枸杞和炎症的製作方法

2023-09-12 05:52:55 2

專利名稱：枸杞和炎症的製作方法
枸杞和炎症 本發明總體上涉及炎症領域。本發明尤其涉及天然化合物在製備治療炎症的產品
中的用途。例如，枸杞提取物被證實具有抗炎特性。 炎症是組織對有害剌激，例如病原體，損傷的細胞，或剌激物的複雜生物應答。其 通常是生物體清除有害剌激和引發組織癒合過程的保護性嘗試。但是，未充分控制的炎症 可以導致幾種疾病，不論受試者的年齡如何。 衰老與免疫系統調節異常有關，例如細胞介導的免疫應答的顯著下降，伴隨增加 的體液免疫功能異常(例如，對疫苗的低應答)。此外衰老經常與輕度炎症狀態有關。因 此，尤其很多老年人處於促進發病和死亡的感染和非感染疾病的高風險中。
枸杞因其對健康的多種益處而聞名，這是基於複合營養(例如，玉米黃素，維生素 和寧夏枸杞多糖)成分。 但是，該領域仍然需要具有抗炎特性的可獲得的天然化合物。 例如，營養介入，如n-3PUFA (多不飽和脂肪酸)減弱了炎性細胞功能，而且降低了
細胞介導的免疫應答(例如，淋巴細胞增殖和NK活性)，其可以導致對於宿主防禦潛在的不
利影響。 因此本發明的目的是為本領域提供可選的天然化合物，其具有抗炎特性並且對於 受試者的免疫防禦沒有任何不利影響。 本發明人驚奇地發現枸杞提取物具有抗炎特性。因此本發明的目的是通過為本領 域提供枸杞提取物在製備治療和/或預防炎症的產品中的用途而達到的。而且發現維持了 免疫應答。 因此，本發明的一個實施方式是包括枸杞或其一部分和任選地包含乳或乳蛋白的 載體的初級組合物，在製備治療和/或預防炎症的產品中的用途。
該產品可以設計用於口服或局部施用。 乳或乳蛋白可以獲自動物或植物來源，或來自其混合物。優選地，乳是牛奶，駱駝 奶，水牛奶，山羊奶，綿羊奶，植物乳，尤其是大豆乳或其混合物。乳蛋白應當理解為可獲自 上面列出的一種或多種乳類型的蛋白級分。
優選地，初級組合物是易混合組合物。 特別是如果初級組合物包含乳或包含乳蛋白的載體，其有利地具有完整枸杞的基 本活性組分的封閉範圍，其具有在水相系統中良好的穩定性，可混合性和/或可分散性。
進一步地，特別是如果包含乳或包含乳蛋白的載體，該初級組合物，以更好的生物 利用率和穩定性形式，具有增強的營養價值。其具有令人愉快的味道和顏色。其能夠被直 接應用或被濃縮或乾燥成粉末，用於日常消費的食物產品中的幾種應用或其它營養用途。
如果初級組合物通過如下方法製備，那麼可以獲得所有這些特性，所述方法用於 製備初級組合物以遞送枸杞的基本親脂和/或親水生物活性組分，包括步驟i)在乳或包 括乳蛋白的液體介質中混合和碾磨枸杞材料，ii)任選分離不溶性纖維以獲得水性懸浮液 iii)任選巴氏滅菌產生的懸浮液iv)任選在加工過程中加入合成的或天然的生物活性組 分v)和進一步任選乾燥該懸浮液以得到粉末。
因此，在本發明的一種實施方式中，通過如下方法可得到初級組合物，該方法包括 步驟i)在乳或包括乳蛋白的液體介質中混合和碾磨枸杞材料，ii)任選分離不溶性纖維
以獲得水性懸浮液iii)任選巴氏滅菌獲得的懸浮液iv)任選在加工過程中加入合成的或
天然的生物活性組分v)和進一步任選乾燥該懸浮液以得到粉末。 該方法的主要的益處是天然的和低成本，使得可以以其天然組分中穩定的水溶和 脂溶化合物組合的形式改善改善多種營養物的遞送，無有機溶劑殘留。 在另外一方面，本發明提供了一種增加枸杞材料的生物活性化合物在水相系統中 的可混合性或可分散性，穩定性，和生物利用率的方法，其利用上述方法，尤其地，通過使用 乳或乳蛋白，大豆乳或來自植物的乳樣蛋白提取和遞送枸杞的功能成分的多種營養物來實 現。 上述初級組合物能夠用於釋放枸杞的功能成分的多種營養物，其具有改進的生物 利用率，可混合性和穩定性。 術語生物活性化合物可以被理解為意思是當口服或局部應用時，顯示出生物活性 或健康影響的分子或組分。 枸杞可以例如，以果實和該植物的其它部分的形式使用。果實可以新鮮的，濃縮的 或乾燥的材料形式，例如，風乾或冷凍乾燥的材料使用。但優選使用乾燥的成熟果實。
