一種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法

2023-09-11 10:11:35

專利名稱：一種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法
技術領域：
本發明涉及體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法。
背景技術：
轉移因子是從淋巴細胞中提取的一種低分子多肽與核酸複合物，能特異性或非特 異性地提高機體免疫功能，傳遞免疫信息，被譽為細胞免疫激活劑。它無種屬特異性，可在 種屬間傳遞，動物來源可用於人類。 轉移因子常規的製備方法是將動物新鮮或冷凍的脾臟及淋巴結在25t:左右去 除脂肪及結締組織，然後用純化水洗淨；將洗淨的組織切成小塊，加入適量水，用組織搗碎 機破碎細胞，製成勻漿，加適量純化水，混勻，置_201:反覆凍融5 8次，融化溫度不得超
過37t:;將凍融的勻漿離心(離心溫度4t:)，去沉澱，留上清液備用；上清液裝透析袋，透
析24-48小時，半成品過濾除菌；成品的配置與檢驗。 轉移因子是經誘導，由動物免疫防禦系統產生的可對抗外源性病原體的防禦性肽 類活性物質，分子量小、活性強，具有抗細菌、真菌、病毒和原蟲作用，甚至對癌細胞也具有 殺傷作用，應用十分廣泛。轉移因子作為具有特異性與非特異性的免疫活性細胞調節因子， 廣泛應用於治療任何動物病毒性疾病、真菌感染、細胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤的 輔助治療，並有好的療效。但製備轉移因子的工藝繁瑣複雜、回收率低、無特異性。本發明 通過體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子特異性強、產出率高。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中製備的及轉移因子針對疾病沒有特異性，治療效 果不穩定等缺點，提供一種體外免疫法生產特異性強、成本低、產出率高、效果更好的抗雞 傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法。
本發明的技術解決方案概述如下 —種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法，由如下步驟 組成 (1)無菌採取實驗雞脾臟或抗凝血，用脾臟或外周血製備淋巴細胞單層； [ooog] (2)對淋巴細胞單層進行傳代培養； (3)當淋巴傳代細胞長成單層後，用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導培 養，即獲得體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子。剌激雞脾細胞和雞血淋巴細胞增殖的植物血凝素劑的質量濃度為50-100mg/L。
本發明的優點 本發明以較少的雞脾臟或外周血為原料，製成淋巴細胞單層，在體外培養，然後用 植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導培養誘導淋巴細胞單層即可體外生產出大量抗 雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的混合體，本發明的方法製備的抗雞傳染性支氣管
3炎病毒特異性轉移因子無需進一步的提純，直接將混合體用於禽類，即可起到抗雞傳染性 支氣管炎病毒及抗菌的作用，同時提高禽類的免疫力。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1 : —種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法，步驟
(1)無菌採取抗凝血，用外周血製備淋巴細胞單層，步驟為 無菌靜脈採取動物全血25毫升，加0. 8%肝素溶液0. 3ml抗凝，靜置45分鐘，用
帶膠球吸管吸取紅細胞層以上的所有血漿，特別是緊接紅細胞層上的白細胞層要儘量吸
取，分裝於消毒離心管內，用PBS (pH為7. 2)液反覆洗滌2 3次，離心速度800 1200轉
/分，然後用含30%犢牛血清水解乳蛋白40毫升進行白細胞培養，均勻混合後分裝於容量
100毫升培養方瓶或磚瓶中，塞緊瓶塞，置37t:恆溫箱中或磚瓶機中培養，經2 3天，白細
胞均勻貼壁，即製成淋巴細胞單層。 (3)對淋巴細胞單層進行傳代培養； 在作傳代細胞培養前，首先將培養瓶置於顯微鏡下觀察，以確定細胞已長成單層， 即可進行細胞的傳代培養。 (4)當淋巴傳代細胞長成單層後，用植物血凝素(終濃度為100mg/L)和雞傳染性 支氣管炎病毒(終濃度為1280血凝單位/ml)誘導培養。 (5)經培養2 3天，離心細胞培養液，收集上清，上清液在4t:下磁力攪拌透析， 超濾除菌，即製成特異型轉移因子。 轉移因子濃度的測定、抑菌實驗的方法、半成品和成品的檢驗項目均同實施例1。 本方法生產的的轉移因子為黃色澄明液體，多肽含量0. 43g/L，核糖含量0. 35g/L。
實施例2 —種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法，步驟
(1)無菌採取實驗雞脾臟，用脾臟製備淋巴細胞單層，步驟為
A、處理雞脾臟 取新鮮雞脾臟置於無菌玻璃容器中，加入PBS(pH為7. 2)溶液浸泡半小時或浸於 質量百分濃度為1 %的新潔爾滅溶液中，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾 髒脂肪及包膜，用PBS(pH為7. 2)液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最後用眼科 剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS (pH為7. 2)液洗滌2_3次，以去除血細胞、色素物質及剪 碎過程中機械損傷的細胞；
B、消化及分散組織塊 將上步清洗過的PBS(pH7. 2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按組織塊體 積的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(pH為7. 6 7. 8)，置37"水浴中消化20 40分鐘。 每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續消化，直到組織變成鬆散、表面發 毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH為7. 2)液洗滌2 3 次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口徑稍大的細管吹打數次，用四層紗布濾過；
C、細胞計數
採用血球計數板進行計數，計數方法與白細胞計數相同；
D、細胞懸液的分裝和培養 按細胞計數結果，將細胞懸液用DMEM營養液調整至60萬/毫升細胞懸液。將細 胞懸液分裝入細胞培養瓶(100ml)和細胞轉瓶，分裝量為該瓶容量的1/5，蓋上蓋，做好標 識，然後將細胞培養瓶和轉瓶分別放在二氧化碳培養箱和轉瓶機上培養；
