二環cb2大麻鹼受體配體的製作方法
2023-09-12 11:33:45 1
專利名稱：二環cb2大麻鹼受體配體的製作方法
技術領域：
本發明涉及作為外周大麻鹼(cannabinoid)受體CB2配體的(+)α-蒎烯衍生物及其藥物組合物，可用於預防和治療自身免疫性疾病以及相關的紊亂、炎症、疼痛、肌肉痙攣、心血管紊亂、神經系統紊亂、神經退行性疾病、CNS中毒以及某些種類的癌症。
背景技術：
長期以來大麻製劑已經被認為是治療多種疾病的治療劑(Mechoulam，R.「作為治療劑的大麻鹼(Cannabinoids as TherapeuticAgents)」CRC Press，Boca Raton，Fla.，1-19，1986)。現今，天然的活性組分Δ9-四氫大麻鹼(Δ9-THC)以通用名Dronabinol由醫生開處方作為抗催吐劑並增強食慾，主要用於愛滋病人。然而，直到最近才實現臨床上不希望的影響精神的效果和治療上所希望的效果，諸如血管血壓過低和免疫調節之間的區別。兩種大麻鹼受體CB1和CB2的發現已經幫助闡明了大麻鹼不同的效果。
受體顯示出具有七個偶聯的跨膜結構G-蛋白，它們共有44％的胺基酸序列同源性，但是在組織特異性方面不同(Munro，S.，Thomas，K.L. Abu-Shaar，M.，Nature 36561-5，1993)。這兩種受體都通過對百日咳毒素-敏感的GTP-結合蛋白負調節腺苷醯基環化酶的活性來發揮它們的作用。在某些細胞類型中它們還表現出激活有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)(Parolaro，D.，Life Sci.65637-44，1999)。
CB1受體主要表達在CNS中，並且在其它組織中表達水平較低。主要在與大麻鹼對行為的作用相關的大腦區域，諸如海馬、扁桃體、腦皮層、基底神經節以及小腦中發現CB1受體的存在。此外，發現高濃度的CB1受體存在於調節傷害感受過程的區域中。CB2受體大多數表達在與免疫功能相關的外周組織中，包括巨噬細胞、B和T細胞以及外周神經末梢中以及肥大細胞上(Pertwee，R.G.，Prog.Neurobiol.63569-611，2001)。雖然已經充分地研究了由主要存在於CNS中的CB1介導的作用，但是由CB2介導的作用目前仍然在解釋中。
利用放射性標記的THC類似物，諸如[3H]CP-55940確定受體的神經解剖學分布(Elphick，M.R. Egertova，M.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.356381-408，2001)。人們發現最高濃度的大麻鹼結合位點，特異性CB1受體存在於在參與運動的腦區域基底神經節和小腦中。受體的一個亞群表達在脊神經後根神經節的外周末梢。有人認為大麻鹼的止痛作用在解剖學上比它們的運動作用更明顯的位置處介導。其它技術包含免疫組織化學、利用特異性轉錄本的原位雜交分析(Galiegue，S.等人，Eur.J.Biochem.23254-61，1995)以及基因敲除小鼠(Buckley，N.E.等，Eur.J.Pharmacol.396141-9，2000)已被用來幫助對受體表達圖譜與功能的理解。CB2受體不在大腦中表達，但是在免疫組織中尤為豐富，比CB1的表達水平高10-100倍。在脾臟和扁桃體中，CB2 mRNA的含量相當於中樞神經系統中CB1 mRNA的含量。在主要的人類血細胞亞群中，CB2 mRNA的分布圖顯示重要的變化，即在B細胞中比在自然殺傷細胞或者單核細胞中水平更高以及在多形核嗜中性細胞、T8細胞和T4細胞中水平較低。
CB1基因敲除小鼠在行為分析中已經顯示對大麻鹼無反應，從而提供了通過活化主要存在於CNS中的CB1受體來清楚解釋包含鎮靜、幻覺以及精神錯亂和抗傷害感受的影響精神作用的分子證據。對CB2基因敲除小鼠的分析證實了CB2受體在調節免疫系統中發揮功能的事實。對來自CB2基因敲除小鼠的脾、淋巴結和胸腺的細胞的FACS分析確定了CB2不影響免疫細胞的發育和分化，但是介導Δ9-THC的抑制作用。
由於CB2受體在免疫細胞和神經元的亞群中的限制性表達，所以選擇性CB2配體具有治療學價值(Pertwee，R.G.Curr.Med.Chem.6635-64，1999)。特別重要的是那些對CB2受體具有高親合性和高特異性的化合物。這些化合物可以賦予CB2激動劑(agonism)的優點同時避免了在對CB1受體具有親合性的化合物中發現的不良副作用。這種化合物可以有效治療自身免疫疾病，包括但不限於多發性硬化、類風溼性關節炎、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、I型糖尿病、肝炎、炎性腸病或者過敏性腸症候群、牛皮癬的自身免疫性疾病及其他免疫相關的紊亂，包括但不限於器官移植中的組織排斥、吸收不良症候群諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘和Sjgren氏綜合症。
大麻鹼受體的發現以及最近對能夠激活CB受體的內源性配體內源性大麻鹼(endocannabinoid)的鑑定已經使我們理解了由大麻鹼和相關化合物賦予的許多作用。除某些大麻鹼激動劑有總的神經保護作用外，還可以發現更具體的應用。因此，除了通過對由免疫細胞表達的CB2受體的作用進行免疫調節而可能緩和疾病以外，例如由內源性大麻鹼系統提供的對痙攣緊張性控制的證據暗示大麻鹼激動劑可以輔助對肌肉痙攣以及多發性硬化中震顫的治療(Baker D.等人，FASEB J.15300-2，2001)。大麻鹼激動劑也被證明有助於治療癌症以及HIV/AIDS患者的肌肉痙攣(Hall W.D.，Degenhardt L.J. Currow D.Med.J.Aust.17539-40，2001)以及神經性肌肉失調。
CB1受體的活化除了鎮靜以及不希望的影響精神的作用以外，在治療疼痛以及炎症的治療中具有治療效果。大麻鹼不僅通過對傷害應答的神經元的作用抑制急性疼痛而且還調節持續的疼痛以及炎症誘導的行為超敏反應。除了大麻鹼的主要作用外，它們也抑制損傷部位的疼痛，並且有趣的是大麻鹼在周圍神經中的抗炎以及抗痛覺過敏作用也可以涉及CB2受體介導的活性。選擇性激活CB2受體的化合物有可能作為免疫調節劑並且為自身免疫性疾病以及相關紊亂提供治療方法。另外，已經證明選擇性CB2受體激動劑可用於治療炎症和疼痛，心肌缺血以及某些類型的癌症。THC，以及迄今為止鑑定的兩種主要的內源配體，花生四烯醯乙醇醯胺(arachidonoylethanolamide)(anandamide或者AEA)(Devane，W.A.等人，Science 2581946-9，1992)以及2-花生四烯醯甘油(arachidonylglycerol)(2-AG)(Sugiura，T.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.21589-97，1995)通過結合到這兩種大麻鹼受體發揮它們大部分的作用。
幾個合成的化合物已經顯示出對CB2受體的結合比對CB1受體具有更高的親合性(Pertwee，R.G.，Expert Opin.Investig.Drugs 91553-71，2000)。大麻鹼受體激動劑包括四個主要的化合物組。典型的大麻鹼保持了THC的二苯並吡喃環系，而非典型的大麻鹼包括缺乏吡喃環的二環或者三環類似物。氨基烷基吲哚以及類似物組成第三族，而包含anandamide及其它脂肪酸衍生物的內源性大麻鹼組成第四族。例如，L-759656是典型的大麻鹼類似物，而HU-308是二環類似物。兩者都具有300-400的CB2/CB1結合親合性比值，並且兩者都已經在功能分析中表現出有效和特異的CB2激動劑(Hanus，L.等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 9614228-33，1999；Ross，R.A.等，Br.J.Pharmacol.126665-72，1999)。
將CB2受體的活化與治療學特性聯繫起來的證據是多方面的。大麻鹼特異性地通過活化CB2參與心臟保護，抗缺血以及包含心律不齊的再灌注作用最近在PCT專利申請WO 01/28588中以及被Krylatov等人(Krylatov A.V.等，Bull.Exp.Biol.Med.131523-5，2001)描述，其公開內容在此處引入作為參考。大麻鹼由於能夠誘導各種類型的腫瘤，包含動物模型的肺腺癌，神經膠質瘤，甲狀腺上皮瘤以及皮膚非黑色素瘤的退化，可能是潛在的抗腫瘤劑。某些腫瘤，特別是神經膠質瘤表達CB2受體。Guzman等人(Galve-Roperh，I.等人，Nat.Med.6313-9，2000；Guzman，M.，Sanchez，C.，Galve-Roperh，I.，J.Mol.Med.78613-25，2001)已經證實THC以及WIN55212-2誘導動物體內惡性腦腫瘤的退化或者根除，前者THC是天然的配體，而後者WIN55212-2為合成的大麻鹼。大鼠神經膠質瘤C6細胞系表達CB2並且根據用選擇性CB拮抗劑的研究，已經有人認為任何一種受體的活化都可以引起細胞程序性死亡。
內源性大麻鹼系統在免疫抑制中的作用是許多研究的焦點(Berdyshev，E.V.Chem.Phys.Lipids 108169-90，2000)。Anandamide(AEA)，棕櫚醯乙醇醯胺(PEA)以及2-AG顯示出下調多種實驗系統中的免疫應答並且用作抗炎藥和免疫抑制劑。
THC因其止痛特性而眾所周知。兩種主要的內源性配體，AEA和2-AG已經顯示出起止痛劑的作用，並且可以通過結合到兩種大麻鹼受體而發揮它們的作用(Calignano，A.等，Nature 394277-81，1998)。因此CB2受體或者假定的CB2樣受體的激動劑可用作外周、內臟、神經性、炎症以及關聯痛的抑制劑。此外，CB2受體配體可以是防止CNS中毒。
美國專利4,208,351公開了在製備典型的三環大麻鹼立體結構選擇性過程中作為中間體的任選的旋光活性二環化合物。然而，沒有將治療活性歸因於中間體，也沒有提到這種化合物結合大麻鹼受體的能力，因此就沒有預想到包括這種化合物的藥物組合物。
美國專利4,282,248公開了蒎烯衍生物的兩種同分異構體的混合物以及單獨的異構體。包含止痛、中樞神經系統抑制、鎮靜以及鎮定活性的治療活性歸因於所述化合物，但是該公開內容沒有教導所述化合物會結合任何大麻鹼受體。
美國專利5,434,295公開了一族新的4-苯基蒎烯衍生物，並且教導如何將所述化合物利用在用於治療與中樞神經系統損害相關的各種病理學症狀的藥物組合物中。這個公開內容既沒有教導也沒有暗示任何這些衍生物對於外周大麻鹼受體是選擇性的。國際專利申請WO01/32169公開了一族二環化合物，包含作為CB2特異性激動劑的HU-308，並且舉例說明了它們在治療疼痛和炎症、自身免疫性疾病、胃腸機能紊亂以及作為降血壓劑中的應用。
美國專利6,013,648公開了作為CB2特異性激動劑並且可能用於製備免疫調節藥物的吲哚衍生物。國際性專利申請WO 01/28497公開了對CB2受體顯示出高親合性的新的二環大麻鹼類似物。對專業技術人員而言，顯而易見的是當參考在本申請中採用的命名法時，上述專利中的化合物為立體化學取向，其中C-1、C-4和C-5為R。然而，還沒有合成相應的(+)α-蒎烯衍生物，並且它們的治療活性是未知的。
很清楚本發明明確地排除了已知的化合物，包括那些公開在美國專利4,208,351，4,282,248和5,434,295和國際專利申請WO 01/32169中的化合物；雖然這些化合物的某些新特性同樣要求了保護的權利。
發明概述本發明的一個目的是提供新的α-蒎烯衍生物及其組合物。尤其是，優選的化合物顯示對外周大麻鹼受體CB2的特異性結合親合性，因此本發明提供了包括特異性治療用CB2結合配體的治療方法。這個方法涉及適當配製的藥物組合物的應用。本發明的另一目的是提供能夠體內發揮它們的CB2受體-特異性作用的CB2結合配體。本發明進一步提供了通過給需要的個體施用包含作為活性成分的治療有效量的CB2特異性配體的藥物組合物以預防和治療疾病的方法。
根據本發明的第一個實施方案，我們公開了下列通式(I)的化合物及其藥用鹽、酯或者溶劑化物
式I 式I具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中R1選自(a)O或者S，(b)(R′)2，其中每次出現的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，並且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)滷素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基，以及每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現的R如前所定義，(b)飽和或者不飽、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義被進一步取代；附帶條件是當R1為O並且R2和R3為OH時，那麼R4不是直鏈或者支鏈的C5-C10烷基、C5-C10烯基、C5-C8環烷基以及C5-C8環烯基。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開通式(I)的化合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，並且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附帶條件如對式(I)的定義。
據本發明的另一實施方案，我們公開下列通式(II)的化合物及其藥用鹽、酯或溶劑化物
式II 式II具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式，並且C-2------C-3為任選的雙鍵；並且其中R5選自(a)滷素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫或飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現的R″如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自
(a)滷素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基，而且每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；並且R4選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2，SR，和C(S)R，其中每次出現的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那麼R4不是直鏈或者支鏈的C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選末端碳由苯基取代，以及直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開通式(II)的化合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，並且在C-2和C-3之間有一個任選的雙鍵，附帶條件如對式(II)的限定。
根據本發明的另一優選的實施方案，我們公開通式(I)的CB2結合化合物式I 式I具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中R1-R4取代基如上所定義。
根據本發明一可選擇的優選實施方案，我們公開通式(II)的CB2結合化合物式II 式II具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式，以及C-2------C-3為任選的雙鍵；並且其中取代基R2-R5如對式(II)的限定以及其中所限定的附帶條件。
