製備消毒的胰酶粉末的方法

2023-08-13 23:43:51

專利名稱：製備消毒的胰酶粉末的方法
專利說明製備消毒的胰酶粉末的方法 本發明涉及製備和使用胰酶的方法，其中通過加熱胰酶降低一種或多種生物，特別是病毒汙染物在其中的濃度。
胰酶是一種來源於哺乳動物胰腺的物質並且包含不同的消化酶，諸如脂酶、澱粉酶和蛋白酶。胰酶已經用於治療胰腺外分泌機能不全，它通常涉及囊性纖維化、慢性胰腺炎、胰切除術後、胃腸旁路分流術後(例如Billroth II胃腸吻合術)和因新生物導致的導管梗阻(例如胰腺或總膽管梗阻)。就胰酶在藥物產品而言，優選基本上維持不同消化酶的高水平內在活性。然而，這些酶可以發生降解，例如在儲存時，並且對升溫特別敏感。因此，胰酶需要在整個操作、生產和儲存過程中謹慎控制條件。
由於胰酶的動物來源而使得它還可能包含其它不需要的成分，諸如一種或多種生物汙染物，例如病毒汙染物。在超過100年的包含胰酶的藥物產品商業化過程中，尚無報導患者實際受到被任何病毒汙染的胰酶侵害的情況。然而，生產來源於生物組織和/或體液的藥物產品的公司經受了來自管理部門的壓力，以便通過將所有種類的汙染物降至最可能的低水平來增加其產品安全性水平，無論是否認為任何關注的汙染物為人病原體。就胰酶在藥物產品中的應用而言，由此需要將其中的生物汙染物濃度降至一般可接受的檢測限。
因此，就胰酶的生產、操作和儲存過程而言，本領域技術人員面臨如下挑戰，即以維持高水平的不同消化酶活性，同時將一種或多種生物汙染物在其中的濃度降至最低限度的方式制定這類方法。
目前胰酶的生產方法看起來並不能夠使所有的生物汙染物，特別是特定的病毒有效滅活至目前可接受的檢測限。
已知不同的手段可以降低酶組合物中病毒和細菌的濃度。這類方法包括加熱處理、過濾、添加化學滅活劑或致敏物、用輻射處理和延長加熱。這些方法如下所述。
加熱處理意旨例如將產品加熱至60℃下70小時，它可以破壞敏感性產品。在某些情況中，常規的加熱滅活實際上可以破壞大量產品的酶活性。
過濾包括過濾產品以便以物理方式除去汙染物。令人遺憾的是，該方法也可以除去具有高分子量的產物。此外，在某些情況中，小病毒和類似大小的汙染物和病原體無法通過濾器除去。
化學致敏操作包括添加結合病毒DNA/RNA並且通過UV或其它輻射活化的有害試劑。這種輻射產生了結合病毒DNA/RNA的反應性中間體和/或自由基，打斷了DNA/RNA主鏈上的化學鍵和/或以致使病毒不再複製這類方式交聯或複合病毒DNA/RNA。這一操作需要從產品中洗滌未結合的致敏物，因為這些致敏物即使並非誘變性或致癌性的，也有毒性，並且不能對患者給予。
美國專利US 3,956,483(Lewis)中披露了製備具有合適的澱粉分解，蛋白水解和脂解活性並且從其中消除有害細菌，同時維持所述活性的方法。該方法包含將胰酶加熱至120-180(約49-82℃)的足夠高的溫度。然而Lewis未能提供適合於將病毒濃度降至目前可接受的檢測限的方法。
US 6,749,851(Mann)中提示了通過下列步驟處理包含消化酶的組合物在第一步中通過(a)降低組合物的溫度、(b)減少組合物中的溶劑或(c)向組合物中添加穩定劑，隨後在第二步中輻射該組合物。
Braeuniger等(Braeuniger等，Int.J.Hyg.Environ.Health203，71-75，2000)提示了加熱在滅活牛細小病毒中的應用。已經證實可以滅活的牛細小病毒依賴於暴露和溼度。一般而言，較高的溼度使得熱暴露期限較短，從而提供與較低溼度與較長暴露期限組合相同的滅活。然而，Braeuniger等未披露任何有關加熱對構成動物胰酶組成部分的酶諸如脂酶、澱粉酶和蛋白酶所具有的作用的內容。因此，對提供具有高活性水平的酶的胰酶而同時足以降低生物汙染物的濃度的方法存在需求。
已經發現選擇的條件可以用於製備胰酶，其中一種或多種生物汙染物在其中的濃度得到降低，並且其中將酶活性維持在可接受的水平上。特別地，已經發現本文披露並且請求保護的方法用於降低胰酶中病毒汙染物的濃度。此外，已經發現本文所述的方法有效地滿足了管理部門有關從生物產品中除去病毒，同時將酶活性(例如脂酶、蛋白酶和澱粉酶)維持在可接受的水平上的各種要求(例如由Committee ForProprietary Medicinal Products頒布的「Note For Guidance onVirus Validation StudiesThe Design，Contribution andInterpretation of Studies Validating the Inactivation andRemoval of Viruses」(下文稱作「CPMP/BWP/268/95」)。
本文所述方法和所得胰酶以及通過本文所述方法獲得的包含該胰酶的藥物組合物的另一個優點在於其在實驗室規模、中試規模和生產規模上的可應用性。
因此，本文披露的一個實施方案為製備胰酶的方法，其中通過下列步驟降低了一種或多種生物汙染物，特別是病毒汙染物的濃度在至少85℃的溫度下加熱包含一種或多種溶劑的胰酶的分散形式，並且在該加熱步驟過程中的任意點獲得的胰酶的分散形式中總溶劑含量低於9％重量。這類方法提供了其中將酶活性維持在可接受水平的胰酶，並且其中一種或多種生物汙染物，特別是一種或多種病毒汙染物的濃度得到降低。
在另一個實施方案中，本文描述了製備胰酶的方法，包含下列步驟 (a)預加熱包含一種或多種溶劑的胰酶的分散形式到至少85℃的溫度；並且 (b)在至少85℃的溫度下將胰酶的分散形式持續加熱達48小時期限，並且在加工步驟(b)過程中的任意點獲得的胰酶的分散形式中總溶劑含量低於9％重量。
本文所述的另一個實施方案涉及可通過上述段落獲得的胰酶。
本文披露的另一個實施方案為按照本文披露的方法製備包含胰酶的藥物組合物的方法，其中這類藥物組合物為適合於口服給藥和速釋和/或調釋的劑型，這類劑型可以選自片劑、丸粒、微丸、微球、顆粒、粒劑、粉末、混懸液、乳液、分散體、膠囊、小藥囊以及其它劑型。
另一個實施方案為藥物組合物，包含 (1)藥理學有效量的胰酶，其中該胰酶以包含一種或多種溶劑的分散胰酶形式被加熱到至少85℃的溫度，其中存在於胰酶中的溶劑總量在加熱步驟過程中的任意點均低於9％重量；其中在加熱後存在於胰酶中的病毒汙染物滴度水平低於加熱前存在於胰酶中的病毒汙染物滴度水平至少1000倍；和 (2)一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
另一個實施方案涉及膠囊或小藥囊形式的藥物組合物，其中所述的膠囊或小藥囊包含進行了所披露的過程的胰酶。
另一個實施方案涉及治療胰腺外分泌機能不全的方法，通過給予安全和有效量的經本文所述方法獲得的胰酶來進行。
