新型清除蛋白受體的製作方法

2023-09-12 02:33:35

專利名稱：新型清除蛋白受體的製作方法
技術領域：
本發明是關於分離的人及小鼠的新型清除蛋白(scavenger)受體(在本說明書中分別稱為hSRCL-P1和mSRCL-P1，對兩者不加區別的情況下只稱SRCL-P1)的基因及蛋白質，它們的相同體，變異體，修飾體及多型性變種(這些總稱為衍生物)，它們的片段(以下全稱為SRCL-P1s)以及它們的檢出方法。再有，關於含有SRCL-P1s的醫藥用、診斷用、研究用的組合物，它們的製造方法及應用。還有關於SRCL-P1s蛋白質的激活劑和拮抗劑，用SRCL-P1s的藥物的篩選方法。更進一步關於構建含SRCL-P1s基因的載體，用該構建的載體轉化的轉化細胞和關於針對SRCL-P1蛋白質的抗體及產生該抗體的細胞。
背景技術：
作為動脈粥樣硬化症的初期病變的病理學特徵是泡沫細胞出現在動脈壁上增多的現象。存在於巨噬細胞的細胞膜上的清除蛋白受體(以下簡稱SR)(Krieger，M.等人；Annu.Rev.Biochem.，63，601-637，1994)與LDL受體不同，缺乏膽固醇的負反饋調節，變性的LDL(膽固醇與脂蛋白質的複合體是低密度脂白質)因為被積極地攝入細胞內，細胞自身變成泡沫細胞而積累在血管內皮細胞下面。所以，巨噬細胞及其SR被認為在形成動脈粥樣硬化時起主要的作用。(Brown M，S.等人；Nature，343，508-509，1990，Kurihara，Y.A.等人；Current Opinion Lipidology，2，295-300，1991，Krieger，M.；TIBS，17，141-146，1992，Krieger，M.等人；J.Biol.Chem.，268(7)，4569-4572，1993)。
因糖尿病產生的體內持續的高血糖，引起各種蛋白質的非酶促糖化。席夫鹼·阿嗎多瑞(アマドリ)化合物經糖化過程產生最終產物美拉德反應後期產物(AGEadvanced glycation end products)。具有細胞障礙作用的AGE通過AGE受體結合於巨噬細胞、血管內皮細胞、肝細胞、腎小球繫膜細胞等，對機體施加惡劣的影響。例如AGE與巨噬細胞結合，促進TNF(Tumor Necrosis Factor腫瘤壞死因子)、IL-1(Interleukin-1白細胞介素)及來自血小板的增殖因子(PDGF)等的細胞素的分泌，引起以糖尿病性合併症為特徵的細胞障礙，這一點已為人們所知。因為SR是與AGE的攝取分解有關的受體之一(Araki，N.，等人；Eur.J.Biochem.，230，408-415，1995，Susuki，H.等人；Circulation，92，1-428，1995)，在SR雙缺損小鼠中AGE的分解活性降低三分之一，所以人們認為SR與糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜症、糖尿病性神經障礙等糖尿病性合併症也有很深的關係。其次，在大鼠體內，因為飼餵過量的AGE白蛋白，和腎中AGE的沉積，引起小球體硬化症(Vlassara，H.等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，11704-11708，1994)，所以推想，識別AGE的SR與小球體硬化症有深深的關聯。
再者，人們認為SR與早老性痴呆病也有關係。早老性痴呆病的病理學特徵是β澱粉樣蛋白沉積的老人斑。有人報導，β澱粉樣蛋白通過在小膠細胞上發現的SR產生激活小膠細胞的活性氧而表達神經毒性(Nature，382，716-719，1996)。
作為SR的配體，因SR分子種類不同，而存在特異性上的差異，具有負電荷的配體有，例如乙醯化LDL(AcLDL)氧化LDL(OxLDL)等的變性LDL、順丁烯二醯化的BSA等的變性蛋白質、多聚肌苷酸等的四螺旋核酸、葡聚糖硫酸和多聚巖藻糖等多糖類，磷脂醯絲氨酸和磷脂醯肌醇等酸性磷脂類，內毒素(LPS)、AGE、老化細胞及凋亡細胞等。此外人們認為，SR還具有清除生物體內的各種變性物、病毒等異物和陳舊廢物的重要作用(Hamptom，R.Y.等人；Nature，352，342-344，1991、Tokuda，H.等人；Biochem.Biophys.Res.Commun.，196(1)，8-24，1993、Pearson，A.M.等人；J.Biol.Chem.，268，3546-3554，1993、Dunne，D.W.等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，1863-1867，1994、Freeman，M.W.；Current Opinion in Lipidology，5，143-148，1994)。
在除巨噬細胞以外的肝類洞內皮細胞(Eskild，W.等人；Elsevier Biomedical N.Y.，255-262，1982)、血管內皮細胞(Baker，D.P.等人；Arteriosclerosis，4，248-255，1984、Bickel，P.E.等人；J.Clin.Invest.，90，1450-1457，1992)、血管平滑肌細胞(Pitas，R.E.等人；J.Biol.Chem.，265，12722-12727，1990、Bickel，P.E.等人；J.Clin.Invest.，90，1450-1457，1992)、纖維芽細胞(Pitas，R.E.等人；J.Biol.Chem.，265，12722-12727，1990)上都發現了SR。其次，SR可分類成SRA、SRB、SRC(Peason，A.等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，4056-4060，1995)、FcγRIIB2(Stanton，L.W.等人；J.Biol.Chem.，270，22446-22451，1992)以及macrosialin(CD68)(Ramprasad，M.P.等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，9580-9584，1995)、人血管內皮OxLDL受體(LOX-1類似植物凝集素的氧化的LDL受體)(Sawamura，T.等人；Nature，386，73，1997)，SRA可進一步分類成SR-AI和SR-AII(Kodama，T.等人；Nature，343，531-535，1990)及MARCO(一種新的巨噬細胞受體，具有膠原結構)(Elomaa，O.等人；Cell，80，603-609，1995)，SRB可進一步分類成CD36(Endemann，G.等人；J.Biol.Chem.，268，11811-11816，1993)和SR-B1(Acton，S.L.等人；J.Biol.Chem.，269，21003-21009，1994)。
SR-AI及SR-AII是均聚三體，是N末端在細胞內的內-外(inside-out)型貫穿膜的蛋白質。該蛋白質在細胞外部分可分辨出類似膠原蛋白的區段、α-螺旋區段和富含半胱氨酸區段等構造上的數個區段(Rohrer，L.等人；Nature，343，570，1990、Matsumoto，A.等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，9133，1990)。類似膠原蛋白區段具有膠原蛋白特有的(Gly-Xaa-Yaa)n構造(Xaa和Yaa可以是任何一種胺基酸殘基)，這一區段有配體結合部位的功能。α-螺旋區段則是每7個胺基酸向右旋轉兩圈的7肽重複序列，即α-螺旋構造，每7個胺基酸有三條多肽，亮氨酸和異亮氨酸等疏水性胺基酸朝內側，極性胺基酸和糖鏈結合部位朝外側(亮氨酸拉鏈)形成均聚三體。該區段的作用是維持均聚三體的構造，並且，與變形LDL等配體結合併進入細胞內。由於核內體中的pH低，使受體的三次構造改變，從而具有使配體解離的作用。
該蛋白質的細胞質內區段具有和LDL受體和胰島素受體中的NRXY順序和鐵傳遞蛋白受體中的YXRF順序相同的內吞作用信號特有的急轉向(タイトタ一ン)構造，如果使這些順序缺損，則內吞作用受到抑制。
SR-AI和SR-AII是通過編碼富含半胱氨酸的mRNA的兩者擇一地剪接產生的，SR-AI該區由110個胺基酸組成，SR-AII由17個胺基酸組成。已經發現至少在來自末梢單球的巨噬細胞、肺胞巨噬細胞及肝Kupffer細胞上有SR-AI和SR-AII，並且與生體防禦、動脈硬化、鈣離子非依賴性的細胞接著等有關。(Krieger，M.等人；Annu.Rev.Biochem.，63，601-637，1994、Wada，Y.等人；Ann.N.Y.Acad.Sci.，748，226-239，1995、Fraser，I.P.等人；Nature，364，343，1993)。其次，OxLDL存在於動脈硬化巢的巨噬細胞內，在這種巨噬細胞的細胞膜上更多地發現SR-AI和SR-AII，SR-AI在轉基因小鼠中能抑制脂質負荷而引起的血中脂蛋白上升的現象，SR-AI和SR-AII對OxLDL的攝取起重要的作用。
另一方面，分類上屬於SRA的MACRO和SR-AI有類似的構造，不存在α-螺旋區段，其特徵是具有長的膠原蛋白樣的區段。發現於脾臟巨噬細胞和淋巴節巨噬細胞等處的MACRO，由於其配體的特異性，被認為是作為針對細菌感染的生物體防禦機構發揮機能。
鈴木等人製作成功了SRA缺損的小鼠，他們用卡那黴素耐性基因置換了SR-AI和SRA-II的共同部分的第四外顯子(Suzuki，H.等人；Nature，386，292-296，1997)。SRA缺損的小鼠和野生型比較表現出了免疫障礙，它們對李斯特菌和單純皰疹病毒的感染率高。其次發生凋亡的T細胞的貪食現象與SRA有關係，SRA缺損的小鼠與野生型比較，表現出貪食能力降低(Platt，N.等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，12456，1996)。還有，SRA缺損小鼠與動脈硬化的動物模型的apoE缺損小鼠(Plump，A.S.等人；Cell，71，343，1992、Zhag，S.H.等人；J.Clin.Invest.，94，937，1994)交配，得到了雙重缺損小鼠，有意思的是，它們的動脈硬化灶的面積也比apoE缺損小鼠的小(Suzuki，H.等人；Nature，386，292-296，1997)。
照這樣，巨噬細胞機能的解明、動脈硬化、糖尿病性合併症以及AD、高β脂蛋白血症、高膽固醇血症、高甘油三脂血症、低α脂蛋白血症、移植、動脈粥樣硬化斑切除和血管形成後再狹窄等各種疾患的發病機制的解明，然後其診斷、預防以及治療方法、還有為此可以開發利用的試藥及醫藥，SR以及所有屬於這一族的新型種類分子的發現，使上述課題有了解決手段。
另一方面，對生物體防禦起著重要作用的補體系統，作為識別免疫球蛋白的分子，已知有補體第一成分Cl活化的經典途徑及細菌等異物為補體第三成分C3的直接結合的第二途徑。近年來加入到這些補體活化途徑之中的已知有是血清凝集素的甘露糖結合蛋白質(以下稱MBP)，通過直接識別結合在異物表面的糖鏈而活化補體系統的凝集素途徑(Sato，T.等人；Int.Immunol.，6，665-669，1994)。
MBP是在Ca離子存在下與甘露糖以及N-乙醯葡萄糖胺等特異結合的C型(外源)凝集素，其構造至少含有由(Gly-Xaa-Yaa)n組成的類似膠原蛋白的區域、糖鏈識別區域(CRD)。與MBP相同，具有類似膠原蛋白區域和CRD的血清凝集素總稱為共同凝集素(コレクチン)(Malhotora，R.等人；Eur.J.Immunol.，22，1437-1445，1992)，除MBP以外還可以舉出共同凝集素-43(CL-43)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白D(SP-D)以及牛粘合素(BKg)等。共同凝集素具有調理素活性，所以被認為與以細菌、病毒為首的各種微生物的基礎免疫有關係(Kawasaki，N.等人；J.Biochem.，106，483-489，1989、Ikeda，K.等人；J.Biol.Chem.262，7451-7454，1987、Ohta，M.等人；J.Biol.Chem.，265，1980-1984，1990、Summerfield，J.A.等人；Lancet，345，886，1995)。
這類共同凝集素，如

圖1(a)所示，已知由含有(1)CRD和(2)類似膠原蛋白區域等特徵的基本構造構成(Malhotora，等人；Eur.J.Immunol.，22，1437-1445，1992)，這一基本構造在類似膠原蛋白區域，由三螺旋形成的亞基，然後這種亞基形成3體、4體、6體等寡聚體構造。
最近有資料暗示共同凝集素與非特異免疫應答有關，例如有人報告，對於嬰兒來說，來自母親的移行抗體和特有的防禦系統不十分發達，在中和和排除各種微生物上起重要作用(Super等人；Lancet，2，1236-1239，1989)。其次，關於這些共同凝集素在宿主的生體防禦上的作用，例如由於MBP基因中的變異引起血中MBP濃度下降，宿主變得易受感染，這樣的研究結果已有人報告(Sumiya，等人；Lancet，337，1569-1570，1991)。再有，有報告說，調理素作用不全的血清中MBP含量低(Madsen，H.O.等人；Immunogenetics，40，37-44，1994)，易發生細菌感染，(Garred，P.等人；Lancet，346，941-943，1995)，可以認為MBP對免疫機構有重要作用。
本發明者曾發現，BKg和MBP能阻礙H1和H3型的流感病毒A型感染和紅血球的凝集活性(Wakamiya等人；Glycoconjugate；J.，8，235，1991、Wakamiya等人；Biochem.Biophys.Res.Comm.，187，1270-1278，1992)。其次，在這之後獲得了編碼BKg的cDNA克隆，也發現了BKg和SP-D等的關連性(Suzuki等人；Biochem.Biophys.Res.Comm.，191，335-342，1993)。
共同凝集素可能是對闡明生物體防禦機制有用的和作為生理活性物質有用的物質，這一族新型分子種的發現，除對傳染病的治療外，對各種醫療領域乃至生物學領域，人們也寄予很大的期望。
發明的內容本發明的目的是提供新型的清除蛋白受體，有可能用於闡明巨噬細胞和基礎免疫的機能、闡明動脈硬化、糖尿病性綜合症、早老性痴呆病、高β脂蛋白血症、高膽固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、移植、動脈粥樣硬化斑切除後和血管形成後再狹窄、以及細菌感染症等各種疾病的發病機制，然後用於診斷、預防和治療方法以及用於為此開發的試藥和醫藥。
因此，本發明提供了(1)一種蛋白質或其衍生物或片段，所述蛋白質具有SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示的742個胺基酸組成的胺基酸序列，或者，該蛋白質的胺基酸序列由SEQ IDNO2所示胺基酸序列中有一個或數個胺基酸缺失、置換或添加的胺基酸序列構成，且該蛋白質和具有SEQ ID NO2胺基酸序列1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同的性質；(2)一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO1鹼基號74-2299所示的鹼基序列、編碼SEQ ID NO2中胺基酸號1-742所示的胺基酸序列或其片段的鹼基序列、或在嚴謹條件下與這些鹼基序列或這些鹼基序列的互補鹼基序列雜交且編碼與具有SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同性質的蛋白質的鹼基序列；(3)一種蛋白質或其衍生物或片段，所述蛋白質具有SEQ ID NO24胺基酸號1-618所示的胺基酸組成的胺基酸序列，或者，該蛋白質的胺基酸序列由SEQ ID NO24所示胺基酸序列中有一個或數個胺基酸缺失、置換或添加的胺基酸序列構成，且該蛋白質和具有SEQ ID NO24胺基酸序列1-618所示胺基酸序列的蛋白質有相同的性質；
(4)一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO23鹼基號74-1933所示的鹼基序列、編碼SEQ ID NO24胺基酸號1-618所示的胺基酸序列或其片段的鹼基序列、或在嚴謹條件下與這些鹼基序列或這些鹼基序列的互補鹼基序列雜交且編碼與具有SEQ ID NO24胺基酸號1-618所示胺基酸序列的蛋白質有相同性質的蛋白質的鹼基序列；(5)一種蛋白質或其衍生物或片段，所述蛋白質具有SEQ ID NO4胺基酸號1-742所示的742個胺基酸組成的胺基酸序列，或者，該蛋白質的胺基酸序列由SEQ IDNO2所示胺基酸序列中有一個或數個胺基酸缺失、置換或添加的胺基酸序列構成，且該蛋白質和具有SEQ ID NO2胺基酸序列1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同的性質；(6)一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO3鹼基號74-2299所示的鹼基序列、編碼SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示的胺基酸序列或其片段的鹼基序列、或在嚴謹條件下與這些鹼基序列或這些鹼基序列的互補鹼基序列雜交且編碼與具有SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同性質的蛋白質的鹼基序列；(7)含有(2)、(4)或(6)所述的多核苷酸為特徵的載體；(8)保持(2)、(4)或(6)所述的多核苷酸的表達可能的轉化細胞；(9)培養用(2)或(4)所述的多核苷酸轉化的細胞，收穫產生的hSRCL-P1蛋白質為特徵的蛋白質製造方法；(10)培養用(6)中所述的鹼基序列遺傳轉化的細胞，收穫產生的mSRCL-P1蛋白質為特徵的蛋白質製造方法；(11)(9)或(10)所述的製備方法，其中細胞是大腸菌、動物細胞或昆蟲細胞；(12)SRCL-P1基因的表達水平被改變了的轉基因非人動物；(13)(12)所述的轉基因非人動物，其特徵為SRCL-P1基因是編碼SRCL-P1的cDNA，基因組DNA或合成的DNA；(14)(13)所述的轉基因非人動物，其特徵為通過在基因表達調節部位引起變異來改變表達水平；(15)一種剔除小鼠，它的mSRCL-P1基因機能缺損；(16)針對(1)、(3)或(5)中所述的蛋白質或其片段的抗體；(17)(16)所述的抗體，其特徵為多克隆抗體、單克隆抗體或肽抗體；(18)針對(1)、(3)或(5)中所記的蛋白質或其片段的單克隆抗體製作方法，其特徵為將(1)、(3)或(5)中所述的蛋白質或其片段注入人以外的溫血動物，選擇抗體效價被確認的該動物，取出脾臟或淋巴節，將它們含有的產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合、製作出能產生單克隆抗體的雜交瘤；(19)根據(16)或(17)中所述的抗體與SRCL-P1蛋白質或其片段的免疫結合而來的該蛋白質或其片段的定量方法；(20)根據(16)或(17)中所述的抗體與SRCL-P1蛋白質或其片段的免疫結合而來的該蛋白質或其片段的檢出方法；(21)刺激(1)、(3)或(5)中所述的蛋白質活性的激活劑；(22)阻礙(1)、(3)或(5)中所述的蛋白質活性或活性化的拮抗劑；(23)應用(1)、(3)或(5)中所述的蛋白質為特徵的藥物篩選方法；(24)用(23)中所述的篩選方法獲得的藥物；(25)以治療與氧化LDL累積有關的病態為目的藥物篩選方法，通過比較在候選藥物有或無的條件下(1)、(3)或(5)中所述的蛋白質與氧化LDL的結合量可以做出評價，當候選藥物對該蛋白質與氧化LDL的結合有阻礙能力，則可鑑定出與氧化LDL累積有關的病態的藥物，以含有這樣的工程為特徵的藥物篩選方法；(26)通過(25)所述的篩選方法得到的藥物；(27)與氧化LDL累積有關的病態的治療方法，應用(26)中所述的藥物，具有以阻礙SRCL-P1蛋白質或其片段與氧化LDL結合為特徵的工程的方法；(28)為治療與氧化LDL累積有關的病態的醫藥組合物，含有(26)中所述的藥物；(29)和細胞上結合AGE有關的病態的治療藥物的篩選，通過比較(1)、(3)或(5)中所述的蛋白質在有或無候選藥物的情況下與AGE的結合量，做出評價，根據候選藥物阻礙該蛋白質與AGE結合的能力，鑑定可用於治療與細胞上結合AGE有關的病態的藥物的工程為特徵的藥物篩選方法；(30)用(29)中所述的篩選方法得到的藥物；(31)與AGE結合於細胞有關的病態的治療方法，應用(30)中所述的藥物，以阻礙SRCL-P1蛋白質或其片段與AGE結合的工程為特徵的方法；(32)含有(30)中所述的藥物的醫藥組合物，其特徵為與AGE結合細胞有關的病態治療用的醫藥組合物。