在本發明的一個優選實施方式中，初級組合物包含枸杞的至少一部分基本親脂和 /或親水生物活性組分。 基本的親脂和/或親水生物活性組分優選選自包括脂質，生物鹼，蛋白質，糖類， 糖蛋白，類胡蘿蔔素，多酚化合物例如黃酮類化合物，維生素，礦物質或其混合物的組。
類胡蘿蔔素可以選自包括胡蘿蔔素和葉黃素例如，番茄紅素，胡蘿蔔素，六氫番茄 紅素，八氫番茄紅素，角黃素，P _隱黃素，辣椒紅，葉黃素，玉米黃素，或那些脂肪酸酯形式 或其混合物的組。 糖蛋白優選選自包括阿拉伯半乳聚糖蛋白，尤其枸杞多糖和能夠由13 _葡糖基 Yariv試劑檢測的大分子的組。 黃酮類化合物優選選自包括黃酮例如5， 7， 4'-三羥黃酮，毛地黃黃酮，或香葉木 素，黃酮醇例如櫟精，楊梅黃酮，4'， 5， 7-三羥黃酮醇，黃烷酮，花色素例如花葵素，二甲翠雀 素，或異黃酮例如染料木黃酮，大豆黃素，或其混合物的組。 本發明的初級組合物可以在乳中或包括乳蛋白的載體中含有至少包含枸杞或其 中一部分的基本生物活性組分，不包括不溶性纖維。乳載體可以是來自動物或植物來源的 脫脂乳或全脂乳形式(例如，大豆乳，果汁或椰子乳，等)。在一種更優選的實施方式中，根 據希望得到的初級組合物使用牛奶或大豆乳。舉例來說，包含乳的載體可以是包括乳蛋白， 如酪蛋白或乳清蛋白的任何可食用的液體。
植物油可以任選加入到液體介質中。 枸杞材料可以在所述乳或包括乳蛋白的液體介質中以約i : i到i : iooo，優選 從i : 5到i : 50的各自比例混合和碾磨。混合和碾磨步驟可以在從i到95t:，優選從
約20到80°C ，和更優選從40到80°C的溫度下進行。然後，不溶性纖維可以被至少部分去
除以獲得水性懸浮液。 其可以通過任何常規方法進行。產生的初級組合物可以通過本領域已知的技術進一步被巴氏滅菌和/或乾燥成粉末。獲得的初級組合物也可以是液體或凝膠形式。
這樣品發明提供了初級組合物，其包括與完整果實相似譜的重要營養物，其具有 良好穩定性，可混合性和生物利用率。如果選擇粉末形式，這些組合物可以在水相系統中是 高度可分散的。在這種情況下，舉例來說，粉末在冷水或熱水中是可分散的。其同樣能夠加 入乳中。 另外，組合物可以包含一種或多種乳化劑，穩定劑，抗氧化劑和其它添加劑。優選 使用相容於食物的乳化劑，如磷脂，例如卵磷脂，聚氧乙烯山梨糖醇酐單或三硬脂酸酯，單 月桂酸酯，單棕櫚酸酯，單或三油酸酯，單或二甘油酯。 也可以使用已知在食物，化妝品，或藥品中適用的任何類型的穩定劑。
可以使用已知在食物，化妝品，或藥品中適用的任何類型的抗氧化劑。
可以進一步使用已知在食物，化妝品，或藥品中適用的添力口劑，香味劑，色素。
依照初級組合物預期的最終用途，可以加入乳化劑，穩定劑，抗氧化劑和添加劑。
該組合物可以進一步包含合成的或天然的生物活性成分如胺基酸，脂肪酸，維生 素，礦物質，類胡蘿蔔素，多酚等。其優選在巴氏滅菌和/或乾燥之前，通過乾燥或者潮溼混 合加入到所述組合物中。 使用本發明製備的產品可以是膳食補充劑，用作或用於藥物的補充劑或用作或用 於乳膏的補充劑。 在本發明的一個優選實施方式中，該產品預期用於由人或寵物使用和/或應用於 人或寵物。 該產品可以施用於任何年齡的受試者，尤其是嬰兒，兒童，青少年，成年人和/或 老年人。但是，枸杞的益處似乎尤其適合於成年人和老年人。 根據本發明的一種優選實施方式，通過使用本發明製備的產品預期在食品中或作 為食品，用於人類消費。該食品可以經腸應用-為了本發明的目的，包括口服的或-胃腸外 的。 因此，該初級組合物可以是口服應用的食品中的添加齊U，例如在營養組合物，食品 補充劑，寵物食物產品，化妝品製劑中或在藥物製劑中。初級組合物也可以是局部使用的產 品，如化妝品或藥物製品中的添加劑。 因此，通過使用本發明製備的產品可以是營養完全配方食品，乳製品，冷藏的或耐 貯藏飲料，用於哺乳母親的產品，液體飲料，湯，膳食補充劑，膳食替代品，營養棒，甜食，乳 或發酵乳製品，酸乳酪，奶粉，腸內營養製品，嬰兒配方奶粉，嬰兒營養製品，濃湯，穀類製品 或發酵穀類製品，冰淇淋，糖果，甜點，餅乾，蛋糕，巧克力，熱牛奶咖啡，助卩啡，烹飪製品例如 蛋黃醬，番茄醬，或沙拉醬，寵物食品或寵物飲品。