一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法

2023-09-11 14:29:10

一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法
【專利摘要】本發明涉及多肽合成領域，特別涉及一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法。本發明通過固相合成方法替度魯肽對定點的PEG修飾，從而改變替度魯肽的性質。其主要優點是可以延長蛋白質（多肽）在體內的半衰期，降低免疫原性和抗原性。
【專利說明】一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及多肽合成領域，特別涉及一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法。

【背景技術】
[0002]短腸症候群(SBS)是指由於嚴重小腸疾病或外科手術切除大部分小腸導致機體無法正常吸收營養而引發一系列症候群。SBS降低了患者攝取液體和營養物質的能力，導致他們脫水和營養不良。而腸外營養支持治療又將增加全身感染和其他長期併發症的風險，迄今為止尚無藥物可以治療短腸症候群。
[0003]替度魯肽(teduglutide)是一種胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)類似物，是一種天然生成的激素，可減少胃排空和分泌，並調節小腸內膜細胞的生長、增殖和修復。替度魯肽於2001年被定性為孤兒藥。臨床試驗表明，該藥能夠降低短腸症候群患者對胃腸外營養的需求。
[0004]常規的替度魯肽含有蛋白質(多肽)類藥物常有的弊病。例如半衰期短，有免疫原性，易被蛋白水解酶降解，溶解性差等。傳統的PEG修飾多為隨機修飾，存在修飾劑呈現多種聚合度、選擇性不夠高、修飾後的蛋白質分子Mr分布寬、活性降低、穩定性有時不夠理想等突出問題。因此，提供一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法具有現實意義。


【發明內容】

[0005]有鑑於此，本發明提供一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法。本發明通過固相合成方法替度魯肽對定點的PEG修飾，從而改變替度魯肽的性質。其主要優點是可以延長蛋白質(多肽)在體內的半衰期，降低免疫原性和抗原性。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
[0007]本發明提供了一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物，其N端氨基和/或Lys側鏈氨基通過醯胺鍵與單甲氧基PEG衍生物偶聯。
[0008]在本發明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為1000~40000Da。
[0009]在本發明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為2000~20000Da。
[0010]在本發明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為5000~lOOOODa。[0011 ] 在本發明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物為直鏈型或支鏈型。
[0012]在本發明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥珀醯亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀醯亞胺丁酸酯(mPEG_SBA)或mPEG-琥珀醯亞胺碳酸酯(mPEG_SC)。本發明在此不作限定。
[0013]在本發明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自Lys-HiPEG2 *Tris_mPEG3。
[0014]本發明還提供了一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物的固相製備方法，包括如下步驟:
[0015]步驟1、取Asp與固相載體偶聯,獲得固相載體-Asp ；
[0016]步驟2、取固相載體-Asp逐步偶聯胺基酸，獲得固相載體-多肽，多肽的序列如SEQID N0.1 所示；
[0017]步驟3、脫除固相載體-多肽的N端氨基的保護基團和/或Lys側鏈氨基的保護基團後，單甲氧基PEG衍生物通過醯胺鍵與N端氨基和/或Lys側鏈氨基偶聯，裂解、純化後，即得。
[0018]本發明提供的一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物的固相製備方法中，單甲氧基PEG衍生物是指通過醯胺鍵與N端氨基或賴氨酸側鏈氨基偶聯的任何活化PEG衍生物。本發明在此不作限定。
[0019]在本發明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為1000~40000Da。
[0020]在本發明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為2000~20000Da。
[0021]在本發明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物的分子量為5000~lOOOODa。
[0022]在本發明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物為直鏈型或支鏈型。
[0023]在本發明的一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥珀醯亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀醯亞胺丁酸酯(mPEG_SBA)或mPEG-琥珀醯亞胺碳酸酯(mPEG_SC)。
[0024]在本發明的另一些實施例中，單甲氧基PEG衍生物選自Lys-HiPEG2 *Tris_mPEG3。
[0025]在本發明的一些實施例中，N端氨基的保護基團為Fmoc。
[0026]在本發明的一些實施例中，Lys側鏈氨基的保護基團為mmt，mtt, Alloc或Trt。
[0027]作為優選，Trt側鏈保護基只在PEG單修飾N端胺基酸時使用。
[0028]在本發明的一些實施例中，N端氨基的保護基團的脫除劑為20%哌啶/DMF溶液。
[0029]在本發明的另一些實施例中，Lys側鏈氨基的保護基團的脫除劑為TFA或四三苯基勝鈕/苯矽烷。
[0030]作為優選，選擇性脫除mmt或mtt採用TFA，選擇性脫除Alloc採用四三苯基膦鈀
/苯矽烷。
[0031]本發明還提供了上述固相製備方法獲得的替度魯肽的聚乙二醇偶合物。