本發明還包括含有作為活性成分的式(III)的化合物或其藥用鹽、酯或溶劑化物的藥物組合物
式(III) 式III具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中R1選自(a)O或者S，(b)C(R′)2，其中每次出現的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫，或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，並且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)滷素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈的或者環狀的C1-C6烷基，以及每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現的R如前所定義，(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義進一步取代。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開包含作為活性成分的通式(III)的化合物的藥物組合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，並且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
本發明還包括含有作為活性成分的式(II)化合物或其藥用鹽、酯或溶劑化物的藥物組合物式II
式II具有特異性立體化學結構其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式，並且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中R5選自(a)滷素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫，或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR」以及C1-C6烷基-N(R」)2，其中每次出現的R」如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)-Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)滷素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-鏈，
其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基，而且每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；以及R4選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR，和C(S)R，其中每次出現的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那麼R4不是直鏈或者支鏈的C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選末端碳由苯基取代，並且直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開包含作為活性成分的通式(II)的化合物的藥物組合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，並且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
除了傳統活性成分以外，新的組合物可以包含生產生理學可接受和穩定製劑所必需的藥用載體、稀釋劑以及賦形劑。
藥物組合物可以通過任一傳統並且合適的路徑進行給藥，包括口服、胃腸外、靜脈內、肌內、損傷內、皮下、透過皮膚、鞘內、直腸或者鼻內給藥。
本發明的另一方面提供了通過刺激CB2受體治療病人的方法，所述方法包括給所述病人施用包含治療有效量的本發明通式(II)和(III)化合物的藥物組合物。
因此，本發明提供了給需要治療的個體施用治療有效量的通式(II)和(III)化合物的方法，用於免疫調節和對CB2受體調節敏感的症狀。所述症狀包括但不限於自身免疫疾病，包括類風溼性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、I型糖尿病、肝炎和牛皮癬；以及免疫相關疾病，包括但不限於器官移植中的組織排斥、吸收不良症候群諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合症，包含炎性腸病的炎症，包含外周、內臟、神經性、炎性以及關聯痛的疼痛，肌肉痙攣，、包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發性頭痛的神經系統紊亂，包含帕金森氏症、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化、亨廷頓氏舞蹈症、朊病毒相關神經退行性病變的神經退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌症。
本發明包括通式(II)和III的化合物在製備用於治療和預防自身免疫性疾病的藥物中的應用，所述自身免疫性疾病包括但不限於如說明書中所示的風溼性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬和免疫相關的紊亂，包括但不限於器官移植中的組織排斥、吸收不良症候群諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合症，包含炎性腸病的炎症，包含外周、內臟、神經性、炎性以及關聯痛的疼痛，肌肉痙攣，包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發性頭痛的神經系統紊亂，包含帕金森氏症、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化、亨廷頓氏舞蹈症、朊病毒相關神經退行性病變的神經退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌症。
雖然本發明的化合物和組合物具體目的是用作外周大麻鹼受體CB2的配體，但是不管是否通過CB2受體介導它們可能同時具有被稱作「非典型大麻鹼」類別的化合物的其它所希望的治療特徵。因此通式(I)到(III)的化合物和組合物除了它們的免疫調節活性以外還具有神經保護特性。
如下舉例所示，現在我們已經發現已知的CB2特異性激動劑HU-308，其化學名全稱為(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇，也以(+)4-[2，6-二甲氧基-4-(1，1-二甲基庚基)苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇公開在WO 01/32169中，其不僅在治療外周疼痛而且在治療神經性疼痛中有效。而且，現在我們已經發現HU-308在治療和預防帕金森氏症中尤其有效。
為了幫助理解本發明尤其是在實施例中給出的數據，給出下列附圖圖1顯示選定的二環化合物結合到CB1和CB2人類大麻鹼受體。
圖2顯示選定的二環化合物對活化的巨噬細胞分泌作用的影響。試驗組A顯示單劑量對IL-1β分泌作用的影響。試驗組B顯示各種劑量對PGE2分泌作用的影響。
圖3顯示了各種劑量的本發明化合物對激活的T細胞的IL-2分泌作用的影響。
圖4顯示了各種劑量的本發明化合物在多發性硬化的EAE模型中的作用。
圖5顯示了各種劑量的已知CB2激動劑HU-308以及本發明的化合物在過敏或者其它免疫反應的DTH模型中的作用。
圖6顯示了已知的CB2激動劑HU-308在帕金森氏症的MPTP模型中的作用。
圖7顯示了兩種劑量的本發明化合物在慢性神經性疼痛的收縮神經損傷模型中的作用。
圖8顯示了各種劑量的本發明化合物在急性外周疼痛的Tail Flick模型中的作用。試驗組A給出處理後30分鐘獲得的結果，試驗組B是處理後90分鐘獲得的結果。
圖9顯示了與介質和嗎啡相比，單劑量的本發明化合物在5.5小時的時間內在急性外周疼痛的Tail Flick模型中的作用。試驗組A給出的結果是潛伏時間，而試驗組B給出的結果是顯示潛伏時間比介質處理的動物高兩倍的處理組中動物的百分比。
圖10顯示本發明的化合物與嗎啡相比對Tail Flick模型中測定的耐受性發展的影響。試驗組A顯示的結果是潛伏時間，而試驗組B顯示的結果以疼痛消失的動物的百分比表示。
發明詳述本發明提供了屬於非典型大麻鹼的新化合物，含有這些化合物的藥物組合物以及使用這種化合物和組合物的方法。這種類型的化合物顯示了對大麻鹼受體的親合性。本發明優選的新化合物顯示了對外周人類大麻鹼受體CB2的親合性。本發明的組合物已經顯示出具有免疫調節、抗炎、止痛、神經保護以及某些抗腫瘤的特性。一些化合物的作用可以引起參與免疫調節和炎症的基因的轉錄調節或者參與這種過程的信號轉導組分的調節。
大麻鹼被認為是主要通過受體介導的機制發揮它們的生理學作用，但是已經報導了非受體介導的活性(Felder C.C.等，Mol.Pharmacol.42838-45，1992)。而且，發展的藥理學證據顯示除了迄今為止發現的CB1和CB2以外還存在其它種類的大麻鹼受體(Howlett A.C.等人，Pharmacol.Review 54161-202，2002)。因此，雖然本發明化合物最可能的作用機制是通過它們選擇性結合到CB2受體並且與特異性信號轉導途徑功能性偶聯得以實現，但是我們不能排除其它的機理，例如通過結合到其它尚未鑑定的大麻鹼受體或者通過非受體介導的途徑或者這些機制的組合。
在本發明的說明書中，術語「前體藥物」表示在體內例如通過在血液中的水解迅速轉化成式(I)到(III)的母體化合物的化合物。一些式(I)到(III)的化合物能夠進一步形式藥用鹽和酯。「藥用鹽和酯」是指可以藥用並且具有期望的藥理學特性的任一鹽和酯。這種鹽包含可能來源於包含胺基酸的無機或者有機酸或者無機或者有機鹼的鹽，所述酸或鹼在任何情況下都沒有毒性或者符合要求。本發明同樣在其範圍內包含式(I)到(III)的化合物的溶劑化物及其鹽，例如水合物。所有這些藥物形式都將包含在本發明的範圍內。
在本發明的說明書和權利要求中使用的「預防有效的」是用來限定化合物的量以實現預防、降低或者根除紊亂發生的風險同時避免不良副作用。術語「治療有效」是用來限定所需的化合物的量，從而一旦紊亂不能進一步延緩以及病人不再無徵狀，將實現減輕、減少紊亂的發展或者治療紊亂而同時沒有副作用的目的。本發明的組合物為預防性的和治療性的。
為了治療目的的「個體」或者「病人」包含受到對所述治療具有有效治療效果的任一疾病感染的所有人類或者哺乳動物受試對象。
基於它們的抗炎和免疫調節特性，應該認識到本發明的組合物可用於治療具有涉及它們的病源學或者發病機理的炎性或者自身免疫機制的症狀，所述症狀的例子為包含類風溼性關節炎、關節炎的關節炎，多發性硬化，全身性紅斑狼瘡(SLE)，重症肌無力，I型糖尿病，肝炎和牛皮癬，免疫相關的紊亂包含但不限於器官移植中的組織排斥，吸收不良症候群諸如脂瀉病，肺疾病諸如哮喘和Sjgren氏綜合症，炎性腸病以及風溼性疾病。
雖然本發明的化合物和組合物是指CB2配體，但是它們共有這類非典型大麻鹼的其它特性，包含神經保護的特性(美國專利5,434,295)。由於它們的神經保護特性，應該認識到根據本發明的組合物將用於治療包含但不限於中風、偏頭痛和叢發性頭痛的神經系統紊亂。本發明的組合物也可有效治療某些慢性退行性疾病，所述退行性疾病的特徵在於逐漸的選擇性神經元喪失。在這一點上，預計本發明的組合物預計在治療帕金森氏症、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化、亨廷頓氏舞蹈病和朊病毒相關的神經退行性變中是治療有效的。由CB2激動劑賦予的神經保護還可以有效預防和/或治療神經毒劑，諸如神經毒氣，以及其它由化學或者生物製劑引起的大腦或者神經組織的損害。
由於它們的止痛的特性，應該認識到本發明的組合物將用於治療包含外周、內臟、神經性、炎性和關聯痛的疼痛。本發明的組合物也可有效保護心臟預防心律不齊、高血壓和心肌缺血。本發明的組合物也可有效治療肌肉痙攣和顫動。
本發明的另一特徵是公開的化合物能夠預防或者治療某些癌症，包含惡性腦腫瘤、皮膚腫瘤、肺腺癌、神經膠質瘤、甲狀腺上皮瘤，其中CB2結合配體可以引發腫瘤細胞的細胞程序性死亡以及抑制腫瘤的血管生成。
而且，我們已經發現一些優選的CB2結合化合物也可通過調節參與免疫調節和炎症的基因的轉錄發揮作用。
此外，我們現在公開被發現有效治療外周疼痛的已知的CB2特異性激動劑HU-308出乎意料地也可以有效治療神經性疼痛，正如通過齧齒動物模型中坐骨神經的慢性收縮所評定的。
另外，同樣發現HU-308顯著降低了用神經毒素MPTP處理的小鼠黑質中產生的細胞死亡的程度。這就提示這種化合物在治療帕金森氏症中可以證實特別有效。
顯示出對CB2受體具有高親合性和特異性的二環化合物已經由Makriyannis及合作者公開在國際專利申請WO 01/28497中。本領域技術人員會辨別出在此公開內容中公開的化合物與本發明的化合物具有相反的立體化學結構，因為如此公開物內容式I和II所示，四元環的二甲基位於萜烯環平面的下方而芳基位於這個平面的上方。根據本發明中採用的命名法，Makriyannis的化合物為立體化學取向，其中C-1、C-4和C-5為R。
通常，已經可以在功能上區分大麻鹼和大麻鹼相關化合物的R和S對映異構體。化合物HU-210和HU-211舉例說明了這種情況。HU-210為合成的大麻鹼7-羥基-Δ6-四氫大麻鹼-1，1-二甲基-庚基的(-)(3R，4R)對映異構體。HU-211為此化合物的(+)(3S，4S)對映異構體。與HU-210相反，HU-211顯示出對大麻鹼受體較低的親合性，因此不能治療精神性疾病。另外，HU-211作為非競爭性的NMDA-受體激動劑和神經保護劑發揮作用，HU-210缺乏這兩種特性(美國專利5,284,867)。
本發明的發明者意想不到地發現與公開在WO 01/28497中的化合物相反的立體化學對映異構體是有效的CB2受體配體。本發明的公開內容教導(+)α-蒎烯的新衍生物，如式(I)到(III)所示，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式。本發明的優選化合物與它們已知對映異構體相比不僅對CB2具有更高的親合性和更好的選擇性而且通過試驗結果證實在體內更有效。關於這一點，應該注意到對公開在WO 01/28497中的對映異構體而言，發明者只測試了它們的結合活性而沒有在體外和體內測試其它生物活性。
而且，本發明涉及這些新CB2配體在製備預防或者治療自身免疫性疾病和相關紊亂、炎症、疼痛、肌肉痙攣、心血管紊亂、神經系統紊亂、神經退行性疾病、CNS中毒和某些類型的癌症的化合物中的應用。
在本發明中，我們將參考環狀結構中下列位置的編碼，其中位置1，4和5為手性中心。本發明公開的化合物的立體化學如式(IV)所示，其中C-5為S、C-1和C-5位置的質子彼此間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式