E、觀察 置於37t:培養的細胞，需逐日進行觀察。若細胞已生長，則要觀察細胞的形態特徵
並判斷其所處的生長階段直至形成淋巴細胞單層。
(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養 在作傳代細胞培養前，首先將培養瓶置於顯微鏡下現察，以確定細胞已長成單層， 即可進行細胞的傳代培養。
(4)當淋巴傳代細胞長成單層後，用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導培
養 當脾淋巴傳代細胞長成單層後，更換維持液同時加入植物血凝素(終濃度為
75mg/L)和雞傳染性支氣管炎病毒(終濃度為640血凝單位/ml)誘導培養。 (5)誘導培養24小時後，將細胞培養物經超聲破碎後取樣，並檢測轉移因子的濃度。
轉移因子濃度的測定對轉移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-酚法或分 光光度法測定多肽含量，以多肽含量lmg為一個轉移因子單位。本方法生產的的轉移因子 為黃色澄明液體，多肽含量0. 38g/L，核糖含量0. 28g/L。
半成品和成品的檢驗 半成品檢定半成品進行細菌內毒素、無菌檢查、pH值等項檢測。
成品檢定成品分別作轉移因子和的鑑別試驗、外觀檢測、pH值、多肽含量、特異
活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒性等項檢驗。 實施例3 —種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法，步驟
(1)取新鮮雞脾臟置於無菌玻璃容器中，加入PBS(pH為7. 2)溶液浸泡半小時或浸 於質量百分濃度為1 %的新潔爾滅溶液中，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除 脾臟脂肪及包膜，用PBS (pH為7. 2)液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最後用眼 科剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS (pH為7. 2)液洗滌2-3次； (2)將上步清洗過的PBS(pH7. 2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按組織 塊體積的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(pH為7. 6 7. 8)，置37。C水浴中消化20 40 分鐘。每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續消化，直到組織變成鬆散、 表面發毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH為7. 2)液洗滌 2 3次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口徑稍大的細管吹打數次，用四層紗布濾過；
(3)將細胞懸液用DMEM營養液調整至60萬/毫升細胞懸液，然後分裝入細胞培養 瓶和細胞轉瓶，分別放在二氧化碳培養箱和轉瓶機上培養； (4)經2 3天，白細胞均勻貼壁，即製成淋巴細胞單層，可進行細胞的傳代培養。 當長成單層後，更換維持液同時用植物血凝素(終濃度為70mg/L)和雞傳染性支氣管炎病
5毒(終濃度為640血凝單位/ml)誘導培養。 (5)經培養1 2天，離心細胞培養液，收集上清，上清液透析，超濾除菌，上清液即
為特異型轉移因子。 應用實例 100隻15日齡肉雞(經過健康檢查無菌)分為A、B、C、D、E共5組，B、C、D、E組經過人工感染0. 5ml雞傳染性支氣管炎病毒強毒攻毒後作實驗。A組為健康組，不感染病毒，不給藥；B組陰性對照組，感染病毒，不給藥；C組為本發明藥物低劑量組，按禽0. 5ml/只雞/天肌肉注射；D組為本發明藥物高劑量組，按禽1. 0ml/只雞/天注射飼餵；E組為黃芪多糖組(天津生機集團股份生物有限公司)，按禽0.5g/只雞/天注射注射。結果表明，採用本發明藥物治療雞傳染性傳染性支氣管炎病毒病有著明顯的療效。
本發明特異性轉移因子實驗結果如下
編號組另IJ_死亡率％ '治癒率％_有效率％
~~健康組 5 100.0(20/20) 100.0(20/20)
B 陰性對照組 95.0(19/20) 0(0/20) 20.0(4/20) 本次試驗結果表明，該藥物低、高劑量治療組與對照組差異非常顯著(P 0.01)。 上述參照實施例對抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法進行的
詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定範圍列舉出若干個實施例，因此在不
脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護範圍之內。
C 低劑量治療組 25.0(50/20) 30.0(6/20) 75 (15/20)
D 高劑量治療組 15.0(3/20) 75.0(15/20) 75.0(17/20)E "黃芪多糖"組25.0(5/20) 20.0(4/20)_65.0(13/20)
權利要求
一種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法，其特徵是由如下步驟組成(1)無菌採取雞脾臟或雞血，用脾臟或外周血製備淋巴細胞單層；(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(3)當淋巴傳代細胞長成單層後，用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導培養，即獲得體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子。
2. 根據權利要求書1中體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的制 備方法，其特徵是剌激雞脾細胞和雞血淋巴細胞增殖的植物血凝素劑的質量濃度為 50-100mg/L。
全文摘要
本發明涉及一種體外製備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子的製備方法。本發明雞脾臟或外周血為原料，製成淋巴細胞單層，然後用植物血凝素和雞傳染性支氣管炎病毒誘導培養淋巴細胞，體外生產出大量抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉移因子。本發明的方法體外製備的抗特異性轉移因子用於治療雞傳染性傳染性支氣管炎病，同時提高禽類的免疫力。
文檔編號A61K35/14GK101757027SQ20081015241
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月21日 優先權日2008年10月21日
發明者王連民, 田杏芳 申請人:天津生機集團股份有限公司