在一種優選實施方式中，用於人類消費的 食品組合物由上面的初級組合物補充。初級組合物，優選粉末形式的初級組合物，能夠按照 獲得上述生物活性營養物日常攝入的量在上面提到的食品或飲料中分散，其可以根據希望 的效果和目標組織選擇。為獲得有益效果而由個體消費的初級組合物或食品組合物的量還 取決於其大小，類型和年齡。 如果該產品是口服施用的營養補充劑，其可以存在於膠囊，明膠膠囊，軟膠囊，片 劑，糖衣片劑，丸劑，糊劑或錠劑，樹膠，或可飲用的溶液或乳劑，糖漿或凝膠中。初級組合 物的劑量可以根據本領域技術人員意欲達到的目的變化，但通常在初級組合物為約O. 1到100重量百分數之間。這樣的補充劑也可以包括增甜劑，穩定劑，抗氧化劑，添加劑，調味劑
和/或色素。此外，化妝用目的的補充劑可以包括有關皮膚的活性組合物。 在另外一種實施方式中，如果本發明的產品是藥物組合物，其可以被施用用於預
防和/或治療性治療。 在治療應用中，組合物以足以至少部分治癒或抑制疾病症狀和其併發症的量被施 用。足以達到該目的的量被定義為"治療有效劑量"。對該目的有效的量取決於本領域技術 人員已知的多種因素，例如疾病的嚴重程度和病人的體重和一般狀態。在預防應用中，根據 本發明的組合物以足以至少部分降低患病風險的量應用於易感特定疾病或處於特定疾病 風險的病人。這樣的量定義為"預防有效劑量"。再次，準確的量取決於多種病人的特定因 素，例如，病人的健康狀況和體重。 本發明的組合物，如果作為藥物組合物施用，優選與藥學上可接受的載體一起施 用，載體的基本性質根據施用方式而不同，例如，經腸的，口服的和局部(包括眼科用)途 徑。希望的劑型可以使用各種賦形劑製備，包括，例如，藥物級的甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸 鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂。 可以理解的是，技術人員可以基於其掌握的知識，考慮施用的途徑，選擇靶向活性 化合物到目的組織，例如，皮膚，結腸，胃，眼睛，腎臟或肝臟的適宜的組分和蓋侖形式。
本發明也涉及包含上述初級組合物的化妝品組合物。例如，其可以配製在洗劑，洗 發劑，乳膏，防曬霜，曬後霜劑，抗衰老霜劑和/或軟膏中。能夠局部使用的組合物進一步包 含可以在化妝品中使用的脂肪或油，例如CTFA化妝品原料手冊(Washington)中提到的那 些。加入其它的化妝活性成分也是可能的。組合物進一步包含結構劑(structuring agent) 和乳化劑。其它的賦形劑，著色劑，香料或遮光劑也可以加入到該組合物。可以理解的是， 本化妝品製品可以包含技術人員已知的不同成分的混合物，以保證所述物質快速滲透入皮 膚和預防其貯存過程中的降解。 可以理解的是，本發明的概念可以同樣用作輔助性治療，協助目前使用的藥物。由 於本發明的化合物可以容易地與食品材料一起施用，可以應用包含大量所述物質的專門臨 床食品。 上述食品，營養補充劑，化妝品或藥物組合物施用給寵物或人，獲得改善的健康狀 況，尤其是通過至少部分地減輕炎症。 能夠通過應用使用本發明製備的產品而被治療的炎症可以選自急性炎症例如膿 毒症，感染，燒傷，和慢性炎症例如炎性腸病，克隆病，潰瘍性結腸炎，壞死性腸結腸炎，皮膚 炎症，例如紫外線或化學誘導的皮膚炎症，溼疹，反應性皮膚，銀屑病，白癜風，痤瘡，炎性腸 病症候群，肝臟炎症，酒精性肝硬化，變態反應，特異反應性，骨炎症，類風溼性關節炎，系統 性紅斑狼瘡，Gougerot-Sjogren' s症候群，賴特爾症候群，脊髓灰質炎，皮肌炎，甲狀腺炎， 巴澤多病，橋本病，I型糖尿病，艾迪生病，自身免疫性肝炎，乳糜瀉，比爾默病，多發性硬化， 肌無力，腦脊髓炎，眼炎症，肥胖相關的炎症，年齡相關的輕度炎症，Blau' s症候群，阿爾茨 海默氏病，心血管疾病，動脈粥樣硬化，代謝症候群，牙齦炎和paronditis。
