腦膠質瘤瘤變前期的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的製作方法

2023-09-12 13:16:00 2

專利名稱：腦膠質瘤瘤變前期的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與癌前變的mRNA表達改變(病理演變過程)的相關檢測技術。
背景技術：
根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌症的新增人數260萬，死亡人數近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌症患者800萬，死亡人數接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數將翻一番，這是一組可怕的數字。癌症診治成本越來越高，按癌症患者的年治療費用20萬(貧窮地區可能偏高，發達地區可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，每年的花費是1. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有1萬億人民幣白白消耗了。而且，癌症患者大部分會在治療後不久死亡。因此，現有的臨床癌症診治模式一定要改變，本發明的創新點是提前做到預防性篩查，然後及時介入預防性調控和預防性治療，做到基因水平癌症的治未病。2005年美國衛生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對 1972年發起的抗癌大戰進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰中是失敗，結論是癌症死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質性(多態性);2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善(動物模型設計不科學)等。同時，該報告中亦提出應重新審視現有診治癌症的措施。本發明人在長期研究中發現，導致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現有的臨床醫學影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技術)指標來診斷癌症，都是腫瘤形成後診斷，前者要有組織學變化或已有佔位性病變，後者大部分是腫瘤形成後所分泌、釋放、或腫瘤的標記物。傳統臨床觀念認為佔位性癌塊在2公分下是屬於早期癌症的診斷，這一概念值得認真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角度來分析，1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠不止 2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌症唯一的發生地和單獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發灶後，其它器官復發灶或多發癌塊灶先後形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發現原發病灶時，同時發現轉移病灶，不在我們表述的內容中)，其實這時已經是晚期診斷和晚期治療，這是導致癌症死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌症基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌症、治療癌症、以及預防癌症，已取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉錄功能產物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預測和篩查。本發明採用核酸原位雜交技術，選擇多組臨床標本(癌症病人、高危人群、正常對照)，對FUBPl基因與腦膠質瘤的早期預警進行檢測分析。研究人員發現與少突膠質細胞瘤(Oligodendrogliomas)相關的兩個基因變異， 這揭開了之前一直未能確定的少突膠質細胞瘤的主要致病基因變異之謎，為進一步分析腦部腫瘤提供了重要資料。少突膠質細胞瘤(Oligodendrogliomas)是從少突膠質細胞發生的腫瘤。多發生在大腦的淺部，生長緩慢，界限不清，是由富於圓形和具有蜂窩狀特徵 (honeycomb architecture)的細胞所構成的神經膠質瘤。這種疾病是常見的惡性腦瘤之一，佔成人中所有腦腫瘤的約20%。多年來醫學界多年來一直在尋找少突膠質細胞瘤的主要致病基因變異，但是儘管確定了相關變異發生在人類1號和19號染色體，依然未能發現其中的關鍵基因變異。研究人員對少突膠質細胞瘤的基因中的編碼蛋白區域進行了測序，之前的研究發現這種腫瘤具有特徵性的染色體畸變，而該畸變與染色體Ip和19q上存在的關鍵性的腫瘤抑制基因是一致的。研究人員通過實驗發現在染色體19q上的CIC基因中的以及在染色體Ip上的FUBPl基因中具有普遍的體細胞突變在最初的7個少突膠質細胞瘤樣本中，6個都發現了 CIC基因變異，2個檢測出FUBPl基因變異，進一步對27個樣本進行全基因組掃描後發現，存在CIC基因變異的有12個，出現FUBPl基因變異的有3個。因此研究人員認為這些基因是這類癌症的基因變異。而FUBPl基因所編碼的是一種可與DNA (其中包括MYC腫瘤基因的調控區)結合的蛋白質。研究人員認為這兩個基因變異很少在其他腫瘤中出現，這意味著它們很可能是少突膠質細胞瘤特異基因。將FUBPl基因的mRNA作為早期篩查腦膠質瘤瘤變前期有非常重要的臨床診斷意義。FUBPl基因的mRNA在腦膠質瘤變前期及癌變過程中低表達，作於腦膠質瘤瘤變前期篩查、及腦膠質瘤術的復發、轉移預警也有非常重要的臨床意義。發明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌症和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現在治已病(發病後診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發病率和死亡率，降低社會成本和醫療成本。因此，發明人在開發和生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了創新。特別是篩選臨床標本(正常人群、腦膠質瘤高危人群、腦膠質瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發思路，來尋找和開發癌前變的mRNA水平，與癌症早期基因病理生理學演變密切相關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上腫瘤形成後診治模式變成腫瘤的預防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預防癌症。目前對FUBPl基因的研究都採用高通量基因晶片技術，而這些方法多用於科研方面，不適應臨床應用。根據現有的文獻資料FUBPl基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報導。本發明人在針對創新性發明的要求，設計了不同數據例組(腦膠質瘤患者、高危人群、正常對照人)例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上腦膠質瘤症病人基因低和零表達，高危人群有不同程度表達15-25%，正常人都是高表達。表明FUBPl基因腦膠質瘤變前期篩查的重要標誌物。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便於示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利於以後的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有咕、353、1251和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優點，但是由於放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和螢光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、衝洗和顯示。本發明採用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是採用鹼基互補(雜交互補)的原理，同時經過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響(因為，發明人採用的mRNA序列都超過600bp以上)。鑑於目前臨床上癌症的診斷(影像醫學和生化指標物都是腫瘤形成後的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導致死亡率不降的醫治模式。本發明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到預防性診治，將目前影像醫學手段和眾多生化標記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技術，做了創新性的技術突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技術，為臨床癌症的診治爭取時間和空間。

