTGAGTATCGTAAATATTAAGCAATTGAAATTGTTTTTTATTTTTATAAAAAAACATTGGAGCTATGGAAATTAATTTTTTCATGCTCTTAATATATATGTTTTTAAAGCATATTTGAATGTACCCAATATATAAATATTAAAAAAATATAAGTGGTATATCAAAGTCATTGGATGATTTTTTCTATAAAAATTTGAAAAAGACATATTGTTATACAGAAAAGCTTATTTTTTTTAATATAAAAGGGATTATTCACTTTAAAAAATATGCACAAAAAAAACTTAATTGCGATCTCAACTCATACGTGACTACCCCCTGAATTTAAGCATATTAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGG吳氏白蛉，SEQ ID NO 6TGTGAACTGCAGGACACATGAACATCGACATTTTGAACGCACATTGCGGTCCATGCTAATGTTTTTAACTTATGTTTTTAAACTGCATGGACCACGTATGGTTGAGTGTCGTAAATAATAAGCAGAACAAATTGTTTTTACTACACCCTAATTGTTGGGGGGTAGTAAAAACATTGGAGCTATGTAAGTCCTTTGTACTTTCATGCTCTTAAAATTTTTTTTGACGCATTTGAATGTACTCATTGAAAAATGTAATATTACATTATGTGAGTGTAACATCATAATCATTGCATAAATCACTTATGTGAGATTTTTGTTACATTCCAGTATTATTACTATAAGAGATTATTCATAATAAAGAATGTGTCTAAAGAAAAAATGTATATTTTTAAAAAAGCGACCTCAACTCATGCGTGACTACCCCCTAAATTTAAGCATAATCACTA
8.根據權利要求1所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法，其特徵在於步驟(3)所述的限制性內切酶濃度為lOu/μ 1，所述的酶切反應條件為將膠回收穫得的PCR產物 10 μ 1，雙蒸水18 μ 1，IOX Buffer 2 μ 1及限制線內切酶Dra I 2 μ 1輕輕混勻，置於37°C水 浴孵育IOh。
9.一種黑熱病媒介白蛉種類的鑑別試劑盒，其特徵在於包括下列組成(1)白蛉DNA抽提液包括裂解液、苯酚、氯仿和異戊醇的混合液、Tris-EDTA緩衝液、蛋 白酶K;(2)PCR反應液包括雙蒸滅菌水、2XMasterPCR mix、濃度為25-50ymol/L的引物； 所述 2XMaster PCR mix 含 MgC124mM、dNTPs 0. 4mM、Taq DNA 聚合酶 0. 05u/μ 1，所述引 物的序列為上遊5' -CCT GGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T-3'，SEQ ID NO :1，下遊 5' -CGC AGC TAA CTG TGT GAAATC-3『，SEQ ID NO 2 ；(3)限制性內切酶DraI及酶切緩衝液。
10.根據權利要求9所述的黑熱病媒介白蛉種類的鑑別試劑盒，其特徵在於所述的 白蛉DNA抽提液裂解液為DEB緩衝裂解液，含有0.5% SDS，25m mol/L EDTA，0. lmol/L pH 為8. 0的Tris-OH和0. 2mol/L NaCl ；所述的苯酚、氯仿和異戊醇的混合液比例為苯酚氯 仿異戊醇 25 24 1 ；所述的 Tris-EDTA 緩衝液含有 IOm mol/L Tris-Cl 和 Im mol/L EDTA, pH為8. 0 ；所述的的蛋白酶K濃度為20mg/mL。
全文摘要
本發明涉及一種黑熱病媒介白蛉種類的鑑別方法及其鑑別試劑盒。本發明的鑑別方法包括下列步驟白蛉DNA抽提，所提取DNA進行PCR擴增，用限制性內切酶Dra I酶切，觀察酶切條帶，根據有無酶切及酶切片段判斷白蛉種類情況。本發明的鑑別試劑盒包括白蛉DNA抽提液，PCR反應液，限制性內切酶Dra I及酶切緩衝液。本發明所提供的鑑別方法簡單實用，試劑盒敏感性高、特異性強、重複性好，為基層展開白蛉分子學鑑定提供便利。
文檔編號C12Q1/68GK101955992SQ201010159499
公開日2011年1月26日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者何宇平, 危芙蓉, 張儀, 田楨幹, 陸曄, 顧燈安 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所;中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局