其它目的、特徵和優點在如下的實施方案詳細描述中闡述，且部分由本說明書而清楚或可以通過實施請求保護的本發明學習到。這些目的和優點可以通過書面的說明書及其權利要求中特別指出的方法和組合物實現和達到。
附圖簡述

圖1在80℃、85℃、90℃、95℃和100℃溫度與1％溶劑含量下的胰酶加熱實驗後的脂酶活性。在2、4、6、12、15、18、21、24和30小時後測定脂酶活性。
圖2在90℃和95℃溫度與3％溶劑含量下加熱胰酶後的脂酶活性。在2、4、8、15、24和48小時後測定脂酶活性。
圖3在80℃溫度與3％、6％、9％和12％溶劑含量下加熱胰酶後的脂酶活性。在0.5、1.0和3.0小時後測定脂酶活性。
圖4在具有1％溶劑含量的80℃、85℃、90℃、95℃和100℃溫度下使用豬細小病毒摻加的豬胰酶Log滴度下降(下文稱作「PPV-摻加的胰酶」)。在6、12、15、18、21、24和30小時後測定病毒濃度。
圖5在具有1％和3％溶劑含量的90℃和95℃溫度下使用豬細小病毒摻加的12小時期限的PPV-摻加的胰酶Log滴度下降(下文稱作「PPV-摻加的胰酶」)。在3、6和12小時後測定病毒濃度。
除非另作陳述，否則本文所用的所有技術和科學術語指定具有與相關領域技術人員通常理解相同的含義。
本文所用的術語「消毒」意指進行本文所述方法的胰酶，特別是分散的胰酶中發現的至少一種生物汙染物的濃度降低。更具體地說，術語「消毒」意指進行本文所述方法的胰酶，特別是分散的胰酶中發現的至少一種病毒汙染物的濃度降低。
本文所用的術語「胰酶」意指來源於任何哺乳動物胰腺的胰酶，諸如牛和豬胰酶。例如，按照美國專利US4,623,624中所述的方法或類似方法生產的胰酶可以用於本發明披露的目的。為了達到減少胰酶中生物汙染物的優選效果，優選應用與所述方法條件相容的分散形式胰酶。胰酶的分散形式包含例如粉末、丸粒、微丸、微球、顆粒和粒劑。使用胰酶粉末，例如直接獲自生產胰酶方法的胰酶粉末獲得了優選的效果。如本文所用的胰酶還可以包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑，它們與本文所述的加工條件相容並且可以例如選自如下提供的藥學上可接受的賦形劑。
本文所用的術語「生物汙染物」意指在直接或間接接觸胰酶時可能對胰酶或對其接受者具有有害作用的汙染物。此外，術語「活性生物汙染物」意指能夠單獨或與另一種因素，諸如第二種生物汙染物在胰酶製劑或對胰酶接受者導致有害作用的生物汙染物。這類生物汙染物包括，但不限於病毒汙染物和/或病菌。病菌包括，但不限於細菌、黴菌和/或酵母。生物汙染物可以為人病原體。
本文所用的術語「病毒」或「病毒汙染物」意指特別是無包膜病毒。更具體地說，術語「病毒」或「病毒汙染物」包括所謂的高耐受性病毒如細小病毒科，特別是豬細小病毒科；環病毒科，特別是豬環病毒科；和杯狀病毒科，特別是豬杯狀病毒科。豬細小病毒(PPV)可以用作全部類型的高度耐受性病毒特別是高度耐受性豬病毒的一般可接受的模型或指示劑。此外，本說明書上下文中的術語「病毒」或「病毒汙染物」還包括小核糖核酸病毒科，特別是豬小核糖核酸病毒科；呼腸孤病毒科，特別是豬呼腸孤病毒科；星狀病毒科，特別是豬星狀病毒科；腺病毒科，特別是豬腺病毒科和hepeviridae，特別是豬hepeviridae。
本文所用的術語「溶劑(solvent)」或「溶劑(solvents)」意指作為結合或複合液體或作為自由可用的液體存在於胰酶中的液體量或比例。自由可用的液體意旨存在於被加熱的胰酶中與胰酶結合或與之複合的液體。存在於胰酶中的該液體通常包含水和親酶的有機溶劑以及水與所述親酶有機溶劑的混合物。合適的親酶有機溶劑為例如揮發性有機溶劑，如丙酮、氯仿、二氯甲烷或直連或支鏈C1-4-鏈烷醇類，特別是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、2-丁醇、叔丁醇或所述溶劑的混合物。2-丙醇優選為親酶的有機溶劑。一般而言，水與親酶的有機溶劑之比在50∶1-3∶1，更一般地在30∶1-10∶1。
無論使用何種溫度範圍，例如85℃-100℃，均意指在清楚描述範圍內的任意處的溫度和在清楚描述範圍內導致不同溫度的溫度輪廓，包括範圍極限。可以將在本文披露方法過程中的溫度範圍連續或間斷施用，只要滿足所披露的溫度範圍內的總時間期限。
本文所述的方法包含在至少85℃的溫度下加熱包含一種或多種溶劑的胰酶的分散形式，並且在該加熱步驟過程中的任意點獲得的胰酶的分散形式中總溶劑含量低於9％重量。在一個實施方案中，可以將胰酶的分散形式加熱達48小時期限。
在這類方法的一個實施方案中，胰酶的溶劑含量一般低於8％，甚至更一般低於6％，通常低於5％，大部分等於或低於3.5％，優選0.1％-3.5％，更優選0.1％-3％且甚至更優選0.1％-1.6％重量。在其它實施方案中，溶劑含量低於7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.0％或0.5％。
在一個實施方案中，本文所述的方法使用了分散的胰酶，特別是胰酶粉末，其中溶劑含量為9％重量或9％重量以下，一般在2％-3.5％重量。然後將胰酶加熱至所需加工溫度，可以在85℃-100℃，例如90℃。在開始的預加熱期過程中，胰酶中的溶劑含量一般作為時間和溫度的函數下降。應理解所述的開始預加熱期的期限為批量大小和起始的批量溫度的函數且由此可以花費約15分鐘到長至10小時。在預加熱期後，在至少85℃，通常在85℃-100℃，例如在90℃和所披露的加工時間，即達48小時期限，例如24小時期限中持續加熱胰酶的分散形式。當使用本文披露的參數內的方法時(一般在大氣壓下)，發現在預加熱期結束時達到的溶劑含量一般可以為0.1％-1.6％重量。可以觀察到在預加熱期結束時達到的0.1％-1.6％重量溶劑含量在整個優選加工參數範圍內相對恆定。在終止如本文所述的方法後，可以使加熱的胰酶再次接觸正常環境條件(例如室溫和正常溼度條件)。可以在這些正常環境條件下維持通過本文所述方法實現的胰酶中病毒汙染物下降，因為如本文所述的任何病毒汙染物在所述加工條件下已經被不可逆地滅活。
在另一個實施方案中，預加熱分散的胰酶到至少85℃的溫度，且隨後在至少85℃下加熱1小時-36小時期限，更優選8小時-30小時期限，更優選10小時-24小時期限。在這類方法的一個額外的實施方案中，預加熱分散的胰酶到至少85℃的溫度，且隨後在至少85℃下加熱1小時-36小時期限，諸如，例如1小時，2小時，3小時，4小時，5小時，6小時，7小時，8小時，9小時，10小時，11小時，12小時，13小時，14小時，15小時，16小時，17小時，18小時，19小時，20小時，21小時，22小時，23小時，24小時，25小時，26小時，27小時，28小時，29小時，30小時，31小時，32小時，33小時，34小時，35小時或36小時。在這類方法的另一個實施方案中，預加熱分散的胰酶到至少85℃的溫度，且隨後在至少85℃下加熱10小時-30小時期限。