式IV 本發明中，結合親合性由IC50值表示，也就是測試化合物置換來自CB受體的50％放射性標記的激動劑的濃度。優選的化合物顯示出對CB2結合的IC50值為50nM或者更低，優選地30nM或者更低，更優選地10nM或者更低，最優選地1nM或者更低。「CB2特異性或者選擇性的」表示化合物具有的CB2/CB1結合親合性比值至少10，優選地20，更優選地50並且最優選地100或者更高。優選地，可以獲得人類CB1和CB2受體的這些比值。對CB2的選擇性表示為CB2/CB1親合性，通過如下方式進行計算用測試化合物置換CB1特異性放射性配體獲得的IC50值除以測試化合物置換CB2特異性放射性配體獲得的IC50值，即IC50CB1/IC50CB2。一些本發明優選的化合物不必共有這兩種特性，換句話說，一些化合物對CB2的IC50具有1nM或者更低但是比例僅僅為約30。
貫穿本說明書，本發明的某些化合物可能通過大寫字母而不是通過它們完整的化學名稱給出。烷基取代基可以為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀，只有當烷基鏈中碳原子的數目大於或等於3時才是後者的情況。OC(O)R代表酯，OC(O)NR為氨基甲酸酯，OC(S)R為硫酯，NR2為胺，NRC(O)R為醯胺，NRC(O)NR為尿素，NRC(S)R為硫代醯胺，SR為硫醇或者硫化物，S(O)R為亞碸，SC(O)R為硫酯，SC(O)NR為硫代氨基甲酸酯，SC(S)R為二硫酯，S(O)(O)R為碸，S(O)(O)OR為磺酸酯，S(O)(O)NR為磺醯胺，S(O)(O)NC(O)R為醯基磺醯胺，S(O)(O)NC(O)NR為硫脲，當R為氫或者烷基鏈時S(O)(O)NC(S)R為硫代醯基磺醯胺。
本發明涉及通式(I)的化合物式I 式I具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中取代基R1-R4為式(I)所限定以及其中限定的附帶條件。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開通式(I)的化合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2以及R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，並且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附帶條件如對式(I)的限定。
根據其它目前優選的實施方案，我們現在公開通式(I)的化合物，其中R1是O，R2和R3為OCH3，而R4為1，1二甲基-庚基；R1為N-OH，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基；R1為O，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-3-苯基-丙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1-甲基-1-對氯苯基-乙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-5-溴-戊基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-5-氰基-戊基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為琥珀酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基；R1為O，R2為OH，R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為H，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為CH2，R2和R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為二乙基磷酸酯，以及R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為CH2，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；以及R1為O，R2為延胡索酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基。
本發明也涉及通式(II)的化合物式II 式II具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式，以及C-2------C-3為任選的雙鍵；並且其中取代基R2-R5如對式(II)的限定以及其中所限定的附帶條件。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開通式(II)的化合物，其中R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，並且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
根據其它目前優選的實施方案，我們現在公開通式(II)的化合物，其中R5是OH，R2和R3為OH，R4為1，1二甲基-庚基，並且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基，並且在C-2和C-3之間具有一個雙鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-乙基-苯基，並且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；R5為OH，R2和R3為H，R4為1，1-二甲基-庚基，並且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，並且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；R5為OH，R2和R3為二乙基磷酸酯，R4為1，1-二甲基-庚基並且在C-2和C-3之間具有一單鍵。
本發明進一步涉及通式(I)的CB2結合化合物式I 式I具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中取代基R1-R4為對式(I)的定義。
本發明進一步涉及通式(II)的CB2結合化合物
式II 式II具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式，並且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中取代基R2-R5為對式(II)的限定以及其中所限定的附帶條件。
本發明涉及為了上述目的的藥物組合物，包括作為活性成分的通式(III)的化合物式III 式III具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中取代基R1-R4為對式(III)的定義。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開包括作為活性成分的通式(III)化合物的藥物組合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，並且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
根據目前其它優選的實施方案，我們現在公開包括作為活性成分的通式(III)化合物的藥物組合物，其中R1是O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為N-OH，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-3-苯基-丙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1，3-三甲基-丁基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1-甲基-1-對氯苯基-乙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1-乙基-1-甲基-丙基；R1為O，R2和R3為OH，以及R4為1，1-二甲基-5-溴-戊基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-5-氰基-戊基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為琥珀酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基；R1為O，R2為OH，R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為H，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為CH2，R2和R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為二乙基磷酸酯以及R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊-4-烯基；R1為CH2，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；以及R1為O，R2為延胡索酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基。
本發明進一步涉及用於上述目的的藥物組合物，包括作為活性成分的通式(II)的化合物式II
式II具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式，並且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中取代基R2-R5為式(II)的限定以及其中限定的附帶條件。
根據目前優選的實施方案，我們現在公開包括作為活性成分的通式(II)化合物的藥物組合物，其中R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基，或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，並且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
根據其它目前優選的實施方案，我們現在公開包括作為活性成分的通式(II)化合物的藥物組合物，其中R5是OH，R2和R3為OH，R4為1，1二甲基-庚基，並且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基並且在C-2和C-3之間具有一個雙鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-乙基-苯基，並且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；R5為OH，R2和R3為H，R4為1，1-二甲基-庚基，並且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，並且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；以及R5為OH，R2和R3為二乙基磷酸酯，R4為1，1-二甲基-庚基並且在C-2和C-3之間具有一單鍵。
本發明的新的非典型大麻鹼最優選地有效結合CB2受體，但是較弱地結合CB1受體，後者除了有效的治療作用外已知具有介導CNS中精神調理活性。
本發明進一步涉及利用本發明組合物在預防和治療如下疾病中的新的治療方法自身免疫疾病，包括類風溼性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、I型糖尿病、肝炎和牛皮癬，以及免疫相關的紊亂，包括但不限於器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合症諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合症，包含炎性腸病的炎症、包含外周、內臟、神經性、炎性以及關聯痛的疼痛，肌肉痙攣，包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發性頭痛的神經系統紊亂，包含帕金森氏症、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化、亨廷頓氏舞蹈症、朊病毒相關神經退行性病變的神經退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌。
新的組合物除了活性成分以外可以包含傳統上對製備生理學上可接受和穩定製劑所必需的藥用載體、稀釋劑以及賦形劑。對於具有溶解性問題的化合物而言，本發明的一些化合物在特徵上是疏水的，並且具有較強的親油性，事實上不溶於水，具有表示為它們較高的辛醇/水分配係數和logP值，所以應該採用製備可接受劑型的製劑策略。能夠使本發明的化合物治療有效並且方便給藥是本發明不可分割的一部分。
對於水溶性化合物，將採用標準製劑。可以通過將活性成分與作為藥用稀釋劑的傳統藥用成分，諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、環糊精、葡聚糖、甘油、polyglycolized甘油酯、tocopheryl聚乙二醇琥珀酸酯、十二烷基硫酸鈉、聚乙氧基化蓖麻油、非離子表面活性劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣和樹膠混合，製備用於口服給藥的固體組合物，諸如藥片、藥丸、膠囊、軟膠囊等。藥片或者藥丸可以包被或與本領域已知的藥用材料混合，諸如微晶纖維素和纖維素衍生物，諸如羥丙基甲基纖維素(HPMC)，以提供能夠延長作用或者持續釋放的劑型。其它固體組合物可以製備成用於直腸給藥的栓劑。可以製備用於口服或者注射的液體形式，所述給藥方式包含但不限於皮下、透皮、靜脈內、鞘內、損傷內、接近或者進入腫瘤及其它腸胃外給藥途徑。液體組合物包含水溶液，存在或者不存在有機助溶劑，水或者油懸浮液，包含但不限於作為懸浮劑的環糊精，帶有食用油的加香乳劑，甘油三酸脂和磷脂以及酏劑和類似的藥用介質。另外，本發明的組合物可以製成用於鼻內等給藥的氣霧劑形式。本發明的局部藥物組合物可以與包含但不限於丙二醇、磷脂、甘油單酸酯、甘油二酯、甘油三酯、聚山梨酸酯、表面活性劑、水凝膠、礦脂或者其它本領域已知的賦形劑的藥用賦形劑配製成溶液、洗液、凝膠、乳油、油膏、乳劑或者粘著膜。
在它們用作藥劑之前，藥物組合物通常配製成單位劑量。用於人類的活性劑量一般在每公斤體重0.05mg到約50mg的範圍內，給藥方案為每天1-4次。優選的的劑量範圍是每kg體重從0.1mg到約20mg。然而，對本領域技術人員而言，顯而易見的是劑量將由主治醫師根據待治療的疾病、給藥方法、病人的年齡、體重、禁忌症等進行確定。
參考下列的實施例將更全面的理解本發明的原理，所述實施例應以非限制性的方式解釋。
實施例合成實施例合成化合物A(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
流程圖1中描述了化合物A的合成，其中苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-庚基。