附圖簡單說明圖1表示以前報告的主要的共同凝集素的基本構造和蛋白質的概況。
圖2以前報告的3種共同凝集素的胺基酸序列的直線排列的前半部分。
圖3表示和圖2相同的直線排列的後半部分。
圖4(b)為測定本發明新型的清除蛋白受體的鹼基序列所使用的各引物的名稱，表示順序儀讀出的鹼基序列，圖4(a)表示所得到的新型共同凝集素的ORF。
圖5 A酵母，B革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌，Escherichia coli)或C革蘭氏陽性細菌(金黃色葡萄球菌，Staphylococcus aureus)與表達hSRCL-P1的細胞特異結合的情形。
圖6 A氧化LDL，B甘露糖和CAGE與表達hSRCL-P1的細胞特異結合的情形。
圖7酵母在表達hSRCL-P1的細胞內被攝取的情形。
圖8 A健康人和B小鼠的心臟血管內皮細胞中hSRCL-P1被表達的情形。
實施發明的最佳形態本發明人成功地克隆到了人和小鼠的新型SR。在新型SR(SRCL-P1)的C末端存在著含有被認為與基礎免疫有關的CRD的共同凝集素區段，其次，這種全部構造類似SRA，特別是SR-A1。具體地說，靠N末端一側至少含有亮氨酸重複4次的亮氨酸拉鏈構造貫穿膜區段、α-螺旋區段、類似膠原蛋白區段、頸區段、CRD區段。3個具有上述特徵的分子，由螺旋區形成o-螺旋、在類似膠原蛋白區段形成三螺旋，構成均聚三體。其次，類似膠原蛋白區段在生理pH條件下，推測帶有正電荷。還有，SRCL-P1蛋白質具有多個糖鏈結合部位。
使用本說明書時，所謂的hSRCL-P1基因和mSRCL-P1基因，除特別指出外，均指含有SEQ ID NO1或3所示的核酸順序的多核苷酸，它們的衍生物(相同體、變異體、修飾體和多態變體)，以及它們的片段。其次，使用本說明書時，所謂的hSRCL-P1蛋白質和mSRCL-P1蛋白質，除特別指出外，均指含有SEQ ID NO2或4所示的胺基酸序列(多肽)，它們的衍生物、它們的片段。無論是天然的或是人工製作的，均包含在本發明前面的記載中。
可以舉出hSRCL-P1作為例子，它具有SEQ ID NO24所示的胺基酸的蛋白質(至於SEQ ID NO1所示的蛋白質，是膠原蛋白區段的一部分和頸區段，即第483～606號胺基酸殘基缺失的變異體)，SEQ ID NO1所示的多核苷酸變異體的例子，可以舉出編碼SEQ ID NO24的蛋白質的SEQ ID NO23所示的多核苷酸。
再有，本發明中也含有實際上與SEQ ID NO2或4所示的胺基酸序列類似的胺基酸序列及編碼實際上與SEQ ID NO2或4所示的胺基酸序列類似的胺基酸序列的鹼基序列。並且也含有具有這些胺基酸序列的蛋白質。與SEQ ID NO2或4所示的胺基酸序列實際上相似的胺基酸序列，和含SEQ ID NO2或4所示的胺基酸序列的蛋白質具有同樣的性質，即是說，因為含有SR所特有的亮氨酸拉鏈構造的貫穿膜區段、α-螺旋區段、類似膠原蛋白區段，在具有活性、機能和三次構造的範圍內，帶有一個或數個胺基酸置換、缺失、添加和/或插入等的改變的胺基酸序列。無論它們是天然的或是人工製作的。
其次，本發明也包含SEQ ID NO1或3之一的核酸順序或其片段的核酸順序、或與它們互補的核酸順序(以下稱為特定順序)、也包含嚴謹條件下能夠雜交的核酸順序。在本發明中，所謂嚴謹條件是指，例如在含有5xSSC、5％Denhard′s溶液(0.1％BSA、0.1％Ficoll400、0.1％PVP)、0.5％SDS和20μg/ml變性鮭精子DNA的溶液中，37℃保溫一夜，隨後，在室溫下用含0.1％SDS的2xSSC洗淨。使用適當的SSPE代替SSC也很好。這樣得到的核酸順序，至少是特定的順序，被認為具有50％的同源性。特定順序和嚴謹條件下可以雜交的核酸順序所編碼的蛋白質，推測多具有和SRCL-P1蛋白質相同的性質，並且，只要具有和SRCL-P1蛋白質相同性質，本發明也包括這樣的蛋白質。
特別是SEQ ID NO2所示hSRCL-P1(胺基酸號1～742)的胺基酸序列是由742個胺基酸組成的蛋白質，編碼此蛋白質的鹼基序列由2226個鹼基組成。該順序中存在有亮氨酸拉鏈區段、α-螺旋區段、類似膠原蛋白區段、頸區段、CRD區段等特有的胺基酸序列，即是說，存在有胺基酸號36～57所示的亮氨酸拉鏈區段、胺基酸號72～426(Coils Program)或81～431(Multicoil Program)所示的α-螺旋區段、胺基酸編號443-589所示的類似膠原蛋白區段、胺基酸號590-606所示的頸部區段、胺基酸號607～742所示的CRD區段等。還可舉出其它區段如胺基酸號63～742(TMHMM1.0program)或者58～742(TMpred program)所示的細胞外區段、胺基酸號1～39(TMHMM1.0 program)或1～37(TMpred program)所示的細胞內區段、胺基酸號40～62(TMHMM1.0 program)或38～57(TMpred program)所示的貫穿膜區段、胺基酸號443～743的外源凝集素區段(結構域)等，還有，含有胺基酸號708～730所示的C型凝集素基序。編碼此蛋白質的鹼基序列示於SEQ ID NO1。
其次，SEQ ID NO4所示的mSRCL-P1(胺基酸號1～742)的胺基酸序列是由742個胺基酸組成的蛋白質。編碼此蛋白質的鹼基序列由2226個鹼基組成。該序列和序列2所示的hSRCL-P1相同，存在有亮氨酸拉鏈區段、a-螺旋區段、類似膠原蛋白區段、頸區段、CRD區段、C型凝集素基序等特徵性的胺基酸序列。編碼此蛋白質的鹼基序列示於SEQ ID NO3中。
本說明書使用的所謂相同體是指同源性高的核酸順序或胺基酸序列，至少在50％以上，較好為70％以上，更好在90％以上。順序中存在缺失和插入時，最好能進行帽子(キヤツプ)結合的同源性檢查。例如，可以用多重直線排列(商品名SODHO，富士通)的方法進行檢查。其次，同源性檢查的推導法可以用最嚴密的Smith-Waterman推導法。此外，可通過網際網路利用FASTA和BLAST等。
本說明書中使用的所謂變異體，可以舉出，例如等位基因(allele)單核苷酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)等。其次，在本發明的核酸順序中也含有密碼子縮小範圍內起變化的核酸順序的變異。可以按照通常的方法利用合成的寡核苷酸構成的引物，編碼所希望的改變，使核酸順序的密碼子的一部分改變的，位置特異的變異導入法等(Mark，D.F.等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，81，5662，1984)進行，本發明的核酸順序中也包括所得到的人工基因變異體。其次，也有超出密碼子縮小範圍的場合，由變異的密碼子翻譯出變異的胺基酸，最好具有與正常胺基酸類似的性質。例如脂肪族胺基酸的丙氨酸、頡氨酸、亮氨酸、以及異亮氨酸之間的變異，中性胺基酸有甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、頡氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺之間的變異，酸性胺基酸有天冬氨酸和穀氨酸之間的變異，鹼性胺基酸有精氨酸、賴氨酸以及組氨酸之間的變異，有羥基的絲氨酸和蘇氨酸之間的變異，有芳香環的苯丙氨酸和酪氨酸之間的變異等，最好胺基酸的性質、功能和特性等都類似。本發明也包含這些人工的和天然的變異的蛋白質。可以用PCR法引起特異位置上的變異，也可以使用人們熟知的其它方法，引起任意位置上的變異。
本說明書中使用的修飾體，例如乙醯基化、醯基化、ADP-核糖基化、醯胺化、肉豆蔻醯基化、葡萄糖基化、羥化、磷酸化、硫酸化、甲醯基化、甲基化、聚乙二醇化、脂質結合、核苷酸結合、金屬結合(鈣附加體等)、與多種蛋白質(白蛋白等)的融合體、二聚體等的改變，都可用通常的方法進行。例如，因為大腸菌不能引起宿主的葡萄糖基化，所以在打算葡萄糖基化時最好用真核細胞進行。可以利用昆蟲細胞，也可以利用哺乳動物細胞進行翻譯後的葡萄糖基化。
本說明書中使用的多型性變種是指例如染色體DNA的構造以及形態上的差異產生的多型性，由於某種基因的等位基因變化產生的多型性等。一般真核生物的基因多顯示多型現象，由於這一現象，一個或多個胺基酸也被置換，其次，這種場合下蛋白質的活性仍保持著。因此，編碼SEQ ID NO2或4任意一個顯示的胺基酸序列的基因被人工改變，所得的編碼蛋白質的基因，只要該蛋白質具有本發明的基因的特有的功能，本發明都包括在內。其次，SEQ ID NO2或4任意一個所顯示的胺基酸順序被人工改變後得到的蛋白質，只要具有本發明的蛋白質的特徵，都包括在本發明內。所謂改變可理解為含有置換、缺失、添加和/或插入。
本說明書中使用的所謂片段是指例如上述SRCL-P1具有的胺基酸序列中的任意片段，可以舉出細胞外片段和細胞內片段、貫通膜區段、亮氨酸拉鏈區段、a-螺旋區段、類似膠原蛋白區段、頸部區段、CRD區段、類似共同凝集素區段、疏水性區段(頸部區段、貫穿膜區段等)、親水性區段(疏水性區段以外)等。再有可以舉出這些片段被融合的片段。例如可舉出SEQ ID NO2所示的hSRCL-P1的胺基酸序列缺失了貫穿膜區段形成可溶性受體的由58乃至63號到742號的胺基酸片段、缺失CRD區段形成貫通膜型清除蛋白受體的具有約1-606號胺基酸的片段、由亮氨酸拉鏈區段和α-螺旋區段構成的可溶性清除蛋白受體的約36號到426號乃至431號的胺基酸片段，還有，除去CRD區段和頸部區段的第1-589號胺基酸的片段等。
獲得SRCL-P1基因的方法可以用任何方法獲得本發明的SRCL-P1基因。例如，可以從表達該蛋白質的細胞製取mRNA，再用常規方法轉換成雙鏈DNA，獲得編碼SRCL-P1的鹼基序列。可用異硫氰酸胍-氯化鈣等方法抽提mRNA(Chirwin，等人；Biochemistry，18，5294，1979)。應用結合了寡聚(dT)的載體，例如聚蔗糖或膠乳粒，進行親和層析等從總RNA提取多聚(A)RNA。用所得的RNA做模板，用3′末端上有多聚(A)鏈的互補的寡聚(dT)或λ噬菌體引物，或者與SRCL-P1的胺基酸序列的一部分相對應的合成寡核苷酸作為引物，進行逆轉錄酶反應(Mol.Cell Biol.，2，161，1982、Mol.Cell Biol.，3，280，1983、Gene，25，263，1983)，這樣得到的cDNA鏈，再用大腸桿菌RnaseH、大腸菌DNA聚合酶I、大腸菌連接酶處理，通過變換成DNA，可得到雙鏈的cDNA。可以將此cDNA重組進質粒載體、噬菌體載體、粘粒載體，轉化進大腸菌，或體外包裝之後轉染進大腸菌，建成cDNA文庫。
可以在這裡使用的質粒載體只要能在宿主內複製，沒有特別的限制。噬菌體載體，只要能在宿主內增殖，也沒有特別的限制。克隆用的載體，可以舉出的有，pBR322、pUC19、λgt10、λgt11等。其次，在提供免疫學篩選時最好有能夠表達宿主內SRCL-P1基因的啟動子的載體。
將cDNA重組進質粒的方法可參考Maniatis等人的方法(《分子克隆實驗指南》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版)。其次，將cDNA重組入噬菌體載體的方法可參考Hyunh等人的方法(DNA Clonging，a practical approach，1，49，1985)。
前述將表達載體導入宿主細胞的方法，例如有脂聚胺、DEAE-葡聚糖、hanahan(ハナハン)法、脂轉染法、磷酸鈣法由來的轉染法、微注射法和電穿孔等方法(《分子克隆實驗指南》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版)。體外包裝可用市售的試劑盒(Stratagene公司制、Amersham公司制)，簡便易行。
由上述製得的cDNA文庫分離編碼SRCL-P1蛋白質的cDNA的方法，可用一般的cDNA篩選方法組合進行。例如，製作32P標記的探針，採用菌落雜交法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3961，1975)、噬斑雜交法(《分子克隆實驗指南》MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，2，108，1989)可以篩選出含有目的cDNA的克隆。其次，也可以用PCR法選擇克隆。再者，在使用表達cDNA的載體製作cDNA文庫時可通過利用識別SRCL-P1的抗體來篩選目的克隆。
其次，用能表達SRCL-P1基因的細胞分離SRCL-P1基因的時候，例如，採用SDS或蛋白酶K溶解該表達細胞，用酚處理，用核糖核酸酶消化沒有用的RNA。用限制酶消化得到的DNA，將所得的DNA片段用噬菌體或粘粒擴增製成文庫。然後選擇目的克隆，就可以獲得SRCL-P1基因。
可以應用馬克薩姆-吉爾伯特法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，560，1977)或桑格爾法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463，1977)測定這樣得到的DNA的鹼基序列。可以用限制酶等從上述得到的克隆中切出SRCL-P1基因。
使用根據SRCL-P1鹼基序列合成的引物，應用以SRCL-P1表達細胞的多聚(A)+RNA為模板的RT-PCR法進行篩選，也是可以的。其次，不用PCR，根據SRCL-P1鹼基序列製作合成探針，直接篩選cDNA文庫，也可以得到目的cDNA。用這些方法得到的基因中，可以通過測定基因鹼基序列選擇出本發明的基因。也可以用例如磷亞胺酸酯法(Mattencci M.D.等人，J.Am.Chem.Soc.，130，3185，1981)等核酸化學合成的通常方法製作本發明的基因。
表達載體的製作方法本發明還涉及以含有SRCL-P1s核酸順序為特徵的載體。對於載體沒有特別的限制，只要能表達SRCL-P1s蛋白質的即可，質粒載體、RNA載體、DNA載體、病毒載體、噬菌體載體等都可以使用。具體地，可以舉出Invitrogen公司生產的pBAD/His、pRSETA、pcDNA2.1、pTrcHis2A、pYES2、pBlueBac4.5、pcDNA3.1、pSecTag2、Novagen公司生產的pET、pBAC、Promega公司生產的pGEM、Stratagene公司生產的pBluescriptII、pBS、Phagescript、pSG、pSV2CAT或者Pharmacia公司生產的pGEX、pUC18/19、pBPV、pSVK3、pSVL等。
表達載體上連接的SRCL-P1s cDNA順序和啟動子有功能地連接著。關於啟動子，可以舉出噬菌體的λPL啟動子、大腸菌的lac、trp、tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子、T7和T3啟動子、逆轉錄病毒的LTR啟動子。特別是，可以使用的真核細胞啟動子，有CMV啟動子、HSV啟動子、SV40早期和晚期啟動子、逆轉錄病毒的LTR啟動子、RSV啟動子、金屬硫蛋白啟動子。再有，表達載體也可以含有能選擇轉化的宿主的特殊記號和增強子。記號有二氫葉酸還原酶基因、卡那黴素耐性基因、氨苄青黴素耐性基因等。增強子有SV40增強子、巨細胞病毒的早期增強子-啟動子、腺病毒增強子等。
轉化細胞的製作方法本發明提供上述載體中保存的本發明的這些鹼基序列，並保持可能表達它們的轉化細胞。雖然本說明書所指的作為轉化細胞用的宿主細胞最好是動物細胞和昆蟲細胞，但是可以舉出能夠表達本發明的表達載體中的SRCL-P1s蛋白質的所有細胞(包括微生物)。
本說明書中的動物細胞或昆蟲細胞，可以舉出分別來自人的細胞、來自果蠅或蠶的細胞。例如CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、Vero細胞、骨髓瘤細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、Jurkat細胞、小鼠L細胞、小鼠C127細胞、小鼠FM3A細胞、小鼠纖維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、S2、Sf9、Sf21、High FiveTM(註冊商標)細胞等。本說明書所指的微生物包括大腸菌或酵母等。可以用上面所述的方法導入這些宿主。
本發明的SR表達細胞，可以用來分析有關動脈硬化發病的SR路徑、通過此路徑被攝入細胞的被修飾的LDL的特異性。其次，可以用作分析以受體為媒介的物質攝入細胞的模型。其次，本發明的細胞可以用於動脈硬化症治療藥物的開發，例如，LDL變性的抑制劑、醯基輔酶A、膽固醇醯基轉移酶(ACAT)活性抑制劑等的開發過程中，用於藥物的篩選。還有可以應用於有糖鏈的人SR蛋白質的製造。此外，可以用於以SR為媒介的異物或變性物的處理過程的實驗系統，或者作為引起伴隨變性白蛋白的感染的B型病毒等的感染實驗系統。
獲得蛋白質的方法本發明也涉及培養上述用本發明的鹼基序列轉化的細胞，提取產生的SRCL-P1，製造SRCL-P1的方法。可以用本領域的人熟知的方法進行細胞培養，蛋白質分離還有精製。
本發明的蛋白質，其本身可以作為，容易分離、精製、識別的重組融合蛋白質被表達。所謂重組融合蛋白質編碼目的蛋白質的核酸順序緊連在可能表達的蛋白質的N末端或/和C末端的一側並添加了適當的肽鏈的可被表達的蛋白質。為了使表達的蛋白質的精製變容易，最好作為具有細胞分泌信號的融合蛋白質被表達。其次，從各種原料精製蛋白質，例如從培養細胞、培養組織、轉化細胞等產生蛋白質的原料，可以採用歷來公認的方法，如硫酸銨沉澱法等鹽析、用交聯葡聚糖等的凝膠過濾法、離子交換層析法、疏水性層析法、色素凝膠層析法、電泳法、透析、限制過濾法、親和層析和高速液相層析法。
基因利用方法為了檢出SRCL-P1基因，可以根據SEQ ID NO1或3任意一個所記載的鹼基序列設計探針。或者，可以設計為了擴增含有這些鹼基序列的DNA和RNA用的引物。利用給定的順序設計探針和引物是本領域的從業人員日常進行的工作。可以通過化學合成得到具有設定的鹼基序列的寡核苷酸，然後在此寡核苷酸上添加適當的標記，則可利用各種各樣的雜交檢測法。或者可以採用PCR那樣的核酸合成反應。作引物用的寡核苷酸至少有10個鹼基，較好15-50個鹼基的長度是理想的，用作探針的寡核苷酸，全長達100個鹼基較為理想。其次，因為也可以應用於編碼SRCL-P1蛋白質的基因變異的檢出和SNP的檢出等，可用來診斷SRCL-P1基因變異而產生的疾病。例如，推想可以利用來診斷動脈硬化、糖尿病性合併症以及早老性痴呆病、高β脂蛋白血症、高膽固醇血症、高甘油三酯血症、低α-脂蛋白血症、移植、動脈切除及血管形成後再狹窄、以及細菌感染等各種疾病。再有，因為SRCL-P1基因可被導入並表達，對於基因治療也是有用的。