在另一個實施方案中，將胰酶預加熱到至少85℃的溫度，例如加熱至85℃-100℃的溫度，且隨後在85℃-100℃，特別是在85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃的溫度或這些指定整數溫度值之間範圍中的任意溫度下加熱。在這類方法的一個額外的實施方案中，將胰酶預加熱到至少85℃的溫度，例如加熱至85℃-95℃的溫度，且隨後在85℃-95℃的溫度，特別是在85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃或這些指定整數溫度值之間範圍中的任意溫度下加熱。在該實施方案的其它備選方案中，將胰酶預加熱到至少85℃的溫度，例如加熱至90℃-100℃的溫度，且隨後在90℃-100℃的溫度，特別是在90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃或這些指定整數溫度值之間範圍中的任意溫度下加熱。在該實施方案的更優選的備選方案中，將胰酶預加熱到至少85℃的溫度，例如加熱至90℃-95℃的溫度，且隨後在90℃-95℃的溫度，特別是在90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃或這些指定整數溫度值之間範圍中的任意溫度下加熱。
在這類方法的另一個實施方案中，獲得的胰酶的溶劑含量在0.1％-3.5％重量並且將胰酶預加熱到至少85℃的溫度，例如加熱至85℃-100℃的溫度，且隨後在85℃-100℃溫度下加熱8小時-30小時期限。
在這類方法的另一個實施方案中，獲得的胰酶的溶劑含量在0.1％-3.0％重量並且將胰酶預加熱到至少85℃的溫度，例如加熱至85℃-95℃的溫度，且隨後在85℃-95℃溫度下加熱10小時-30小時期限。
在這類方法的另一個實施方案中，獲得的胰酶的溶劑含量在0.1％-1.6％重量並且將胰酶預加熱到至少85℃的溫度，例如加熱至85℃-95℃的溫度，且隨後在85℃-95℃溫度下加熱10小時-30小時期限。
由於使用了這類方法的每一單一和合併的實施方案，所以胰酶中一種或多種生物汙染物的濃度得到降低，特別是一種或多種病毒汙染物的濃度得到降低，而基本上不會影響胰酶的活性。在一個實施方案中，高度耐受性病毒在胰酶中的濃度，更優選豬細小病毒的濃度得到降低。
另外披露了可通過本文所述方法獲得的胰酶。上述對本文所述方法進行的所有準備也適用於可通過這類方法獲得的胰酶。
另一個實施方案涉及按照本文所述方法製備包含胰酶的藥物組合物的方法，其中這類藥物組合物為適合於口服給藥的劑型。口服劑型可以用於速釋和/或調釋，這類劑型可以為片劑、丸粒、微丸、微球、顆粒、粒劑、粉末、混懸液、乳液、分散體、膠囊、小藥囊以及其它劑型。
在用於製備藥物組合物的這類方法的一個實施方案中，進一步用耐胃酸的包衣層給胰酶和/或其劑型包衣。
在用於製備藥物組合物的這類方法的一個實施方案中，任選將耐胃酸包衣的胰酶或其劑型進一步填充入小藥囊/或膠囊。
在此描述了藥物組合物，包含 (1)藥理學有效量的胰酶，其中該胰酶以包含一種或多種溶劑的分散胰酶形式被加熱到至少85℃的溫度，其中存在於胰酶中的溶劑總量在加熱步驟過程中的任意點均低於9％重量；其中在加熱後存在於胰酶中的病毒汙染物滴度水平低於加熱前存在於胰酶中的病毒汙染物滴度水平至少1000倍；和 (2)一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
在這類藥物組合物的一個實施方案中，胰酶存在於適合於口服給藥的劑型中。口服劑型可以用於速釋和/或調釋，這類劑型可以為片劑、丸粒、微丸、微球、顆粒、粒劑、粉末、混懸液、乳液、分散體、膠囊、小藥囊以及其它劑型。
在這類藥物組合物的另一個實施方案中，進一步用耐胃酸的包衣層給胰酶和/或其劑型包衣。
還披露了膠囊或小藥囊形式的藥物組合物，所述的膠囊或小藥囊包含本文所述的胰酶。
在這類藥物組合物的另一個實施方案中，該組合物進一步包含藥學上可接受的賦形劑。
在這類藥物組合物的另一個實施方案中，該組合物為適合於口服給藥的劑型。口服劑型可以用於速釋和/或調釋，這類劑型可以為片劑、丸粒、微丸、微球、顆粒、粒劑、粉末、混懸液、乳液、分散體、膠囊、小藥囊以及其它公知的劑型。
在這類藥物組合物的另一個實施方案中，進一步用耐胃酸的包衣層給胰酶和/或其劑型包衣。
本文所述的藥物組合物可以包含藥學上可接受的賦形劑。用於上述組合物的藥學上可接受的賦形劑以如下為典型糖類，諸如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；澱粉，諸如玉米澱粉、木薯澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素和衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；磷酸鈣，諸如磷酸二鈣和磷酸三鈣；硫酸鈉；硫酸鈣；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；鹼土金屬硬脂酸鹽，諸如硬脂酸鎂和硬脂酸鈣；硬脂酸；植物油，諸如花生油、棉子油、芝麻油、橄欖油和玉米油；非離子型、陽離子型和陰離子型表面活性劑；乙二醇聚合物；β環糊精；脂肪醇類；和水解穀類固體；以及其它無毒性的相容性填充劑、粘合劑、崩解劑、試劑，例如滑石粉；緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、矯味劑和其它對在藥物製劑中應用而言可接受的賦形劑。
一般而言，本發明的藥物組合物可以包含0.1％-100％，諸如，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，優選25％-90％，諸如，例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，更優選50％-90％，諸如，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％重量的胰酶，而剩餘部分(如果有的話)由藥學上可接受的助劑、賦形劑和/或載體構成。
在一個實施方案中，藥物組合物包含(a)50％-90％重量的通過本文所述方法獲得的胰酶；和(b)10％-50％重量的藥學上可接受的賦形劑，例如乙二醇聚合物，特別是乙二醇2000，3000，4000，6000，8000和/或10000，成分(a)和(b)添加至100％重量。