流程圖1 化合物AR＝1，1-二甲基-庚基化合物LR＝1，1-二甲基-戊基在-78℃的氮氣氣氛下，向含有正丁基鋰(196ml，2M)和44g叔丁醇鉀的3-頸瓶中逐滴添加50ml的(+)-α-蒎烯(1)。將反應物溫熱到室溫並連續攪拌48小時。然後將反應物冷卻到-78℃。添加硼酸三甲酯(113ml)的80ml醚溶液，然後將反應物溫熱到室溫並且再攪拌1小時。分離有機層，並用正己烷(3×80ml)萃取水層。用鹽水洗滌混合的有機相，並經無水硫酸鈉乾燥，過濾並蒸乾獲得化合物(2)％(+)-β-蒎烯。該流程根據Brown等人的方法進行(Brown H.C.等人，J.Org.Chem.541764-6，1989)。向(+)-β-蒎烯(2)(30.8g)中添加RuCl3(0.470g)，以及溶於250ml乙酸乙酯的苄基三丁基氯化銨(2.12g)。向這種混合物中逐滴添加高碘酸鈉(145.5g)的1.3L水溶液，在室溫下攪拌3小時並保存過夜。向反應混合物中添加250ml的乙酸乙酯。分離有機相，用500ml的鹽水、500ml的10％亞硫酸鈉洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾、減壓蒸發後獲得化合物(3)(-)-諾蒎酮。該流程根據Yuasa等人的方法進行(Yuasa Y.等人，J.Essent.Oil.Res.1039-42，1998)。將(-)-諾蒎酮(3)(14.86g)和對甲苯磺酸(1.48g)溶於異戊烯基乙酸酯(148ml)中。利用Dean-Stark裝置回流加熱反應混合物5小時以除去丙酮。減壓除去溶劑，將殘餘物轉移到400ml醚中，用水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發以獲得化合物(4)(+)諾蒎酮烯醇乙酸酯。這個流程基於由Archer等人對相反對映異構體所開發的方法進行(Archer R.A.等人，J.Org.Chem.422277-84，1977)。向16.17g(+)-諾蒎酮烯醇乙酸酯(4)的202ml無水甲苯溶液中添加62.2g的Pb(OAc)4(之前在真空中經P2O5/KOH乾燥過夜)。反應混合物在80℃受熱3.5小時，冷卻，過濾，用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層，經無水硫酸鈉乾燥並在減壓下蒸發以產生(+)-6，6-二甲基-2，4-二乙酸基-2-norpinene(5)和(-)-6，6-二甲基-2，2-二乙酸基-3-norpinene(6)。5和6(1.18g，5mmol)，R為1，1-二甲基庚基(7)(1.18g，5mmol)的間苯二酚和對甲苯磺酸(0.95g，5mmol)的氯仿(50ml)的混合物在室溫下反應4小時。然後添加乙醚(30ml)，用飽和碳酸氫鈉、水洗滌有機相，然後經無水硫酸鈉乾燥、過濾並蒸發。殘餘物在乙腈中結晶後提供0.5g的晶體。母液經矽膠進行層析分離，另獲得0.7g的純化合物A。
合成化合物L(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
流程圖1中描述了化合物L的合成，其中間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-戊基。如合成化合物A所述製備化合物1到6。
合成化合物B(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物B的合成描述在流程圖2中。
向化合物A(115mg，0.3mmol)的DMF(5ml)的溶液中添加碳酸鉀(0.5g，3.6mmol)並攪拌混合物10分鐘。然後添加碘代甲烷(0.15ml，24mmol)並在室溫下攪拌混合物過夜。向反應混合物中添加水並用EtOAc萃取。有機相用水洗滌兩次，經無水硫酸鈉乾燥並蒸發。殘餘物經反相C-18柱利用10％水的乙腈溶液作為洗脫液進行層析分離以獲得98mg的化合物B。
流程圖2.
合成化合物C(-)-5-(1，1-二甲基-庚基)-2-(4-羥基-6，6-二甲基二環[3.1.1]庚-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物C的合成描述在流程圖3中。
將溶於10ml甲醇的100mg的化合物A冷卻到0℃。逐步添加硼氫化鈉(200mg)並攪拌反應混合物4小時。將混合物倒入50ml的5％HCl中，用乙酸乙酯(2×30ml)萃取，經Na2SO4乾燥，過濾並蒸發以產生白色粉末形式的90mg的化合物C。
流程圖3 合成化合物D4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮肟。
化合物D的合成描述在流程圖4中。
將鹽酸羥胺(37.3mg)溶於5ml水中並將溶液冷卻到0℃。緩慢添加氫氧化鉀(30mg)的1ml水溶液中。添加化合物A(372.5mg)繼之以添加甲醇以溶解所有的組分。攪拌3小時後，觀察不到起始物質。然後添加水並用乙酸乙酯萃取溶液，經Na2SO4乾燥、過濾並蒸發以提供380mg的化合物D。
流程圖4
合成化合物E(+)-5-(1，1-二甲基-庚-6-炔基)-2-(4，6，6-三甲基-二環[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物E的合成描述在流程圖5中，其中間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-庚-6-炔基。
流程圖5 (+)馬鞭草烯醇 3-間苯二酚化合物ER＝1，1-二甲基-庚-6-炔基化合物KR＝1，1-二甲基-戊基化合物QR＝1，1-二甲基-乙基-苯基反應在無水條件下進行。(+)馬鞭草烯醇(0.505，3.3mmol)，3-(1，1-二甲基庚-6-炔基)間苯二酚(0.77g，3.3mmol)和催化量的無水對甲苯磺酸鈉的無水氯仿(10ml)的混合物在0℃攪拌1小時。將混合物倒入碳酸氫鈉(50ml)的水溶液上並用氯仿(3×30ml)萃取水相。然後用水(3×30ml)和鹽水(3×100ml)洗滌混合的有機層。有機層經Na2SO4乾燥、過濾並蒸發。這樣獲得的粗物質通過矽膠上的快速層析利用5％乙醚/石油醚作為洗脫液進行純化以獲得1.034g的化合物E。
化合物Q的合成5-(1，1-二甲基-乙基-苯基)-2-(4，6，6-三甲基-二環[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
流程圖5中描述了化合物Q的合成，其中間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-乙基-苯基。
如對化合物14所述利用苯基鋰製備1，1-二甲基-乙基-苯基間苯二酚。如對化合物E所述利用(+)-馬鞭草烯醇進行濃縮。
合成化合物F(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚-6-炔基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物F的合成描述在流程圖6中。
如Harrington等人的描述製備(3，5-二甲氧基苯基)-N-甲氧基-N-甲基甲醯胺(carboxamide)(8)(Harrington P.E.等，J.Org.Chem.656576-82，2000)。根據Negishi等人的描述製備1-(三甲基甲矽烷基)-6-溴-1-己炔(9)(Negishi E-I等，J.Amer.Chem.Soc.1105383-96，1988)。根據下列流程製備[7-(3，5-二甲氧基苯基)-7-氧代-1-庚炔基]三甲矽烷(10)。
流程圖6
向金屬鎂(300mg)的5ml無水THF中添加催化量的二溴甲烷，並將反應混合物加熱到回流幾分鐘。終止加熱並利用注射器以保持回流的添加速率注射0.9ml的化合物9(大約20分鐘)。完成添加後，繼續回流1小時。將反應混合物冷卻到室溫。在0℃通過套管將如此獲得的Grignard轉移到化合物8(0.9g)的2ml THF溶液中。30分鐘後，用1M HCl溶液猝滅反應混合物並用乙醚進行稀釋。分離有機相，經Na2SO4乾燥、過濾並蒸發以提供1.5g的粗物質。通過矽膠快速層析法，利用10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為洗脫液進行純化獲得680mg的純化合物10。如國際專利申請WO 01/28497所述，從化合物10獲得3-(1，1-二甲基-6-炔基)間苯二酚(11)。5和6(1.18g，5mmol)，3-(1，1-二甲基-6-炔基)間苯二酚(11)(1.18g，5mmol)以及對甲苯磺酸(0.95g，5mmol)的氯仿(50ml)的混合物在室溫下反應4小時。然後添加乙醚(30ml)，用飽和碳酸氫鈉、水洗滌有機相，然後經無水硫酸鈉乾燥、過濾並蒸發。殘餘物在乙腈中結晶以提供0.5g的晶體。母液經矽膠進行層析分離以另提供0.7g的純化合物F。
合成化合物G4-[4-(1，1-二甲基-苯基-丙基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物G的合成描述在流程圖7中，其中R為2-乙基-苯。
如Harrington等所述製備化合物8，12以及13(Harrington P.E.等人，J.Org.Chem.656576-82，2000)。如國際專利申請WO 01/28497所述製備化合物14。如前合成化合物A所述製備化合物5以及6。如合成化合物A所述進行化合物5，6和14的縮合。
流程圖7 化合物GR＝2-乙苯化合物HR＝仲丁基化合物JR＝對氯苯合成化合物H(-)-4-[2，6-二羥基-4-(1，1，3-三甲基-丁基)-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物H的合成描述在流程圖7中，其中R為仲丁基。如化合物A和F的合成所述製備化合物5，6，8，12-14。如合成化合物A所述進行化合物5，6和14的縮合。
合成化合物J(-)-4-{4-[1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基]-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物J的合成描述在流程圖7中，其中R為對氯苯。
如化合物A和F的合成所述製備化合物5，6，8，12-14。如合成化合物A所述進行化合物5，6和14的縮合。
合成化合物M(-)-4-[4-(1-乙基-1-甲基-丙基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物M的合成描述在流程圖8中。
流程圖8
(留18行插入原文第34頁的圖)化合物M如下合成化合物161-(1-羥基-1-乙基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。在無水條件下進行反應。在0℃，向甲基-3，5-二甲氧基基苯甲酸酯(5g，25.5mmole)的無水THF(100ml)溶液中添加乙基溴化鎂的THF(1M，76.5ml)。在室溫下攪拌反應混合物72小時。添加乙酸乙酯和水，並用乙酸乙酯萃取水相。然後用水和鹽水洗滌混合的有機層、乾燥(Na2SO4)，並過濾以提供6.3g的化合物16。
下列流程描述在國際專利申請WO 01/28497中。
如下合成化合物171-(1-氯-1-乙基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。化合物16(6.3g，25mmole)溶於無水CCl4(30ml)中，HCl(g)起泡1小時。然後用水和10％碳酸氫鈉溶液洗滌有機層、乾燥(Na2SO4)並蒸發以產生6.3g的化合物17。
如下合成化合物181-(1-乙基-1-甲基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。在N2下將化合物17(6g，25mmole)的無水甲苯溶液冷卻到-30℃，並添加三甲基鋁的庚烷(2M溶液)(25ml)。反應混合物溫熱到室溫並攪拌過夜。添加HCl(1N)，然後分離有機層，用水洗滌、乾燥並蒸發。在矽膠上利用1％乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液層析分離粗物質以提供5.3g的化合物18。
如下合成化合物195-(1-乙基-1-甲基-丙基)-間苯二酚。在N2氣氛下向冷卻的(-50℃)化合物18的無水二氯甲烷中添加硼-三-溴化物(10.15ml，107.3mmole)。反應混合物溫熱到室溫並攪拌過夜。添加飽和碳酸氫鈉，分離有機層、乾燥(Na2SO4)並蒸發以產生4.2g的期望的間苯二酚19。如化合物A的合成所述製備化合物5和6以及與間苯二酚19的縮合。
合成化合物N(-)-4-[4-(5-溴-1，1-二甲基-戊基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物N的合成描述在流程圖9中，其中R為溴原子。
如合成化合物A所述製備化合物5以及6。化合物20的製備如Singer等人所述(Singer等，J.Med.Chem.414400-7，1998)。如合成化合物A所述進行化合物5，6和20的縮合。
合成化合物P(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊基-5-腈)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物P的合成描述在流程圖9中，其中R為氰基。
流程圖9 化合物20R＝Br化合物NR＝Br化合物21R＝CN化合物PR＝CN化合物5和6如化合物A的合成所述進行製備。化合物21從化合物20以類似於Singer等人描述的方法進行製備(Singer等，同上)。如合成化合物A所述進行化合物5，6和21的縮合。
合成化合物R(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物R的合成描述在流程圖10中。
合成化合物S4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-二琥珀酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物S的合成描述在流程圖10中。
在N2氣氛下將化合物A(227mg，0.61mmole)和琥珀酸酐(731mg，7.31mmole)的無水吡啶(10ml)的混合物加熱到50℃。添加叔丁醇鉀，並將獲得的混合物攪拌過夜(50℃)。將混合物倒入1N HCl中，並用乙酸乙酯萃取。混合的有機相用1N HCl和鹽水進行洗滌，乾燥(Na2SO4)並蒸發。通過柱層析(20％乙酸乙酯/石油醚+0.1％乙酸)分離兩種產物以產生220mg的化合物R(油)和150mg的化合物S(固體)。
流程圖10
合成化合物T4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-雙-二乙基磷酸酯-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物T的合成描述在流程圖11中。
流程圖11 反應在N2氣氛下進行。向充分攪拌的化合物A(1.97g，5.29mmole)的新蒸餾的THF溶液中添加叔丁醇鉀(1.54g，13.75mmole)，並攪拌混合物10分鐘。然後添加二乙基氯磷酸酯，並攪拌反應混合物過夜。添加水並用乙酸乙酯萃取水相。用鹽水洗滌混合的有機層，乾燥(Na2SO4)並蒸發。在矽膠上利用25％-70％乙酸乙酯-石油醚作為洗脫液進行色譜純化產生2.2g的純化合物T。
合成化合物U4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-二乙基磷酸酯-6-羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物U的合成描述在流程圖11中。
合成化合物W(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-雙-二乙基磷酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚烷-2-亞甲基。
化合物W的合成描述在流程圖12中。