再有，根據本發明提供的SRCL-P1的cDNA鹼基序列，也有可能取得基因組中存在的SRCL-P1基因的啟動子區、增強子區。具體地說，用日本專利公開公報平6-181767、(J.Immunol.，155，2477，1995、Proc.Natl.Acad.Sci，USA.，92，3561，1995)等同樣的方法得到這些控制區是可能的。本說明書中所述的啟動子區是指存在於轉錄開始部位，調控基因表達的DNA區，所謂增強子區是指存在於內含子、5′不翻譯區或3′不翻譯區的增強基因的表達的DNA區。
蛋白質利用方法本發明的SRCL-P1s蛋白質有可能被利用來闡明巨噬細胞和基礎免疫的機能，闡明動脈硬化、糖尿病性合併症和早老性痴呆病、高β脂蛋白血症、高膽固醇血症、高甘油三酯血症、低α-脂蛋白血症、移植、動脈切除及血管形成後再狹窄、以及細菌感染等各種疾病的發病機制。另外，有可能用於這些疾病的診斷、預防以及治療方法，和為了醫治這些疾病而開發利用試藥和醫藥都成為可能。其次，可以用作抗原，製作針對SRCL-P1s的抗體。而且也可用於激活劑和拮抗劑的篩選。
激活劑和拮抗劑本發明也涉及刺激本發明的SRCL-P1的活性或活性化的激活劑。還涉及阻礙本發明的SRCL-P1的活性或活性化的拮抗劑。拮抗劑的篩選可以使用作用於例如表達SRCL-P1蛋白質的細胞的候補抑制劑和OxLDL或抗體的競爭實驗系統，根據OxLDL的結合比例篩選候補抑制劑是可能的。此外，可以使用本領域公認的方法。其次，抑制劑也包含能阻礙SRCL-P1基因的表達的反義核酸。其它篩選方法有測定因受體的活化發生的細胞外pH變化的方法(Science，246，181-296，1989)。
利用篩選的拮抗劑可以作為藥物對與氧化LDL的積累以及細胞與AGE結合有關的疾病進行治療、預防等處理。這種篩選方法是將本發明的SRCL-P1與氧化LDL或與AGE的結合量，在有候補藥物存在下和不存在下做比較，根據這種候補藥物阻礙兩者結合的能力可以鑑定用於處理目的疾病的藥物，這種篩選方法包括有鑑定藥物工程為特徵。
轉基因非人動物本發明涉及SRCL-P1基因的表達水平有變化的轉基因非人動物。這裡所謂的SRCL-P1基因包括編碼hSRCL-P14或SRCL-P1的cDNA、基因組DNA或是合成DNA。其次，基因的表達既包括轉錄也包括翻譯各步驟。本發明的轉基因非人動物，對於SRCL-P1的功能或表達調節的研究對推想與SRCL-P1有關的疾病的機理的闡明，醫藥品的篩選，安全性試驗用的疾病模型動物的開發是有用的。
在本發明中，正常情況下，調節基因表達的幾個重要部位(增強子、啟動子、內含子等)的一部分由於發生缺失、置換、添加和/或插入等的變異，和原來的基因表達水平比較上升或下降，這樣的人工修飾是可能的。這種變異的導入可以用眾所周知的方法進行，可以獲得轉基因動物。
所謂轉基因動物，狹義上講，是通過基因重組，外來基因被人為地導入生殖細胞的動物，廣義上講，是使用反義RNA抑制了特定的基因的功能的反義轉基因動物和用胚性幹細胞(ES細胞)使特定的基因被缺損的動物，包含被導入了點突變的DNA的動物，在個體發生的初期，外來基因被導入安定的染色體，作為遺傳物質傳遞給子孫的動物。
本說明書中所謂轉基因動物應廣義地理解為人以外的所有脊椎動物。本發明中的轉基因動物對於SRCL-P1的功能或表達調節的研究，對人體內表達的細胞有關的疾病的機理的闡明，醫藥品的篩選，安全性試驗用的疾病模型動物的開發是有用的。
轉基因動物的製作方法是在相差顯微鏡下用微型吸管將基因直接導入前核期卵子的核的方法(微注射法，美國專利4873191)、使用胚性幹細胞(ES細胞)的方法等。此外正在開發將基因插入反轉錄病毒載體或腺病毒載體，感染卵子的方法、其次，精子介導的將基因導入卵子的精子載體法等。
所謂精子載體法，是使外來基因附著在精子上或者用電穿孔等方法導入精子之後，再使卵子受精，將外來基因導入的基因重組法(M.Lavitranoet等，Cell，57，717，1989)。或者可以用噬菌體P1的cre/lox P重組酶系統和啤酒酵母的FLP重組酶系統等，在體內進行部位特異的基因重組，其次，也有人報告使用反轉錄病毒將目的蛋白質的轉基因導入非人動物。
使用微注射法製作轉基因動物的方法是按照下面介紹的方法進行的。
首先，由與表達調控有關的啟動子、編碼特定蛋白質的基因、和多聚A信號構成的轉基因是必要的。由啟動子的活性左右著特定分子的表達樣式和表達量。其次，由於導入的轉基因的拷貝數和在染色體上的導入部位，製作的轉基因動物在系統間的不同，要確認在各系統間的表達樣式和表達量。為了判明非翻譯區和因為剪接而發生的表達量的變化，最好預先在多聚A信號之前導入剪接內含子順序。導入受精卵的基因，儘可能使用純度高的，這一點是重要的。作為使用的動物，採取受精卵用的小鼠(5-6周齡)、交配用的雄小鼠、假妊娠的雌小鼠、結紮了輸精管的雄小鼠等都可以用。
為了高效率地得到受精卵，最好也使用促性腺激素誘發排卵。回收受精卵，用微注射法將微注吸管中的基因注入卵子的雄性前核。將注射過的卵子移入準備好的動物(假妊娠的小鼠等)的輸卵管，一隻動物約移植10～15個卵子。之後，為了確認誕生的小鼠是否有導入的轉基因，從尾部前端抽出基因組DNA，用分子雜交法或PCR法檢出轉基因，或者用陽性篩選法，即只有在發生了同源重組時，插入的記號被激活，才可能應用這一方法。再有，為了確認轉基因的表達，可使用RNA-DNA雜交法或RT-PCR法檢出來自轉基因的轉錄產物。或者利用針對蛋白質或其片段的特異抗體進行Western印跡。
缺損小鼠本發明的缺損(敲除，knock out)小鼠是指SRCL-P1基因的功能經處理而喪失的小鼠。所謂缺損小鼠是通過同源重組技術，使任意的基因破壞，其功能缺損的轉基因小鼠。利用ES細胞進行同源重組，選擇一方等位基因改變了的、破壞了的胚性幹細胞，可以製作缺損小鼠。例如，在受精卵的胚盤胞及桑椹期，注入基因，經過操作的胚性幹細胞，得到了來自胚性幹細胞的細胞和來自胚的細胞混合的嵌合體小鼠。這種嵌合體小鼠(所謂嵌合體是指基於兩個以上的受精卵的體細胞形成的單一個體)和正常小鼠交配，可以製成一方的等位基因完全改變、破壞的雜合結合體小鼠。此外雜合接合體小鼠相互交配，可製得同型接合體小鼠。
所謂同源交換，是指鹼基序列相同或非常類似的兩個基因之間，通過基因交換機制發生交換。選擇發生了同源交換的細胞可以使用PCR。使用插入基因的一部和期待插入的區域的一部作為引物進行PCR，能產生擴增產物的細胞就可以判明發生了同源交換。其次，在胚幹細胞中表達基因重組的場合，導入的基因上結合了卡那黴素耐性基因，導入後可通過卡那黴素耐性選擇細胞，使用公認的方法及改進的方法可以容易地進行選擇。
抗體製作方法本發明還提供識別SRCL-P1或其片段的抗體。本發明的抗體包括針對，例如具有SEQ ID NO2或4任意一個記載的胺基酸序列的蛋白質或其片段的抗體。製作SRCL-P1或其片段的抗體(例如多克隆抗體、單克隆抗體、肽抗體)或抗血清，可以使用本發明的SRCL-P1或其片段等作為抗原，按照本領域的人們公認的抗血清製作技術操作。特別是，能夠調控SRCL-P1功能的抗體(例如能識別CRD、類似膠原蛋白區段和α-螺旋區段等的抗體)作為含有抗體的醫藥品是有用的。
將本發明的SRCL-P1或其片段本身、或者和稀釋劑、載體一道注射到溫血動物的可能因注射而產生抗體的部位。為了注射時產生的抗體高，也可以注射完全的弗氏佐劑和不完全的弗氏佐劑。通常每1～6周注射一次，共注射2～10次。可以使用的溫血動物有，例如猴子、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、雞等。小鼠和大鼠就很好用。大鼠以Wistar和SD系的為好，小鼠以BALB/c、C57BL/6和ICR系的為好。
製作產生單克隆抗體的細胞時，從抗原免疫後的溫血動物(例如小鼠)選擇抗體效價已測定的個體，在最後一次免疫後的2～5天採取脾或淋巴節作為抗原，將它們所含的產生抗體細胞和骨髓瘤細胞融合，用這種方法可以製作產生單克隆抗體的雜交瘤。可以用下述的方法測定抗血清的抗體效價，即用標記的SRCL-P1與抗血清反應，然後測定與抗體結合了的標記劑活性。可以按照人們熟知的方法進行融合操作，例如Keller和Milstein法(Nature，256，495，1975)及其改進方法(J.Immunol.Method，39，285，1980、Eur.J.Biochem.，118，437，1981 Nature，285，446，1980)。聚乙二醇(PEG)和仙臺病毒等可以用作融合促進劑，PEG就很好。再有，為了提高融合效率可以適當地添加植物凝集素、多聚-L-賴氨酸、或者DMSO。
骨髓瘤細胞有X-63Ag8、NS-1、P3U1、SP2/O、AP-1等，最好用SP2/O。使用的產生抗體細胞(脾臟細胞)數與骨髓瘤細胞數的最佳比例為1∶20～20∶1，添加PEG(PEG1000～PEG6000最好)的濃度為10～80％，20～40℃，最好30～37℃培養1～10分鐘，可進行高效率的細胞融合。可以使用各種方法篩選產生抗SRCL-P1抗體的雜交瘤，例如，將SRCL-P1抗原直接或者與載體共同吸附在固相上(如微型平皿)添加雜交瘤培養上清，然後加上被放射性物質和酶等標記了的抗免疫球蛋白的抗體(細胞融合使用的細胞是小鼠細胞時，使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或者加蛋白A接合在固相上抗SRCL-P1抗體的檢出方法，可以舉出在吸附了抗免疫球蛋白的抗體或蛋白A的固相上添加雜交瘤培養上清，加入用放射性物質或酶等標記的SRCL-P1等，檢出結合在固相上的抗SCRL-P1的單克隆抗體。
選擇和克隆抗SRCL-P1單克隆抗體可按照本領域人們熟知的或者按照下述方法進行。利用添加了通常的HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺苷)的動物細胞用的培養基進行。挑選、克隆及育種用的培養基可利用能使雜交瘤生長發育的那種培養基，例如含1～20％，最好是10～20％牛胎兒血清的RPM1培養基、含1～10％的牛胎兒血清的GIT培養基、或培養雜交瘤用的無血清培養基等。培養溫度最好在37℃左右。培養時間通常為5天～3周，最好1～2周。通常在5％二氧化碳氣體下進行培養。雜交瘤培養上清的抗體效價，可以用上述測定抗血清中的抗SRCL-P1抗體效價的同樣方法測定。這就是說，可利用放射免疫檢測(RIA)法、酶免疫測定法(ELISA)、螢光免疫檢測法(FIA)、噬斑測定法、凝集反應法等，下面介紹的ELISA方法很好。
可以按照以下方法進行ELISA法篩選。將像處理免疫抗原同樣的方法處理過的蛋白質固定在ELISA平板的各個孔的表面。然後為防止非特異吸附，將BSA、MSA、OVA、KLH、明膠、或脫脂乳等在各孔中固化。在這些孔中添加雜交瘤培養上清液，放置一定時間進行免疫反應。用PBS等作為洗滌液洗淨各孔。在洗滌液中最好添加表面活性劑。添加酶標二次抗體並放置一定時間。標記酶可用β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、過氧化物酶等。用相同的洗滌液將各孔洗淨後添加標記酶的底物溶液，進行酶反應。添加的雜交瘤培養上清液中存在目的抗體時，就會發生酶反應，並且底物溶液的顏色起變化。
可用通常的半固體瓊脂法和極限稀釋法等本領域公認的方法進行克隆，具體地說，在確認了上述方法產生了目的抗體的孔之後，進行克隆操作，獲得單個克隆。最好使用極限稀釋法作為克隆方法，即稀釋雜交瘤時，預期平均每個培養平板的一個孔形成一個群落。在用極限稀釋法克隆時，為了提高群落形成能力，可利用支持細胞，也可以添加白細胞介素6等細胞增殖因子。此外，還可利用FACS和單細胞操作法。克隆化的雜交瘤最好培養在無血清培養基中。並在此上清液中加入適量的抗體。這樣獲得的單一的雜交瘤，用搖瓶和細胞培養裝置進行大量培養、在動物的腹腔內培養(J.Immunl.Meth.，53，313，1982)等方法都可得到單克隆抗體。在搖瓶培養時，可用含O～20％的FCS的細胞培養用的培養基(IMDM、DMEM、RPMI 1640及MEM等)。在動物腹腔內培養時，最好使用細胞融合時使用的骨髓瘤細胞由來的動物及同一種動物、同系統動物或缺損胸腺的裸小鼠。預先給予姥鮫烷等礦物油然後移植雜交瘤。1～2周後腹腔內骨髓瘤細胞增殖，可以得到含單克隆抗體的腹水。
用本發明的單克隆抗體，因為能選擇地識別SRCL-P1上的特異表位，可以不和其它蛋白質發生交叉反應。一般在構成這種蛋白質的胺基酸序列中，至少5個以上連續的胺基酸，最合意地是7～10個胺基酸順序才呈現出表位，這樣就可以說是此蛋白質顯示了固有的表位。所以由SEQ ID NO2和4任意一個記載的胺基酸進行選擇，並且至少連續5個胺基酸殘基構成的胺基酸序列的肽組成的表位，能被單克隆抗體認識，對本發明來說，就稱為hSRCL-P1和mSRCL-P1特異的單克隆抗體。如果從SEQ ID NO2和4記載的胺基酸序列之間找出保守的胺基酸序列，則可以選擇出SRCL-P1共同的表位。或者如果是含對各順序特異的胺基酸序列領域，則可能選擇出能識別各種蛋白質的可能的單克隆抗體。
抗SRCL-P1單克隆抗體的分離和精製，可以採用和多克隆抗體的分離精製同樣的免疫球蛋白的分離精製法。人們熟知的精製法，如鹽析法、酒精沉澱法、等電點沉澱法、電泳法、硫銨沉澱法、用離子交換劑(如DEAE)的吸附洗脫法、超離心法、凝膠過濾法、將抗原結合在固相上或用蛋白A或蛋白G等活性吸附劑僅僅提取抗體，獲得結合併解離的抗體的特異精製法，這樣的方法都可以應用。為了防止精製過程中形成凝集物以及抗體效價降低，可以添加如人血清白蛋白，濃度在0.05～2％。此外也可以添加甘氨酸、α-丙氨酸、等胺基酸類，特別是賴氨酸、精氨酸和組氨酸等鹼性胺基酸、葡萄糖和甘露醇等糖類或氯化鈉等鹽類。在有IgM抗體的場合，因為知道特別容易凝集，也可以用β-丙氨酸內酯和無水醋酸處理。
本發明的多克隆抗體可以按照本領域人們熟知的，根據這些方法衍生出來的方法製作。例如用免疫抗原(蛋白質抗原)本身，或它們與載體蛋白質的複合體，和製作上述單克隆抗體的方法相同，對溫血動物免疫，由該免疫動物可以提取針對本發明的蛋白質或其片段的抗體的血清，通過分離精製，可以製作出抗體。關於免疫溫血動物使用的抗原和載體-蛋白質複合體。載體蛋白質的種類和載體-半抗原的混合比，在載體上偶聯的免疫半抗原，對於抗體的效率若是好的話，什麼樣的物質以什麼樣的比例偶聯都可以，例如牛血清白蛋白和牛血清球蛋白、血藍蛋白等，對半抗原1的重量比，採用約0.1～20，最佳約1～5的比例，進行偶聯。其次，半抗原和載體偶聯時，可以應用各種縮合劑，可使用戊二醛、碳化二亞胺、馬來醯亞胺活性酯、含有巰基、二硫代吡啶基的活性酯試藥等。將縮合產物本身或與載體、稀釋劑一道注入溫血動物的可能產生抗體的部位。為了提高注射產生抗體的能力，最好還注入完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑。通常每2～6周注射一次，共注射3～10次。從上述方法免疫的溫血動物的血液、腹水等，最好從血液，提取多克隆抗體。測定抗血清中多克隆抗體的效價，可以用和上述測定血清中抗體效價樣同的方法。多克隆抗體的分離精製可以按照與分離精製上述單克隆抗體所用相同的免疫球蛋白分離精製法進行。
利用抗體的方法可以利用針對SRCL-P1或其片段的單克隆抗體以及多克隆抗體，診斷與治療和表達SRCL-P1的細胞有關聯的疾病。因為這些抗體與本發明的SRCL-P1或其片段能免疫結合，所以可利用這些抗體測定SRCL-P1或其片段。具體地說，用這些抗體測定SRCL-P1或其片段的方法，可以舉出例如，三明治法，其特點是檢出不溶性載體上結合的抗體與標記的抗體和SRCL-P1或其片段反應生成的三明治錯體，和競爭法，其特點是標記的SRCL-P1與受檢材料中的SRCL-P1或其片段與抗體發生競爭性反應，從抗體與反應的標記抗體量測定受檢材料中的SRCL-P1或其片段。
利用三明治法測定SRCL-P1或其片段可用二步法或一步法，二步法是首先在固定化抗體與SRCL-P1或其片段反應之後，洗滌以完全除去未反應物，添加標記的抗體，使形成固定化抗體-SRCL-P1標記抗體，一步法是將固定化抗體、標記抗體及SRCL-P1或其片段同時混合。
測定中使用的不溶性載體有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯酸酯、尼龍、聚縮醛、氟樹脂等合成樹脂、纖維素、瓊脂糖等多糖類、玻璃、金屬等。不溶性載體的形狀可以採用淺盤狀、球狀、纖維狀、棒狀、盤狀、容器狀、蜂窩狀、管狀等各種形狀。吸附了抗體的載體，在適宜的疊氮化鈉等防腐劑的存在下，保存於冷處。
關於抗體的固層化可以使用人們熟知的化學結合法或物理吸附法。化學結合法，可以舉出例如戊二醛法、N-琥珀醯-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-縮酸酯以及N-琥珀醯甲基-2-馬來醯亞胺乙醯酯等的馬來醯亞胺法、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸等碳化二亞胺法、此外，也可以用馬來醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯法、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸法、雙重氮化聯苯胺法、二棕櫚基賴氨酸法等。或者先使被檢出物質與表位不同的第二抗體反應，形成複合體，將針對此抗體的第三抗體用上述方法固層化也可能捕捉到被檢物質。
使用酶、螢光物質、發光物質、放射性物質、以及金屬螯合劑等作標記物質都很好。酶，可以舉出，例如過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、d-5-固醇異構酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、西洋山嵛菜過氧化物酶、天冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖澱粉酶、乙醯膽鹼酯酶等。螢光物質，可以舉出，例如螢光素異硫氰酸酯、藻膽色素蛋白、鹼性蕊香紅、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻青蛋白、鄰酞醛等。發光物質，可以舉出，例如異魯米諾爾、光澤精、魯米諾爾、芳香族丙烯鎓酯、咪唑啉、丙烯二鎓鹽及其修飾酯、螢光素、螢光素酶、水母發光蛋白等、放射性物質可列舉有125I、127I、131I、14C、3H、32P、35S等。不止這些，凡免疫測定上可以使用的方法都沒有特別的限制。其次，抗體上結合了生物素、二硝基酚、吡哆醛或螢光胺那樣的低分子半抗原也很好。使用西洋山嵛菜過氧化物酶作為標記酶更好。這個酶能和多個底物反應，用過碘酸法容易將它結合在抗體上。
標記物是酶時，為了測定其活性，根據需要用顯色劑作底物。用過氧化物酶時，用H2O2作底物，顯色劑可用2，2′-連氮基-雙-(3-乙基苯並噻唑磺酸)銨鹽(ABTS)、5-氨基水楊酸、鄰苯二胺、4-氨基安替比林、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺等。用鹼性磷酸酶時，底物可用鄰硝基磷酸苯酯、對硝基磷酸苯酯，用β-D-半乳糖苷酶時，底物用螢光素-二-(β-D-半乳糖吡喃苷)、4-甲基傘形酸苯基-β-D-半乳糖吡喃苷等。本發明還包括前述的單克隆抗體、多克隆抗體以及試劑盒化的試藥類。
偶聯劑可用N，N′-鄰苯二馬來醯亞胺、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷酸-N-琥珀醯亞胺酯、6-馬來醯亞胺己酸-N-琥珀醯亞胺酯、4，4′-二硫代吡啶以及人們熟知的其它偶聯劑。這些偶聯劑與酶及抗體反應，可根據各偶聯劑的性質進行。其次，根據情況可用抗體的片段作為抗體，例如Fab′、Fab、F(ab′)2。其次，不論多克隆抗體還是單克隆抗體都可經同樣的處理獲得酶標抗體。用上述偶聯劑得到的酶標抗體，若用親和層析等公認的方法精製，可成為靈敏度很高的免疫測定系統。精製的酶標抗體、加上硫柳汞或甘油等作穩定劑，或冷凍乾燥後保存於暗處。
測定對象沒有限制，只要是含有SRCL-P1的試料即可，如血漿、血清、血液、尿、組織液、腦脊髓液等體液。各種細胞、組織等。