在另一個實施方案中，藥物組合物包含(a)55％-85％重量的通過本文所述方法獲得的胰酶；(b)5％-35％重量的乙二醇聚合物；(c)1.0％-20％重量的丙-2-醇；和(d)任選0％-10％重量的石蠟，在每種情況中成分(a)，(b)，(c)和(d)均添加至100％重量。包含胰酶的其它組合物例如披露在EP 0 583 726和EP 0 826 375中。
本文所述的方法可以在至少85℃的任意溫度下進行，該溫度不會對胰酶產生不可接受水平的損害。按照本文所述的方法，損害的「可接受的水平」可以根據所用的本文所述特定方法的某些特徵的不同而改變，諸如所用特定胰酶的性質和特徵和/或所加熱胰酶的指定應用，並且可以由本領域技術人員根據經驗確定。損害的「不可接受的水平」由此可以為排除所加熱胰酶安全和有效應用的損害水平。可以使用本領域技術人員公知的方法和技術中的任意種測定對指定胰酶樣品損害的特定水平。
當用於藥物組合物中時，加熱後的酶活性為原始酶活性的50％或50％以上，優選70％或70％以上，更優選85％或85％以上且最優選90％或90％以上是理想的。
為了建立將酶活性降低水平減至最低限度的條件，進行實驗。在幾個系列的這類實驗中，在如下詳細描述的某些實驗條件下加熱前和之後測定為主要酶的脂酶的原始酶活性和殘留酶活性。
在類似系列的實驗中，測定了生物汙染物在其中的濃度下降。在這類實驗中，在如下詳細描述的某些實驗條件下加熱前和之後測定為主要病毒的高度耐受性豬細小病毒的病毒滴度值。就每一實驗而言，使用豬細小病毒-摻加的豬胰酶樣品。
通過終點滴定測定PPV-摻加的樣品的病毒滴度，包括標準偏差，並且隨後按照German「Bundesanzeiger」 No.84，May 4，1994中所述的Spearman-Kaerber公式計算半數-最大組織培養感染劑量(＝TCID50)。因此，使用細胞培養基對等分部分連續1∶3稀釋，並且使用8-倍複製品在包含相應靶細胞的96-孔微量滴定板中加入每一稀釋液的等分部分。在孵育6-7天後，用顯微鏡檢查靶細胞的病毒誘導的CPE。如上所述計算病毒滴度並且將它們表示為log10 TCID50/ml與95％置信限。通過對數下降因子(LRF)描述滅活或除去病毒的處理能力。按照EC指導原則III/8115/89-EN(目前被CPMP/BWP/268/95替代)附錄II將LRF計算為固定對照樣品與接觸加熱的樣品之間的病毒滴度差。
當用於藥物組合物中時，活性生物汙染物在其中的濃度下降，特別是病毒汙染物濃度下降至少為3.0，優選3.5，更優選4.0且最優選4.5或4.5以上log下降為理想的。為了符合有關生物產品病毒安全性的當局建議(例如，參見CPMP/BWP/268/95)，通常將可以提供4.0log滴度下降的加工步驟視為在病毒滅活方面是穩固的且由此認為是令人滿意的。
Log滴度下降由此表示以對數單位表示的病毒濃度降至基礎值10(＝log10)，即log滴度下降為3可以包含病毒濃度下降1000-9999-倍，而log滴度下降為4可以包含病毒濃度下降10000-99999-倍。如果，該方法的應用導致甚至高度耐受性病毒在胰酶中的下降令人滿意，那麼可以認為對胰酶消毒的方法為最有效的。
為了建立用於最有效log滴度下降的條件，進行實驗。由於技術局限，所以目前僅能夠測定生物汙染物在胰酶樣品中的濃度下降為4.5-5.0log滴度(檢測限)。
在第一個系列中，進行實驗，其中測定了在加熱具體期限後的脂酶活性並且是不同的，但卻是恆定的。在第一次實驗中，測定在80℃和1％溶劑含量下加熱0、2、4、6、12、15、18、21、24和30小時後的脂酶活性。在第二次實驗中，測定在8 5℃和1％溶劑含量下加熱0、6、12、15、18、21、24和30小時後的脂酶活性。在第三次實驗中，測定在90℃和1％溶劑含量下加熱0、6、12、15、18、21、24和30小時後的脂酶活性。在第四次實驗中，測定在95℃和1％溶劑含量下加熱0、6、12、15、18、21、24和30小時後的脂酶活性。在第五次實驗中，測定在100℃和1％溶劑含量下加熱0、6、12、15、18、21和24小時後的脂酶活性。第一個系列實驗的結果如表1中所示並且例示在圖1中 表1在80℃、85℃、90℃、95℃和100℃(1％溶劑含量)下加熱胰酶；在表1中提供的數據為兩次孵育的平均值；n/a＝不適用；Temp.＝溫度 正如可以從表1和圖1中對1％恆定溶劑含量觀察到的，脂酶活性在指定溫度下孵育時間增加時下降。此外，脂酶活性在高溫和指定孵育時間增加時下降至較高的程度。當用於藥物組合物中時，遵循在直達並且包括95℃下進行直達並且包括30小時期限的加熱在1％溶劑含量下提供了具有可接受殘留酶活性的胰酶。當用於藥物組合物中時，遵循在直達並且包括100℃下進行直達並且包括24小時期限進行的加熱在1％溶劑含量下提供了具有可接受殘留酶活性的胰酶。
在第二個系列中，進行兩次實驗，其中在加熱後測定了在3％溶劑含量下的脂酶活性。在第一次實驗中，測定在90℃和95℃，3％溶劑含量下加熱0、2、4、6、8、15、24和48小時後的脂酶活性。這第二個系列的實驗的結果如表2中所示並且例示在圖2中 表2在90℃和95℃下加熱胰酶(3％溶劑含量)。
正如可以從表2和圖2中對3％恆定溶劑含量觀察到的，脂酶活性在指定溫度下孵育時間增加時下降。此外，脂酶活性在高溫和指定孵育時間增加時下降至較高的程度。當用於藥物組合物中時，遵循在直達並且包括90℃下進行直達並且包括48小時期限的加熱在3％溶劑含量下提供了具有可接受殘留酶活性的胰酶。當用於藥物組合物中時，進一步遵循在直達並且包括95℃下進行直達並且包括24小時期限進行的乾燥加熱實驗在3％溶劑含量下提供了具有可接受殘留酶活性的胰酶。
在第三個系列的實驗中，在80℃，不同但分別為3％、6％、9％和12％的恆定溶劑含量下加熱0.5、1.0和3.0小時後測定了脂酶活性。這些實驗結果如表3中所示並且例示在圖3中。
表3在80℃分別與3％、6％、9％和12％溶劑含量下加熱處理胰酶。
正如可以從表3和圖3中對恆定，但分別為3％、6％、9％和12％不同溶劑含量觀察到的，脂酶活性在80℃下孵育時間增加時下降。此外，在高溶劑含量於給定孵育時間下脂酶活性下降至很大的程度。當用於藥物組合物中時，遵循在直達並且包括80℃下進行直達並且包括3小時期限的加熱在6％溶劑含量下提供了具有可接受殘留酶活性的胰酶。當用於藥物組合物中時，進一步遵循在直達並且包括80℃下進行直達並且包括1小時期限進行的乾燥加熱實驗在9％溶劑含量下提供了具有可接受殘留酶活性的胰酶。
該系列實驗證實酶對延長加熱期限敏感並且對高溶劑含量敏感。如果在受控條件，即短期內和/或低溫和/或低溶劑含量下進行加熱，那麼其高的原始活性得以維持。在一個實施方案中，如果在短期內在低溫和低溶劑含量下加熱處理酶，那麼可以維持高的原始酶活性。