[0032]本發明提供一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法。本發明通過固相合成方法替度魯肽對定點的PEG修飾，從而改變替度魯肽的性質。其主要優點是可以延長蛋白質(多肽)在體內的半衰期，降低免疫原性和抗原性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1示替度魯肽及本發明提供的替度魯肽的聚乙二醇偶合物的藥代試驗結果；其中，線I示替度魯肽，線2示實施例12製備的PEG2000修飾的替度魯肽，線3示實施例15製備的PEG5000修飾的替度魯肽，線4示實施例21製備的PEG10000修飾的替度魯肽，線5示實施例19製備的PEG20000修飾的替度魯肽；
[0034]圖2示替度魯肽及本發明提供的替度魯肽的聚乙二醇偶合物對小鼠體重修復的影響；其中，線I示替度魯肽，線2示實施例12製備的PEG2000修飾的替度魯肽，線3示實施例15製備的PEG5000修飾的替度魯肽，線4示實施例21製備的PEG10000修飾的替度魯肽，線5示實施例19製備的PEG20000修飾的替度魯肽。

【具體實施方式】
[0035]本發明公開了一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0036]本發明提供的替度魯肽的聚乙二醇偶合物及其固相製備方法中所用原料及製劑均可由市場購得。
[0037]
縮寫及英文含義
mmt4-曱氧基三苯曱基
mtt曱基三苯曱基
Trt三苯甲基
Fmoc9-苟甲氧羰基
DIPCDI二異丙基碳二亞胺 HOBt1-羥基苯並三唑 DMFN,N-二曱基甲醯胺
DCM二氯曱烷
TFA三氟乙酸
Alloc烯丙氧羰基
mPEG-SC曱氧基聚乙二醇琥珀酖亞胺碳酸酯
[0038]
mPEG-SBA曱氧基聚乙二醇琥珀酖亞胺丁酸酯
mPEG-SPA曱氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺丙酸酯
[0039]下面結合實施例，進一步闡述本發明:
[0040]實施例1:替代度為0.lmmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂的合成
[0041]稱取替代度為1.0mmol/g的Wang樹脂40g，加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用 DMF溶脹樹脂 30 分鐘。稱取 4.94g Fmoc-Asp (OtBu) _0H( 12mmol )、1.95g HOBtC 14.4mmol)和0.15g DMAP (1.2mmol)溶於體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.25mlDIC (14.4mmol)活化3min後加入固相反應柱中，室溫反應2小時。用DMF洗滌3次，加入70ml封閉液(吡啶/乙酸酐=1: l，400mmol:400mmol)封閉8小時(樹脂若未完全擴散加DCM作為溶劑)。用DMF洗滌4次，DCM洗4次，甲醇收縮抽乾，得到Fmoc-Asp (OtBu) -Wang樹脂。檢測替代度為0.098mmol/go
[0042]實施例2:替代度為0.19mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂的合成
[0043]稱取替代度為1.0mmol/g的Wang樹脂40g，加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘。稱取 9.38g Fmoc-Asp (OtBu)-OH (22.8mmol )、3.70g HOBt(27.4mmol)和0.28g DMAPC0.23mmol)溶於體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.28ml DIC(27.4mmol)活化3min後加入固相反應柱中，室溫反應2小時。用DMF洗滌3次，加入70ml封閉液(吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol:400mmol)封閉8小時(樹脂若未完全擴散加DCM作為溶劑)。用DMF洗滌4次，DCM洗4次，甲醇收縮抽乾，得到Fmoc-Asp (OtBu) -Wang樹脂。檢測替代度為0.192mmol/go
[0044]實施例3:替代度為0.15mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂的合成
[0045]稱取替代度為1.0mmol/g的Wang樹脂40g，加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用 DMF溶脹樹脂 30 分鐘。稱取 7.42g Fmoc-Asp (OtBu) _0H( 18mmol )、2.92g H0Bt( 21.6mmol)和0.22g DMAP (1.8mmol)溶於體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.38mlDIC (21.6mmol)活化3min後加入固相反應柱中，室溫反應2小時。用DMF洗滌3次，加入70ml封閉液(吡啶/乙酸酐=1: l，400mmol:400mmol)封閉8小時(樹脂若未完全擴散加DCM作為溶劑)。用DMF洗滌4次，DCM洗4次，甲醇收縮抽乾，得到Fmoc-Asp (OtBu) -Wang樹脂。檢測替代度為0.150mmol/go
[0046]實施例4:胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的製備
[0047]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g (5mmol),加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。用DBLK脫除Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表示Fmoc已脫除。取5.97gFmoc-Thr (tBu) -OH (15mmol), 2.43g HOBt (18mmol )，溶於體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min後加入固相反應柱中，室溫反應2小時。以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需再偶聯反應I小時，此判斷標準適用於後續內容中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重複上述脫除Fmoc保護和加入相應胺基酸偶聯的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯。其中偶聯Lys的原料為Fmoc-Lys (mmt)-OH。偶聯完最後一個胺基酸His後不需要脫除Fmoc。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，稱重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc) -Leu-1le-Gln (Trt) -Thr-Lys (mmt) -1le-Thr (tBu) -Asp (OtBu) -Wang Resin 樹脂。