人用抗體的製作方法在人體內製作對任意抗原免疫的抗體，理論上是不可能的。其次，將小鼠單克隆抗體注入人體，因為對人是異種蛋白，有發生各種副作用的危險。因此，把抗體應用於人時，最好用對人抗原性低的抗體。
人的單克隆抗體的製作方法，除了細胞融合法以外，還有用Epstein-Bar病毒(EBV)遺傳轉化的方法，還有把這種轉化的細胞與親細胞融合的方法，利用基因工程的嵌合抗體，製作人用的抗體等。所謂嵌合抗體是指將不同種動物的免疫蛋白基因片段連接製成的抗體。所謂人用抗體是指將小鼠等對人是異種的抗體，加以改變，把H鏈和L鏈的互補性決定部(CDR)以外的一次構造，用人抗體的對應部分的一次構造置換了的抗體。
嵌合抗體的製作方法如下，首先將小鼠免疫，由此小鼠單克隆抗體的基因切出與抗原結合的抗體可變部(V區)，使與來自人骨髓瘤的抗體恆定部(C區)基因結合，製作成嵌合基因。這種嵌合基因如果在宿主細胞中表達，就可產生人-小鼠-單克隆抗體。由於嵌合抗體對人抗原性小，可用做注入人體的治療性和攝像診斷用的單克隆抗體。與抗體有關的公認的技術見於特開平05-304989號、特開平04-330295號、WO9106649、特開昭63-036786號、特公平06-98021號等。
其次，最近開發出了比嵌合抗體更有用的是人用抗體。人用抗體是指僅將抗體分子的抗原結合部位(CDRComplementary determining reagion，互補決定區)的基因順序移到了人的抗體基因上(CDR嫁接)，除了抗體分子的CDR外，整個分子都是人抗體。由於本抗體比人-小鼠嵌合抗體，小鼠抗體部分少，抗原性小，因而安全性高。製作人單克隆抗體用的親細胞是人/小鼠雜合骨髓瘤SHM-D 33株(ATCC CRL 1668)或者RF-S1株可獲得與小鼠親細胞同樣高的融合效率。用這些親細胞得到的雜交瘤，無飼餵細胞也可以克隆，IgG型抗體比較穩定，而且可以大量生產。親細胞的培養用添加了15％FCS的ERDF培養基，其它操作與小鼠的情況是相同的。其次，製作IgG型的人單克隆抗體時最好採用末梢血液的被抗原充分感應了的人淋巴球。如果難以取得被抗原充分感應了的淋巴球，也可在體外進行抗原的感應。在日本，現在正在進行針對成年人T細胞白血病的人用抗體的臨床試驗。關於人用抗體的製造方法及其有關的技術可以利用例如美國Genentech公司(WO9222653、WO9845332、WO94O4679、WO9837200、WO9404679)和英國Celltech公司(WO9429451、WO9429351、WO9413805、WO9306231、WO9201059、WO9116927、WO9116928、WO9109967、WO8901974、WO8901783)等公開的技術。
採用上述的方法可以有效地將本發明的抗體人化，在給予人的場合非常有用。
組合物SRCL-P1多核苷酸、或蛋白質以及抗體物質、而且SRCL-P1的拮抗物等，與氧化LDL(變性LDL)累積有關的病態，例如從動脈粥樣硬化症等的動脈硬化開始、與AGE結合到細胞上有關的小球體硬化症等的障礙、糖尿病性合併症、以及AD、高β脂蛋白血症、高膽固醇血症、高甘油三脂血症、低α脂蛋白血症、移植、動脈切除以及血管形成後再狹窄、以及細菌感染症等各種疾病的診斷、預防和治療方法，以及可應用的試藥和醫藥的開發。其次，也可以和公認的醫藥合用或配合應用。例如動脈粥樣硬化症的治療藥、可以和ACAT抑制劑、HMG-CoA還原酶阻礙劑、脂質調節劑、膽汁酸調節劑合用或配合應用。
本發明的醫藥組合物可含有SRCL-P1多核苷酸和蛋白質、刺激SRCL-P1活性或活化的物質或阻礙物質，針對SRCL-P1蛋白質的抗體等物質(以下稱SRCL-P1關連物質)。SRCL-P1關連物質可以直接或用水稀釋後使用，可以配合各種藥品、非醫藥品使用。這種場合中該物質的配合量，要根據製品作適當的選擇，通常全身給藥時，可以用人體重量的0.001～50％、最好是重量的0.01～10％，少於0.001％就不認為可能滿足促進淚液分泌作用，其次，超過50％時製品本身的穩定性以及香味等特性可能受到損害。
除前述的口服和靜脈內給藥以外還可以選擇經黏膜、皮膚、肌肉內、皮下、直腸內、眼局部等給藥途徑。
本發明的SRCL-P1關連物質可以鹽的形式含在製劑中。藥劑學容許的鹽，可以舉出，例如無機鹼、有機鹼等鹼的鹽、無機酸、有機酸、鹼性或酸性胺基酸等的酸附加鹽等。無機鹼可以舉出，例如鈉、鉀等鹼金屬、鈣、鎂等鹼土金屬、鋁、銨等、有機鹼可以舉出，例如乙醇胺等一級胺、二乙基胺、二乙醇胺、二環己基胺、N，N′-二苄基乙二胺等二級胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、三乙醇胺等三級胺。無機酸可以舉出，例如鹽酸、溴氫酸、硝酸、硫酸、磷酸等。有機酸可以舉出，例如蟻酸、醋酸、乳酸、三氟乙酸、富馬酸、草酸、酒石酸、馬來酸、安息香酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。鹼性胺基酸例如可列舉精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等。酸性胺基酸可列舉天冬氨酸、穀氨酸等。
口服時的劑型有散劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、錠劑、酏劑、懸浮劑、乳劑和糖漿劑等，可以適當選擇。另外，在這些製劑中可施加緩釋、穩定、易崩解、難崩解、腸溶化、易吸收等修飾。另外，口腔內局部給予時的劑型有咀嚼劑、舌下劑、頰劑、錠劑、軟膏劑、貼布劑、液劑等，可按需選擇。並且，這些製劑可施加緩釋、穩定、易崩解、難崩解、腸溶化、易吸收等修飾。
關於上述劑型，可以採用人們熟知的給藥系統(DDS)技術。本說明書所述的DDS製劑是指處方化製劑，局部適用製劑(糖錠、圓片形錠、舌下錠等)，控制藥物釋放製劑、腸溶製劑和胃溶性製劑等，給藥途徑，生物藥效率，副作用等都加以考慮的是指最適宜的製劑形態的製劑。
DDS的基本構成要素有藥物、藥物釋放的模數、數量和治療方案構成，至於各構成要素，特別是停止釋放時能使血中濃度迅速下降的半減期短的藥物最好，給藥部位的生體組織不反應的量最好，再有，設定期間中維持最佳的藥物濃度的治療方案最好。藥物釋放的模數基本上有藥物儲藏庫、釋放控制部、能源及放出孔或釋放表面。這些基本構成要素不必完全齊備，可以適當增加或減少，可以選擇最佳的情況。
DDS中可以使用的材料有高分子材料、環化糊精誘導體、卵磷脂等。高分子材料有不溶性高分子材料(聚矽酮、乙烯-醋酸乙烯酯的共聚物、乙烯-乙烯醇的共聚物、乙基纖維素、醋酸纖維素等)，水溶性高分子材料和羥基凝膠形成的高分子(聚丙烯醯胺、聚羥基甲基丙烯酸乙酯交聯體、聚丙烯交聯體、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、水溶性纖維素衍生物、交聯泊洛沙姆、甲殼質、殼聚糖等)、緩溶性高分子(乙基纖維素、甲基乙烯基醚-無水馬來酸共聚體的部分酯等)、胃溶性聚合物(羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、焦糖鈉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯甲基丙烯酸甲酯共聚物等)、腸溶性聚合物(羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羥丙基甲基纖維素醋酸琥珀酸酯、羧甲基乙基纖維素、丙烯酸類聚合物等)、生物分解性聚合物(熱凝固或交聯的白蛋白、交聯的明膠、膠原、纖維蛋白、聚丙烯酸氰酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚-β-羥乙酸、聚己內酯等)，可根據劑型適當選擇。
特別是，聚矽酮、乙烯-醋酸乙烯酯共聚合體、乙烯-乙烯基乙醇的共聚合體、甲基乙烯基醚-無水馬來酸共聚合體的部分酯可以用於藥物釋放的控制，醋酸纖維素可以用作浸透壓泵的材料，乙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、甲基纖維素可以用作緩釋劑的膜材料，聚丙烯基交連體可以用作口腔黏膜或眼黏膜附著劑使用。
其次，根據劑型(口服劑、注射劑、座劑、等人們熟知的劑型)，在製劑中可以加入溶劑、賦形劑、包衣劑、基劑、結合劑、潤滑劑、分散劑、助溶劑、懸濁化劑、粘稠劑、乳化劑、穩定劑、緩衝劑、等滲劑、無痛化劑、保存劑、矯味劑、芳香劑、著色劑等。
本發明舉出各種具體例子加以說明，但是對這些並沒有特別的限制。
精製水、注射用水、生理鹽水、花生油、酒精、甘油，[賦形劑]澱粉類、乳糖、葡萄糖、白糖、結晶纖維素、硫酸鈣、碳酸鈣、滑石、二氧化鈦、巖藻糖、木糖醇、[包衣劑]白糖、明膠、醋酸、鄰苯二酸、纖維素以及上述高分子，〔基劑〕凡士林、植物油、聚乙二醇、水包油乳劑性基劑、油包水乳劑性基劑，〔結合劑〕澱粉及其衍生物，纖維素及其衍生物、明膠、精氨酸鈉、角豆樹膠、阿拉伯樹膠等天然高分子化合物、聚乙醯吡咯烷酮等的合成高分子化合物、糊精、羥基丙基澱粉，〔潤滑劑〕硬脂酸及其鹽類、滑石、蠟類、小麥澱粉、聚乙二醇、加氫植物油、蔗糖脂肪酸酯、聚乙烯二醇，〔分散劑〕澱粉及其衍生物、瓊脂、明膠粉、碳酸氫鈉、纖維素及其衍生物、焦糖鈣、羥基丙基澱粉、羧甲基纖維素及其鹽類、以及其偶聯體、低置換型羥基丙基纖維素，〔助溶劑〕環化糊精、乙醇、丙烯二醇、聚乙烯二醇，〔懸濁化劑〕阿拉伯樹膠、角豆樹膠、精氨酸鈉、單硬脂酸鋁、檸檬酸、各種表面活性劑，〔粘稠劑〕焦糖鈉、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯醇、角豆樹膠、阿拉伯樹膠、精氨酸鈉，〔乳化劑〕阿拉伯樹膠、膽固醇、角豆樹膠、甲基纖維素、各種表面活性劑、卵磷脂，〔穩定劑〕亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、生育酚、螯合劑、惰性氣體、還原性物質，〔緩衝劑〕磷酸氫鈉、醋酸鈉、硼酸，〔等滲化劑〕氯化鈉、葡萄糖，〔治痛劑〕鹽酸普魯卡因、利多卡因、苄基醇，〔保存劑〕苯甲酸及其鹽類、對氧苯甲酸酯類、氯代丁醇、逆性石鹼、苄基醇、酚、thyromesale、〔調味劑〕白糖、糖精、甘草精、山梨醇、木糖醇、甘油、〔芳香劑〕橙皮酊、玫瑰油、〔著色劑〕水溶性食用色素、色澱染料。
實施例以下是關於本發明的新型清除蛋白受體用實施例依次作詳細的說明，但是當然不可以用這些實施例的揭示內容對本發明做出限定的解釋。
就是，EST資料庫的檢索(實施例1)，篩選用探針的製作(實施例2)，來自人胎盤的cDNA文庫的篩選(實施例3)，新型人清除蛋白受體的鹼基序列的確定(實施例4)，和新型小鼠清除蛋白受體的cDNA的獲得(實施例5)，其次，瞬間表達新型人清除蛋白受體的轉染體的製作方法(實施例6和7)，穩定表達新型人清除蛋白受體轉染體的製作方法(實施例8和9)，新型人清除蛋白受體的結合特異性的驗證(實施例10)，貪食能力的證明(實施例11)，然後，血管內皮細胞中表達的證明(實施例12)，因為對以上這些結果都做了舉例證明，以下加以說明。
實施例1EST資料庫的檢索通過比較已知的共同凝集素，即人MBP，人SP-A和人SP-D的胺基酸序列(參看圖2和3，圖中，確認相同的胺基酸殘基部分已用方框圈起)對分子間保守性高的區域進行檢索。結果表明人MBP的胺基酸序列中從第220號到第246號的27個胺基酸(圖3，白框圈出部分，SEQ ID NO5)的保守性高，做成幾個相當於這一區域的相似順序，並進行EST(Expressed Sequence Tags)資料庫檢索。使用的EST資料庫是1996年10月11日的，含676750條順序。
結果得到了數個含有和上述27胺基酸的序列同源性高的胺基酸序列。對所得數據的胺基酸序列進行GenBank/EST資料庫檢索，以判定各是已知或未知的物質，相似順序為Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn-Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gln-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe(SEQ ID NO6)，用此胺基酸序列檢索時得到的順序中，得到了兩個數據，它們含有同源性高的未知胺基酸序列(登錄號W72977和R74387)。它們分別來自胎盤和胎兒心臟，它們是顯示新型共同凝集素的鹼基序列的一部分的克隆。
所以，這中間，購自ATCC(American Type Culture Collection)的來自胎兒心臟的克隆(I.M.A.G.E.Consortium Clone ID 34472)，被用來製作為篩選以下新型清除蛋白受體所用的探針。
實施例2篩選用探針的製作用引物(Parmacia公司制M13 Universal Primer(SEQ ID NO7，5′-螢光素-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3′)和M13反向引物(SEQ ID NO8，5′-螢光素-caggaaacagctatgac-3′))測定了上述克隆的插入DNA鹼基序列。
將這一鹼基序列的讀碼框和共同凝集素的胺基酸序列作比較，由此得出可以讀取的相當於胺基酸序列的鹼基序列，使用Applied Biosystems公司製造的392A DNA/RNA合成儀製作了相當於這一部分的地高辛(DIG)標記的cDNA探針用的引物(反向引物，caatctgatgagaaggtgatg(SEQ ID NO9)和正向引物，acgaggggctggatgggacat(SEQ ID NO10)。用PCR DIG探針合成試劑盒(Bohringer-Manheim公司制)進行了DIG標記。反應組成如下，質粒DNA(克隆W72977，50ng/ul)2μl(100ng)，10x緩衝液5μl，25mM MgCl25μl，dNTP(PCR標記混合物)5μl，20mM反向引物2.5μl，20mM正向引物5μl，H2O28μl，Taq聚合酶0.5μl)。用阿透公司生產的PCR儀進行PCR反應，92℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，循環35次。
實施例3人胎盤cDNA文庫的篩選首先，用以下方式進行了人胎盤的噬菌體cDNA文庫的效價測定.用mLB培養基(含10mM MgSO4和0.2％麥芽糖的LB培養基(1g胰酶水解腖，0.5g酵母提取物，0.5g NaCl/100ml)在37℃培養了16小時的大腸桿菌(Escherichia coli)Y1090r-0.2ml用SM緩衝液(5.8g NaCl、2g MgSO4.7H2O、2M Tris-HCl(pH 7.5)25ml、5ml 2％明膠/L)階段稀釋了的cDNA文庫0.1ml 37℃培養15分鐘，然後加入2.5ml LB-上層瓊脂糖(0.75％瓊脂糖/LB培養基)並混合均勻，倒在90mm直徑的LB培養基平板(巖城硝子公司制)(1.5％瓊脂/LB培養基)。室溫下15分鐘令其固化，42℃保溫5小時，將各平板的噬斑計數後，通過計算求出噬菌體的數據。結果數據是2.1×1010pfu/ml。就這樣測定了效價的cDNA文庫，利用實施例2製作的探針按以下過程進行了篩選。
用mLB培養基37℃培養了16小時的大腸桿菌(Escherichia coli)Y1090r-0.6ml和用SM緩衝液稀釋的cDNA文庫1×105pfu 37℃保溫15分鐘，然後加入7.5ml LB上層瓊脂糖(0.75％瓊脂糖)並混合均勻。將它鋪在140mm2LB培養基方形平板(日水製藥社制)上，製作10個平皿，室溫15分鐘使之固化，42℃培養5小時。確認噬斑形成後，再複印至尼龍膜上。用Nytran 13N(Schleicher and Schuell Co.)進行複印。將12.5cm×9.0cm濾膜在蒸餾水中浸10分鐘潤溼，然後在Whatman 3MM紙上除去多餘水分，將濾膜放在形成了噬斑的平板上。放置2分鐘後，剝下濾膜，風乾10分鐘。用0.2MNaOH/1.5M NaCl將噬菌體DNA變性2分鐘，用0.4M Tris-HCl(pH7.6)/2xSSC中和2分鐘，用2xSSC洗淨2分鐘。然後用GS GENE LINKER(Bio-Rad制)進行紫外線照射，將噬菌體DNA固定在濾膜上。雜交和信號的檢出按以下方法進行。用2xSSC將濾膜浸溼，用Whatman 3MM紙除去多餘水分，移入雜交袋和雜交溶液(5xSSC，1％封閉劑，0.1％N-月桂醯肌氨酸，0.02％SDS)68℃預雜交1小時。接下來除去袋中的雜交溶液，袋中加入含DIG標記的cDNA探針10ng/ml的雜交溶液，55℃雜交16小時。雜交終了後，將濾膜用2xSSC/0.1％SDS溶液室溫洗滌5分鐘，洗2次，55℃下，用0.5xSSC/0.1％SDS溶液洗15分鐘，洗2次。然後用DIG緩衝液I(100mMTris-HCl，150mM NaCl(pH7.5))處理1分鐘，除去SDS，用DIG緩衝液II(1％封閉劑，DIG緩衝液I)處理30分鐘將濾膜封閉。用DIG緩衝液I洗1分鐘，然後加入用DIG緩衝液II稀釋5000倍的鹼性磷酸酶標記抗體(Bohringer-Manheim公司制)溶液，室溫進行30分鐘抗體反應之後，用DIG緩衝液I室溫下洗15分鐘，洗2次。用DIG緩衝液III(100mM Tris-HCl，100mM NaCl(pH 9.5)，50mM MgCl2)處理3分鐘提高Mg2+的濃度，當加入NBT/BCIP(和光純藥社制)的DIG緩衝液III顯色時，得到了10個陽性克隆。從平板上把相當於這些克隆的噬斑切下來加到裝了1mlSM緩衝液的試管中，攪拌10分鐘後用SM緩衝液作階段稀釋，將此稀釋液0.1ml和用mLB培養基37℃培養了16小時的大腸桿菌(Escherichia coli)Y1090r-0.2ml混合，37℃培養15分鐘。然後將混合液加到2.5ml LB-上層瓊脂糖中並混合均勻，鋪在90mm直徑的LB培養基平板上面，製作10個平板，室溫15分鐘令固化，42℃培養5小時，得到了幾個噬斑，與第一次篩選一樣地進行了第二次篩選。
實施例4新型人清除蛋白受體鹼基序列的測定從平板上切出第二次篩選得到的陽性克隆中被認為是合適的克隆的噬斑，加到裝入了200μl蒸餾水的試管中，室溫攪拌30分鐘之後，15000rpm離心分離5分鐘得到上清。以得到的上清作模板，用TaKaRa LA PCR Kit Ver.2(保酒造社制)，通過PCR擴增插入的DNA。PCR反應的組成如下(上清27μl，10x LA PCR緩衝液II(不含Mg2+)5μl，25mM MgCl25μl，dNTP混合物8μl，20uM lgtII反向引物(SEQ ID NO11，5′-ttgacaccagaccaactggtaatg-3′)2.5μl，20uM λgt11正向引物(SEQ ID NO12，5′-ggtggcgacgactcctggagcccg-3′)2.5μl，LA Taq聚合酶0.5μl，H2O添加至總體積50μl)。使用Applied Biosystem公司制的Gene Amp PCR系統9600進行PCR反應，98℃20秒，68℃5分鐘為一循環，進行30循環。PCR產物經1％瓊脂糖電泳確認後，從凝膠切出精製。精製時使用了Pharmacia公司生產的Sephaglas Band Prep Kit試劑盒。
切出的DNA片段被重組進了Invitrogen公司生產的TA克隆試劑盒的pCR2.1載體。重組的載體被轉化進了Invitrogen公司生產的TA克隆試劑盒含有的TOP10F′細胞。用LB培養基(100μg/ml氨苄青黴素)培養轉化體，用鹼SDS法抽出了各克隆含有的3種質粒DNA。