為了評價豬細小病毒下降，在1％恆定溶劑下測定了在80℃、85℃、90℃、95℃和100℃下加熱6、12、15、18、21、24和30小時後的log10TCID50。這些實驗結果如表4中所示。在表4和下表中，表示為「小於」(≤)的滴度表示檢測限。
表4在80℃、85℃、90℃、95℃和100℃與1％溶劑含量下加熱PPV-摻加的胰酶；n/a＝不適用；Temp.＝溫度；h＝小時；LTR＝Log滴度下降。
如上述表4和如下實施例13中所述在85℃製備並且加工2-4批額外的胰酶粉末。為了評價豬細小病毒的下降，再次在1％的恆定溶劑含量下測定在85℃下加熱6、12、15、18、21、24和30小時後的log10 TCID50。這些額外實驗結果如表4a中所示。
表4a在85℃與1％溶劑含量下加熱3個不同批量的PPV-摻加的胰酶。指定為「±」的值表示95％置信區間。「*」意旨未檢測到感染病毒；Temp.＝溫度；h＝小時；LTR＝Log滴度下降。
表5表示與實驗開始比較的log滴度下降。圖4例示了在80℃、85℃、90℃、95℃和100℃與1％溶劑含量下加熱後的PPV-摻加的胰酶log滴度下降。
表5在80℃、85℃、90℃、95℃和100℃與1％溶劑含量下加熱PPV-摻加的胰酶後的Log滴度下降；n/a＝不適用；Temp.＝溫度。
正如可以從表4和5和圖4中對1％恆定溶劑含量觀察到的，log滴度下降在指定溫度下孵育時間增加時增加。此外，log滴度下降在溫度增加時下降至較高的程度。當用於藥物組合物中時，遵循在80℃溫度下進行直達並且包括30小時期限進行的加熱在1％溶劑含量下提供了其中具有可接受的生物汙染物濃度下降的胰酶。12小時期限和在90℃溫度下進行的實驗在1％溶劑含量下提供了其中具有活性生物汙染物濃度下降的胰酶。15小時期限和在90℃溫度下進行的實驗在1％溶劑含量下提供了其中甚至具有生物汙染物濃度較大下降的胰酶。
從表4a中可以看出當應用作為表4a中指定的參數時，滿足了當局有關生物產品病毒安全性的建議(例如，參見CPMP/BWP/268/95)，即在85℃的加工溫度下可以達到4.0log滴度下降(例如，參見批號2,30小時後的LTR)。使用在80℃下加工的額外批量進行的類似實驗表明不能滿足當局有關生物產品病毒安全性的建議，即在80℃的加工溫度下不能達到4.0log滴度下降。
在另一系列實驗中，測定在恆定溫度和不同但分別為1％和3％的恆定溶劑含量下加熱12小時後的log10TCID50。這些實驗結果如表6中所示。
表6分別在90℃和95℃與1％和3％溶劑含量下加熱PPV-摻加的胰酶 表7表示相對於起始量豬細小病毒中的log滴度下降(就結果而言列在表5中)。圖5例示了分別在90℃和95℃與1％和3％溶劑含量下加熱後PPV-摻加的胰酶的log滴度下降。在與產生如表5中所列結果的實驗相比適度不同條件下進行產生作為表6和7中出現的結果的實驗。
表7分別在90℃和95℃與1％和3％溶劑含量下加熱PPV-摻加的胰酶的Log滴度下降 可以從表6和7以及圖5中對分別為1％和3％的恆定溶劑含量可以觀察到，log滴度下降在指定溫度下的孵育時間增加時增加。此外，log滴度下降在3％溶劑含量下增加至較高的程度，與1％溶劑含量下的結果相反。就在藥物組合物中的應用而言，遵循在95℃下進行至少6小時期限的加熱在3％溶劑含量下提供了生物汙染物在其中的濃度具有可接受的下降的胰酶。就在藥物組合物中的應用而言，遵循在90℃下進行至少12小時期限的加熱分別在1％或3％溶劑含量下提供了生物汙染物在其中的濃度具有可接受的下降的胰酶。
該系列實驗表明通過在上述條件下加熱可以有效地降低豬細小病毒的濃度。從上述實驗中可以推定這種降低在高溫和/或長時間期限和/或在較高溶劑含量下更為有效。在一個實施方案中，如果在合適的溫度和溶劑含量下的足夠時間期限內加熱病毒，那麼可以有效地降低豬細小病毒的濃度。
對豬細小病毒濃度下降獲得的結果與對酶證實的相反。因此，本領域技術人員面臨如下挑戰，即以維持高水平的不同消化酶活性，同時將一種或多種生物汙染物，特別是病毒在其中的濃度降至可接受水平的方式對胰酶消毒的方法。
從上述實驗中可以觀察到，在實驗條件下豬細小病毒在胰酶中的濃度得到降低，同時脂酶活性水平對在藥物組合物中的應用而言仍然是可接受的。可以將這些實驗條件概括如下 在至少85℃、低於9％重量的溶劑含量下加熱達48小時期限。
調整溶劑含量和加熱的步驟可以在對所加熱的胰酶無害的任何壓力下進行。一般而言，所披露的方法在大氣壓、減壓或升壓下進行。合適的方法可以由本領域技術人員根據經驗確定。在一個實施方案中，所述的方法可以在大氣壓下進行。按照另一個實施方案，本文所述的方法可以在消毒的同時在真空中進行。
類似地，按照本文所述的方法，加熱可以在對所處理的胰酶無害的任意氣體中進行。一般而言，本文所述的方法在標準氣體環境中進行。按照一個實施方案，所披露的方法在低氧氣體環境或惰性氣體環境中進行。當使用惰性氣體時，該氣體優選由氮氣或惰性氣體諸如氦或氬，更優選較高分子量惰性氣體且最優選氬氣組成。可以理解本文所述特徵中的一種或多種的組合可以用於進一步將對本文所述方法的不需要的作用減少至最低限度，同時維持所述方法對生物汙染物足夠的有效性。
可以通過本領域技術人員公知的方法和技術降低胰酶的溶劑含量，以便從一種或多種消化酶製劑中減少溶劑，而不會對該製劑產生不可接受水平的損害。這類方法包括，但不限於蒸發、濃縮、離心濃縮、玻璃化、添加溶質、凍幹(在先添加或不添加抗壞血酸鹽)和噴霧乾燥。
降低胰酶溶劑含量的優選方法為濃縮，它可以通過本領域技術人員公知的方法和技術來進行。可以通過控制對製劑的加熱且隨後蒸發不需要的溶劑或通過減壓蒸發進行濃縮。此外，可以應用在適度條件下聯用這兩種方法，即在低溫和減壓下蒸發，以便達到所需的溶劑含量。然後所得製劑具有所需的溶劑含量，而與所用的方法無關。
本文所述的方法可以在任何規模下，在具有1g-1000g質量的實驗室規模下，在具有1kg-50kg質量的製劑的中試工廠規模下和在具有至少100kg，優選200kg-1500kg質量的製劑的生產規模下進行。
實施例 下列實施例為例示性的並且並不意味著限定請求保護的本發明。其它變型和改變具有本領域技術人員所遇到的多樣性，並且完全屬於本發明的實質和範圍。
酶促活性的測定 按照基於Ph.Eur.(Pancreas Powder，European Pharmacopoeia5.0，2179-2182；01/20050350)中胰腺粉末的專題文章的Solvay測試法對脂酶活性進行測定。
溶劑含量的測定。