[0048]實施例5:胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的製備
[0049]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g(5mmol),加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。
[0050]用DBLK脫除Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表不 Fmoc 已脫除。取 5.97g Fmoc-Thr (tBu) -OH (1 Smmol ), 2.43g HOBt (18mmol),溶於體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min後加入固相反應柱中，室溫反應2小時。以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需再偶聯反應I小時，此判斷標準適用於後續內容中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重複上述脫除Fmoc保護和加入相應胺基酸偶聯的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯。其中偶聯Lys的原料為Fmoc-Lys (mtt)-OH。偶聯完最後一個胺基酸His後不需要脫除Fmoc。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，稱重得到 Fmoc-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser (tBu) -Phe-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Glu (OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-AIa-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn (Trt)-Trp (Boc)-Leu-1le-Gln (Trt)-Thr-Lys(mtt)-1le-Thr(tBu) -Asp (OtBu) -Wang Resin 樹脂。
[0051]實施例6:胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的製備
[0052]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g(5mmol),加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。
[0053]用DBLK脫除Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表不 Fmoc 已脫除。取 5.97g Fmoc-Thr (tBu) -OH (1 Smmol ), 2.43g HOBt (18mmol),溶於體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min後加入固相反應柱中，室溫反應2小時。以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需再偶聯反應I小時，此判斷標準適用於後續內容中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重複上述脫除Fmoc保護和加入相應胺基酸偶聯的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯。其中偶聯Lys的原料為Fmoc-Lys (Alloc)-OH。偶聯完最後一個胺基酸His後不需要脫除Fmoc。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到 Fmoc-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser (tBu) -Phe-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Glu (OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys(Alloc)-1le-Thr(tBu)-Asp (OtBu) -ffang Resin 樹脂。
[0054]實施例7:胺基酸序列如SEQ ID N0.1所示的替度魯肽肽樹脂的製備
[0055]稱取替代度為0.150mmol/g 的 Fmoc-Asp(OtBu)-Wang 樹脂 33.3g (5mmol),加入到固相反應柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘。用DBLK脫除Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次，用茚三酮法檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表示Fmoc已脫除。取5.97gFmoc-Thr (tBu) -OH (15mmol), 2.43g HOBt (18mmol )，溶於體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC (18mmol)活化3min後加入固相反應柱中，室溫反應2小時。以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需再偶聯反應I小時，此判斷標準適用於後續內容中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重複上述脫除Fmoc保護和加入相應胺基酸偶聯的步驟，按照替度魯肽主鏈肽序順序偶聯。其中偶聯Lys的原料為Fmoc-Lys (Trt)-OH。偶聯完最後一個胺基酸His後不需要脫除Fmoc。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到Fmoc-His (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Gly-Ser (tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn (Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln (Trt) -Thr-Lys (Trt) -1le-Thr (tBu) -Asp (OtBu) -ffang Resin 樹脂。