本發明人已經研究了本發明的初級組合物抗炎效果的分子機制。不希望受理論約 束，發明人現在相信，其抑制巨噬細胞的LPS-介導的促炎細胞因子的產生(

圖1)和人腸上 皮細胞內TNF- a或LPS-誘導的NF_ k B活化途徑(圖2)。在臨床前研究中，包括本發明初
7級組合物的膳食補充劑在急性腸炎的小鼠模型中顯示了強烈抗炎特性(圖3到10)。此外， 本發明的初級組合物還能夠減少年老小鼠肝臟中促炎細胞因子的表達，例如，TNF-a (圖 11)。而且，包括本發明初級組合物的膳食補充劑增強年老小鼠體內抗原特異性的體液和細 胞介導的免疫應答(分別見圖12和13)。這樣，本發明的初級組合物被證實有益於減輕炎 症狀態。同時，本發明的初級組合物還能夠支持免疫系統。 因此，本發明製備的產品可以用於減輕炎症狀態和_同時-提升免疫系統。
因此，本發明的初級組合物具有恢復受損免疫和炎症反應到穩態的潛力。通過此 雙重效應，本發明的初級組合物適於，例如，在老年的，臨床的和寵物營養的產品中使用。
本發明的初級組合物尤其有益於維持衰老過程中的免疫功能，同時減輕年齡相關 的輕度炎症狀態。 本發明的初級組合物也可以應用於控制急性或慢性炎症的臨床產品。 因此，在本發明的一個實施方式中，通過使用本發明製備的產品被用於改善受損
的免疫應答。其也可以用於增強抗原特異性的體液免疫應答和/或增強細胞介導的免疫應答。 另外，該初級組合物和/或本發明的產品可以用於治療或預防氧化應激相關的疾 病。發明人已經證實使用該初級組合物和/或本發明的產品能夠誘導抗氧化基因顯著的 增加，例如，GPX-1， CAT1和S0D2(圖9)。因此，該初級組合物和/或本發明的產品可以提 供針對氧化應激的保護，所述氧化應激由例如，自由基，如 02—，超氧陰離子；11202，過氧化 氫； 0H，羥基自由基；R00H，有機氫過氧化物；R0 ，烷氧自由基；ROO ，過氧自由基；H0C1， 次氯酸；00N0-，過氧亞硝酸根;禾口 /或N0 弓l起。 本領域技術人員明確的是，可以自由組合本文所述的任何特徵而不脫離本發明原 始公開的範圍。 從下面的實施例和附圖來看，本發明進一步的優點和特點是顯而易見的。 圖1顯示了小鼠巨噬細胞系(RAW細胞)中通過LWB抑制LPS-介導的IL_6的產生。 圖2顯示了人腸上皮細胞系(穩定轉染NF- k B報告基因的HT-29)中通過LWB抑 制LPS-介導的NF- k B的活化。 圖3顯示了TNBS施用後體重的減輕。平均數+/_SEM。 圖4顯示了宏觀的得分評定。右側區平均數+/-SEM ;左側區個體值和中位數。
圖5顯示了組織學得分評定。右側區平均數+/-SEM ;左側區個體值和中位數。
圖6顯示了 COX-2與參考蛋白(肌動蛋白)的比例。右側區平均數+/-SEM ;左 側區個體值和中位數。 圖7顯示了 pSTAT3的表達。右側區平均數+/-SEM ;左側區個體值和中位數。
圖8顯示了急性腸炎的小鼠模型中促炎基因，例如TNFa ， IL_6和IL_1 P和蛋白 質，例如KC的表達，補充或不補充LWB。 圖9顯示了急性腸炎的小鼠模型中抗氧化基因，例如，GPX-1 ， CAT1和S0D2的表達， 補充或不補充LffB。
圖10顯示了抗氧化能力。右側區平均數+/-SEM ;左側區個體值和中位數。 圖11顯示了與正常年老小鼠(H20)和成年鼠(CTRL)肝臟中觀察到的水平相比，
8補充LWB的年老小鼠肝臟中編碼TNF- a的基因的表達。 圖12顯示了年老小鼠體內抗原(KLH)特異性的抗體反應。 圖13顯示了年老小鼠體內細胞介導的免疫的遲髮型超敏(DTH)反應。 實施例1 包含枸杞和乳的初級組合物的製備(LWB，乳糖-枸杞，Lacto-Wo If berry)