用限制酶切斷被認為合適的所得的DNA，將各DNA片段重組進了pUC18載體，轉化進了XL1-Blue細胞。用LB培養基(100μg/ml氨苄青黴素)培養轉化體，用鹼SDS法抽出質粒。由CL-P1-2-1得到了含EcoR I-Hind III片段、HindIII-EcoR I片段的質粒，由CL-P1-3-4得到了含EcoR I-BamH I片段、BamH I-Sma I片段、Sma I-Hind III片段、Kpn I-Sau3A I片段、Sau3A I-EcoR I片段、EcoR I-Kpn I片段、EcoR I-Sma I片段的質粒，由CL-P1-3-7得到了含EcoR I-BamH I片段、BamHI-Sma I片段、Sma I-Hind III片段、Kpn I-Sau3A I片段、Sau3AI-EcoR I片段、EcoR I-Kpn I片段、Kpn I-EcoR I片段的質粒。使用AutoReadSequening Kit(Pharmacia公司生產)帶有的M13 Universal Primer(SEQ ID NO7)、M13Reverse Primer(SEQ ID NO8)和用DNA/RNA合成儀作成的FITC(Pharmacia公司生產FluorePrime)標記的以下引物，用Pharmacia公司生產的AutoRead SequencingKit和A.L.F.自動合成儀測定了全部的鹼基序列。
HPP 15′-螢光素-cgtgaaaatgaatggaagtgg-3′(SEQ ID NO13)、HPP 25′-螢光素-ttttatccattgctgttcctc-3′(SEQ ID NO14)、HPP 35′-螢光素-ctggcagtccccgaggtccag-3′(SEQ ID NO15)、HPP 55′-螢光素-gctggtccccccggagagcgt-3′(SEQ ID NO16)。
以上實施的順序測定的概略示於圖4。圖4(a)表示獲得的清除蛋白受體的共同凝集素構造部分的ORF，其中的G-X-Y(G表示甘氨酸，X和Y可以是任何一種胺基酸殘基)表示類似膠原蛋白區。然後，圖4(b)表示上述各引物的名稱，用順序儀讀取的鹼基序列(用箭形符號表示)以及M13 Universal primer(用U表示)和M13 Reverseprimer(用R表示)。
其次，用Cap Site cDNA，決定了含有此順序的轉錄開始點的5′末端區的鹼基序列。
根據Cap Site cDNA人肝(NIPPON GENE公司生產)使用添上的IRC2 Primer(5′-caaggtacgccacagcgtatg-3′(SEQ ID NO17)和用Applied Biosystems公司生產的392ADNA/RNA合成儀合成的TGP1 Primer(5′-tcttcagtttccctaatccc-3′(SEQ ID NO18))進行第一次PCR。反應混合物總液量50μl，含有LA PCR BufferII(不含Mg2+)、2.5mMMgCl2、各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP(以上保酒造社制)1μlCap SitecDNA Human Liver，0.5μM IRC2 Primer(以上NIPPON GENE公司生產)以及0.5μMTG P1 Primer。PCR的條件為，熱變性95℃20秒，60℃退火20秒，伸長反應72℃20秒，進行35個循環，再，包括重複反應前95℃熱變性5分鐘，最後72℃伸長反應10分鐘。第一次PCR終了後，進行嵌套PCR。取第一次PCR產物1μl做模板，引物用添上的2RC2引物(5′-gtacgccacagcgtatgatgc-3′(SEQ ID NO19))及合成的TGP2引物(5′-cattcttgacaaacttcatag-3′(SEQ ID NO20))(用和合成TGP1 Primer同樣的方法合成)，用和第一次PCR相同的反應組成、條件(但是循環次數為25次)進行。以上的PCR反應用保酒造社生產的TaKaRa PCR Thermal Cycler 480進行。得到的PCR產物經瓊脂糖電泳確認後，從凝膠中切出條帶，-80℃凍結10分鐘，15000rpm離心分離10分鐘後，取上清用酒精沉澱精製。
將精製的DNA片段重組進了Novagen公司生產的pT7Blue Vector，將此載體轉化進了感受態細胞XL1-Blue。用LB培養基(100μg/ml氨苄青黴素)培養轉化體，用鹼SDS法抽出質粒，用Pharmacia公司生產的AutoRead Sequencing Kit和A.L.F.DNA Sequencer測定了鹼基序列。引物用AutoRead Sequencing Kit附帶的M13Universal Primer(SEQ ID NO7)和M13 Reverse Primer(SEQ ID NO8)。
然後，為了確認N末端，合成了得到的cDNA克隆N末端部分的順序上遊方向的引物5′-atcttgctgcagattcgtgac-3′(SEQ ID NO21)，對胎盤來的cDNA文庫(Clontec公司生產)進行了篩選。篩選用合成的上遊方向的引物5′-atcttgctgcagattcgtgac-3′(SEQID NO21)和載體上含有的一部分引物λgt11 5′測序引物5′-gactcctggagcccg-3′(SEQ IDNO22)進行PCR。配製的反應液含2.5mM MgCl2、1xLA PCR Buffer II(不含Mg2+)、2U TaKaRa LA Taq、2種引物5′-atcttgctgcagattcgtgac-3′(SEQ ID NO21)、λgt11 5′測序引物5′-gactcctggagcccg-3′(SEQ ID NO22)各0.2μM、胎盤來的cDNA文庫1μl、加水至總量50μl、94℃2分鐘進行一個循環、94℃30秒、60℃30秒、72℃1分30秒進行50個循環。
將得到的cDNA用瓊脂糖凝膠電泳分離，用溴化乙錠溶液(0.1μg/ml)染色、用紫外線燈確認電泳圖形，發現相當於約600bp的插入順序被擴增了出來。因此將此擴增的部分從瓊脂糖凝膠切出、-80℃凍結10分鐘、15000rpm離心分離10分鐘後，取上清，用酒精沉澱精製。將精製的DNA片段重組進Novagen公司生產的pT7BlueVector，將此載體轉化進了大腸菌XL1-Blue的感受態細胞。用LB培養基(50μg/ml氨苄青黴素)培養轉化體，用鹼SDS法抽出質粒，用PE Applied Biosystems公司生產的DNA Sequencing Kit和序列分析儀ABI PRISM 377測定了鹼基序列。引物用Pharmacia公司生產的AutoRead Sequencing Kit附帶的M13 Universal Primer(SEQID NO7)和M13 Reverse Primer(SEQ ID NO8)。
已弄清楚，得到的鹼基序列是比N末端一側的604鹼基更長的順序。由以上結果確認，這裡得到的hSRCL-P1的cDNA含有2628鹼基，具有2226鹼基的ORF(翻譯解讀框)(SEQ ID NO1)，SEQ ID NO2所示的742個胺基酸是編碼的胺基酸。
接下來，用GenBank資料庫進行DNA和胺基酸相同性的檢索，得到的胺基酸序列，和以前發現的共同凝集素/清除蛋白受體終歸有所不同，發現是新型的蛋白質順序。
其次，得到了SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的第483～606號胺基酸缺失，由SEQ ID NO23所示的鹼基序列的第74～1933號得到編碼的突變體(SEQ ID NO24)。
實施例5新型小鼠清除蛋白受體的cDNA的獲得使用和hSRCL-P1同樣的方法，進行了小鼠肝臟cDNA文庫的篩選，得到了mSRCL-P1基因。所得mSRCL-P1的cDNA克隆含有2637鹼基，具有2226鹼基的ORF(翻譯解讀框)(SEQ ID NO3)，SEQ ID NO4表示的742胺基酸，可以確認是編碼的胺基酸。
實施例6hSRCL-P1的瞬間表達載體pEGFP-N1-hSRC-P1的構建首先，SEQ ID NO1所示的hSRCL-P1的開始密碼到終止密碼，使用ccgctcgagcggtcaccatgaaagacgact鹼基序列(SEQ ID NO25)做成的引物和tccccgcggtaatgcagatgacagtactgt鹼基序列(SEQ ID NO26)做成的引物、以人胎盤由來的cDNA文庫做模板，通過PCR(TaqKaRa公司生產TaKaRa Thermal Cycler MP)進行了擴增。將得到的hSRCL-P1 cDNA和pT7Blue T-Vector(Novagen公司生產)連接，並轉化進了大腸菌XL1-Blue。由得到的克隆精製了含hSCRL-P1 cDNA的質粒。用序列分析儀確認了所得質粒的鹼基序列之後，用限制酶Xho 1和Sac II消化正確無誤的質粒，用同樣的酶消化精製的pEGFP-N1 載體(Clontech公司生產)，進行了連接。連接的質粒被轉化進大腸菌XL1-Blue之後，培養得到的克隆，精製質粒，被認為是瞬間表達載體pEGFP-N1-hSRCL-P1。
實施例7用瞬間表達系統表達hSRCL-P1用實施例6中得到的表達載體pEGFP-N1-hSRCL-P1和LIPOFECTAMINE2000(LF2000)Reagent(GIBCOBRL公司生產)，試驗了在CHO細胞中瞬間表達。首先，準備了LF2000 Reagent溶液(LF2000 Reagent 12μl、Nutrient Mixture F-12 Ham(Ham′sF-12培養基(Sigma公司生產)))0.2ml，室溫培養5分鐘之後，和載體溶液0.2ml(pEGFP-N1-hSRCL-P1載體4μg、Ham′s F-12培養基)混合，培養20分鐘。然後添加在35mm培養皿中用2ml Ham′s F-12培養基(含5％FCS)培養至高密度的CHO細胞。37℃、5％CO2下培養4小時之後，換上新培養基，再繼續37℃5％CO2下培養20小時。用Olympus公司生產的倒立型系統顯微鏡IX70的螢光觀察系統，進行GFP的螢光像的觀察，以確認有無表達。這樣得到的細胞被認為是瞬間表達hSRCL-P1的細胞。
實施例8製作hSRCL-P1的穩定表達細胞株用的載體pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-P1的構建首先，SEQ ID NO1所示的hSRCL-P1的開始密碼到終止密碼中取aatgcggccgcaccatgaaagacgacttcgcagag鹼基序列(SEQ ID NO27)用作引物，和取gctctagaccgcggtaatgcagatgacagtac鹼基序列(SEQ ID NO28)用作引物，以來自人胎盤的cDNA文庫作模板，進行了PCR(TaKaRa公司生產Takara Thermal Cycler MP)擴增。將得到的hSRCL-P1 cDNA和pT7Blue T-Vector(Novagen公司生產)連接，並轉化進了大腸菌XL1-Blue。由得到的克隆精製了含hSCRL-P1 cDNA的質粒。用序列分析儀確認了所得質粒的鹼基序列之後，用限制酶Not 1和Sac II消化正確無誤的質粒，用同樣的酶消化精製的pcDNA3.1/Myc-His A載體(Invitrogen公司生產)，進行了連接。連接的質粒被轉化進大腸菌XL1-Blue之後，培養得到的克隆，精製質粒，被認為是穩定表達載體pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-P1。
實施例9hSRCL-P1的穩定表達細胞株的製成用實施例8中得到的表達載體pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-P1和LIPOFECTAMINE 2000(LF2000)Reagent(GIBCOBRL公司生產)，試驗了hSRCL-P1的穩定表達。首先，準備了LF2000 Reagent溶液0.5ml(LF2000 Reagent 30μl、Ham′sF12培養基)，室溫培養5分鐘之後，和載體溶液0.5ml(載體10μg、Nutrient MixtureF-12 Ham(Ham′s F-12培養基)(Sigma公司生產))混合，培養20分鐘。然後添加在25cm3搖瓶中用5ml Ham′s F-12培養基(含5％FCS)培養至高密度的CHO細胞。37℃、5％CO2下培養4小時之後，換上新培養基，再繼續37℃5％CO2下培養20小時。然後將培養基換用Ham′s F-12培養基(含5％FCS、0.4mg/ml Geneticin(GIBCOBRL公司生產))，接著培養10天。中間更換一次培養基。
通過此10天的藥物選擇，只有轉化的細胞生存並增殖，而非轉化細胞死亡了。為了從得到的轉化細胞中獲得高表達的細胞，使用細胞分選儀(Becton Dikinson公司生產)進行分選。首先將細胞表面表達了hSRCL-P1的細胞進行染色。用5ml PBS(-)洗轉化的25cm3搖瓶的細胞兩次之後，用EDTA solution 0.02％(Nakalitesk公司生產)0.3ml將細胞剝下，懸浮在10ml PBS(-)中，4℃下、200xg離心7分鐘，除去上清。添加用2％FCS/PBS(-)稀釋10倍的抗myc抗體(Invitrogen公司生產)50μl到剩下的細胞，將細胞好好地懸浮之後，4℃下培養20分鐘。然後，添加2％FCS/PBS(-)10ml並懸浮之後，4℃下、200xg離心7分鐘，除去上清，洗淨細胞。在剩下的細胞中添加用2％FCS/PBS(-)稀釋10倍的第二抗體Alexa488標記抗小鼠IgG(H+L)溶液50μl，將細胞好好地懸浮之後，4℃下培養20分鐘。然後，添加2％FCS/PBS(-)10ml並懸浮之後，4℃下、200xg離心7分鐘，除去上清，洗淨細胞。剩下的細胞懸浮在2％FCS/PBS(-)0.5ml中，作為分選的樣本。將樣本通過細胞分選儀附帶的5ml試管(Becton Dickson公司生產)然後加到細胞分選儀上。同樣方法處理沒有轉化的CHO細胞作為對照樣本，選出比對照樣本螢光強度高10倍的細胞。取96孔細胞培養平板，每孔放入100μl Ham′s F-12培養基(含5％FCS、0.4mg/ml Geneticin)和平均放入一個細胞。37℃、5％CO2下進行培養，培養一周後，再每孔加100μl培養液，繼續培養一周。由於用Geneticin的藥物選擇作用，將增殖起來的克隆分成兩份，在12孔和24孔細胞培養用平板中繼代培養。這時，除了一個孔中由二個以上細胞增殖的克隆以外，以9∶1的細胞比播種於12孔和24孔細胞培養用平板。37℃、5％CO2下進行培養，當12孔平板的細胞達到高密度時，再將每個克隆與分選時同樣的方法染色後送入FACSCalibur(Becton Dickinson公司生嚴)，測定表達量。確認了表達量高的克隆之後，取分別對應的24孔平板的細胞作為穩定表達細胞株(CHO/hSRCL-P1)。
實施例10hSRCL-P1的結合特異性用實施例9得到的穩定表達細胞株(CHO/hSRCL-P1)試驗了hSRCL-P1對(1)酵母(Zymosan A Bioparticles、Molecular Probes公司生產)、革蘭氏陰性細菌(Escherichiacoli Bioparticles、Molecular Probes公司生產)或革蘭氏陽性細菌(Staphylococcus aureusBioparticles、Molecular Probes公司生產)、(2)氧化LDL(2.0mg/ml LDL添加50μMCuSO4反應24小時，再對PBS(-)透析過)、(3)AGE-HAS(AGE-人血清白蛋白、按照Ikeda，K.等人.，Biochemistry 35(24)，8075-8083(1996)的方法處理)、或者(4)甘露糖(α-D-甘露糖BP-探針，生化工業社生產)或巖藻糖(α-L-巖藻糖BP探針、生化工業社生產)的結合特異性。
首先，1×105CHO/hSRCL-P1細胞播種於35mm平皿(松浪玻璃公司生產)中，37℃、5％CO2下培養3天。培養在2ml Ham′s F-12培養基(含5％FCS、0.4mg/mlGeneticin)中進行。3日後用含2％ FCS的Minimum Essential Medium AlphaMedium(αMEM/2％FCS)1ml洗兩次，然後添加含有25μg/ml酵母、25μg/ml革蘭氏陰性細菌、25μg/ml革蘭氏陽性細菌、5μg/ml氧化LDL、10μg/ml AGE、或10μg/ml甘露糖或10μg/ml巖藻糖的αMEM/2％FCS各1ml，4℃下反應3小時，然後用1ml αMEM/2％FCS洗5次。
用以下方法確認結合。首先，關於(2)、(3)和(4)，分別添加抗氧化磷酸乙醯膽鹼抗體(2)，抗HSA抗體(BIOSYS公司生產)(3)，streptavidin，Alexa594 conjugate(molecularProbes公司生產)(4)各用αMEM/2％FCS稀釋100倍的溶液1ml，然後4℃培養30分鐘，之後，用1ml αMEM/2％FCS洗3次。其次，從(1)到(4)全部都添加4％多聚甲醛/PBS(-)溶液0.2ml，室溫培養20分鐘進行固定，用1ml TBSC(寶酒造社制TBS(Tris-Buffered Saline)其中添加了粉末狀CaCl2並用滅菌蒸餾水調整最終濃度為5mM)洗3次。然後，關於(2)和(3)，與第二抗體進行反應。這就是說分別添加用25％BlockAce(大日本製藥社制)/TBS稀釋200倍的若丹明標記抗小鼠IgM Muchain(Chemicon International公司生產)(2)和Alexa 594抗山羊IgG(H+L)(MolecularProbe公司生產)(3)溶液1ml，接著室溫培養30分鐘，然後用1ml TBSC洗3次。然後用SlowFade Light Antifade Kit(Molecular Probe公司生產)將(1)到(4)裝片，在螢光顯微鏡下觀察樣本。使用Olympus公司生產的倒立型系統顯微鏡IX70的螢光觀察系統進行螢光像的觀察。分別地將(1)的結果表示於圖5(A酵母、B革蘭氏陰性細菌(Escherichia coli)、和C革蘭氏陽性細菌(Staphylococcus aureus))(2)到(4)的結果表示於圖6(A氧化LDL、B甘露糖、和CAGE)。這些圖清楚地表明，所有(1)到(4)，在穩定表達hSRCL-P1的CHO細胞上，都能觀察到特異的結合像，使用微生物的圖5 A到C中顯示的結果，hSRCL-P1的染色的地方(各左圖，綠色染色)和各種微生物存在的地方(各中央圖，紅色染色)是重疊的(Overlap，各右圖)，表明了各種微生物對hSRCL-P1的特異結合。
還有，在瞬間表達hSRCL-P1的細胞上(參見實施例7)，也同樣得到顯示特異結合的結果。
實施例11藉助於hSRCL-P1的吞噬作用結合物被攝入細胞內用實施例7和9得到的hSRCL-P1的瞬間表達細胞和穩定表達細胞株，觀察了實施例10中所用的各種結合物的細胞內攝取。改良了實施例10中記載的方法，與結合物反應溫度用37℃，確認了結合物的攝入。染色後，用Olympus公司生產的共焦點雷射顯微鏡，通過三維圖像處理，觀察了向細胞內攝取的狀態。用瞬間表達細胞對酵母得到的結果，表示於圖7，證明了酵母(紅色染色)被攝取進表達hSRCL-P1(綠色染色)的細胞內。並且，用穩定表達細胞株也得到了同樣的結果。
實施例12用血管內皮細胞證明SRCL-P1的表達為了確認hSRCL-P1的組織內表達的部位，使用來自健康人和小鼠心臟的石臘包埋切片(Novagen公司生產)，按照以下的操作，做了螢光免疫染色。
在石臘包埋切片載片的染色瓶中，在二甲苯中室溫下浸泡10分鐘，浸3次，進行脫石臘處理。然後在室溫下在100％-90％-80％-70％酒精中順次各浸10分鐘，在PBS(-)溶液中浸10分鐘，進行水合作用。
其次，為了抑制組織切片中內因性過氧化物酶活性，將切片在含有3％過氧化氫的PBS(-)溶液中室溫下浸泡10分鐘，然後室溫下浸泡在封閉劑(大日本製藥社制)中1小時，進行封閉處理。