[0056]實施例8:替度魯肽賴氨酸側鏈保護基的選擇性脫除
[0057] 將實施例4或實施例5中的肽樹脂加入到固相反應柱中，用DCM洗滌2次，用DCM溶脹樹脂30分鐘，抽乾DCM。加入5%TFA/DCM溶液300ml，室溫反應2h。以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂顯色，說明Lys側鏈保護已經脫除。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到 Fmoc-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser (tBu) -Phe-Ser (tBu) -Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys-1Ie-Thr (tBu)-Asp (OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0058]實施例9:替度魯肽賴氨酸側鏈保護基的選擇性脫除
[0059]將實施例6中的肽樹脂加入到固相反應柱中，用DCM洗滌2次，用DCM溶脹樹脂30分鐘，抽乾DCM。加入300mlDCM做為溶劑，再加入7.40ml苯基矽烷(60mmol )，反應3分鐘，再加入1.56g Pd (PPh3) 4( 1.35mmol)，室溫反應45分鐘，抽掉反應液，茚三酮檢測樹脂顏色，樹脂有顏色，表示Fmoc已脫除。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn (Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp (OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn (Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys-1le-Thr(tBu)-Asp (OtBu)-ffang Resin肽樹脂。
[0060]實施例10:替度魯肽賴氨酸側鏈單PEG修飾的製備
[0061 ] 將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽乾DMF。以400mlDMF為溶劑，稱取1g直鏈mPEG (1000) _SC( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解並與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側鏈氨基已與mPEG偶合，抽乾反應液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(B oc)-Leu-1le-Gln (Trt)-Thr-Lys (mPEG (1000))-1le-Thr (tBu)-Asp (OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0062]將肽樹脂置於反應燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應物用砂芯漏鬥過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合併濾液。加入冰凍的無水乙醚沉澱(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉澱離心，用無水乙醚洗滌3次，真空乾燥得到白色粉末固體。
[0063]離子交換層析和反相高效液相色譜純化後得到結構為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (1000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 3.26g。純度為 98.6%。
[0064]實施例11:替度魯肽賴氨酸側鏈單PEG修飾的製備
[0065]將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽乾DMF。以400mlDMF為溶劑，
[0066]稱取400g直鏈mPEG (40000) _SC( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解並與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側鏈氨基已與mPEG偶合，抽乾反應液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到H-His (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln (Trt) -Thr-Lys (mPEG (40000)) -1le-Thr (tBu) -Asp (OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0067]將肽樹脂置於反應燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應物用砂芯漏鬥過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合併濾液。加入冰凍的無水乙醚沉澱(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉澱離心，用無水乙醚洗滌3次，真空乾燥得到白色粉末固體。
[0068]離子交換層析和反相高效液相色譜純化後得到結構為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (40000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 21.77g，純度為 97.6%。
[0069]實施例12:替度魯肽賴氨酸側鏈單PEG修飾的製備
[0070]將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽乾DMF。以400mlDMF為溶劑，稱取20g直鏈mPEG (2000) -SBA( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解並與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側鏈氨基已與mPEG偶合，抽乾反應液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到H-His (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn (Trt)-Thr (tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(2000))-1le-Thr(tBu)-Asp(OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0071]將肽樹脂置於反應燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應物用砂芯漏鬥過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合併濾液。加入冰凍的無水乙醚沉澱(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉澱離心，用無水乙醚洗滌3次，真空乾燥得到白色粉末固體。