將乾燥的枸杞果實(40g)和全脂乳(300g)加入到1升的容器。混合物保持 靜止不動10分鐘，在氣氣條件下用Polytron (Dispersing and MixingTechnology by KINEMATICA, PT3000)以26000rpm處理15分鐘。在Polytron處理過程中，混合物的溫度 通過水浴方法維持在80-85°C ，之後冷卻到室溫。獲得的混合物接著以2000G離心10分鐘。 丟棄固體殘餘物。液相(306g橘黃色乳)被凍幹。乾燥產品最終被磨碎，產生54g橘黃色 粉末，其與枸杞果實粉末相比，顯示出極好的水分散性和改善的玉米黃素穩定性。
實施例2
試劑 來自先導批N'WB03A1506H，照上述方式在NRC(雀巢研究中心，Lausanne)生產 的乳糖-枸杞(LWB)粉末和枸杞提取粉末(批次N'WB03A1506H)由J.Wang(FS， Lipids & Bioactives)提供。來自大腸桿菌血清型055 :B5的脂多糖(LPS)購自Sigma (St. Louis, M0)。經倫理委員會批准，從產後20天的不同健康供者收集人母乳(HM)。鑰孔血藍蛋白 (KLH)購自Sigma。
細胞培養 小鼠單核細胞/巨噬細胞系RAW 264. 7(TIB-71，來自ATCC， Manassas, Virginia, USA)在添加10X熱滅活FCS(Amimed)和1%青黴素/鏈黴素(Invitrogen，Paisley,UK)的 Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM，Amimed，Bioconc印t，Allschwill， Switzerland)中，於 37°C，5% 0)2/空氣的培養箱中培養。使用胰蛋白酶/EDTA(Sigma，St-Louis，MO，USA)傳代 細胞。人結腸腺癌細胞系HT-29克隆34細胞(S卩，穩定轉染了 NF- k B報告基因的HT-29細 胞)在包含1%穩定卜穀氨醯胺和添加10%熱滅活(56t:—個小時)FCS，l^青黴素/鏈黴 素(Sigma，St Louis，MO) ， 500ug/ml G418 (Invitrogen)禾口 100ug/ml normocin (Invivogen) 的高葡萄糖(4. 5g/l)DMEM(Bioconc印t， Allschwill， Switzerland)中，於37。C，5X C02/ 空氣的培養箱中培養。培養基每2天更換直到細胞單層達到約90%匯合。使用胰蛋白酶/ EDTA(Sigma)傳代細胞。
定量LPS-介導的IL-6表達 RAW264. 7細胞以104個細胞/孔接種於平底96孔板(Nunc, Rosklide， Denmark) 普通培養基中，置於37"，5%0)2/空氣的培養箱中。培養三天後(即，細胞達到約80%匯 合)，不存在或存在LWB樣品(終濃度0. 1-1 % )情況下，細胞在普通培養基中以0. 5ug/ml 大腸桿菌LPS(055 :B5，Sigma)剌激或不剌激24小時。接著收穫細胞培養上清液並用於定量 IL-6的產量。根據製造商的說明通過ELISA(Murine IL-6Eli-pair， Diaclone， Besancon， France)測定細胞培養上清液中的白細胞介素6 (IL-6)水平。
NF- k B的活性 HT-29克隆34細胞以104個細胞/孔接種於平底96孔板(Nunc)培養物維持培 養基中。培養3-4天後(即，細胞達到約80%匯合)，在磷酸鹽緩衝液(PBS) (Sigma)中清
9洗細胞，接著在不存在或存在LWB樣品的情況下，在包含1%青黴素/鏈黴素的DMEM中，以 LPS(10ng/ml+5X人母乳)或者重組TNF-a (10ng/ml ;R&D systems, Oxon， England)剌激 或不剌激24小時。接著收穫細胞培養上清液並貯存於+4°C 0/N直到分析NF-kB的活性。 NF-KB激活後，HT-29克隆34細胞在培養上清液中分泌鹼性磷酸酶(SEAP)。根據製造商的 說明(Applied Biosystems， Bedford, USA)，使用螢光檢測方法(Phospha—Light System) 檢測SEAP釋放。簡要地，細胞培養上清液與Phospha-Light System的反應緩衝液在白色 平底96孔聚丙烯板(Greiner)中孵育20分鐘，使用Spectraf luor Plus分光光度計(Tecan 8634 Hombrechtikon， Switzerland)檢測螢光。結果表達為相對發光單位(RLU)。