在N2氣氛下進行合成。向甲基-三苯基-碘化膦(5.92g，14.65mmole)的無水THF(100ml)的懸浮液中添加雙(三甲基甲矽烷基)醯胺鉀(PBTSA)的甲苯(0.5M，28.7ml)，並在室溫下攪拌混合物0.5小時。添加化合物T(1.89g，2.93mmole)的THF(10ml)溶液，並將混合物攪拌過夜。添加氯化銨的水溶液，分離有機層並用EtOAc萃取水相。混合的有機相用鹽水進行洗滌，乾燥(Na2SO4)、過濾並蒸發。利用15％到30％EtOAc/石油醚作為洗脫液通過矽膠柱層析純化產物。
流程圖12 合成化合物Y(-)-4-{4-[1，1-二甲基-戊基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物Y的合成類似於描述在流程圖10中化合物R的合成。唯一的差異是起始物質，利用相同的合成流程，化合物A產生化合物R，化合物L產生化合物Y。
合成化合物Z(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-延胡索酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物Z的合成描述在流程圖13中。
流程圖13 化合物A(600mg，1.6mmol)溶於100ml的無水二乙醚中。然後添加0.21ml的三乙胺(1.6mmol)和0.18ml的富馬醯氯(1.7mmol)。攪拌約15分鐘後，過濾氯化三甲銨鹽並蒸發濾液。然後向殘餘物中添加乙酸乙酯，並用水洗滌3次直到pH高於4。然後用飽和氯化鈉洗滌有機相，經硫酸鈉乾燥、過濾並蒸發。然後利用20％乙酸乙酯和石油醚作為洗脫液在矽膠上通過柱層析純化化合物Z。
合成化合物AA(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2-羥基-6-甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AA的合成描述在流程圖14中。
流程圖14 向化合物A(150mg，0.4mmol)的DMF(16ml)溶液中添加碳酸鉀(400mg，2.9mmol)，並在室溫下攪拌混合物10分鐘。然後添加碘代甲烷(85.2mg，0.6mmol)，並在室溫下攪拌混合物過夜。向反應混合物中添加水並用EtOAc萃取。用水洗滌有機相兩次，經無水硫酸鈉乾燥、過濾並蒸發。殘餘物經反相柱利用50％水的乙腈溶液作為洗脫液進行層析分離以提供30mg的化合物AA。
合成化合物AB4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-雙-二乙基磷酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-醇。
化合物AB的合成描述在流程圖15中。
流程圖15
向充分冷卻的化合物T(0.12g，0.18mmol)的無水乙醇(6ml)溶液中添加硼氫化鈉(51mg，1.34mmol)。在-40℃攪拌反應混合物1小時，然後溫熱到室溫。3小時後，TLC分析顯示初始物質的完全消失。然後添加水，並用乙酸乙酯萃取反應混合物。用水、飽和氯化鈉洗滌有機層，並經硫酸鈉乾燥。通過蒸發除去剩餘溶劑以提供0.17g的化合物AB(92％的產率)。
合成化合物AC4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-醇。
化合物AC的合成描述在流程圖16中。
流程圖16 在無水條件下進行反應。向充分冷卻的(-78℃)化合物AB(0.107g，0.165mmol)的無水THF(6ml)和液氨(約50ml)溶液中添加鋰(約50mg，7.2mmol)。保持反應容器完全封閉直到藍色消失(約30分鐘)，然後打開過夜使氨氣蒸發。殘餘物溶於乙酸乙酯(30ml)和氯化銨的飽和溶液中。用乙酸乙酯萃取水相。經硫酸鈉乾燥混合的有機相、過濾並蒸發以提供77.6mg的化合物AC，HPLC測得的純度為100％。
合成化合物AD(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AD的合成描述在流程圖17中。
流程圖17 向充分攪拌的化合物AC(0.204g，0.6mmol)的無水二氯甲烷溶液中以一部分添加吡啶重鉻酸鹽(0.448g，1.2mmol)。在室溫下攪拌反應混合物過夜。通過硅藻土過濾固形物並用DCM洗滌。通過蒸發除去溶劑以提供0.27g的殘餘物。利用10％乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液通過快速層析法純化粗物質以提供0.15g的純化合物AD(產率74％)。
合成化合物AE(+)5-(戊酸甲酯)-2-(4，6，6-三甲基-二環[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物AE的合成描述在流程圖18中。
在室溫下攪拌甲基3，5-二甲氧基苯甲酸酯(20g，0.12mole)，咪唑(100g，1.47mole)和叔-丁基二甲基甲矽烷基氯化物(100g，0.66mole)的DMF(無水，400ml)溶液2小時。用水(300ml)稀釋反應混合物並用乙醚(3×300ml)萃取水相。用水洗滌混合的有機相，乾燥(Na2SO4)並蒸發。獲得的粗物質溶於THF(300ml)中，冷卻到-20℃並逐滴添加LiAlH4的THF(1N，140ml，0.14mole)。在室溫下攪拌反應混合物2小時。反應混合物冷卻到-30℃並添加乙酸乙酯(300ml)，然後添加MgSO4的飽和溶液。通過硅藻土過濾獲得的溶液。
流程圖18 分離有機層並用乙酸乙酯萃取水相3次。用飽和氯化鈉洗滌混合的有機相，乾燥(硫酸鈉)並蒸發以提供44.2g的粗產物(23)(0.12mole)。不用任何純化步驟，將三乙胺(25ml，0.18mole)和戊醯氯(30ml，0.25mole)添加到溶於無水二氯甲烷(1升)的粗產物(23)中。在室溫下攪拌產生的混合物過夜。然後添加水，分離有機層並用DCM(3×300ml)萃取水相。用飽和氯化鈉洗滌混合的有機相，乾燥(Na2SO4)並蒸發。殘餘物在矽膠上用4％乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液進行層析。獲得45g的黃色油(24)。向黃色油(45g，0.1mole)的THF(1升)溶液中添加氟化四丁銨(87g，0.33mole)，然後在室溫下攪拌混合物過夜。將反應混合物倒入用乙酸酸性化直到pH約為4.5的水(11)中，並用乙酸乙酯萃取若干次。用飽和氯化鈉洗滌混合的有機相，乾燥(Na2SO4)並蒸發。用30％乙酸乙酯和石油醚作為洗脫液在矽膠柱上層析分離殘餘物以提供20g的白色固體(25)。將白色固體(0.75g，3.3mmol)用馬鞭草烯醇(0.5g，3.3mmol)溶解在CHCl3(40ml)中，並將產生的溶液冷卻到0℃。添加無水對甲苯磺酸(催化量)並將產生的混合物在0℃攪拌15分鐘。將反應混合物倒入碳酸鈉的飽和溶液中。用CHCl3萃取水相併用碳酸鈉的水溶液洗滌混合的有機相。乾燥(Na2SO4)有機相、過濾並蒸發。分離化合物AE並用20％水與乙腈作為洗脫液通過預備性HPLC進行純化。
合成化合物AF4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-二甲氧基-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-亞甲基。
化合物AF的合成描述在流程圖19中。
流程圖19
在N2氣氛和無水條件下進行反應。向甲基三苯基碘化膦(1.083g，2.68mmol)的無水THF(20ml)的懸浮液中添加雙(三甲基甲矽烷)醯胺鉀的甲苯(5.26ml，2.63mmol，0.5M)。在室溫下攪拌反應混合物半小時。然後添加化合物B(0.214g，0.537mmol)的無水THF(2ml)溶液，並將產生的混合物攪拌過夜。向反應混合物中添加氯化銨的飽和溶液，並用乙酸乙酯萃取水相(3次)，用飽和氯化鈉清洗混合的有機相，乾燥(硫酸鈉)過濾並蒸發。用己烷研磨獲得的粗褐色固體以除去三苯基氧化膦。
然後用100％的己烷作為洗脫液在矽膠上進行層析以獲得淡黃色油的化合物AF。
合成化合物AG(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊-4-烯基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AG的合成描述在流程圖20中。
1g的金屬鈉(43mmol)溶於無水甲醇(25ml)中，然後添加溶於甲醇(3.5g，12mmol)的4-(7-溴-1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羥基-苯基(20)。攪拌反應混合物約半小時。然後將反應混合物倒入100ml的1N HCl中。用乙酸乙酯萃取水相(3×100毫升)，用飽和氯化鈉清洗混合的有機相，乾燥(硫酸鈉)、過濾並蒸發。獲得800mg的粗間苯二酚產物(26)，並用20％的乙酸乙酯的石油醚溶液經矽膠柱層析進行純化。讓產物間苯二酚(170mg，0.82mmol)與諾蒎酮二-乙酸酯的兩種異構體(5)和(6)(540mg，2.2mmol)的CHCl3溶液和催化量的對甲苯磺酸反應。在室溫下攪拌4小時後，完成反應。用碳酸氫鈉洗滌反應混合物並用乙酸乙酯萃取(3次)，用飽和氯化鈉清洗混合的有機相，乾燥(硫酸鈉)、過濾並蒸發。獲得的粗物質用石油醚研磨以產生150mg的粗化合物AG。然後用50％的水∶乙腈作為洗脫液經反相層析純化產物。
流程圖20(留10行插入原文第45頁的圖)化合物AG合成化合物AH2，2-二甲基丙酸-4-{4-[1，1-二甲基-戊基]-2，6-二羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-烯-2基甲酯。
化合物AH的合成描述在流程圖21中。
流程圖21(留10行插入原文第43頁的上圖)4-羥基桃金孃烯基-7-特戊酸酯5-(1，1-二甲基-戊基)-間苯二酚化合物AH4-羥基桃金孃烯基-特戊酸酯的製備如美國專利4,876,276所述，而5-(1，1-二甲基戊基)-間苯二酚的製備如下。在250ml的圓底燒瓶中添加100ml的甲醇和100ml的THF。然後添加5.5g的3，5-二甲氧基-苯甲酸(0.03mole)和1.27g的氫氧化鋰一水合物(0.03mole)。然後添加10ml的水，並攪拌反應混合物1小時。過濾獲得的漿液並蒸發。殘餘物用乙醚研磨，並再一次蒸發獲得淺黃色固體。在60℃、減壓條件下用P2O5乾燥固體。向100ml THF的250ml圓底燒瓶中添加3，5-二甲氧基鋰苯甲酸的乾燥鹽。添加正丁基鋰(20ml，1.7M，0.032mole)。反應物溫熱到50℃並攪拌2小時。反應混合物冷卻到室溫，並逐滴添加到250ml的1N HCl。然後添加Na2CO3直到pH為約11。然後用乙醚萃取反應混合物3次。經硫酸鈉乾燥混合的有機相，過濾並蒸發以產生從正戊烷結晶而來的橙色油。獲得2.6g的化合物12，其中R為丁基，總產率為39％。如流程圖7所述製備化合物13和14，其中R為丁基。如化合物E所述進行4-羥基桃金孃烯基-特戊酸酯和5-(1，1-二甲基戊基)-間苯二酚的縮合，並且產率為65％。
生理學實施例在一系列實驗系統中進行新的二環CB2配體治療作用的評估以支持這些藥物作為免疫調節、抗炎、止痛、神經保護和抗腫瘤劑的實用性。這些作用都在體外和體內進行評價，並利用如下所述的系統進行證實。除非另有所示，測試化合物的製備如下為了體外分析，首先將化合物溶於DMSO中，並逐步稀釋在分析緩衝液，通常為組織培養基中，直到終濃度為0.1％DMSO。為了體內分析，測試化合物首先稀釋在CREMOPHOR EL∶乙醇中(分別為70％和30％w/w)並且進一步以1∶20的比例稀釋在生理緩衝液，通常為生理鹽水中，以到達合適的劑量。因此介質為稀釋在合適緩衝液中的初始「溶劑」。
實施例1CB1和CB2受體的結合親合性。
在膜上通過檢測新化合物從CB1受體置換[3H]CP55940的能力進行CB1的結合分析，所述膜來源於hCB1穩定轉染的HEK-293細胞(Perkin Elmer/NEN)。將膜稀釋在分析緩衝液(50mM Tris-HCl，2.5mMEDTA，5mM MgCl2，1mg/ml BSA，pH＝7.4)中得到500μg蛋白/ml。在存在或者不存在二環測試化合物的條件下將50μl的稀釋膜(25μg)與[3H]CP55940一起溫育在總體積0.5ml中。測試化合物溶於DMSO中，並稀釋在分析緩衝液中得到0.1％溶劑的終濃度。添加與介質等量的對照樣品。通過添加10μM的WIN 55212-2測量非特異性結合。在30℃培養1.5小時後，通過Whatman 934A/H過濾器(用0.1％的聚乙烯亞胺(PEI)預浸透)過濾反應物。
通過檢測新二環類似物從膜中的受體置換[3H]WIN 55212-2的能力確定新二環類似物與CB2受體的親合性，所述膜來源於hCB2穩定轉染的CHO細胞(Perkin Elmer/NEN)。將膜稀釋在分析緩衝液(10mMHEPES，1mM MgCl2，1mM EDTA，0.3mg/ml BSA，pH＝7.4)中得到500μg蛋白/ml。在存在或者不存在幾個濃度的二環測試化合物的條件下將50μl的稀釋膜(25μg)與0.8nM的[3H]WIN 55212-2一起溫育在總體積1ml中。如前對hCB1的分析所述溶解並稀釋測試化合物。通過添加10μM的CP 55940測定非特異性結合。在30℃培養40分鐘後如先前所述過濾反應物。所有結合分析的過濾器用β-計數器計數並將類似物濃度的log對結合％作圖。從這個圖外推出IC50的值。
結合分析的結果顯示在表1中，其根據它們分別從CB2或者CB1結合位點置換[3H]WIN 55212-2或者[3H]CP55940的能力描述了優選化合物的構效關係(SAR)。
表1用於定義R2、R3和R4的縮寫參考下列取代基DMBP＝1，1-二甲基-5-溴代-戊基DMCP＝1，1-二甲基-5-氰基-戊基DMEP＝1，1-二甲基-乙基-苯基DMH＝1，1-二甲基-庚基
DMH6＝1，1-二甲基-庚-6炔基DMP＝1，1-二甲基戊基DMPP＝1，1-二甲基-3-苯基-丙基EMP＝1-乙基-1-甲基-丙基MCPE＝1-甲基-1-(對-氯代-苯基)-乙基表1中報告的IC50的值從諸如描述在圖1的圖表計算而來，其顯示了所選擇的二環化合物與大麻鹼受體的結合。通過競爭性抑制穩定轉染有人類CB1受體基因的HEK-293細胞中的[3H]CP55940來測定與CB1的結合。通過競爭性抑制轉染有人類CB2受體基因的CHO細胞中的[3H]WIN55212-2來測定與CB2的結合。以抑制％作為化合物濃度函數的兩個曲線(hCB1■和hCB2◆)在這個圖中重疊。A-顯示由化合物A得到的結果。B-顯示由化合物B得到的結果。C-顯示由化合物J得到的結果。D-顯示由化合物L得到的結果。
表1.式(I)到(III)的二環化合物的SAR和IC50(nM)
帶有星號的化合物不在式(I)和(II)定義的範圍內，包含在內僅僅用於比較。HU-210公開在美國專利5,284,867中，而HU-308公開在國際專利申請WO 01/32169中。
實施例2體外二環CB2配體的抗炎特性。
炎性應答級聯的特異方面通過諸如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，IFN-γ，IL-2和IL-1β的細胞因子以及諸如COX-2和PGE2的炎性介質介導。調節這些前炎性劑的水平對於最終炎癥結果的嚴重性是非常重要的。這些前炎性劑也由免疫系統的激活細胞產生，而這個研究的目的是測試新二環CB2配體對從活化的巨噬細胞和T細胞分泌這些炎性劑的影響。各種測試組中的分泌水平通過ELISA分析進行測定，並且對比介質治療組計算抑制水平。
利用ELISA進行蛋白定量。