[0072]離子交換層析和反相高效液相色譜純化後得到結構為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (2000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 3.74g，純度為 97.9%。
[0073]實施例13:替度魯肽賴氨酸側鏈單PEG修飾的製備
[0074]將實施例8或9中的肽樹脂(5mmol)加入到固相反應柱中，用DCM洗滌2次，用DMF溶脹樹脂30分鐘，抽乾DMF。以400mlDMF為溶劑，稱取40g直鏈mPEG (4000) -SPA( 1mmol )，加入上述溶液中，適當搖勻使PEG溶解並與肽樹脂混合均勻，在室溫條件下反應2h，茚三酮檢測無色透明，說明賴氨酸側鏈氨基已與mPEG偶合，抽乾反應液，DMF洗滌6次。用DBLK脫除N端Fmoc保護，然後用DMF洗滌6次。反應結束後用甲醇收縮，樹脂真空乾燥過夜，得到H-His (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn (Trt)-Thr(tBu)-1le-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp (OtBu)-Phe-1le-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-1le-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(4000))-1le-Thr(tBu)-Asp(OtBu) -ffang Resin 妝樹脂。
[0075]將肽樹脂置於反應燒瓶中。以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:苯甲醚=90:5:3:2(V:V)，室溫攪拌2h。反應物用砂芯漏鬥過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合併濾液。加入冰凍的無水乙醚沉澱(無水乙醚用量為100ml/g樹脂)，將沉澱離心，用無水乙醚洗滌3次，真空乾燥得到白色粉末固體。
[0076]離子交換層析和反相高效液相色譜純化後得到結構為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser—Asp-Glu-Met-Asn-Thr—IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-1le—Asn—Trp-Leu-1le-Gln-Thr-Lys (mPEG (4000))-1le-Thr-Asp-OH 的精肽 5.26g，純度為 98.1%。
[0077]其中，mPEG-SPA為甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺丙酸酯，結構如式I所示:
[0078]

【權利要求】
1.一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物，其特徵在於，其N端氨基和/或Lys側鏈氨基通過醯胺鍵與單甲氧基PEG衍生物偶聯。
2.根據權利要求1所述的替度魯肽的聚乙二醇偶合物，其特徵在於，所述單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥珀醯亞胺丙酸酯、mPEG琥珀醯亞胺丁酸酯或mPEG-琥珀醯亞胺碳酸酯。
3.一種替度魯肽的聚乙二醇偶合物的固相製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: 步驟1、取Asp與固相載體偶聯,獲得固相載體-Asp ； 步驟2、取所述固相載體-Asp逐步偶聯胺基酸，獲得固相載體-多肽，所述多肽的序列如 SEQ ID N0.1 所示； 步驟3、脫除所述固相載體-多肽的N端氨基的保護基團和/或Lys側鏈氨基的保護基團後，單甲氧基PEG衍生物通過醯胺鍵與所述N端氨基和/或所述Lys側鏈氨基偶聯，裂解、純化後，即得。
4.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述單甲氧基PEG衍生物的分子量為 1000 ~40000Da。
5.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述單甲氧基PEG衍生物的分子量為 2000 ~20000Da。
6.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述單甲氧基PEG衍生物的分子量為 5000 ~1000Da0
7.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述單甲氧基PEG衍生物為直鏈型或支鏈型。
8.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述單甲氧基PEG衍生物選自mPEG琥拍醯亞胺丙酸酯、mPEG琥拍醯亞胺丁酸酯或mPEG-琥拍醯亞胺碳酸酯。
9.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述單甲氧基PEG衍生物選自Lys-mPEG2 或 Tris-mPEG3。
10.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述N端氨基的保護基團為Fmoc ο
11.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，Lys側鏈氨基的保護基團為mmt, mtt, Alloc 或 Trt0
12.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，所述N端氨基的保護基團的脫除劑為20%哌啶/DMF溶液。
13.根據權利要求1所述的固相製備方法，其特徵在於，Lys側鏈氨基的保護基團的脫除劑為TFA或四三苯基膦鈀/苯矽烷。
14.根據權利要求3至13任一項所述的固相製備方法獲得的替度魯肽的聚乙二醇偶合物。
【文檔編號】C07K1/06GK104072604SQ201310102207
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月27日 優先權日:2013年3月27日
【發明者】宓鵬程, 劉建, 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業股份有限公司