本文涉及的與水相關的溶劑含量在此涉及通過FDA批准的改進的卡爾·費歇爾法進行測定的水平(Meyer和Boyd，Analytical Chem.31215-219，1959；May，等，J.Biol.Standardization，10249-259，1982；Centers for Biologics Evaluation and Research，FDA，Docket No.89D-0140，83-93；1990)。可以通過本領域公知的方式測定其它溶劑的定量含量，這取決於所用的溶劑。用於測定本文所述方法過程中或之後胰酶中溶劑含量的也包括在本發明披露內容中的其它合適的方式為例如熱解重量法(包括紅外乾燥和微波乾燥)、光譜測定法(包括紅外光譜法、微波光譜法和核磁共振光譜法)、電導分析法、decametry或熱傳導。通常用於測定胰酶中溶劑含量的優選方法為熱解重量法(例如測定「乾燥時的損耗」)，因為該方法可以涵蓋所用可能存在於胰酶中的液體，包含例如水和親酶有機溶劑，如異丙醇。熱解重量法特別適合於測定在胰酶中9％-3.5％重量的溶劑含量。如果經測定胰酶中溶劑含量較低，例如溶劑含量低於3.5％，更一般的情況是低於3％，甚至更一般的情況是低於1.6％重量，那麼存在於胰酶溶劑含量中的水的比例一般比存在於胰酶中親酶有機溶劑的比例重要。因此，有利的是通過卡爾·費歇爾法或其改進方法測定溶劑含量低於3.5％，更一般性的是低於3％，甚至更一般的是低於1.6％重量。就工藝批次大小和連續測定而言，溶劑含量的紅外光譜測定是有利的，特別是其中例如在預加熱後的加熱過程穩態中，經測定溶劑含量低於3.5％，更一般性的是低於3％，甚至更一般的是低於1.6％重量。優選為本領域技術人員公知的紅外光譜測定法(NIR)。紅外光譜法一般要求對可以為卡爾·費歇爾水滴定法或其改進方法的參比方法標準化。由於上述概括的原因，所以測定胰酶中總溶劑含量的最優選方法為熱解重量法(即測定胰酶中乾燥時的損耗，特別是對具有較高溶劑含量的胰酶而言)與卡爾·費歇爾法或其改進方法(即測定胰酶中遺留的水含量，特別是對具有較低溶劑含量的胰酶而言)的組合。
豬細小病毒減少的測定 通過病毒終點滴定測定處理樣品中的病毒滴度並且按照Bundesanzeiger No.84，1994年5月4日中所述的Spearman-Kaerber公式計算TCID50。為了防止使用胰酶與檢測Pk-13-細胞(豬腎)不相容情況的發生，在每次滴定前將測試物質稀釋為3log滴度(例如1∶2000)。通過對數下降因子描述滅活或除去病毒的處理能力。為了能夠評估不依賴於孵育期過程中感染性必然下降的病毒滴度下降，所述的感染性必然下降可能因測試物質自身的性質而下降至一定程度，採取固定加熱樣品。按照EC指導原則III/8115/89-EN(目前被CPMP/BWP/268/95替代)附錄II將樣品的對數滴度下降(LTR)計算為固定樣品與終點樣品的病毒滴度(log10 TCID50/ml)差。
加熱 就實驗室規模而言，加熱在乾燥箱(例如來自Memmert公司，ULE400)或旋轉蒸發器(例如來自Büchi公司，R-144)與水浴(例如BüchiB-480)中進行。在中試工廠規模中，使用真空乾燥器(公司Hosokawa，Vrieco-Nauta，體積120L)。在生產規模中，使用真空乾燥器(公司Hosokawa，Vrieco-Nauta，體積4000L)。
標準化胰酶粉末的製備 在真空乾燥器中連續攪拌下乾燥50kg-1000kg溼潤胰酶(起始溶劑含量40-50％)。使溫度從60℃逐步增加至95℃。然後在至少70℃的溫度下進行乾燥，直至達到溶劑含量＜3.5％。為了分別獲得具有6％、9％或12％重量的溶劑含量的胰酶粉末樣品，按照公知方式在乾燥過程中在早期點取樣。
a)用於在實驗室規模製備標準化胰酶粉末的額外步驟包括 在所需溫度下加熱，直到根據下述起始實驗要求(如下的實施例1-11)分別達到1％或3％重量的溶劑含量。
就分別具有6％、9％或12％重量溶劑含量的標準化胰酶粉末的備選製備而言，可以將適量的溶劑，例如水，丙-2-醇或其混合物加入到具有3.5％重量的溶劑含量的胰酶粉末中並且根據需要勻化獲得的溼潤胰酶樣品，以便獲得具有所需溶劑含量的樣品。
b)用於製備中試工廠和生產規模的標準化胰酶粉末的額外步驟包括 在所需溫度下加熱，直到根據下述起始實驗要求(如下的實施例1-11)達到1％重量的溶劑含量和80℃-100℃的產品溫度。
用於豬細小病毒研究的胰酶的額外加工 按照科學和藥理學群體中一般可接受的原理，使用添加的豬細小病毒摻加胰酶以便建立原理證據。按照指導原則CPMP/BWP/268/95進行摻加。
在對胰酶進行生產方法(參見上文)的標準乾燥後，冷卻胰酶粉末並且重新懸浮於水中(得到40％混懸液以便在胰酶粉末中獲得均勻分布)。然後在細胞培養基中給胰酶以9∶1的比例(胰酶混懸液病毒混懸液)摻加高濃縮豬細小病毒混懸液。然後凍幹所得混懸液且隨後在80℃-100℃的溫度下加熱，直到根據下述起始實驗要求(如下的實施例12-20)分別達到1％和3％重量的溶劑含量。
實施例1 隨後將具有1％溶劑含量的48kg標準化胰酶加熱至80℃下30小時期限。在0、2、4、6、12、15、18、21、24和30小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表1和圖1中所示。
實施例2 隨後將具有1％溶劑含量的48kg標準化胰酶加熱至85℃下30小時期限。在0、6、12、15、18、21、24和30小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表1和圖1中所示。
實施例3 隨後將具有1％溶劑含量的48kg標準化胰酶加熱至90℃下30小時期限。在0、6、12、15、18、21、24和30小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表1和圖1中所示。
實施例4 隨後將具有1％溶劑含量的48kg標準化胰酶加熱至95℃下30小時期限。在0、6、12、15、18、21、24和30小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表1和圖1中所示。
實施例5 隨後將具有1％溶劑含量的48kg標準化胰酶加熱至100℃下30小時期限。在0、6、12、15、18、21和24小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表1和圖1中所示。
實施例6 隨後將具有3％溶劑含量的1.5g標準化胰酶加熱至90℃下48小時期限。在0、2、4、8、6、15、24和48小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表2和圖2中所示。