接下來在保溼箱中，將抗hSRCL-P1家兔多克隆抗體(IgG部分、100μg/ml)100μl作為第一抗體，塗布在組織切片上，室溫下反應30分鐘。在染色瓶中將第一抗體浸在洗淨液(Tris-HClpH7.5，0.15M NaCl，0.05％Tween20)中，室溫下緩慢振蕩10分鐘，洗3次，然後與作為第二抗體的POD(過氧化物酶)標記抗家兔IgG羊抗體(Boehringer Mannheim公司生產)以5U/ml濃度，和第一抗體時同樣地反應，並洗淨。然後將Biotinyl Tyramide Amplification Reagent(NEN(商標名)、Life Science Products公司生產)塗布在切片上，室溫反應10分鐘，和第一抗體時同樣地洗淨。Avidin AlexaFluor(商標名)488 conjugate(Molecular Products公司生產)1mg/ml，用PBS(-)溶液稀釋100倍，取此溶液100μl，在保溼箱中塗布在載玻片上的組織切片上，室溫下反應30分鐘，和第一抗體時同樣地洗淨後，用Slowfade Light Antifade Kit(Molecular Products公司生產)裝片，用螢光顯微鏡(Nikon公司生產)觀察樣本。另外用正常兔血清代替第一抗體進行反應，進行了同樣處理的載玻片作為陰性對照。
這一結果，正如圖8所示，A健康常人和B小鼠的，心臟血管內皮細胞染色像觀察(各左圖)，陰性對照的這樣的染色像(各右圖)則完全看不到。因此證明了SRCL-P1在心臟中在血管內皮細胞中表達，在這裡表明了有關氧化LDL和AGE等與血管壁結合的可能性。
發明的效果本發明的SRCL-P1蛋白質，因為具有SR構造和共同凝集素構造，所以被認為是顯示這些特有的效果的物質，有可能利用來闡明巨噬細胞和基礎免疫的機能、闡明動脈硬化、糖尿病性合併症和早老性痴呆病、高β脂蛋白血症、高膽固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、移植、動脈硬化手術和血管形成後再狹窄、闡明細菌感染症等各種疾病的發病機制，然後用於診斷、預防和治療方法以及用於為此開發的試藥和醫藥。
序 列 表110扶桑藥品工業株式會社120新型清除蛋白受體13001P211WO1602821012112628212DNA213智人(Homo Sapiens)220
221CDS222(74)..(2299)4001ggggggacga cttcctcggc tgcgcggcgc tcgcgcggag ctccccggcc ggcggtgcgt 60ccccacggtc acc atg aaa gac gac ttc gca gag gag gag gag gtg caa 109Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gln1 5 10tcc ttc ggt tac aag cgg ttt ggt att cag gaa gga aca caa tgt acc157Ser Phe Gly Tyr Lys Arg Phe Gly Ile Gln Glu Gly Thr Gln Cys Thr15 20 25aaa tgt aaa aat aac tgg gca ctg aag ttt tct atc ata tta tta tac205Lys Cys Lys Asn Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser Ile Ile Leu Leu Tyr30 35 40att ttg tgt gcc ttg cta aca atc aca gta gcc att ttg gga tat aaa253Ile Leu Cys Ala Leu Leu Thr Ile Thr Val Ala Ile Leu Gly Tyr Lys45 50 55 60gtt gta gag aaa atg gac aat gtc aca ggt ggc atg gaa aca tct cgc301Val Val Glu Lys Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg65 70 75caa acc tat gat gac aag ctc aca gca gtg gaa agt gac ctg aaa aaa349Gln Thr Tyr Asp Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys80 85 90tta ggt gac caa act ggg aag aaa gct atc agc acc aac tca gaa ctc397Leu Gly Asp Gln Thr Gly Lys Lys Ala Ile Ser Thr Asn Ser Glu Leu95 100 105tcc acc ttc aga tca gac att cta gat ctc cgt cag caa ctt cgt gag445Ser Thr Phe Arg Ser Asp Ile Leu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Arg Glu110 115 120att aca gaa aaa acc agc aag aac aag gat acg ctg gag aag tta cag493Ile Thr Glu Lys Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gln125 130 135 140gcg agc ggg gat gct ctg gtg gac agg cag agt caa ttg aaa gaa act541Ala Ser Gly Asp Ala Leu Val Asp Arg Gln Ser Gln Leu Lys Glu Thr145 150 155ttg gag aat aac tct ttc ctc atc acc act gta aac aaa acc ctc cag589
Leu Glu Asn Asn Ser Phe Leu Ile Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gln160 165 170gcg tat aat ggc tat gtc acg aat ctg cag caa gat acc agc gtg ctc 637Ala Tyr Asn Gly Tyr Val Thr Asn Leu Gln Gln Asp Thr Ser Val Leu175 180 185cag ggc aat ctg cag aac caa atg tat tct cat aat gtg gtc atc atg 685Gln Gly Asn Leu Gln Asn Gln Met Tyr Ser His Asn Val Val Ile Met190 195 200aac ctc aac aac ctg aac ctg acc cag gtg cag cag agg aac ctc atc 733Asn Leu Asn Asn Leu Asn Leu Thr Gln Val Gln Gln Arg Asn Leu Ile205 210 215 220acg aat ctg cag cgg tct gtg gat gac aca agc cag gct atc cag cga 781Thr Asn Leu Gln Arg Ser Val Asp Asp Thr Ser Gln Ala Ile Gln Arg225 230235atc aag aac gac ttt caa aat ctg cag cag gtt ttt ctt caa gcc aag 829Ile Lys Asn Asp Phe Gln Asn Leu Gln Gln Val Phe Leu Gln Ala Lys240 245 250aag gac acg gat tgg ctg aag gag aaa gtg cag agc ttg cag acg ctg 877Lys Asp Thr Asp Trp Leu Lys Glu Lys Val Gln Ser Leu Gln Thr Leu255 260 265gct gcc aac aac tct gcg ttg gcc aaa gcc aac aac gac acc ctg gag 925Ala Ala Asn Asn Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu270 275 280gat atg aac agc cag ctc aac tca ttc aca ggt cag atg gag aac atc 973Asp Met Asn Ser Gln Leu Asn Ser Phe Thr Gly Gln Met Glu Asn Ile285 290 295 300acc act atc tct caa gcc aac gag cag aac ctg aaa gac ctg cag gac1021Thr Thr Ile Ser Gln Ala Asn Glu Gln Asn Leu Lys Asp Leu Gln Asp305 310 315tta cac aaa gat gca gag aat aga aca gcc atc aag ttc aac caa ctg1069Leu His Lys Asp Ala Glu Asn Arg Thr Ala Ile Lys Phe Asn Gln Leu320 325 330gag gaa cgc ttc cag ctc ttt gag acg gat att gtg aac atc att agc1117Glu Glu Arg Phe Gln Leu Phe Glu Thr Asp Ile Val Asn Ile Ile Ser335 340 345aat atc agt tac aca gcc cac cac ctg cgg acg ctg acc agc aat cta1165Asn Ile Ser Tyr Thr Ala His His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu350 355 360aat gaa gtc agg acc act tgc aca gat acc ctt acc aaa cac aca gat1213Asn Glu Val Arg Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp365 370 375 380gat ctg acc tcc ttg aat aat acc ctg gcc aac atc cgt ttg gat tct1261Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn Thr Leu Ala Asn Ile Arg Leu Asp Ser385 390 395gtt tct ctc agg atg caa caa gat ttg atg agg tcg agg tta gac act1309Val Ser Leu Arg Met Gln Gln Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr400 405 410gaa gta gcc aac tta tca gtg att atg gaa gaa atg aag cta gta gac1357Glu Val Ala Asn Leu Ser Val Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp415 420 425tcc aag cat ggt cag ctc atc aag aat ttt aca ata cta caa ggt cca1405Ser Lys His Gly Gln Leu Ile Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gln Gly Pro
430 435 440ccg ggc ccc agg ggt cca aga ggt gac aga gga tcc cag gga ccc cct1453Pro Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Asp Arg Gly Ser Gln Gly Pro Pro445 450 455 460ggc cca act ggc aac aag gga cag aaa gga gag aag ggg gag cct gga1501Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly Gln Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly465 470 475cca cct ggc cct gcg ggt gag aga ggc cca att gga cca gct ggt ccc1549Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Pro480 485 490ccc gga gag cgt ggc ggc aaa gga tct aaa ggc tcc cag ggc ccc aaa1597Pro Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly Ser Lys Gly Ser Gln Gly Pro Lys495 500 505ggc tcc cgt ggt tcc cct ggg aag ccc ggc cct cag ggc ccc agt ggg1645Gly Ser Arg Gly Ser Pro Gly Lys Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly510 515 520gac cca ggc ccc ccg ggc cca cca ggc aaa gag gga ctc ccc ggc cct1693Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Glu Gly Leu Pro Gly Pro525 530 535 540cag ggc cct cct ggc ttc cag gga ctt cag ggc acc gtt ggg gag cct1741Gln Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Gln Gly Thr Val Gly Glu Pro545 550 555ggg gtg cct gga cct cgg gga ctg cca ggc ttg cct ggg gta cca ggc1789Gly Val Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Val Pro Gly560 565 570atg cca ggc ccc aag ggc ccc ccc ggc cct cct ggc cca tca gga gcg1837Met Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ala575 580 585gtg gtg ccc ctg gcc ctg cag aat gag cca acc ccg gca ccg gag gac1885Val Val Pro Leu Ala Leu Gln Asn Glu Pro Thr Pro Ala Pro Glu Asp590 595 600aat ggc tgc ccg cct cac tgg aag aac ttc aca gac aaa tgc tac tat1933Asn Gly Cys Pro Pro His Trp Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr605 610 615 620ttt tca gtt gag aaa gaa att ttt gag gat gca aag ctt ttc tgt gaa1981Phe Ser Val Glu Lys Glu Ile Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu625 630 635gac aag tct tca cat ctt gtt ttc ata aac act aga gag gaa cag caa2029Asp Lys Ser Ser His Leu Val Phe Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gln Gln640 645 650tgg ata aaa aaa cag atg gta ggg aga gag agc cac tgg atc ggc ctc2077Trp Ile Lys Lys Gln Met Val Gly Arg Glu Ser His Trp Ile Gly Leu655 660 665aca gac tca gag cgt gaa aat gaa tgg aag tgg ctg gat ggg aca tct2125Thr Asp Ser Glu Arg Glu Asn Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Thr Ser670 675 680cca gac tac aaa aat tgg aaa gct gga cag ccg gat aac tgg ggt cat2173Pro Asp Tyr Lys Asn Trp Lys Ala Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gly His685 690 695 700ggc cat ggg cca gga gaa gac tgt gct ggg ttg att tat gct ggg cag2221Gly His Gly Pro Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gln705 710 715
tgg aac gat ttc caa tgt gaa gac gtc aat aac ttc att tgc gaa aaa2269Trp Asn Asp Phe Gln Cys Glu Asp Val Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys720 725 730gac agg gag aca gta ctg tca tct gca tta taacggactg tgatgggatc 2319Asp Arg Glu Thr Val Leu Ser Ser Ala Leu735 740acatgagcaa attttcagct ctcaaaggca aaggacactc ctttctaatt gcatcacctt 2379ctcatcagat tgaaaaaaaa aaaagcactg aaaaccaatt actgaaaaaa aattgacagc 2439tagtgttttt taccatccgt cattacccaa agacttggga actaaaatgt tccccagggt 2499gatatgctga ttttcattgt gcacatggac tgaatcacat agattctcct ccgtcagtaa 2559ccgtgcgatt atacaaatta tgtcttccaa agtatggaac actccaatca gaaaaaggtt 2619atcatcccg 26282102211742212PRT213智人(Homo Sapiens)220
223從核苷酸序列推導出的新型人清除蛋白受體的胺基酸序列.