TNBS-誘導的結腸炎模型 TNBS結腸炎模型是由化學產品三硝基苯磺酸(TNBS)以150mg/kg的劑量誘導 的急性炎症模型。每組10隻小鼠，在誘導結腸炎前七天已經用包含l^LWB(50mg)的飲食 餵養，直到處死。在施用TNBS後1到4天，50mgL WB通過管飼法供給，以補償與急性腸炎 相關的低飲食攝入。評估每隻動物的體重減輕，宏觀的組織學評分，C0X-2， pSTAT3，促炎和 抗氧化基因表達和抗氧化能力。宏觀的和組織學評分根據Wallace (Wallace等，1989)和 Ameho(Ameho等，1997)的評分標準進行。COX-2 (誘導型環加氧酶，72kDa蛋白)負責急性 炎症條件下前列腺素的可誘導的生物合成。Stat3是很多細胞因子的重要信號分子；尤其 是對促炎細胞因子，如IL-6而言。
在年老小鼠中評估免疫調節的研究設計 無特定病原體的雄性C57BL/6J小鼠(4周大小)購自Charles RiverLaboratories Inc (France)。小鼠在常規環境(12小時光照/黑暗循環，溫度22。C，溼度56% )下飼養和 自由飲水和進食半合成的Kliba 3434。小鼠維持每籠5隻直到5個月大小，接著它們被單獨 關在籠中。所有條件和動物處理均由雀巢和國家倫理委員會批准，其與瑞士聯邦獸醫顧問 意見一致。21個月大小的小鼠被隨機分入2組，每組10隻動物。非補充的對照小鼠(H20， n = 10每年齡組)和LWB補充小鼠(LWB， n = 10每年齡組)接受半合成飲食(AIN-93)。 LWB以0.5% (w/v)的溶液以飲用水形式提供，其新鮮配製並每隔一天更換。在試驗過程 中(44天)，允許所有小鼠自由飲水和取食。同樣的研究設計被進行兩次，並也用8個月大 小的小鼠進行(11 = 8每組)。為了研究體內T細胞依賴的體液應答(抗原特異性的抗體 產生)，年老小鼠在試驗的第15天通過皮下注射(100ul)l^明礬(Brenntag Biosector， Frederikssund， Denmark)中惰性抗原鑰孔血藍蛋白(KLH， Sigma) 100ug進行免疫。DTH反 應被用作細胞免疫的體內度量。在引發之前和之後24小時到8天進行耳厚度(耳腫脹) 測量，以確定產生DTH反應的能力。簡要地，用KLH免疫小鼠7天後(即試驗的第22天)， 通過注射回憶抗原KLH(O. 5ug/ml， 10ul)到每隻小鼠的右耳引發DTH反應。左耳單獨注射 載體(鹽水二PBS)並作為每隻動物的內部對照。引發後24小時，和接下來的7天過程中， 非引發的耳(左耳)和引發的耳(右耳)均被測量。DTH反應(KLH-PBS)表達為耳腫脹程 度，g卩，耳厚度的變化，應用下面的公式A耳厚度-[(引發的耳(右，KLH)厚度-非誘發耳 (左，PBS)耳厚度)，其中A耳厚度=[引發後耳厚度-引發的前耳厚度]。在第0，15，29 天從尾靜脈並且第44天通過心臟穿剌收集血液樣品。小鼠在試驗的第44天被處死。在屍 體解剖中，移除肝臟並且迅速在液氮中凍存一塊。樣品貯存於-S(TC直至進一步分析。
定量KLH-特異性的IgG2a抗體水平
血清中KLH-特異性的IgG2a抗體的量通過ELISA測定。簡要地，微量滴定板用 KLH(50ul/孔，100ng/ml)包被並在37 °C孵育3小時。自由結合位置用ELISA緩衝液在 37t:封閉l小時。接著加入樣品並在+4t:孵育過夜。搖動下，結合的抗體與來自Southern Biotechnologies (Birmingham, USA)的綴合生物素的山羊抗小鼠IgG2a( y 2a鏈特異性的) 於37t:反應1小時。平板在加入來自KPL的TMB過氧化物酶底物後於450nm讀數。抗-KLH IgG2a抗體水平被表達為0D45。 值的均值。