發明內容
本發明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發明還要提供上述試劑盒用於與腦膠質瘤瘤變前期篩查及術復發、轉移早期預警相關的原位雜交檢測方法。為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下
本發明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針如SEQ ID NO. 1所示，是FUBPl基因序列中間一段鹼基序列，從300到llOObp，FUBPl 基因序列號NM_003902，如SEQ ID NO. 2所示，基因的核苷酸序列長度是^854p，⑶S是 90……20Mbp，位於染色體lpl3. 1 」上。(在探針標記過程中如果基因序列太長，超過IOOObp 以上，我們會用⑶S的序列來設計探針，如果⑶S的序列也超過IOOObp以上，會採用基因的中間一段鹼基序列來合成探針，鹼基序列不少於500bp，探針合成後要做序列檢測，並對功能進行臨床意義的分析)。本發明試劑盒的一個優選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、螢光素、酶及納米材料。
本發明試劑盒的一個優選方案是還包括雜交液。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括增強劑。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括顯色劑。本發明的癌變前期基因篩查試劑盒應用價值在於，能在mRNA水平，對腦膠質瘤瘤變前期篩查，及瘤變後或術後復發、轉移、擴散發生預警，進一步配合臨床治療。本發明還提供一種基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交複合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交複合體；和
(2)檢測所述雜交複合體。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的可形成穩定雜交複合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自腦膠質瘤患者、腦膠質瘤高危人群、正常對照人群。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的腦膠質瘤高危人群、腦膠質瘤患
者ο本發明的檢測試劑盒是採用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以基因的一級轉錄功能產物mRNA為檢測對象，合成探針是基因的RNA序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供基因的半定量或定量表達程度判定。根據雜交後免疫組化顯色判定以上基因的表達量，正常人基因高表達，即大量顯色，基因在腦膠質瘤病人和正常人有顯著差異，該基因的表達量比正常人表達量都低。本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動後固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。本發明的一個優選實施例的方案是以FUBPl基因為目的基因合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點， 還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素幹憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的基因的表達量。
本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的基因表達量，用來確定瘤變前期的mRNA變化量，預警腦膠質瘤瘤變是否發生及腦膠質瘤患者術後是否復發、轉移的預測。因為基因在正常人中高表達，如果FUBPl基因表達量低或零表達，說明有患腦膠質瘤的風險，說明腦膠質瘤瘤變已發生，或癌症病人術後已經復發、轉移， 從而獲得腦膠質瘤的早期病理演變信息。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述，當檢測到FUBPl基因的表達量低於正常對照時，則可預測受試者為腦膠質瘤變病理過程已發生。本發明具有如下有益效果
本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測腦膠質瘤變發生和病理演變過程中FUBPl基因 mRNA表達量的變化，預警腦膠質瘤發生、發展趨勢。本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌症標誌物，以及影像醫學檢查有顯著不同。本發明可以在基因轉錄的一級功能產物 mRNA水平檢測基因異常表達，在影像醫學檢查未發現佔位性癌病灶復發之前，癌症生化指標未產生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達異常的信息採集，給臨床癌症病患一個真正的早期診斷以及治療後轉移復發及早預測。這樣才有可能實施癌症的早期篩查、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治腦膠質瘤惡疾。此外，本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。


圖1是本發明基因原位雜交技術流程圖。圖2是本發明實施例中腦膠質瘤症病人表達降低圖片。圖3是高位人群圖片。圖4是本發明實施例中正常人表達圖片。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應該理解，下面的實施例用於說明而非限定本發明內容，任何形式上的改變或變通將落入本發明的保護範圍。實施例1
按照常規方法製備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以基因為檢測目的基因設計的雜交探針、標記物、說明書，其中 本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特徵在於，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示的序列。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、螢光素、酶及納米材料。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種FUBPl基因mRNA原位雜交檢測方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)在權利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交複合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交複合體；和(2)檢測所述雜交複合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於，所述的可形成穩定雜交複合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特徵在於，所述的血液白細胞標本選自腦膠質瘤患者、高危人群、正常人標本。
10.FUBPl基因在製備檢測腦膠質瘤瘤變原位雜交試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與腦膠質瘤早期病理演變有密切相關的回文基因(FUBP1)的mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩定雜交複合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交複合體；和(2)檢測所述雜交複合體。本發明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測基因的表達量，比影像醫學和現有的臨床生化檢測指標更早期，能實現真正的癌變前期mRNA水平篩查，同時，本發明的檢測方法簡單方便，成本低,便於縣區級醫院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102453768SQ20111044283
公開日2012年5月16日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者張雲福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司