4002Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gln Ser Phe Gly Tyr1 5 10 15Lys Arg Phe Gly Ile Gln Glu Gly Thr Gln Cys Thr Lys Cys Lys Asn20 25 30Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Leu Cys Ala35 40 45Leu Leu Thr Ile Thr Val Ala Ile Leu Gly Tyr Lys Val Val Glu Lys50 55 60Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg Gln Thr Tyr Asp65 70 75 80Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Asp Gln85 90 95Thr Gly Lys Lys Ala Ile Ser Thr Asn Ser Glu Leu Ser Thr Phe Arg100 105 110Ser Asp Ile Leu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Arg Glu Ile Thr Glu Lys115 120 125Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gln Ala Ser Gly Asp130 135 140Ala Leu Val Asp Arg Gln Ser Gln Leu Lys Glu Thr Leu Glu Asn Asn145 150 155 160Ser Phe Leu Ile Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gln Ala Tyr Asn Gly165 170 175Tyr Val Thr Asn Leu Gln Gln Asp Thr Ser Val Leu Gln Gly Asn Leu180 185 190Gln Asn Gln Met Tyr Ser His Asn Val Val Ile Met Asn Leu Asn Asn195 200 205Leu Asn Leu Thr Gln Val Gln Gln Arg Asn Leu Ile Thr Asn Leu Gln210 215 220Arg Ser Val Asp Asp Thr Ser Gln Ala Ile Gln Arg Ile Lys Asn Asp225 230 235 240
Phe Gln Asn Leu Gln Gln Val Phe Leu Gln Ala Lys Lys Asp Thr Asp245 250 255Trp Leu Lys Glu Lys Val Gln Ser Leu Gln Thr Leu Ala Ala Asn Asn260 265 270Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu Asp Met Asn Ser275 280 285Gln Leu Asn Ser Phe Thr Gly Gln Met Glu Asn Ile Thr Thr Ile Ser290 295 300Gln Ala Asn Glu Gln Asn Leu Lys Asp Leu Gln Asp Leu His Lys Asp305 310 315 320Ala Glu Asn Arg Thr Ala Ile Lys Phe Asn Gln Leu Glu Glu Arg Phe325 330 335Gln Leu Phe Glu Thr Asp Ile Val Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Tyr340 345 350Thr Ala His His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu Asn Glu Val Arg355 360 365Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp Asp Leu Thr Ser370 375 380Leu Asn Asn Thr Leu Ala Asn Ile Arg Leu Asp Ser Val Ser Leu Arg385 390 395 400Met Gln Gln Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr Glu Val Ala Asn405 410 415Leu Ser Val Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp Ser Lys His Gly420 425 430Gln Leu Ile Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg435 440 445Gly Pro Arg Gly Asp Arg Gly Ser Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly450 455 460Asn Lys Gly Gln Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro465 470 475 480Ala Gly Glu Arg Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg485 490 495Gly Gly Lys Gly Ser Lys Gly Ser Gln Gly Pro Lys Gly Ser Arg Gly500 505 510Ser Pro Gly Lys Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Pro515 520 525Pro Gly Pro Pro Gly Lys Glu Gly Le L Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro530 535 540Gly Phe Gln Gly Leu Gln Gly Thr Val Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly545 550 555 560Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro565 570 575Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ala Val Val Pro Leu580 585 590Ala Leu Gln Asn Glu Pro Thr Pro Ala Pro Glu Asp Asn Gly Cys Pro595 600 605Pro His Trp Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Val Glu610 615 620Lys Glu Ile Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser625 630 635 640His Leu Val Phe Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gln Gln Trp Ile Lys Lys645 650 655
Gln Met Val Gly Arg Glu Ser His Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Glu660 665 670Arg Glu Asn Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Lys675 680 685Asn Trp Lys Ala Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gly His Gly His Gly Pro690 695 700Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gln Trp Asn Asp Phe705 710 715 720Gln Cys Glu Asp Val Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys Asp Arg Glu Thr725 730 735Val Leu Ser Ser Ala Leu74021032112637212DNA213小鼠(Mus musculus)220
221CDS222(92)..(2317)4003gacgctagga ctggaacgct gaaggctgcc atgggcgtgc agtgagagac actggtacga 60cttctccggg cggagcgtgt cctcagtcac c atg aaa gac gac ttt gca gag 112Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu1 5gaa gag gag gtg cag tcc ttc ggt tac aag agg ttt ggt att cag gag160Glu Glu Glu Val Gln Ser Phe Gly Tyr Lys Arg Phe Gly Ile Gln Glu10 15 20ggg aca cag tgt acc aaa tgt aaa aat aac tgg gca ctg aag ttt tcg208Gly Thr Gln Cys Thr Lys Cys Lys Asn Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser25 30 35att gta tta tta tac att ctg tgt gcc tta ctg acc atc aca gta gcc256Ile Val Leu Leu Tyr Ile Leu Cys Ala Leu Leu Thr Ile Thr Val Ala40 45 50 55att ttg gga tat aaa gtt gta gag aaa atg gac aat gtc aca gat ggc304Ile Leu Gly Tyr Lys Val Val Glu Lys Met Asp Asn Val Thr Asp Gly60 65 70atg gag aca tct cac cag act tat gac aac aaa ctc act gct gtg gaa352Met Glu Thr Ser His Gln Thr Tyr Asp Asn Lys Leu Thr Ala Val Glu75 80 85agt gac ctg aag aaa tta ggg gat caa gct ggg aag aaa gct cta agt400Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Asp Gln Ala Gly Lys Lys Ala Leu Ser90 95 100acc aac tct gag ctt tct acc ttc aga tca gat att ctg gat ctc cgt448Thr Asn Ser Glu Leu Ser Thr Phe Arg Ser Asp Ile Leu Asp Leu Arg105 110 115caa caa ctt cag gag atc aca gaa aaa acc agc aag aac aaa gat acg496Gln Gln Leu Gln Glu Ile Thr Glu Lys Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr120 125 130 135ctg gag aag ttg caa gca aat ggg gac tca ttg gtt gat agg cag agt544
Leu Glu Lys Leu Gln Ala Asn Gly Asp Ser Leu Val Asp Arg Gln Ser140 145 150cag ctg aag gaa act ctg cag aat aat tct ttc ctc att acc acc gtc 592Gln Leu Lys Glu Thr Leu Gln Asn Asn Ser Phe Leu Ile Thr Thr Val155 160 165aac aaa aca ctc cag gca tat aat ggc tat gtc aca aat ctg caa caa 640Asn Lys Thr Leu Gln Ala Tyr Asn Gly Tyr Val Thr Asn Leu Gln Gln170 175 180gat act agt gtg ctc cag ggc aat ctg cag agc caa atg tat tct cag 688Asp Thr Ser Val Leu Gln Gly Asn Leu Gln Ser Gln Met Tyr Ser Gln185 190 195agc gtg gtt atc atg aac ctc aac aac ctg aac cta acc cag gtt cag 736Ser Val Val Ile Met Asn Leu Asn Asn Leu Asn Leu Thr Gln Val Gln200 205 210 215cag agg aac ctt atc tca aat ctg cag cag tct gtg gat gac aca agc 784Gln Arg Asn Leu Ile Ser Asn Leu Gln Gln Ser Val Asp Asp Thr Ser220 225 230ctg gcc atc cag cga att aag aat gat ttc caa aat ctg cag cag gtt 832Leu Ala Ile Gln Arg Ile Lys Asn Asp Phe Gln Asn Leu Gln Gln Val235 240 245ttc ctt caa gcc aag aag gac acc gat tgg cta aag gaa aaa gta cag 880Phe Leu Gln Ala Lys Lys Asp Thr Asp Trp Leu Lys Glu Lys Val Gln250 255 260agc ttg cag aca ttg gct gcc aac aac tct gcc ctg gcc aaa gcc aac 928Ser Leu Gln Thr Leu Ala Ala Asn Asn Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn265 270 275aat gac acc cta gag gat atg aat agc cag ctc agc tca ttc aca ggt 976Asn Asp Thr Leu Glu Asp Met Asn Ser Gln Leu Ser Ser Phe Thr Gly280 285 290 295cag atg gac aac att acc act atc tca cag gcc aac gag cag agc ctg1024Gln Met Asp Asn Ile Thr Thr Ile Ser Gln Ala Asn Glu Gln Ser Leu300 305 310aaa gac ctt cag gac tta cac aag gat aca gaa aat aga aca gct gtc1072Lys Asp Leu Gln Asp Leu His Lys Asp Thr Glu Asn Arg Thr Ala Val315 320 325aag ttc agc caa ctt gag gaa cgc ttc cag gtc ttt gag aca gat att1120Lys Phe Ser Gln Leu Glu Glu Arg Phe Gln Val Phe Glu Thr Asp Ile330 335 340gtg aac atc att agc aac atc agc tac aca gcc cat cac ctg agg aca1168Val Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Tyr Thr Ala His His Leu Arg Thr345 350 355ctg acc agc aat ctg aat gat gtt agg acc aca tgc aca gac acc ttg1216Leu Thr Ser Asn Leu Asn Asp Val Arg Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu360 365 370 375acc aga cac acg gat gac ctg acc tcc ttg aat aac aca cta gtc aac1264Thr Arg His Thr Asp Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn Thr Leu Val Asn380 385 390atc cgc ttg gat tct att tct ctc agg atg cag caa gac atg atg agg1312Ile Arg Leu Asp Ser Ile Ser Leu Arg Met Gln Gln Asp Met Met Arg395 400 405tca aag tta gac act gaa gtg gcc aac tta tca gtg gtt atg gaa gag1360Ser Lys Leu Asp Thr Glu Val Ala Asn Leu Ser Val Val Met Glu Glu
410 415 420atg aaa ctg gtt gac tcc aag cac ggt cag ctc atc aag aac ttt acc1408Met Lys Leu Val Asp Ser Lys His Gly Gln Leu Ile Lys Asn Phe Thr425 430 435att cta caa ggt cct cct ggc ccc aga ggt cca aaa ggt gac aga gga1456Ile Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly440 445 450 455tct cag gga cca cct ggt cca act ggc aac aag gga cag aaa gga gag1504Ser Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly Gln Lys Gly Glu460 465 470aag gga gag cct ggt cca cct ggc cct gcg ggt gag agg ggc aca att1552Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Thr Ile475 480 485gga cca gtc ggc cct cct gga gag cgt ggc agc aaa gga tcc aaa ggc1600Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly490 495 500tca cag ggt ccc aaa gga tct cgt ggg tcc cca ggg aag cct ggc cct1648Ser Gln Gly Pro Lys Gly Ser Arg Gly Ser Pro Gly Lys Pro Gly Pro505 510 515caa gga cct agt ggg gac cca gga cca cca ggt cca cca ggc aag gat1696Gln Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp520 525 530 535gga ctc cct ggc cct cag ggc cct cct ggc ttc cag gga cta cag ggc1744Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Gln Gly540 545 550act gtg ggt gag cct gga gta cct gga cct cgg ggg ttg cca ggc ttg1792Thr Val Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu555560 565cca ggg gtg cca ggc atg cct ggg cct aag gga cca cct ggc cct cca1840Pro Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro570 575 580ggc ccc tca gga gca atg gag cca ttg gct ctg cag aat gaa cca acc1888Gly Pro Ser Gly Ala Met Glu Pro Leu Ala Leu Gln Asn Glu Pro Thr585 590 595cca gca tca gag gtc aac gga tgt ccg cct cac tgg aag aac ttc aca1936Pro Ala Ser Glu Val Asn Gly Cys Pro Pro His Trp Lys Asn Phe Thr600 605 610 615gat aaa tgc tac tat ttt tca ttg gaa aaa gaa att ttt gaa gat gct1984Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Leu Glu Lys Glu Ile Phe Glu Asp Ala620 625 630aag ctt ttc tgt gaa gac aaa tct tcc cat ctc gtt ttc ata aac tca2032Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser His Leu Val Phe Ile Asn Ser635 640 645aga gaa gaa cag caa tgg ata aaa aag cat acc gtg ggg aga gaa agc2080Arg Glu Glu Gln Gln Trp Ile Lys Lys His Thr Val Gly Arg Glu Ser650 655 660cat tgg atc ggc ctc aca gac tca gaa cag gaa agc gaa tgg aag tgg2128His Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Glu Gln Glu Ser Glu Trp Lys Trp665 670 675cta gac ggg tca cct gtt gat tac aaa aac tgg aaa gct gga caa cca2176Leu Asp Gly Ser Pro Val Asp Tyr Lys Asn Trp Lys Ala Gly Gln Pro680 685 690 695
gat aac tgg ggc agt ggc cat ggg cca gga gaa gac tgt gct ggc ttg2224Asp Asn Trp Gly Ser Gly His Gly Pro Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu700 705 710att tac gca gga cag tgg aat gac ttc cag tgt gat gaa atc aat aac2272Ile Tyr Ala Gly Gln Trp Asn Asp Phe Gln Cys Asp Glu Ile Asn Asn715 720 725ttc att tgt gag aag gaa agg gag gca gta cca tca tcc ata tta2317Phe Ile Cys Glu Lys Glu Arg Glu Ala Val Pro Ser Ser Ile Leu730 735 740taacagcatg atataatagc agaaacatat tttctgatgc ctctgaaagc cgaagaatgc 2377tcgtttttga ttccatcact tctcaccaga ttgaatggaa aaagctctga aaagtagtta 2437ttcaaaataa atggacacct actgcacaat aacccaagga ctagggggct aaaatgctcc 2497cccaagttga tatattgatt tccagtgtac aaatggactg aatcgcatag attttctcag 2557ccattaacca tagaatttat gcaaagtata tctttccaaa tatggaatgc tccaatcaga 2617aaaagccaaa aaaaaaaaaa 26372104211742212PRT213小鼠(Mus musculus)220
223從核苷酸序列推導出的新型人清除蛋白受體的胺基酸序列.
4004Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gln Ser Phe Gly Tyr1 5 10 15Lys Arg Phe Gly Ile Gln Glu Gly Thr Gln Cys Thr Lys Cys Lys Asn20 25 30Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser Ile Val Leu Leu Tyr Ile Leu Cys Ala35 40 45Leu Leu Thr Ile Thr Val Ala Ile Leu Gly Tyr Lys Val Val Glu Lys50 55 60Met Asp Asn Val Thr Asp Gly Met Glu Thr Ser His Gln Thr Tyr Asp65 70 75 80Asn Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Asp Gln85 90 95Ala Gly Lys Lys Ala Leu Ser Thr Asn Ser Glu Leu Ser Thr Phe Arg100 105 110Ser Asp Ile Leu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Glu Ile Thr Glu Lys115 120 125Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gln Ala Asn Gly Asp130 135 140Ser Leu Val Asp Arg Gln Ser Gln Leu Lys Glu Thr Leu Gln Ash Asn145 150 155 160Ser Phe Leu Ile Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gln Ala Tyr Asn Gly165 170 175Tyr Val Thr Asn Leu Gln Gln Asp Thr Ser Val Leu Gln Gly Asn Leu180 185 190Gln Ser Gln Met Tyr Ser Gln Ser Val Val Ile Met Asn Leu Asn Asn195 200 205Leu Asn Leu Thr Gln Val Gln Gln Arg Asn Leu Ile Ser Asn Leu Gln
210 215 220Gln Ser Val Asp Asp Thr Ser Leu Ala Ile Gln Arg Ile Lys Asn Asp225 230 235 240Phe Gln Asn Leu Gln Gln Val Phe Leu Gln Ala Lys Lys Asp Thr Asp245 250 255Trp Leu Lys Glu Lys Val Gln Ser Leu Gln Thr Leu Ala Ala Asn Asn260 265 270Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu Asp Met Asn Ser275 280 285Gln Leu Ser Ser Phe Thr Gly Gln Met Asp Asn Ile Thr Thr Ile Ser290 295 300Gln Ala Asn Glu Gln Ser Leu Lys Asp Leu Gln Asp Leu His Lys Asp305 310 315 320Thr Glu Asn Arg Thr Ala Val Lys Phe Ser Gln Leu Glu Glu Arg Phe325 330 335Gln Val Phe Glu Thr Asp Ile Val Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Tyr340 345 350Thr Ala His His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu Asn Asp Val Arg355 360 365Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu Thr Arg His Thr Asp Asp Leu Thr Ser370 375 380Leu Asn Asn Thr Leu Val Asn Ile Arg Leu Asp Ser Ile Ser Leu Arg385 390 395 400Met Gln Gln Asp Met Met Arg Ser Lys Leu Asp Thr Glu Val Ala Asn405 410 415Leu Ser Val Val Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp Ser Lys His Gly420 425 430Gln Leu Ile Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg435 440 445Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Ser Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly450 455 460Asn Lys Gly Gln Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro465 470 475 480Ala Gly Glu Arg Gly Thr Ile Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Glu Arg485 490 495Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Gln Gly Pro Lys Gly Ser Arg Gly500 505 510Ser Pro Gly Lys Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Pro515 520 525Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro530 535 540Gly Phe Gln Gly Leu Gln Gly Thr Val Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly545 550 555 560Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro565 570 575Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ala Met Glu Pro Leu580 585 590Ala Leu Gln Asn Glu Pro Thr Pro Ala Ser Glu Val Asn Gly Cys Pro595 600 605Pro His Trp Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Leu Glu610 615 620Lys Glu Ile Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser
625 630 635 640His Leu Val Phe Ile Asn Ser Arg Glu Glu Gln Gln Trp Ile Lys Lys645 650 655His Thr Val Gly Ara Glu Ser His Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Glu660 665 670Gln Glu Ser Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Ser Pro Val Asp Tyr Lys675 680 685Asn Trp Lys Ala Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gly Ser Gly His Gly Pro690 695 700Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gln Trp Asn Asp Phe705 710 715 720Gln Cys Asp Glu Ile Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys Glu Arg Glu Ala725 730 735Val Pro Ser Ser Ile Leu740210521127212PRT213人工序列220
223迄今報導的三個共同凝集素的共有序列.
4005Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro1 5 10 15Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe20 25210621127212PRT213人工序列220
223可與新的共同凝集素雜交的修飾的共同凝集素的共有序列.
4006Glu Lys Cys Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Lys Trp Asn Asp Arg Asn1 5 10 15Cys Leu Gln Ser Arg Leu Ala Ile Cys Glu Phe20 25210721124212DNA213人工序列220
223用於測序的M13通用引物序列.
4007
cgacgttgta aaacgacggc cagt 24210821117212DNA213人工序列220
223用於測序的M13反向引物序列.
4008caggaaaca gctatgac 17210921121212DNA213人工序列220
223用於篩選新的共同凝集素的反向引物的序列.
4009caatctgatg agaaggtgat g 212101021121212DNA213人工序列220
223用於篩選新的共同凝集素的正向引物的序列.
40010acgaggggct ggatgggaca t 212101121124212DNA213人工序列220
223用於測序的λgt11反向引物的序列.
40011ttgacaccag accaac tggt aatg 242101221124212DNA213人工序列220
223用於測序的λgt11正向引物的序列.
40012ggtggcgacg actcctggag cccg 242101321121212DNA213人工序列220
223用於篩選新的共同凝集素的引物的序列.
40013cgtgaaaatg aatggaagtg g 212101421121212DNA213人工序列220
223用於篩選新的共同凝集素的引物的序列.
40014ttttatccat tgctgttcct c 212101521121212DNA213人工序列220
223用於篩選新的共同凝集素的引物的序列.
40015ctggcagtcc ccgaggtcca g 212101621121212DNA213人工序列220
223用於篩選新的共同凝集素的引物的序列.
40016gctggtcccc ccggagagcg t 212101721121212DNA
213人工序列220
223用於Cap位點測序的1RC2引物的序列.
40017caaggtacgc cacagcgtat g 212101821120212DNA213人工序列220
223用於Cap位點測序的合成的TGP1引物的序列.
40018tcttcagttt ccctaatccc 202101921121212DNA213人工序列220
223用於Cap位點測序的2RC2引物的序列.
40019gtacgccaca gcgtatgatg c 212102021121212DNA213人工序列220
223用於Cap位點測序的合成的TGP2引物的序列.
40020cattcttgac aaacttcata g 212102121121212DNA213人工序列220
223引物序列.
40021atcttgctgc agattcgtga c 21
2102221115212DNA213人工序列220
223λgt11 5』測序引物的序列.