基因表達 肝臟樣品被轉移到lml RNA裂解緩衝液中(Macherey-Nagel， Duren， Germany)並 使用Ribolyzer(Hybaid， Waltham， MA， USA)以下面的設置勻漿:功率6，20分鐘。使用商 業上可獲得的試劑盒(NucleoSpinRNA II試劑盒；Macherey-Nagel， Duren， Germany)進 行RNA提取。使用Ribogreen RNA定量試劑盒(Molecular Probes ;Eugene， OregonUSA) 實現RNA定量，並使用Agilent RNA 6000Nano LabChip試劑盒測定RNA質量(Agilent Technologies, Palo Alto，USA)。根據製造商的說明(Applied biosystems, Biosystems ; Rokreutz， Switzerland)，使用Multiscribe逆轉錄酶反轉錄總RNA (2 y g)。定製的具有48 個TaqMan探針的低密度陣列(LDA)(負荷能力技術monoplicates中每張卡8個樣品)購 自Applied Biosystems (Foster City， USA)並根據製造商的說明使用。以SDS2. 2. 2計算 機軟體(A卯lied Biosystems)，使用相對定量方法A ACt法計算基因表達。得到的循環 閾值(Ct)值被輸出到MS Excel (Microsoft, USA)進一步分析。簡要地，首先計算A Ct值 (艮P，靶基因的Ct值-GAPDH持家基因的Ct值)，接著使用下面的公式2—ACtX 106，確定相 對mRNA表達。
—般統計分析 通過平均數+/-SEM或標準差，和斯氏T檢驗(非配對)，或當適合時，兩因素方差 分析，來分析數據。低於5%的概率值被認為是顯著的。
結果 A)體外實驗證實了乳糖_枸杞的抗炎特性 乳糖-枸杞(LWB)溶液在體外抑制小鼠巨噬細胞系由LPS介導的促炎細胞因子 IL-6的釋放(圖1)和人腸上皮細胞中LPS-介導的NF- k B的活化(圖2)。
B)體內實驗證實了乳糖_枸杞抗炎和免疫增強效應
a.病理的急性炎症 具有LWB的膳食補充劑在急性腸炎小鼠模型中證實了強烈的抗炎特性。口服施 用1%的LWB獲得了體重減輕的改善(圖3)、宏觀的和組織學的病變(圖4和5)的改善， C0X-2和pSTAT3表達水平的顯著降低(圖6和圖7)。另外，與對照組相比，結腸內促炎基 因，例如TNFa 、IL-6和IL-1 P和蛋白質，例如KC的表達下降(圖8)。並行地，LWB i秀導了 結腸內抗氧化基因例如GPX-1， CAT1和S0D2的顯著增加(圖9)並增強了血漿中的抗氧化 防禦(圖10)。 b.生理的年齡相關的輕度炎症 相對於成年小鼠體內觀察到的水平，具有LWB膳食補充劑(飲用水中0. 5% )導致 了年老小鼠肝臟中炎症相關基因的表達下降(圖11 :編碼TNF-a的基因作為示例)。
c.年老小鼠體內的免疫增強效應
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具有LWB的膳食補充劑(飲用水中0. 5% )改善了年老小鼠體內體液(圖12)和 細胞介導的免疫應答(圖13)。
權利要求
包含枸杞或其一部分的初級組合物在製備治療和/或預防炎症的產品中的用途。
2. 根據權利要求l的用途，其中所述初級組合物進一步包含乳或含有乳蛋白的載體。
3. 根據權利要求l-2之一的用途，其中所述初級組合物和/或產品不包含不溶性纖維。
4. 根據權利要求l-3之一的用途，其中所述產品經設計用於經口、局部、經腸和/或胃 腸外施用；和/或其中該產品是膳食補充劑，用作或用於藥物的補充劑或用作或用於乳膏 的補充劑；和/或其中該產品設計用於由人或寵物使用和/或應用於人或寵物。