實施例7 隨後將具有3％溶劑含量的1.5g標準化胰酶加熱至95℃下48小時期限。在0、2、4、8、6、15、24和48小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表2和圖2中所示。
實施例8 隨後將具有3％溶劑含量的1.5g標準化胰酶加熱至80℃下3.0小時期限。在0.5、1.0和3.0小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表3和圖3中所示。
實施例9 隨後將具有6％溶劑含量的1.5g標準化胰酶加熱至80℃下3.0小時期限。在0.5、1.0和3.0小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表3和圖3中所示。
實施例10 隨後將具有9％溶劑含量的1.5g標準化胰酶加熱至80℃下3.0小時期限。在0.5、1.0和3.0小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表3和圖3中所示。
實施例11 隨後將具有12％溶劑含量的1.5g標準化胰酶加熱至80℃下3.0小時期限。在0.5、1.0和3.0小時後測定脂酶活性。本實驗結果如表3和圖3中所示。
實施例12 隨後將具有1％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至80℃下30小時期限。在6、12、15、18、21、24和30小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表4和5和圖4中所示。
實施例13 隨後將具有1％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至85℃下30小時期限。在6、12、15、18、21、24和30小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表4、4a和5和圖4中所示。
實施例14 隨後將具有1％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至90℃下30小時期限。在6、12、15、18、21、24和30小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表4和5和圖4中所示。
實施例15 隨後將具有1％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至95℃下30小時期限。在6、12、15、18、21、24和30小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表4和5和圖4中所示。
實施例16 隨後將具有1％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至100℃下30小時期限。在6、12、15、18、21、24和30小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表4和5和圖4中所示。
實施例17 隨後將具有1％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至90℃下12小時期限。在3、6和12小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表6和7和圖5中所示。
實施例18 隨後將具有3％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至90℃下12小時期限。在3、6和12小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表6和7和圖5中所示。
實施例19 隨後將具有1％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至95℃下12小時期限。在3、6和12小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表6和7和圖5中所示。
實施例20 隨後將具有3％溶劑含量的1.5g豬細小病毒-摻加的胰酶加熱至95℃下12小時期限。在3、6和12小時後測定病毒滴度。本實驗結果如表6和7和圖5中所示。
實施例21-包含胰酶的藥物組合物 如下獲得包含通過本文所述方法獲得的胰酶的組合物將通過實施例2方法獲得的10kg胰酶與2.5kg乙二醇4000和1.5kg丙-2-醇混合而得到混合物，然後按照公知方式在擠塑機中擠壓它。如EP0583726中披露的製備胰酶微丸並且具體將其進一步填充入膠囊或小藥囊。
實施例22-使用耐胃酸包衣層包衣的胰酶微丸 可以用耐胃酸的包衣層塗布胰酶通過實施例21獲得的微丸芯。例如，可以用耐胃液的成膜劑給胰酶微丸包衣，所述的成膜劑諸如，例如乙酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素(＝HPMCAS)、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(＝HPMCP)、乙酸鄰苯二甲酸纖維素(＝CAP)或聚乙烯乙酸酯鄰苯二甲酸酯(＝PVAP)。也可以使用稱作成膜劑的共聚物，諸如，例如甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物或甲基丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物。使用各種薄膜包衣設備，例如塗布器將成膜劑以常用形式，例如作為有機溶液或有機或水分散液塗布在胰酶微丸芯上，任選添加常用的增塑劑。所得耐胃酸的包薄膜衣的胰酶微丸的顯著特點在於高堆密度，例如在0.6g/ml-0.85g/ml，這使得它能夠增加在每粒膠囊中填充的重量和由此增加每粒膠囊中的活性化合物含量。堆製備耐胃酸的包薄膜衣的胰酶的方法的額外實驗性詳細描述披露在EP0583726中。
將本文引述的所有參考文獻，包括公開文獻，專利申請和專利引入本文作為參考，其引用程度與將每篇參考文獻分別和特別指定引入作為參考並且以完整的形式列出相同。