用於液體樣品，組織培養上清液或者體液中的給定蛋白的定量技術是基於酶聯免疫吸附測定(ELISA)的方法。不管是市售或者自產的，分析是基於由結合到ELISA板微孔底部的特異性抗體捕獲目的蛋白來進行的。衝洗掉未結合的物質，然後將捕獲的蛋白暴露於通常用辣根過氧化酶(HRP)或者鹼性磷酸酶(ALP)標記的二級抗體。再一次衝洗掉未結合的物質，然後將樣品用產生比色反應的合適底物溫育。終止反應並在合適的波長處對分光光度計進行讀數。至少一式兩份測試樣品，並且在每個板上合編出由重組體靶蛋白的系列稀釋構成的合適標準曲線。從標準曲線計算樣品中蛋白的濃度。
巨噬細胞的活化RAW 264.7巨噬細胞為一種小鼠細胞系(ATCC #TIB-71)，將其生長在Dulbecco氏改良的伊格爾培養基(DMEM)上，該培養基用4mM的L-穀氨醯胺調節以包含1.5g/L的碳酸氫鈉、4.5g/L的葡萄糖以及10％熱滅活的胎牛血清。細胞生長在組織培養瓶中並以合適的密度接種在24微孔組織培養板中。一毫升中的0.5×106的Raw細胞用2μg/ml的脂多糖E.coli 055B5(DIFCO實驗室)進行刺激。小鼠巨噬細胞用對照或者10μM的二環CB2配體預處理1小時，其後用LPS激活。50nM的地塞米松用作陽性對照。活化後4小時(對於PGE2)以及24小時(對於IL-1β和TNF-α)收集上清液，通過先前所述的ELISA測定研究中炎性劑的水平。相對介質處理的細胞，計算抑制率。
抑制活化巨噬細胞中的IL-1β。
IL-β獲得的結果描述在圖2A中，其中對每一處理組繪製分泌的水平。由此圖可見，二環CB2配體在10μM時是IL-1β的有效抑制劑，化合物A抑制76％的分泌，化合物D抑制67％，化合物B抑制34％，而化合物C抑制26％的分泌。在相同的實驗中地塞米松抑制IL-1β97％的分泌。
抑制活化巨噬細胞中的TNF-α。
如先前所述進行巨噬細胞的活化。如先前所述用ELISA分析測定TNF-α的水平。對比介質處理的細胞計算抑制率。用10μM的化合物A處理降低了53％的TNF-α分泌並且計算的IC50為10μM。用從1μM到20μM範圍內各種劑量的測試化合物進行處理以確定本發明其它化合物的IC50值，諸如化合物L、N、P、R和Y，並且當劑量高達20μM時它們中沒有一個顯著影響TNF-α的分泌。
抑制活化巨噬細胞中的PGE2。
如先前所述進行巨噬細胞的活化。如先前所述用ELISA分析測定PGE2的水平。對比介質處理的細胞計算抑制率。用從1μM到20μM的範圍內的各種劑量的測試化合物進行處理以確定IC50值。結果描述在圖2B中。由化合物A、L、N、P、R和Y抑制PGE2分泌的IC50值分別為9μM、7μM、7μM、18μM、9μM和7μM。
T細胞的活化。
Jurkat細胞(人類急性淋巴瘤T-細胞系；ATCC #TIB-152)生長在RPMI 1640培養基中，該培養基用2mM的L-穀氨醯胺調節以包含1.5g/L的碳酸氫鈉、4.5g/L的葡萄糖，10mM的HEPES，1.0mM的丙酮酸鈉以及10％熱滅活的胎牛血清。細胞生長在組織培養瓶中並以合適的密度接種在24微孔組織培養板中。用10ng/ml的PMA(Sigma)和1μM的A23187鈣離子載體(Sigma)刺激一毫升中的2×106個細胞。環孢菌素A(Sandoz)為一種已知的免疫抑制藥物，用作陽性對照。刺激之前1小時以所示濃度加入對照和測試化合物。刺激後24小時收集上清液，並且如先前所述用ELISA分析測定研究中的炎性劑。對比載體處理的細胞計算抑制率。
抑制激活T細胞中的IL-2。
如先前所述進行T細胞的活化。如先前所述用ELISA分析測定IL-2的水平。對比介質處理的細胞計算抑制作用。在圖3中顯示的這個實驗的結果為由介質或者化合物處理的細胞獲得的IL-2的分泌水平，在每個濃度進行繪圖。由此圖可見，二環CB2配體可以為IL-2的有效抑制劑，化合物A具有3μM的計算IC50，而化合物L、R和Y分別具有8μM、9μM和9μM的計算IC50。在高達10μM的劑量下，在這種實驗設置中，從中衍生二環合成大麻鹼族的HU-308本身具有最小的作用。相同實驗中濃度為10nM的環孢菌素A抑制98％的IL-2分泌。應該注意到在0.5-5μM的CB1拮抗劑SR141716A或者CB2拮抗劑SR144528存在的條件下在這種實驗設置中同樣測試了化合物A和L，而且它們的IL-2分泌抑制活性沒有被任何這些拮抗劑所逆轉。這種觀察可能通過拮抗劑不完全足以阻斷這種潛在的特異性受體-介導的活性的事實，或者通過一些化合物的活性不能由CB2結合介導但是通過選擇性的機制介導的假設進行解釋，例如通過結合到未經鑑定的大麻鹼受體或者通過非受體介導的機制進行。
總而言之，這些試驗結果支持了下列結論本發明的二環CB2結合化合物是從免疫系統活化的細胞分泌前炎性劑的有效抑制劑，而不管是通過CB2結合還是通過選擇性機制進行的。
肥大細胞的活化。
肥大細胞為活化後釋放有效炎性劑的多功能骨髓來源的細胞。從預先形成的顆粒通過脫顆粒的過程或者在刺激誘導的從頭合成後完成釋放。由肥大細胞釋放的分子包含諸如組胺的生物胺、趨化因子、細胞因子、酶、生長因子、肽、花生四烯酸產物和蛋白多糖。應該注意到肥大細胞也已知在產生疼痛信號中具有關鍵作用。RBL-2H3細胞(大鼠嗜鹼性白血病細胞系；ATCC #CRL-2256)表達了CB2樣受體並且最適合於研究支撐CB2選擇性配體的抗炎活性的機制。RBL-2H3可以由IgE依賴的機制或者通過添加PMA和鈣離子載體進行刺激。
RBL-2H3細胞生長在EMEM培養基中，用Earle氏BSS，2mM L-穀氨醯胺調節到包含1.5g/L的碳酸氫鈉、0.1mM的非必需胺基酸、1.0mM的丙酮酸鈉和15％的熱滅活胎牛血清。細胞生長在組織培養瓶中並以合適的密度接種在24微孔組織培養板中。一毫升中的2×105細胞通過下列之一的方式進行刺激。首先，在IgE依賴的方法中，過夜塗板後，用包含0.5μg/ml的共軛連接IgE的抗-DNP(二硝基苯基)(Sigma，Cat.No.D-8406)的培養基更換培養基並對細胞致敏1小時。然後用PBS洗滌細胞兩次並暴露於包含0.1μg/ml DNP-HAS(二硝基苯基白蛋白，人類血清，Sigma，Cat.No.A-6661)的新預熱的培養基。在最終刺激之前添加稀釋在DMSO中的測試化合物和對照，終濃度不超過0.1％DMSO。根據待評估的介質，在37℃下讓脫顆粒過程進行不同時間段，然後收集200μl的上清液。例如，在組胺取樣之前刺激細胞1小時以及刺激3小時用於監控血清素、TNF-α和IL-4的分泌水平。使用這種模型的第二種可能性是當利用10ng/ml的PMA(Sigma)以及1μM的A23187鈣離子載體(Sigma)實現刺激的時候。Src家族抑制劑PP1或者PKC抑制劑GF109203X(都獲得自Calbiochem)用作陽性對照。刺激之前以所示濃度加入對照和測試化合物。依據在研究中的介質，刺激後收集上清液長達24小時，並且如先前所述用ELISA分析測定這種炎性劑的水平。對比介質處理的細胞計算抑制率。
實施例3化合物對基因表達的作用。
通過一些二環CB2結合化合物對體外或者體內免疫系統活化的細胞中炎性劑分泌的影響顯示的抑制活性可能與基因表達的調節相關。
RNA製備和實時RT-PCR。
利用SV總RNA分離系統(Promega)製備總RNA。細胞或者組織在溶解緩衝液中勻漿化。根據試劑盒的說明書，將裂解物轉移到RNA分離柱，用DNAse處理，洗滌並洗脫。利用GeneQuant II(Pharmacia-Amersham)確定RNA的濃度。利用SUPERSCRIPT II逆轉錄酶(LifeTechnologies)從總RNA合成互補DNA(cDNA)。根據試劑盒說明書，將2μg的總RNA與寡核苷酸(dT)15引物、0.5mM dNTP混合物、8單位的逆轉錄酶及其他反應組分組合達到20μl的終容積。反應混合物在42℃保溫45分鐘並在70℃滅活15分鐘。定量的實時RT-PCR包含1μl的cDNA，300nM的合適正反向引物(根據監控的基因)以及7.5μl的反應混合物，所述反應混合物包含緩衝液、核苷酸、Taq聚合酶和SYBER綠(SYBER Green master混合物，Applied Biosystems)，總反應體積為15μl。利用GeneAmp 5700序列檢測系統(AppliedBiosystems)獲得基因擴增。擴增過程包含在95℃10分鐘的一個步驟，繼之以兩步的40個循環95℃20秒，以及在60℃1分鐘。每個退火步驟期間，擴增產物的量通過雙鏈DNA結合染料SYBER Green的螢光強度進行測定。對每種產物測定循環閾值(CT)，表示可以首先檢測到螢光高於基線信號的增加的PCR循環。CT中一個PCR循環的延遲被轉化為起始模板分子降低兩倍，反之亦然。將特異基因產物CT的改變規格化到參考基因親環素或者GAPDH CT的變化。結果表示為試驗系統中基因表達高於合適對照，諸如滅活細胞系或者介質「處理」的動物的成倍增加。在所有的情況下，結果同樣規格化到諸如親環素或者GAPDH的參考管家基因。
實施例4化合物對ConA誘導的肝臟損傷的作用。
在刀豆素A誘導的肝臟損傷鼠模型中評價二環CB2結合化合物的護肝活性。
T細胞介導的損傷的ConA模型。
人類危急生命的T細胞介導肝臟損害最普遍的原因是感染B型肝炎或者C型肝炎病毒以及自身免疫肝炎。已經發展了自身免疫肝臟損傷的不同動物模型，包含由靜脈內注射T細胞刺激性植物凝集素刀豆素A(ConA)誘導的小鼠急性肝功能衰竭。ConA對肝竇具有較高的親合性。用ConA處理小鼠激活了在肝臟中聚集並釋放調節肝臟損傷的細胞因子(諸如IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ、IL-2)的T細胞。用免疫抑制劑藥物諸如環孢菌素或者FK506預處理完全預防了由ConA注射引起的肝臟損傷，從而證實了T細胞激活在這種模型中的主要作用。
每個實驗組包含至少5隻BALB/c純系雌性小鼠(平均體重25g，Harlan，以色列)。陰性對照組由注射鹽水而非ConA的小鼠組成。以10mg/kg鹽水溶液的劑量在尾的基部通過i.v.進行ConA(Sigma)注射。注射ConA前30分鐘以1mg/kg的劑量i.v.注射進行處理。化合物溶於CREMOPHOR EL∶乙醇中，並且僅以內部對照包含介質。
在三個水平監控處理的效果。首先，在注射ConA後預定的時間點利用後眼眶穿刺收集血樣(200-400μl)。短暫離心後(5000rpm，2分鐘)，收集血清並保藏在-80℃，直到進一步用於經ELISA確定細胞因子的水平以及確定肝臟轉氨酶的滲漏作為肝臟損傷的標誌。同時，也在目的器官中確定細胞因子或者其它炎性介質的水平。為了這個目的，注射ConA後在預定時間點通過頸椎脫臼法處死小鼠。取出脾和肝臟。部分肝臟固定在4％的甲醛中，而其他部分保藏在-80℃用於蛋白或者RNA的提取。將脾稱重，並且將小部分脾固定在4％的甲醛中，而大部分根據下列方法進行培養。用5ml注射器的粗糙末端插入4ml的RPMI培養基中，將每個脾擠壓通過一細胞濾器。通過重力沉積除去大組織片段並且收集上清液。用5ml的紅細胞裂解緩衝液(Boehringer)洗滌細胞3次，重懸在4ml的RPMI培養基中，所述培養基補充有2mM的L-穀氨醯胺，調節到包含1.5g/L的碳酸氫鈉、4.5g/L的葡萄糖，10mM HEPES，1.0mM的丙酮酸鈉以及10％熱滅活的胎牛血清，並在6微孔培養皿中鋪板。細胞保溫24小時並且通過如前所述的ELISA確定上清液中細胞因子的水平。
通過ConA處理8小時後測量血漿中ALT的水平評價化合物A對肝臟損傷的作用。暴露於ConA引起ALT血漿濃度從30急劇升高到2800IU/l以上。用介質處理的動物僅僅顯示ALT非顯著性減少29％，而用1mg/kg的化合物A處理的動物顯示顯著性減少65％。ALT為肝臟損傷的明確標誌，這些試驗結果支持了肝臟炎症中二環CB2配體可能的治療效果。
實施例5注射LPS後化合物在腦組織中的作用。
在CNS炎症的情況下，通過模型在體內的試驗，確定二環CB2結合化合物的神經保護活性，在所述模型中，將LPS注射到小鼠腦室中產生炎性損傷。PBS用作對照。LPS溶於PBS中濃度為50ng/μl，以1μl/分鐘的速度在注射泵和腦注入套管的幫助下將5μl注入每個腦室中。每次注射後，套管繼續遺留在原位一分鐘以避免回流。i.c.v(腦室內)注射LPS後緊接著i.p.(0.1毫升/10g體重)注射各種處理組和對照。每個處理組由五隻C57/BL雄性小鼠(6-8周齡，平均體重25g，Harlan，Israel)組成。注射LPS後6小時，通過i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥鈉處死動物，取出它們的大腦並保藏在-80℃直到下一步驟。從每個完整的大腦提取RNA並通過如前所述的實時RT-PCR分析炎性劑的基因表達水平。這個實驗的結果表示成LPS對PBS注射的大腦中所研究基因的成倍激活。
這個實驗模型同樣能夠通過測量神經膠質增生的程度來監控二環CB2結合化合物對腦炎的作用。為了這個目的，LPS和處理注射後3天處死動物並取出大腦。在海馬區的水平面切割20μm的冷凍切片並利用抗F4/80標記的抗體，通過標準的免疫組織化學方法進行染色。通過對F4/80免疫活性細胞的計數進行定量分析。處理組之間的差異利用方差ANOVA分析繼之以事後(post-hoc)t檢驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
實施例6化合物在中腦動脈阻塞中的作用。
小鼠瞬時MCAo本發明化合物的神經保護活性在模擬腦缺血的中腦動脈阻塞(MCAo)鼠模型中進行評價。這個模型相當於中風中觀察到的腦缺血。用30％氧和70％氮中的氟烷(在麻醉室中4％用於誘導，並且在面罩中1-2％為了維持)麻醉小鼠(C57B1，雄性，平均體重25g，Harlan，Israel)。在頸部皮膚進行中線切割，筆直地切開下面的組織。通過鈍器解剖研究右頸總動脈(CCA)及其與頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)的連接。然後灼燒ECA、枕骨和甲狀腺上動脈的分支。接著通過將其圍繞5-0絲縫線材料(Assut，瑞士)進行CCA的瞬間封閉。切割2釐米段的尼龍縫合材料並放進1％聚L-賴氨酸的溶液中，然後在烘箱(60℃)中乾燥60分鐘。每段的頂端圍繞在火焰的下方。用相同類型的縫合材料將ECA永久地阻塞。此時，在ICA中用5-0絲縫線材料進行第三次瞬時閉合。在ECA中切開小孔並向ICA中插入尼龍線，同時避免進入翼突顎動脈。線插入11mm直到感覺到輕微的抗性。然後打一5-0絲縫線結使線固定。然後切斷留在外面的1釐米線。通過5-0絲縫線材料封閉皮膚傷口。
操作後，使動物在籠中醒來。損傷開始後1小時對動物進行臨床試驗以驗證MCA阻塞是否成功。評估系統基於Belayev等人的工作(Stroke 271616-23，1996；Brain Res.833181-90，1999)。它包括兩個測試姿勢反射測試和前肢放置測試。動物尾部懸吊評價姿勢反射，而通過胃部固定動物進行前肢放置測試。表1總結了這兩個試驗及它們的得分系統。
表1用MCAo進行小鼠的神經學估價。
*記分如下0代表沒有觀察到不足，1代表懸吊測試期間四肢彎曲，2代表側面推力不足。
#記分如下0代表完全直接放置，1代表不完全或者延遲放置(＞2秒)，2代表沒有放置。
只有總分在8到12之間的動物才被歸入研究中。起始損傷後90分鐘，利用相同的方法給選擇的動物再次給服鎮靜劑，然後重新打開頸部傷口並用尼龍線拉出ICA。接著用5-0絲縫線材料封閉皮膚傷口。損傷結束之前1分鐘施用對照和測試化合物。經靜脈內遞送5ml/kg的所有處理物。介質的施用為5ml/kg。每個測試組包括至少6隻動物。然後追蹤動物的三個主要參數臨床功能評估，包含損傷程度的組織病理學評估以及免疫/炎性標記的評估。研究的最後，通過i.p.注射戊巴比妥鈉100mg/kg處死動物。然後取出大腦並準備用於檢查。從大腦同側的一半，製備總RNA用於監控測試化合物對局部缺血標記的作用。通過如前所述的實時RT-PCR分析基因表達水平。結果可以表示成高於假裝操作動物的成倍激活。基因表達規格化到管家基因親環素。
實施例7處理炎症小鼠的耳浮腫模型。