40022gactcctgga gcccg15210232112262212DNA213智人(Homo Sapiens)220
221CDS222(74)..(1933)40023ggggggacga cttcctcggc tgcgcggcgc tcgcgcggag ctccccggcc ggcggtgcgt 60ccccacggtc acc atg aaa gac gac ttc gca gag gag gag gag gtg caa 109Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gln1 5 10tcc ttc ggt tac aag cgg ttt ggt att cag gaa gga aca caa tgt acc157Ser Phe Gly Tyr Lys Arg Phe Gly Ile Gln Glu Gly Thr Gln Cys Thr15 20 25aaa tgt aaa aat aac tgg gca ctg aag ttt tct atc ata tta tta tac205Lys Cys Lys Asn Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser Ile Ile Leu Leu Tyr30 35 40att ttg tgt gcc ttg cta aca atc aca gta gcc att ttg gga tat aaa253Ile Leu Cys Ala Leu Leu Thr Ile Thr Val Ala Ile Leu Gly Tyr Lys45 50 55 60gtt gta gag aaa atg gac aat gtc aca ggt ggc atg gaa aca tct cgc301Val Val Glu Lys Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg65 70 75caa acc tat gat gac aag ctc aca gca gtg gaa agt gac ctg aaa aaa349Gln Thr Tyr Asp Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys80 85 90tta ggt gac caa act ggg aag aaa gct atc agc acc aac tca gaa ctc397Leu Gly Asp Gln Thr Gly Lys Lys Ala Ile Ser Thr Asn Ser Glu Leu95 100 105tcc acc ttc aga tca gac att cta gat ctc cgt cag caa ctt cgt gag445Ser Thr Phe Arg Ser Asp Ile Leu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Arg Glu110 115 120att aca gaa aaa acc agc aag aac aag gat acg ctg gag aag tta cag493Ile Thr Glu Lys Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gln125 130 135 140gcg agc ggg gat gct ctg gtg gac agg cag agt caa ttg aaa gaa act541Ala Ser Gly Asp Ala Leu Val Asp Arg Gln Ser Gln Leu Lys Glu Thr
145 150 155ttg gag aat aac tct ttc ctc atc acc act gta aac aaa acc ctc cag 589Leu Glu Asn Asn Ser Phe Leu Ile Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gln160 165 170gcg tat aat ggc tat gtc acg aat ctg cag caa gat acc agc gtg ctc 637Ala Tyr Asn Gly Tyr Val Thr Asn Leu Gln Gln Asp Thr Ser Val Leu175 180 185cag ggc aat ctg cag aac caa atg tat tct cat aat gtg gtc atc atg 685Gln Gly Asn Leu Gln Asn Gln Met Tyr Ser His Asn Val Val Ile Met190 195 200aac ctc aac aac ctg aac ctg acc cag gtg cag cag agg aac ctc atc 733Asn Leu Asn Asn Leu Asn Leu Thr Gln Val Gln Gln Arg Asn Leu Ile205 210 215 220acg aat ctg cag cgg tct gtg gat gac aca agc cag gct atc cag cga 78lThr Asn Leu Gln Arg Ser Val Asp Asp Thr Ser Gln Ala Ile Gln Arg225 230 235atc aag aac gac ttt caa aat ctg cag cag gtt ttt ctt caa gcc aag 829Ile Lys Asn Asp Phe Gln Asn Leu Gln Gln Val Phe Leu Gln Ala Lys240 245 250aag gac acg gat tgg ctg aag gag aaa gtg cag agc ttg cag acg ctg 877Lys Asp Thr Asp Trp Leu Lys Glu Lys Val Gln Ser Leu Gln Thr Leu255 260 265gct gcc aac aac tct gcg ttg gcc aaa gcc aac aac gac acc ctg gag 925Ala Ala Asn Asn Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu270 275 280gat atg aac agc cag ctc aac tca ttc aca ggt cag atg gag aac atc 973Asp Met Asn Ser Gln Leu Asn Ser Phe Thr Gly Gln Met Glu Asn Ile285 290 295 300acc act atc tct caa gcc aac gag cag aac ctg aaa gac ctg cag gac1021Thr Thr Ile Ser Gln Ala Asn Glu Gln Asn Leu Lys Asp Leu Gln Asp305 310 315tta cac aaa gat gca gag aat aga aca gcc atc aag ttc aac caa ctg1069Leu His Lys Asp Ala Glu Asn Arg Thr Ala Ile Lys Phe Asn Gln Leu320 325 330gag gaa cgc ttc cag ctc ttt gag acg gat att gtg aac atc att agc1117Glu Glu Arg Phe Gln Leu Phe Glu Thr Asp Ile Val Asn Ile Ile Ser335 340 345aat atc agt tac aca gcc cac cac ctg cgg acg ctg acc agc aat cta1165Asn Ile Ser Tyr Thr Ala His His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu350 355 360aat gaa gtc agg acc act tgc aca gat acc ctt acc aaa cac aca gat1213Asn Glu Val Arg Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp365 370 375 380gat ctg acc tcc ttg aat aat acc ctg gcc aac atc cgt ttg gat tct1261Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn Thr Leu Ala Asn Ile Arg Leu Asp Ser385 390 395gtt tct ctc agg atg caa caa gat ttg atg agg tcg agg tta gac act1309Val Ser Leu Arg Met Gln Gln Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr400 405 410gaa gta gcc aac tta tca gtg att atg gaa gaa atg aag cta gta gac1357Glu Val Ala Asn Leu Ser Val Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp415 420 425
tcc aag cat ggt cag ctc atc aag aat ttt aca ata cta caa ggt cca1405Ser Lys His Gly Gln Leu Ile Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gln Gly Pro430 435 440ccg ggc ccc agg ggt cca aga ggt gac aga gga tcc cag gga ccc cct1453Pro Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Asp Arg Gly Ser Gln Gly Pro Pro445 450 455 460ggc cca act ggc aac aag gga cag aaa gga gag aag ggg gag cct gga1501Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly Gln Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly465 470 475cca cct ggc cct gcg ggc tgc ccg cct cac tgg aag aac ttc aca gac1549Pro Pro Gly Pro Ala Gly Cys Pro Pro His Trp Lys Asn Phe Thr Asp480 485 490aaa tgc tac tat ttt tca gtt gag aaa gaa att ttt gag gat gca aag1597Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Val Glu Lys Glu Ile Phe Glu Asp Ala Lys495 500 505ctt ttc tgt gaa gac aag tct tca cat ctt gtt ttc ata aac act aga1645Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser His Leu Val Phe Ile Asn Thr Arg510 515 520gag gaa cag caa tgg ata aaa aaa cag atg gta ggg aga gag agc cac1693Glu Glu Gln Gln Trp Ile Lys Lys Gln Met Val Gly Arg Glu Ser His525 530 535 540tgg atc ggc ctc aca gac tca gag cgt gaa aat gaa tgg aag tgg ctg1741Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Glu Arg Glu Asn Glu Trp Lys Trp Leu545 550 555gat ggg aca tct cca gac tac aaa aat tgg aaa gct gga cag ccg gat1789Asp Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Lys Asn Trp Lys Ala Gly Gln Pro Asp560 565 570aac tgg ggt cat ggc cat ggg cca gga gaa gac tgt gct ggg ttg att1837Asn Trp Gly His Gly His Gly Pro Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu Ile575 580 585tat gct ggg cag tgg aac gat ttc caa tgt gaa gac gtc aat aac ttc1885Tyr Ala Gly Gln Trp Asn Asp Phe Gln Cys Glu Asp Val Asn Asn Phe590 595 600att tgc gaa aaa gac agg gag aca gta ctg tca tct gca tta1933Ile Cys Glu Lys Asp Arg Glu Thr Val Leu Ser Ser Ala Leu605 610 615taacggactg tgatgggatc acatgagcaa attttcagct ctcaaaggca aaggacactc 1993ctttctaatt gcatcacctt ctcatcagat tgaaaaaaaa aaaagcactg aaaaccaatt 2053actgaaaaaa aattgacagc tagtgttttt taccatccgt cattacccaa agacttggga 2113actaaaatgt tccccagggt gatatgctga ttttcattgt gcacatggac tgaatcacat 2173agattctcct ccgtcagtaa ccgtgcgatt atacaaatta tgtcttccaa agtatggaac 2233actccaatca gaaaaaggtt atcatcccg226221024211618212PRT213智人(Homo Sapiens)220
223從核苷酸序列推導出的新的突變的人清除蛋白受體的胺基酸序列.
40024
Met Lys Asp Asp Phe Ala Glu Glu Glu Glu Val Gln Ser Phe Gly Tyr1 5 10 15Lys Arg Phe Gly Ile Gln Glu Gly Thr Gln Cys Thr Lys Cys Lys Asn20 25 30Asn Trp Ala Leu Lys Phe Ser Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Leu Cys Ala35 40 45Leu Leu Thr Ile Thr Val Ala Ile Leu Gly Tyr Lys Val Val Glu Lys50 55 60Met Asp Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Thr Ser Arg Gln Thr Tyr Asp65 70 75 80Asp Lys Leu Thr Ala Val Glu Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Asp Gln85 90 95Thr Gly Lys Lys Ala Ile Ser Thr Asn Ser Glu Leu Ser Thr Phe Arg100 105 110Ser Asp Ile Leu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Arg Glu Ile Thr Glu Lys115 120 125Thr Ser Lys Asn Lys Asp Thr Leu Glu Lys Leu Gln Ala Ser Gly Asp130 135 140Ala Leu Val Asp Arg Gln Ser Gln Leu Lys Glu Thr Leu Glu Asn Asn145 150 155 160Ser Phe Leu Ile Thr Thr Val Asn Lys Thr Leu Gln Ala Tyr Asn Gly165 170 175Tyr Val Thr Asn Leu Gln Gln Asp Thr Ser Val Leu Gln Gly Asn Leu180 185 190Gln Asn Gln Met Tyr Ser His Asn Val Val Ile Met Asn Leu Asn Asn195 200 205Leu Asn Leu Thr Gln Val Gln Gln Arg Asn Leu Ile Thr Asn Leu Gln210 215 220Arg Ser Val Asp Asp Thr Ser Gln Ala Ile Gln Arg Ile Lys Asn Asp225 230 235 240Phe Gln Asn Leu Gln Gln Val Phe Leu Gln Ala Lys Lys Asp Thr Asp245 250 255Trp Leu Lys Glu Lys Val Gln Ser Leu Gln Thr Leu Ala Ala Asn Asn260 265 270Ser Ala Leu Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu Asp Met Asn Ser275 280 285Gln Leu Asn Ser Phe Thr Gly Gln Met Glu Asn Ile Thr Thr Ile Ser290 295 300Gln Ala Asn Glu Gln Asn Leu Lys Asp Leu Gln Asp Leu His Lys Asp305 310 315 320Ala Glu Asn Arg Thr Ala Ile Lys Phe Asn Gln Leu Glu Glu Arg Phe325 330 335Gln Leu Phe Glu Thr Asp Ile Val Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Tyr340 345 350Thr Ala His His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu Asn Glu Val Arg355 360 365Thr Thr Cys Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp Asp Leu Thr Ser370 375 380Leu Asn Asn Thr Leu Ala Asn Ile Arg Leu Asp Ser Val Ser Leu Arg385 390 395 400Met Gln Gln Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr Glu Val Ala Asn405 410 415
Leu Ser Val Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp Ser Lys His Gly420 425 430Gln Leu Ile Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg435 440 445Gly Pro Arg Gly Asp Arg Gly Ser Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly450 455 460Asn Lys Gly Gln Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro465 470 475 480Ala Gly Cys Pro Pro His Trp Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr485 490 495Phe Ser Val Glu Lys Glu Ile Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu500 505 510Asp Lys Ser Ser His Leu Val Phe Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gln Gln515 520 525Trp Ile Lys Lys Gln Met Val Gly Arg Glu Ser His Trp Ile Gly Leu530 535 540Thr Asp Ser Glu Arg Glu Asn Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Thr Ser545 550 555 560Pro Asp Tyr Lys Asn Trp Lys Ala Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gly His565 570 575Gly His Gly Pro Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gln580 585 590Trp Asn Asp Phe Gln Cys Glu Asp Val Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys595 600 605Asp Arg Glu Thr Val Leu Ser Ser Ala Leu610 6152102521130212DNA213人工序列220
223用於PCR擴增hSRCL-P1的引物序列.
40025ccgctcgagc ggtcaccatg aaagacgact 302102621130212DNA213人工序列220
223用於PCR擴增hSRCL-P1的引物序列.
40026tccccgcggt aatgcagatg acagtac tgt 302102721135212DNA
213人工序列220
223用於PCR擴增hSRCL-P1的引物序列.
40027aatgcggccg caccatgaaa gacgacttcg cagag 352102821132212DNA213人工序列220
223用於PCR擴增hSRCL-P1的引物序列.
40028gctctagacc gcggtaatgc agatgacagt ac 3權利要求
1.一種蛋白質或其衍生物或片段，所述蛋白質具有SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示的742個胺基酸組成的胺基酸序列，或者，該蛋白質的胺基酸序列由SEQ ID NO2所示胺基酸序列中有一個或數個胺基酸缺失、置換或添加的胺基酸序列構成，且該蛋白質和具有SEQ ID NO2胺基酸序列1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同的性質。
2.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO1鹼基號74-2299所示的鹼基序列、編碼SEQ ID NO2中胺基酸號1-742所示的胺基酸序列或其片段的鹼基序列、或在嚴謹條件下與這些鹼基序列或這些鹼基序列的互補鹼基序列雜交且編碼與具有SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同性質的蛋白質的鹼基序列。
3.一種蛋白質或其衍生物或片段，所述蛋白質具有SEQ ID NO24胺基酸號1-618所示的胺基酸組成的胺基酸序列，或者，該蛋白質的胺基酸序列由SEQ ID NO24所示胺基酸序列中有一個或數個胺基酸缺失、置換或添加的胺基酸序列構成，且該蛋白質和具有SEQ ID NO24胺基酸序列1-618所示胺基酸序列的蛋白質有相同的性質。
4.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO23鹼基號74-1933所示的鹼基序列、編碼SEQ ID NO24胺基酸號1-618所示的胺基酸序列或其片段的鹼基序列、或在嚴謹條件下與這些鹼基序列或這些鹼基序列的互補鹼基序列雜交且編碼與具有SEQ ID NO24胺基酸號1-618所示胺基酸序列的蛋白質有相同性質的蛋白質的鹼基序列。
5.一種蛋白質或其衍生物或片段，所述蛋白質具有SEQ ID NO4胺基酸號1-742所示的742個胺基酸組成的胺基酸序列，或者，該蛋白質的胺基酸序列由SEQ ID NO2所示胺基酸序列中有一個或數個胺基酸缺失、置換或添加的胺基酸序列構成，且該蛋白質和具有SEQ ID NO2胺基酸序列1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同的性質。
6.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO3鹼基號74-2299所示的鹼基序列、編碼SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示的胺基酸序列或其片段的鹼基序列、或在嚴謹條件下與這些鹼基序列或這些鹼基序列的互補鹼基序列雜交且編碼與具有SEQ ID NO2胺基酸號1-742所示胺基酸序列的蛋白質有相同性質的蛋白質的鹼基序列。
7.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求2、4或6所述的多核苷酸。
8.一種轉化細胞，其特徵在於，它保持了表達權利要求2、4或6所述的多核苷酸的可能。
9.一種製備蛋白質的方法，其特徵在於，該方法包括培養用權利要求2或4所述的多核苷酸轉化的細胞，收穫產生的hSRCL-P1蛋白質的步驟。
10.一種製備蛋白質的方法，其特徵在於，該方法包括培養用權利要求6所述的鹼基序列轉化的細胞，收穫產生的mSRCL-P1蛋白質的步驟。
11.根據權利要求9或10所述的製備方法，其中細胞是大腸桿菌、動物細胞或昆蟲細胞。
12.一種轉基因非人動物，它的SRCL-P1基因的表達水平被改變。
13.根據權利要求12所述的轉基因非人動物，其特徵在於，SRCL-P1基因是編碼SRCL-P1的cDNA，基因組DNA或合成的DNA。
14.根據權利要求13所述的轉基因非人動物，其特徵在於，通過在基因表達調節部位引起變異來改變表達水平。
15.一種剔除小鼠，其特徵在於，它的mSRCL-P1基因機能缺損。
16.一種抗體，其特徵在於，它是針對權利要求1、3或5中所述的蛋白質或其片段的抗體。
17.根據權利要求16所述的抗體，其特徵在於，它是多克隆抗體、單克隆抗體或肽抗體。
18.一種製備針對權利要求1、3或5中所述的蛋白質或其片段的單克隆抗體的方法，其特徵在於，該方法包括將權利要求1、3或5所述的蛋白質或其片段給予人以外的溫血動物，選擇抗體效價被確認的該動物，取出脾臟或淋巴節，將它們含有的產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合，製得能產生單克隆抗體的雜交瘤。
19.一種根據權利要求16或17所述的抗體與SRCL-P1蛋白質或其片段的免疫結合來對該蛋白質或其片段進行定量的方法。
20.一種根據權利要求16或17所述的抗體與SRCL-P1蛋白質或其片段的免疫結合來對檢測該蛋白質或其片段的方法。
21.一種激活劑，其特徵在於，它刺激權利要求1、3或5所述的蛋白質的活性。
22.一種拮抗劑，其特徵在於，它阻礙權利要求1、3或5所述的蛋白質的活性或活性化。
23.一種藥物篩選方法，其特徵在於，該方法使用權利要求1、3或5所述的蛋白質。
24.一種用權利要求23所述的篩選方法獲得的藥物。
25.一種藥物篩選方法，該方法是以治療與氧化LDL累積有關的病態為目的藥物的篩選方法，其特徵在於，該方法包括，通過比較在候選藥物有或無的條件下權利要求1、3或5所述的蛋白質與氧化LDL的結合量來做出評價，當候選藥物對該蛋白質與氧化LDL的結合有阻礙能力，則鑑定出治療與氧化LDL累積有關的病態的藥物。
26.一種用權利要求25所述的篩選方法得到的藥物。
27.一種治療與氧化LDL累積有關的病態的方法，其特徵在於，用權利要求26所述的藥物阻礙SRCL-P1蛋白質或其片段與氧化LDL的結合。
28.一種治療與氧化LDL累積有關的病態的醫藥組合物，其特徵在於，它含有權利要求26所述的藥物。
29.一種藥物篩選方法，該方法是治療和細胞上結合AGE有關的病態的藥物的篩選方法，其特徵在於，該方法包括，通過比較權利要求1、3或5所述的蛋白質在有或無候選藥物的情況下與AGE的結合量，做出評價，根據候選藥物阻礙該蛋白質與AGE結合的能力，鑑定出可用於治療與細胞上結合AGE有關的病態的藥物。
30.一種用權利要求29所述的篩選方法得到的藥物。
31.一種治療與AGE結合於細胞有關的病態的方法，其特徵在於，該方法包括用權利要求30所述的藥物來阻礙SRCL-P1蛋白質或其片段與AGE的結合。
32.一種含有權利要求30所述的藥物的醫藥組合物，其特徵在於，它是用來治療與AGE結合於細胞有關的病態的醫藥組合物。
全文摘要
本發明提供可能利用來闡明巨噬細胞和基礎免疫的機能、闡明動脈硬化、糖尿病性合併症、血管形成後再狹窄、細菌感染症等的各種疾患的發病機制、及其診斷、預防和治療方法、以及為此開發試藥和醫藥的，具有SR構造和共同凝激素構造的新型清除蛋白受體、具有順序號2、4或24的胺基酸順序的蛋白質或具有和它們相同性質的蛋白質，或者，它們的衍生物或片段和含有編碼這些蛋白的鹼基順序的分離的多核苷酸、和抗體、拮抗體等的關連分子。還公開了使用它們的治療方法。
文檔編號C07K14/705GK1646689SQ0180813
公開日2005年7月27日 申請日期2001年2月8日 優先權日2000年2月14日
發明者若宮伸隆 申請人:扶桑藥品工業株式會社