將應用的數值描述為近似的，不過，在該數值前有措詞「約(about)」或「約(approximately)」。類似地，除非另作陳述，否則將在本申請中指定的不同範圍中的數值描述為近似的，不過，在所述範圍內的最小值和最大值前均有措詞「約(about)」或「約(approximately)」，在這種方式中，所述範圍上下的變化可以用於實現與該範圍內數值相同的結果。本文所用的術語「約(about)」或「約(approximately)」在指數值時應具有其對特定主題最接近相關的或涉及有爭議的範圍或要素的領域的普通技術人員而言通常和普通的含義。從嚴格數值邊界增寬的量依賴於許多因素。例如，可以考慮到的某些因素包括要素的臨界狀態和/或指定變量對請求保護的主題所具有的作用，以及本領域技術人員公知的其它考慮因素。作為本文所用的，不同量重要數字在不同數值中的應用並不意味著限定措詞「約(about)」或「約(approximately)」如何用於增寬特定的數值。因此，一般而言，「約(about)」或「約(approximately)」增寬了數值。此外，將披露的範圍指定為連續的範圍，包括最小值與最大值之間的每一個值與通過使用術語「約(about)」或「約(approximately)」獲得的增寬的範圍。因此，除非另作陳述，否則本文引述的數值範圍僅指定用作分別涉及屬於該範圍內的每一單個值的縮寫法，並且將每個單個值引入本說明書，就如同分別在本文中引述一樣。
術語『本發明(the invention)』或『本發明(the presentinvention)』的應用並不意味著以任何方式限定權利要求，並且不應做出如下結論，即涉及術語『本發明(the invention)』或『本發明(the present invention)』的特定應用的任何描述或論點應用於每個和每一權利要求。術語『本發明(the invention)』或『本發明(thepresent invention)』的應用僅以語言或語法上的便利性使用，但不對任何權利要求的任何性能做出限定。
本文描述了請求保護的本發明的備選實施方案，包括對本發明者而言已知用於實施請求保護的本發明的最佳方式。當然，在閱讀上述披露內容時可以對披露的實施方案做出改變，至對本領域技術人員而言顯而易見。本發明者預計本領域技術人員可以適當使用這類改變，並且本發明者指定可以以非本文特別描述的方式實施請求保護的本發明。因此，請求保護的本發明包括作為適用法律所允許的其待批權利要求中所述主題的所有變型和等效物。此外，除非本文另作陳述或上下文中顯然有相反的指示，否則上述要素在其所有可能的改變中的任意組合均包括在請求保護的本發明中。
應理解可以由本文披露的任意數據構成或來源於它們的任意範圍，比例和比例範圍代表了本發明披露的額外實施方案並且本說明書中包括它們作為組成部分，不過，也將它們清楚地列出。這包括可以形成的確實包括或不包括確定上限和/或下限邊界的範圍。因此，最為關注特定範圍，比例或比例範圍的本領域技術人員可以理解這類數值顯然來源於本文提供的數據。
除非本文另作陳述或在上下文中有相反指示，否則在本說明書上下文中(尤其是如下權利要求中)的術語「一種(a)」和「一種(an)」和「所述的(the)」和類似的指示物應解釋為涵蓋單數和複數。除非本文另作陳述或在上下文中另有相反指示，本文所述的所有方法均可以以任何合適的順序進行。本文提供的任何和所有實例或典型語言的應用(例如，諸如優選的，優選)僅指定為解釋本說明書的內容，而並不對權利要求的範圍做出限度。在本說明書中不應將語言指定為表示任何非請求保護的要素對實施請求保護的本發明而言是必需的。
權利要求
1.製備胰酶的方法，包含在至少85℃的溫度下加熱包含一種或多種溶劑的胰酶的分散形式，並且在該加熱步驟過程中的任意點獲得的胰酶的分散形式中總溶劑含量低於9％重量。
2.權利要求1的方法，包含下列步驟
(a)預加熱包含一種或多種溶劑的胰酶的分散形式到至少85℃的溫度；並且
(b)在至少85℃的溫度下將胰酶的分散形式持續加熱達48小時期限，並且在加工步驟(b)過程中的任意點獲得的胰酶的分散形式中總溶劑含量低於9％重量。
2.權利要求1或2所述的方法，其中獲得的溶劑含量等於或低於3.5％重量。
3.權利要求1或2所述的方法，其中獲得的溶劑含量為0.1％-3.5％重量。
4.權利要求2所述的方法，其中加工步驟(b)中胰酶的加熱持續1小時-36小時期限。
5.權利要求2所述的方法，其中加工步驟(b)中胰酶的加熱持續8小時-30小時期限。
6.權利要求1所述的方法，其中溫度在85℃-100℃。
7.權利要求2所述的方法，其中加工步驟a)中的溫度和加工步驟b)中的溫度均為85℃-100℃。
8.權利要求1所述的方法，其中溫度為85℃-95℃。
9.權利要求2所述的方法，其中加工步驟a)中的溫度和加工步驟b)中的溫度均為85℃-95℃。
10.權利要求1所述的方法，其中將加熱持續進行。
11.權利要求1所述的方法，其中將加熱間斷進行。
12.權利要求2所述的方法，其中將加工步驟(b)中的加熱連續進行。
13.權利要求2所述的方法，其中將加工步驟(b)中的加熱間斷進行。
14.前述權利要求中任一項所述的方法，其中在加熱後存在於分散的胰酶中的任何病毒汙染物的滴度水平低於加熱前該病毒汙染物存在於分散的胰酶中的滴度水平至少1000倍，優選10000倍。
15.權利要求1或2所述的方法，其中通過熱解重量法和/或卡爾·費歇爾水滴定法測定加熱過程中胰酶的分散形式中獲得的溶劑含量。
16.權利要求1或2所述的方法，其中胰酶的分散形式選自粉末、丸粒、微丸、微球、顆粒和粒劑。
17.權利要求1或2所述的方法，其中胰酶的分散形式為粉末。
18.權利要求1或2所述的方法，其中加熱後胰酶脂酶活性為加熱前該脂酶活性的至少50％。
19.胰酶，可通過權利要求1-18中任一項的方法獲得。
20.藥物組合物，包含藥理學有效量的權利要求19的胰酶和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
21.權利要求20所述的藥物組合物，其中胰酶存在於適合於口服給藥和速釋或調釋的劑型中，其中該劑型選自片劑、微片、丸粒、微丸、微球、顆粒、粒劑、粉末、混懸液、乳液、分散體、膠囊和小藥囊。
22.權利要求21所述的藥物組合物，其中胰酶存在於經耐胃酸包衣層包衣的劑型中。
23.權利要求20所述的藥物組合物，其為膠囊或小藥囊形式。
24.權利要求21或22所述的藥物組合物，其中該組合物為適合於口服給藥和速釋或調釋的劑型形式。
25.藥物組合物，其包含
(a)50％-90％重量的權利要求19的胰酶；和
(b)10％-50％重量的藥學上可接受的賦形劑。
全文摘要
披露了製備胰酶的方法，其中一種或多種生物汙染物，諸如病毒和/或細菌的濃度得到降低，該方法包含在至少85℃的溫度下，以低於9％重量的總溶劑含量加熱胰酶。還披露了可通過這類方法獲得的胰酶。
文檔編號C12N9/94GK101233229SQ200680027701
公開日2008年7月30日 申請日期2006年7月27日 優先權日2005年7月29日
發明者M·弗林克, C-J·科恩, H·布魯姆, M·拉斯特 申請人:索爾瓦藥物有限公司