新二環CB2配體的抗炎活性利用小鼠的耳浮腫模型進行體內篩選。這個測試系統利用各種炎症誘導物，包含巴豆油(CO)以及花生四烯酸(AA)，並且通過測定耳組織腫脹確定結果。非甾醇類抗炎藥物已經顯示出減輕這種模型的腫脹(Young，J.M.等人，J.Invest.Dermatol.82367-71，1984)。測試化合物預防或者減低對這些興奮劑的炎性應答的能力是它們全身性抗炎能力的指示。
化合物A溶於CREMOPHOR EL∶乙醇中，並根據需要的劑量在用無菌0.9％氯化鈉稀釋到期望的終濃度後i.p.注射成熟雄性ICR小鼠(平均體重30g，Harlan，以色列)。檢查化合物從0到30mg/kg範圍的各種劑量。每個處理組由8-10隻動物組成而介質處理組由16隻動物組成。通過施用20μl 50％CO的丙酮溶液到一隻耳的外表面可立即誘導炎症，對側耳只暴露於丙酮並作為對照。利用錶盤式測厚儀(Mitutoyo，Japan)在施用CO後3小時測定耳的厚度(0.01mm單位)。最後，修剪耳朵，取出一6mm直徑的耳孔並測量其重量。耳的浮腫可以表示為CO處理耳的耳孔重量與對側丙酮處理耳的耳孔重量的比值。結果計算為與CREMOPHOR EL∶乙醇介質處理的動物相比的抑制％。從這個研究中進行的劑量反應的分析，我們發現當腹腔內注射化合物A時，化合物A具有30mg/kg或者81μmole/kg的ED50。這些結果顯示二環CB2配體可以起到全身性抗炎化合物的作用。
實施例8處理炎症小鼠的爪浮腫模型。
這個研究的目的是體內測試化合物對動物後爪注射1％角叉菜膠誘導的爪浮腫的抗炎活性。分別以15和6mg/kg i.p.注射稀釋在無菌鹽水中的甲苯噻嗪和戊巴比妥組合麻醉雌性Balb/c小鼠(平均體重20g，Harlan，以色列)。在一隻(右)爪趾面下區用0.05ml的1％w/v角叉菜膠的無菌水溶液皮下注射麻醉的小鼠。沒有注射對側的(左)爪，因為來自文獻的數據被我們自己的經驗所證實，顯示注射0.05ml的生理鹽水不影響以後的厚度或者容積計量。包含已知的抗炎對照的所述測試化合物，在i.p.注射之前溶於CREMOPHOR EL∶乙醇中並進一步以1∶20或者1∶50稀釋在無菌鹽水中，所述i.p.注射緊跟在角叉菜膠注射之前發生。注射後3小時，如先前所述方法將動物重新服用鎮靜劑。利用錶盤式測厚儀(Spring-dial，恆定低壓壓力表，Mitutoyo，TG/L-1，0.01mm)測量爪厚度，利用器官充滿度測量器(型號#7150，UgoBasile，Italy)測量爪體積。爪浮腫可以表示成同一動物右側處理和左側未經處理的爪之間的差異，或者以立方毫米表示的Δ爪體積(ΔPV)或者以毫米表示的Δ爪厚度(ΔPT)。每個組包括至少10隻動物。結果可以進一步規格化到每個處理組0mg/kg(只有介質)的ΔPV和ΔPT值。在研究最後，i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥使動物安樂死。
結果首先計算為ΔPV或者ΔPT，然後通過比較處理和介質對爪體積或者厚度的作用更進一步被分析成抑制％。各種處理組中的差異利用方差分析(ANOVA)繼之以事後t Fisher試驗進行分析。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
當結果表示為規格化到介質的爪厚度抑制％，並根據測試化合物的劑量作圖時，產生的圖型為給定劑量時起始斜率直至最大的觀察結果(MOE)，繼之以更高劑量的平穩狀態。針對下列兩個參數進行測試化合物的抗炎活性分析爪厚度的最大抑制％以及觀察到最大結果的劑量。第一個總的觀察是與在最多2mg/kg範圍內的已知抗炎化合物，諸如地塞米松和Celecoxib相比，二環CB2配體在較低的劑量下是有效的。二環CB2配體的原型HU-308在0.6mg/kg劑量時產生爪厚度約28％的最大減少。在2.5mg/kg劑量時化合物A對爪厚度有類似28％的減少，而化合物L和R在0.25和0.5mg/kg劑量時分別顯示34％和31％的MOE。由於比較的緣故，已知的抗炎藥物諸如Celecoxib和地塞米松分別在相應的劑量範圍內，在0.1mg/kg時引起爪厚度減少7％和26％，在0.25mg/kg時減少16％和31％，而在0.5mg/kg時減少24％和33％。因此，大多數測試的化合物至少優於Celecoxib。應該記住這些市售藥物顯示嚴重的副作用，如果不經補充性保護藥物處理的話會阻止它們長期應用。本發明的化合物與這些藥物相比具有抗炎活性的事實是非常令人鼓舞的，因為這個家族的化合物具有避免副作用的優點，從而使它們成為代替現存抗炎藥物的重要候選藥物。這些結果支持了本發明的二環CB2配體具有可能與含有炎性組分的較寬範圍的人類狀態相關的抗炎效果。
實施例9試驗性自身免疫疾病CIA，EAE和DTH。
自身免疫疾病與升高水平的炎性細胞因子相關。最常研究的齧齒動物模型為實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)(一種人類多發性硬化的模型)，試驗性自身免疫關節炎(一種人類類風溼性關節炎的模型)，以及遲髮型超敏反應(DTH)(一種人類過敏性反應的模型)。EAE為由動物對中樞神經系統的髓鞘鹼性蛋白致敏化作用引發的自身免疫神經系統疾病，所述髓鞘鹼性蛋白又稱鹼性致腦炎蛋白。試驗性的自身免疫關節炎由完全弗氏佐劑中的膠原蛋白免疫動物所引發因此所述模型稱為膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)。遲髮型超敏反應是根據嚴格時間表通過施用二硝基氟苯誘導的，因此產生的模型相當於人類變應性接觸性皮炎。本研究的目的是測試我們的化合物預防或者減弱這三種自身免疫病模型的臨床徵象的能力。
膠原蛋白誘導的關節炎。
在這個研究中，每處理組使用至少8隻成年DBA/1雄性小鼠(平均體重20g，Harlan，以色列)。在4℃通過攪拌ON將2型牛膠原蛋白溶於0.05M乙酸中，濃度為2mg/ml。膠原蛋白溶液在等體積的完全弗氏佐劑(CFA)中進一步乳化。每隻動物施用100μg的2型膠原蛋白的0.1ml CFA乳化液。在尾的基部s.c.施用膠原蛋白。啟動後21天，小鼠皮內加強注射100μg膠原蛋白的弗氏不完全佐劑溶液。
利用器官充滿度測量器(Hugo Basill，Italy)測量每個後爪的體積，利用轉盤恆壓計量器(Mitutoyo，日本)測量厚度。膠原蛋白給藥之前以及在指定的隨訪期間每隔一天進行測量。所有的處理為腹膜內給藥。處理周期的最後，i.p.100mg/kg的戊巴比妥處死動物。
各種不同的處理組之間爪腫脹嚴重性的差異利用方差分析ANOVA繼之以事後t檢驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
試驗性自身免疫腦脊髓炎。
自身免疫腦脊髓炎的各種動物模型是本領域已知的，這取決於誘導方法，動物的傷情以及用於誘導疾病的抗原。利用Lewis大鼠測試二環CB2配體對EAE的影響，其中誘導後約10天通過臨床症狀的表現觀察疾病的開始。疾病的進展以及臨床記分增加，並且大約15天達到頂點，誘導疾病後約18天觀察到自然恢復。動物(起始研究時每測試組至少9隻，除了未經處理的對照組，只包括5隻大鼠)保持12小時照明/12小時黑暗的作息時間，22℃恆溫，不限量給食和水。通過用s.c.注射後爪25μg純化的豚鼠髓鞘鹼性蛋白(MBP，Sigma)的0.1ml完全弗氏佐劑(Difco)的乳化液免疫這些動物而誘導EAE。
臨床上記分在0.5和1之間，顯示出疾病症狀的動物用測試化合物或者介質對照進行處理，給藥方式為從發病(誘導疾病後約第10天)開始連續3天靜脈內注射，體積為5ml/kg。甲基強的松龍用作陽性對照，其從注射MBP誘導疾病開始每天i.v.施用30mg/kg，連續5天。結果記錄為臨床記分；0分表示沒有臨床徵象的正常動物，0.5顯示尾遠部肌肉彈性的喪失，1顯示整個尾部癱瘓，2顯示截癱，3顯示四肢麻痺，4顯示整個身體癱瘓和瀕臨死亡以及5顯示死亡。發病後對動物臨床記分共11天，計算這段時間曲線下面積(AUC)。各種不同處理組之間臨床結果的差異利用方差分析(ANOVA)繼之以Fisher氏LSD檢驗進行分析。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
圖4中顯示的結果為每個處理組平均AUC的減少％。以劑量相關的方式，化合物A產生臨床記分AUC的降低，在1mg/kg劑量時明顯減少35％。結果顯示為圖4中的#，其在統計學上好(p＜0.05)於未經處理和CREMOPHOR EL∶乙醇介質處理獲得的結果。在這個試驗設置中，當以30mg/kg的劑量在發病前給藥5次時，陽性對照甲基強的松龍(MPred)減少34％。苯甲醇作為Mpred的介質，並且自然而然提高AUC 18％，數據未顯示在圖中。實驗以盲法方式獨立地重複，並獲得類似的結果，例如採用1mg/kg的化合物A，臨床記分減少30％。
此外，在單獨研究中，誘導疾病後15天i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥對動物實施安樂死。取出大腦和脊髓並用4％低聚甲醛溫育固定過夜。利用提高濃度的乙醇溶液對脊髓的頸部脫水，然後包埋入paraplast中。接著對脊髓進行切片(10μm)，並利用蘇木精和曙紅進行染色。用光學顯微鏡對浸潤淋巴細胞的病灶檢查染色的玻片。對病灶的數目進行計數，並對每個動物的6張切片加以平均。在這個系統中測試3組，每組至少4隻動物未經處理的，介質處理的，和用0.5mg/kg的化合物A處理的動物。結果表示為病灶數目的平均值±SD。各種不同的處理組中浸潤病灶數目之間的差異利用方差分析(ANOVA)繼之以學生氏t檢驗進行分析。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
未經處理的動物在它們的脊髓中顯示最高的浸潤病灶數，每個切片平均23±16個病灶。只用介質處理對這個結果沒有影響，病灶數為21±6，而0.5mg kg的化合物A使浸潤顯著降低超過50％，每個切片病灶數為10±5。當已經確診(自從發病約5天)疾病時進行這些觀察，並且支持了二環CB2配體通過阻止細胞浸潤產生損傷的炎性/免疫級聯作為有效的神經保護劑的事實。
總而言之，這些試驗結果不僅在神經系統的組織水平而且在功能性臨床結果的水平，暗示二環CB2配體為與人類多發性硬化相關的模型的有效處理劑。
小鼠的遲髮型超敏反應第0天和第1天在腹部剃毛皮膚上塗敷稀釋在丙酮中的30μl0.15％二硝基氟苯(DNFB)，對成年雌性BALB/c小鼠(平均體重20g，Harlan，以色列)致敏。在第6天，通過在一隻耳上塗敷10μl的DNFB丙酮溶液攻擊動物。對側耳不受攻擊但是塗敷10μl丙酮。以從0到15mg/kg提高的劑量i.p.施用測試化合物兩次，第一次注射緊接在DNFB攻擊後(第6天)，而第二次注射在攻擊後16小時(第7天)。每個處理組包括至少7隻動物。地塞米松(DXM)用作陽性對照。攻擊後24小時(第7天第二次處理後6小時)利用錶盤式測厚儀(Mitutoyo，Japan)確定耳的厚度。
結果分析為DNFB處理的耳厚度高於未用DNFB處理的對側耳的厚度。通過比較其對處理組動物的平均影響與只對合適的介質產生的應答，進一步評價這種測試化合物的效果。結果顯示在圖5中，其中耳厚度減少的％相對處理劑量作圖。一般而言，獲得的圖型為到達活性平穩狀態的曲線。對於陽性對照而言，我們可以發現最大抑制為約80％，而HU-308的最大抑制在60％的範圍內。對於地塞米松計算的IC50為3.2mg/kg，而對於HU-308而言IC50為4.8mg/kg。在測試的劑量下，化合物A和L沒有到達50％的抑制，它們的最大減少是在35-43％的範圍內。這些試驗結果顯示二環CB2配體可以有效處理與人類變應性和免疫應答相關的模型。
實施例10處理神經退行性紊亂MPTP模型。
帕金森氏症(PD)是一種神經退行性紊亂，其特徵在于震顫、運動減慢、僵硬以及平衡性差。如果不是所有的，大多數的這些行動障礙應歸於由黑質緻密層部分(SNpc)中多巴胺能神經元以及紋狀體中它們的突出神經纖維的喪失所引起的紋狀體多巴胺含量的顯著降低。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)是一種眾所周知的神經毒素，可以引起多巴胺含量在紋狀體中的損耗以及黑質紋狀體多巴胺能神經元的數目在幾個物種中的減少，所述物種包含人類(Turski L.等，Nature349573，1991)。本研究的目的是檢驗二環CB2配體對MPTP-誘導的多巴胺能毒性進展的影響。
動物處理和方法。
在第1天以2小時的間隔，用4次注射MPTP(Sigma USA)(20mg/kg，5ml/kg)的鹽水(Teva Medical Israel)溶液對小鼠(C57/BL雄性小鼠，平均體重30g，Harlan，Israel)i.p.給藥。包含(a)鹽水，未處理的，(b)MPTP，未處理的，(c)介質(1∶20的CREMOPHOR EL∶乙醇)，5ml/kg i.p.，以及(d)測試化合物的處理組僅在第一次MPTP給藥前經一次i.p.給藥。MPTP處理動物後七天處死動物(通過i.p.施用戊巴比妥鈉CTS，以色列100mg/kg)，取出大腦利用免疫組織化學技術檢測酪氨酸羥化酶(TH)。
免疫組織化學。
通過心臟灌注4％低聚甲醛繼之以大腦浸入相同的固定劑至少72小時固定大腦。然後用PBS洗大腦並轉入30％蔗糖的PBS溶液中直到它們下沉。大腦沉入蔗糖後，利用專用製冷器速凍(-60℃)進行冷凍。然後在黑質(SN)的平面對大腦進行低溫切片(20μm)。利用兔抗酪氨酸羥化酶(1∶100，Calbiochem)進行免疫組織化學染色。利用自動免疫染色系統(Ventana)的二氨基聯苯胺(DAB)檢測試劑盒對玻片染色。通過在SNpc側面到第三腦神經根部的最寬尺寸處對免疫活性(IR)細胞計數進行定量分析，所述第三腦神經在interpreduncular核的平面將中間和側面SN分離開來。紋狀體平面的標記量利用計算機化圖象分析系統進行評估。
所有的數據表示為平均值±SD。利用方差分析(ANOVA)繼之以事後Fisher檢驗分析數據。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。在SNpc平面上的TH免疫反應性。
圖6顯示了i.p.20mg/kg的HU-308在帕金森氏症MPTP模型中的作用。對每個處理組在MPTP注射和處理後SNpc平面TH-IR細胞/mm2的數目作圖。黑色柱-鹽水注射的未處理組。黑色帶點柱-MPTP注射的未處理組。陰影柱-MPTP注射的用化合物介質處理的組。白色柱-MPTP注射的用HU-308處理組。柱上的符號是指統計分析#與鹽水處理組相比p＜0.05；*與介質相比p＜0.05。注射MPTP後，TH-IR細胞的數目與鹽水處理的動物相比減少65％(58±10鹽水組對20±3MPTP組)。計算處理組相對於MPTP處理組的TH-IR結果顯示HU-308從MPTP毒性拯救約43％的SN多巴胺能細胞。介質本身對TH-IR細胞沒有拯救作用。這些結果顯示二環CB2配體對慢性神經退行性疾病諸如帕金森氏症的模型是有效的。
實施例11內臟疼痛的處理減弱機械痛覺過敏(allodynia)。
這個研究的目的是評價新二環CB2結合化合物在內臟疼痛動物模型中可能的止痛效果。內臟疼痛由諸如胃、腎、膽囊、膀胱、腸等內臟器官紊亂引起。這些紊亂包含來自碰撞或者腫瘤的膨脹、局部缺血、腸繫膜上的炎症和粘連，其可以引起相關徵狀，諸如發燒、不適和疼痛(Al-Haer E.D.等，Pain 96221-5，2002)。內臟疼痛由i.p.注射乙酸誘導小鼠產生。
通過i.v.注射5ml/kg體積劑量的介質、不同劑量的對照和測試化合物對雄性ICR小鼠(平均體重25g，Harlan，Israel)進行預處理。每個處理組由至少4隻動物組成。十五分鐘以後，給小鼠i.p.注射10ml/kg的0.6％乙酸，並在乙酸給藥後5分鐘開始記下5分鐘時間段內萎靡小鼠的數目。結果表示為萎靡平均數±SD。利用方差分析(ANOVA)繼之以事後Fisher試驗分析數據。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