5. 根據權利要求l-4之一的用途，其中該產品設計用於食品中或作為食品用於人類消 費，例如作為營養完全配方食品、乳製品、冷藏的或耐貯藏飲料、用於哺乳母親的產品、液體 飲料、湯、膳食補充劑、膳食替代品、營養棒、甜食、乳或發酵乳產品、酸乳酪、奶粉、腸營養產 品、嬰兒配方奶粉、嬰兒營養產品、濃湯、穀類或發酵穀類產品、冰淇淋、糖果、甜點、餅乾、蛋 糕、巧克力、熱牛奶咖啡、咖啡、烹飪製品例如蛋黃醬、番茄醬、或沙拉醬、寵物食品或寵物飲
6. 根據權利要求l-5之一的用途，其中所述產品是片劑、膠囊劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、粉劑、凝膠劑、乳膏、乾燥口服補充劑、溼潤口服補充劑、沐浴露、牙膏、洗髮劑、 漱口水、唇膏、或個人衛生產品。
7. 根據權利要求1-6之一的用途，其中所述初級組合物包含枸杞親脂和/或親水生物 活性組分的至少一部分，其中所述親脂和/或親水生物活性組分優選選自脂質、生物鹼、蛋 白質、糖類、糖蛋白、類胡蘿蔔素、多酚化合物如黃酮類化合物、維生素、礦物質或其混合物。
8. 根據權利要求7的用途，其中所述糖蛋白選自阿拉伯半乳聚糖蛋白，尤其枸杞多糖 和能夠由P-葡糖基Yariv試劑檢測的大分子，或其混合物；和/或其中黃 >酮類化合物選自 黃酮例如5， 7， 4'-三羥黃酮，毛地黃黃酮，或香葉木素，黃酮醇例如櫟精，楊梅黃酮，4' ， 5， 7_三羥黃酮醇，黃烷酮，花色素例如花葵素，二甲翠雀素，或異黃酮例如染料木黃酮，大豆黃 素，或其混合物；和/或其中類胡蘿蔔素選自胡蘿蔔素和葉黃素例如，番茄紅素，胡蘿蔔素， 六氫番茄紅素，八氫番茄紅素，角黃素，P _隱黃素，辣椒紅，葉黃素，玉米黃素，或那些脂肪 酸酯的形式，或其混合物。
9. 根據權利要求l-8之一的用途，其中所述乳來自動物或植物來源，或其混合物；優選 地，乳是牛奶、駱駝奶、水牛奶、山羊奶、綿羊奶、植物乳，尤其是大豆乳或其混合物。
10. 根據權利要求l-9之一的用途，其中通過包括如下步驟的方法得到初級組合物i) 在乳或包含乳蛋白的液體介質中混合和碾磨枸杞材料，ii)任選分離不溶性纖維以獲得水 性懸浮液iii)任選巴氏滅菌獲得的懸浮液，iv)任選在加工過程中加入合成的或天然的生 物活性組分，v)和進一步任選乾燥該懸浮液以得到粉末。
11. 根據權利要求i-io之一的用途，其中炎症選自急性炎症例如膿毒症，感染，燒傷，和慢性炎症例如炎性腸病，克隆病，潰瘍性結腸炎，壞死性腸結腸炎，皮膚炎症，例如紫外線 或化學誘導的皮膚炎症，溼疹，反應性皮膚，銀屑病，白癜風，痤瘡，炎性腸病症候群，肝臟 炎症，酒精性肝硬化，變態反應，特異反應性，骨炎症，類風溼性關節炎，系統性紅斑狼瘡， Gougerot-Sjogren' s症候群，賴特爾症候群，脊髓灰質炎，皮肌炎，甲狀腺炎，巴澤多病，橋 本病，I型糖尿病，艾迪生病，自身免疫性肝炎，乳糜瀉，比爾默病，多發性硬化，肌無力，腦脊 髓炎，眼炎症，肥胖相關的炎症，年齡相關的輕度炎症，Blau' s症候群，阿爾茨海默氏病，心 血管疾病，動脈粥樣硬化，代謝症候群，牙齦炎和paronditis。
12. 根據權利要求1-11之一的用途，其中所述產品同時加強免疫系統、改善受損的免 疫應答、增強抗原特異性的體液免疫應答，和/或增強細胞介導的免疫應答。
13. 根據權利要求1-12之一的用途，其中所述產品設計由嬰兒、兒童、青少年、成年人 和/或老年人使用。
14. 根據權利要求1-13之一的用途，其中所述產品設計用於維持免疫功能和/或減輕 炎症狀態。
15. 根據權利要求l-14之一的用途，用於治療或預防氧化應激相關的疾病。
全文摘要
本發明總體上涉及炎症領域。本發明尤其涉及天然組合物在製備治療或預防炎症的產品中的用途。例如，枸杞提取物被證實具有抗炎特性。本發明的一種實施方式涉及包含枸杞或其一部分的初級組合物在製備治療或預防炎症的產品中的用途。
文檔編號A61P29/00GK101795699SQ200880106070
公開日2010年8月4日 申請日期2008年9月12日 優先權日2007年9月12日
發明者D·菲利普, K·維達爾, O·巴萊沃爾, P·比舍利, S·布蘭-斯佩裡森, 王軍寬 申請人:雀巢產品技術援助有限公司