未處理的動物顯示為平均30.5±4.3萎靡，而介質處理的只有輕微的非顯著的結果，降低萎靡數目到21.8±3.4。然而，劑量範圍在從0.5到2mk/kg的化合物A在這個模型中效率很高，甚至在最低劑量時仍然具有統計顯著性(p＝0.015)。在0.5mg/kg劑量時，與介質相比化合物A已經降低了64％的萎靡數至7.9±4.8，在1mg/kg劑量時抑制高達95％，只有1.2±0.6的萎靡數，而在2mg/kg的劑量時化合物A顯示完全保護，抑制率達100％，並且根本沒有萎靡的動物。這些試驗結果支持了二環CB2結合化合物是有效止痛的並且防止內臟疼痛。
實施例12處理慢性神經性疼痛減弱機械痛覺過敏。
這個研究的目的是評定新二環CB2結合化合物在神經性疼痛動物模型中的可能止痛效果。坐骨神經慢性收縮後在大鼠右後肢誘導外周monopathy(Bennet，G.J. Xie，Y-K.，Pain 3387-107，1988)。利用建立的行為測試監控機械allodyna的發展(Von Frey纖維)。
確定手術前的基準值作為兩個術前值的平均數。一旦建立了基準值，通過用4根松的鉻羊腸線收緊右側坐骨神經準備動物外科手術。手術後第11天，將基於預手術值已經發展了機械allodyna的動物隨機分配給各種不同的處理組。
根據是否正在施用藥物或者介質，以掩蔽方式進行隨機設計。在測試前，使雄性Sprague-Dawley大鼠適應行為測試設備。在測試這天，每處理組至少6隻動物以2.5ml/kg的體積i.p.施用單劑量的一種測試化合物。15分鐘以後，一系列Von Frey纖維(在測試前預先標定)自下而上施用於後爪的趾面。從最弱力開始以逐漸遞增的順序施加纖維並且評價同側和對側後爪的退縮閾值。每一纖維在腳的中趾面到它剛剛開始彎曲的點壓痕；每一纖維以大約1Hz的頻率重複大約8-10次。縮回閾值被定義為兩種或多種連續Von Frey氏纖維引發一種反射縮回應答(即，一種短暫的爪翹起)的最小壓力，並以克進行測定。
圖7顯示化合物A在神經性疼痛的慢性壓縮神經損傷模型中的作用。結果被表示為在測試化合物處理組中相對介質處理的動物中對VonFrey氏纖維的應答閾值增加的百分比，且根據定義，介質處理組產生無效的基準值。黑色柱表示嗎啡處理的動物(4mg/kg)，灰色和帶點的柱條表示兩種劑量的化合物A(分別為0.5和1mg/kg)。從這個研究中可以看出處理15分鐘後，用4mg/kg劑量的嗎啡處理的動物在其同側的後爪比介質處理組的動物具有91％的更高疼痛閾值。用0.5mg/kg和1mg/kg的化合物A處理的組分別顯示出疼痛閾值增加71％和64％，而在單獨實驗中，用5mg/kg的HU-308處理的動物顯示出117％的改善(數據未顯示)。這些結果表明本發明的二環CB2配體和已知的CB2激動劑HU-308一樣可減輕或治療慢性神經性疼痛。迄今為止，已知HU-308減輕在福馬林測定中評價的外周疼痛(WO 01/32169)。
此外，如實施例10所述，應該注意到化合物A在試驗性自身免疫腦脊髓炎系統模擬的人多發性硬化中是有效的。患有MS的病人不但經受神經缺陷而且發展為嚴重的神經性疼痛。本發明的化合物可同時治療這兩個方面疾病的事實賦於它們顯著的治療優點。
實施例13急性外周疼痛的處理尾部翹起模型。
本研究的目的是用來評價新二環CB2結合化合物在急性疼痛動物模型中潛在的止痛作用。在此模型中，傷害性刺激是熱，並監控直到動物尾部翹起的時間(Le Bars D.，Gozariu M. Cadden S.W.，Pharmacol.Rev.53597-652，2001)。
ICR雄性小鼠(平均體重為20-30g，Harlan，Israel)以5ml/kg的體積劑量進行i.p.注射。每一處理組包含至少6隻動物。嗎啡HCl以5mg/kg的終劑量用作陽性對照。其介質，鹽也被包括在對照中。將測試的化合物溶於CREMOPHOR EL∶乙醇中，並在注射之前以1∶20稀釋在鹽水中，第二種介質也被包括在陰性對照中。注射的終劑量從0.1到10mg/kg。在注射處理物後的預定時間點，動物被放入在尾部翹起系統中(Socrel，model DS 20)。動物輕輕地固定，而它們的尾部被置於光電池上。然後在距離末梢2cm處照射(21V)尾部且記錄按秒計量的潛伏時間，一式兩份。在研究的最後，通過i.p注射100mg/kg的戊巴比妥鈉對動物實施安樂死。
下列兩個參數被用於分析結果潛伏時間和顯示痛覺喪失動物的％。通過後者我們測定處理組中有多少動物已經增加了對疼痛的抗性，通過潛伏時間測定，所述潛伏時間高於或等於介質處理動物中所觀測的潛伏時間的兩倍。兩種情況下的結果表示為平均數±SE。不同處理組之間的顯示痛覺喪失的動物的潛伏時間或百分率之間的差異通過方差分析(ANOVA)繼之以事後Tukey氏檢驗(用於潛伏時間)或Fisher氏精確試驗(用於動物百分率)進行分析。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
圖8顯示了在用於急性疼痛的尾部翹起模型中，不同劑量化合物A(帶點柱)和化合物R(陰影柱)的作用。注射後30分鐘進行測定時(圖A)，兩個對照組的潛伏時間是類似的，對於鹽水為2.65秒，而對於測試化合物的介質為2.89秒。陽性對照嗎啡為5mg/kg時增加潛伏時間到7.5秒(與鹽水相比p＜0.05，用星號標記在圖表中)。測試化合物A在所有從2到10mg kg的測試劑量時都顯著地(與介質相比p＜0.05，用星號標記在圖表上)增加了潛伏時間，在最大測試劑量處具有7.1秒的最長潛伏時間。當注射90分鐘後(圖B)進行測定時，嗎啡的作用顯著地減少且其潛伏時間現在僅僅為3.9秒，幾乎倒回到基線，而化合物A和R的作用保持相對穩定。在最佳的測試劑量10mg/kg時，化合物A在注射後90分鐘，仍然產生7.3秒的潛伏時間，而化合物R的最大潛伏時間保持高達8.5秒。當基於顯示痛覺喪失的動物百分率分析時，結果看上去更為顯著。然後我們觀察到在注射後90分鐘，僅僅大約40％的用5mg/kg嗎啡處理的動物仍然顯示痛覺喪失，而超過80％的用10mg/kg化合物A處理的動物和100％的用10mg/kg化合物R處理的動物具有超過兩倍於介質處理的動物的潛伏時間。甚至注射後330分鐘，8和10mg/kg劑量的化合物A痛覺喪失仍然是明顯的。化合物R更為顯著，100％的用10mg/kg化合物R處理的動物在注射後330分鐘仍然顯示增加的痛覺喪失，在此時間點絕對的潛伏時間仍然高達6.8秒。4和8mg/kg較低劑量的化合物R仍然兩倍於5mg/kg嗎啡所產生的痛覺喪失。
有趣的是注意到，化合物A相反的對映異構體，其中其它所有參數與C-5是R的相同，在此實驗設置中進行測試，且被證明是無效的。化合物A的(+)對映異構體，即(4R)-4-[4-(1』，1』-二甲基庚基)-2，6-二羥苯基]-6，6-二甲基-2-norpinanone根據Makriyannis及其合作者的方案利用(-)-β-蒎烯作為初始材料進行合成(Drake D.J.等，J.Med.Chem.413596-3608，1998)。經i.p.注射4mg/kg的化合物A，(-)對映異構體處理的動物在給藥30分鐘後顯示出潛伏時間增加，為4.9秒，用介質處理的動物為2.8秒，而用4mg/kg的(+)對映異構體處理的動物具有僅僅2.4秒的平均潛伏時間。由(+)和(-)對映異構體得到的結果之間的差異在統計學上是顯著的(雙尾不成對的t檢驗，p＝0.04)。此外，化合物A也比其(+)對映異構體對CB2具有更高的選擇性，對CB2的IC50低10倍，CB2/CB1比例為約30，而對映異構體僅為10。
對Sprague Dawley雄性大鼠進行類似的研究，其中藥物在小鼠模型中通過i.v.注射代替i.p.注射。獲得可比較的結果，僅在引發顯著增加的潛伏時間所需的劑量(與i.p相比在i.v中更低)，作用的開始(與i.p相比在i.v中更迅速)以及作用的持續時間(與i.p相比在i.v中更短)方面有細微的差別。這些觀察與給藥途徑相一致。在i.p研究中注射後的第一個時間點是30分鐘，而i.v注射後其為10分鐘，因此在這些實驗中，作用的開始時間沒有全面地測定。i.v注射後90分鐘，100％的用3或4mg/kg的化合物A處理的動物仍然具有超過介質處理的動物兩倍的潛伏時間。在最後的測試時間點(注射後330分鐘)，幾乎70％的用4mg/kg化合物A處理的動物保持增加的對疼痛的抗性。
一旦確定了最佳的劑量，在此單劑量重複實驗較長的一段時間以確定止痛作用的持續時間。圖9A顯示了在5mg/kg的嗎啡劑量時，潛伏時間更加快速地回到介質的基準值，且注射後兩個半小時嗎啡處理的動物的潛伏時間為3.1秒，而用介質處理組為2.6秒，上述顯示類似於鹽水。這些觀察與已知的嗎啡短期止痛作用相一致。然而，10mg/kg劑量的化合物A，N，R和Z產生持續的止痛作用直到實驗的最後測試時間點。注射5個半小時後，化合物A，N，R和Z處理的動物分別顯示出4.9，5.4，6.8和5.2秒的潛伏時間。在此時間點，介質處理的動物具有2.5秒的潛伏時間直到尾部翹起，而嗎啡處理的動物被輕微保護，具有3.6秒的潛伏時間。當用顯示增加痛覺喪失的動物的數目進行分析時，圖9B描述了相同實驗的結果。結果顯示了相似的模式，其中顯示嗎啡處理動物中增加的痛覺喪失的動物數目從注射後半小時的88％快速降至處理後5個半小時的17％。在用10mg/kg化合物A處理的組中，以更緩和的速度降低顯示痛覺喪失提高的動物的百分比，從研究開始的100％降至5個半小時後的80％，以及對於化合物N和Z而言，從70-90％降至研究結束時的大約60％。在用10mg/kg的化合物R處理的組中獲得了最顯著的結果，其中100％的動物顯示增加對疼痛的抗性，在整個研究期間，用潛伏時間表示是介質的兩倍。
從這些結果可知，二環CB2配體具有比嗎啡時間延長的止痛作用，且它們可減輕或治療急性外周疼痛。雖然可與處理的早期相比較，但是在注射後至多90分鐘，二環CB2配體在獲得的潛伏時間和實現增加潛伏時間的動物的百分比方面都開始開始優於嗎啡。應當記住本發明的化合物是CB2選擇性的，但其中的一些也的確保留對CB1受體的生理學顯著的結合能力。我們不能排除一些觀察到的活性是只取決於CB1的激活或與更強的CB2的激活的結合。儘管本發明的一些化合物的殘餘CB1結合活性，二環CB2配體仍然在副作用，諸如耐受性方面具有顯著優於嗎啡的優點，這將在下面討論。
實施例14炎性疼痛的處理大鼠的爪浮腫模型。
此研究的目的是測定化合物對在動物後爪注射2％的λ角叉菜膠誘導的爪浮腫的抗炎性疼痛活性。雄性Sprague Dawley大鼠(平均體重200g，Harlan，以色列)在注射期間被放置在乾冰上進行短暫鎮靜。在大鼠的一個(右)爪的足底區皮下注射0.1ml的2％w/vλ角叉菜膠的無菌鹽水溶液。因為文獻的數據通過我們自己的經驗已證實，表明注射0.1ml的生理鹽水不影響隨後的止痛測定，因此對側的(左)爪不用注射。測試化合物，包括已知的抗炎性對照，溶於CREMOPHOR EL∶乙醇中，並在角叉菜膠注射後立即進行的i.p注射之前以1∶20或1∶50進一步稀釋在無菌鹽水中。誘導炎性疼痛前和注射後3小時，在兩個系統中測定動物對痛覺刺激的反應。第一刺激是熱，並根據Hargreaves的足底實驗利用Ugo Basile模型7370進行評價。刻度設定到50個任意單位的強度。對紅腫和非紅腫後爪記錄直到動物舉起爪作為對熱刺激的反應的潛伏時間。第二刺激是機械的(觸覺)，並利用DynamicPlantar Sesthesiomether(Ugo Basile Model 73400-002)進行評價。系統被設置在50克的最大力，且施加的力以10g/秒的速率逐步增加。在研究的結束，用100mg/kg的戊巴比妥對動物實施安樂死。
結果測定成在0小時和3小時的兩個後爪之間的差，對研究的熱部分中的潛伏時間為ΔLT，而對研究的機械部分的力為Δ力。每一處理組的結果被表示為平均值±SE，且組之間的差別通過方差分析(ANOVA)繼之以事後Tukey氏實驗進行分析。p＜0.5的值被認為是統計學上顯著的。
給藥2％λ角叉菜膠誘導爪炎症，通過爪的腫脹和紅色表徵。炎症誘導後3個小時，未經處理的或僅用介質處理的動物在熱刺激後後爪之間顯示出大約5到7秒的ΔLT。當該動物用8mg/kg的化合物A(ΔLT＝1.5秒)或10mg/kg的化合物N(ΔLT＝2秒)處理時，這些結果減少了大約3倍，且當動物用10mg/kg化合物R處理時降至ALT＝0秒。在此模型中，5mg/kg嗎啡也是有效的且減少ALT到0秒。當施加的刺激是觸覺型時，人們觀察到引起大鼠舉起它們的爪所需的力減少了17(從注射角叉菜膠之前的47g降至3個小時後的30g)。同樣該結果在未經處理的和用介質處理的動物中是非常相似的，而8mg/kg的化合物A顯著地減少該結果，降至僅僅2g的Δ力，化合物N產生6g的Δ力，化合物R產生4g的Δ力，且化合物Z產生僅僅2g的Δ力，後面的化合物以10mg/kg進行測試。在2mg/kg劑量時，化合物L在未經處理的或介質處理的動物引起Δ力的減少從大約20g降至11g。這些值類似於由1mg/kg的化合物R得到的結果，其被證明在較高的濃度是有效的，然而這種正趨勢沒有統計學顯著性。在此模型中，5mg/kg嗎啡也是同樣有效的，且減少Δ力到2.7克。
二環CB2配體的抗炎止痛活性不僅與麻醉劑而且與非類固醇抗炎藥物(NSAID)進行比較。在此模型中下列三種藥物被測試Celecoxib(COX-2抑制劑)，Ketoprofen(COX-1抑制因子)和DiClofenac(混合的COX-1和COX-2抑制劑)。下列3種劑量的NSAIDS被測試5，10和20mg/kg，且選擇10mg/kg劑量的中間體用於其餘的研究。在以10mg/kg劑量腹腔注射時，所有3種藥物是非常有效的，且減少ΔLT到0秒，然而這些結果是不顯著的，與10mg/kg化合物R的作用相反。當表示為Δ力時，僅僅Diclofenac和Ketoprofen顯示的活性分別為2和7g。這些值與A，N，R和Z相比在相同的範圍中。
應注意的是，在5mg/kg i.p.注射CB1拮抗劑SR141716A或CB2拮抗劑SR144528的情況下，化合物R也在此實驗設置中被測試，在角叉菜膠和化合物前15分鐘給藥。拮抗劑獨自給藥沒有止痛活性。化合物R抗熱和機械刺激的止痛活性不被任何拮抗劑逆轉。這些觀察可通過拮抗劑沒有充分地阻斷此特異活性的事實，或一些化合物的活性不通過CB2結合介導而是通過可選擇的機制，例如通過結合其它的尚未鑑定的大麻鹼受體或通過非受體介導的機制的假說來解釋。
總之，這些結果證明了本發明的二環CB2配體是有效的鎮痛藥，具有類似於或優於嗎啡或NSAIDS的活性。這些活性是通過CB2結合還是通過可選擇的機制介導的仍有待於確定。市售的上述治療劑的副作用是眾所周知的，因此本發明的化合物可有利地代替它們。
實施例15外周有害疼痛的處理福馬林實驗。
通過外周神經系統介導的疼痛，在用於皮膚(外周的)疼痛的「福馬林試驗」中(Tiolson A.等，Pain 515-17，1992)進行測試。首先，測試的化合物經i.p.注射。然後在注射該測試化合物後90分鐘在小鼠的後爪的趾面s.c注射福馬林。福馬林給藥後立即通過動物舔注射福馬林的爪的次數來評價疼痛(每5分鐘評價一次，持續1小時)。
實施例16腺苷醯基環化酶分析。
大麻鹼及衍生物結合G蛋白偶聯的CB1以及CB2受體，並且通過抑制腺苷醯基環化酶的活性行使它們的活性。通過確定它們抑制或者促進毛喉素-活化的cAMP的產生能力，對腺苷醯基環化酶的分析形成了化合物功能分析的基礎。根據Chin等人(Chin，C.N.等，J.Neurochem.70366-73，1998)進行分析。簡要地，用人類CB1或者CB2受體(cDNA)穩定轉染的HEK-293人類腎細胞(ATCC#CRL-1573)生長在補充有10％胎牛血清，1％青黴素-鏈黴素和2mM L-穀氨醯胺的DMEM中。細胞以5×104細胞/微孔接種在24微孔板中，並培養48小時。然後除去培養基並用PBS清洗粘附細胞。向每個微孔添加補充有0.2mM Ro 20-1724，0.25％BSA以及20mM HEPES的200μl不含血清的培養基。然後在濃度範圍從10pM直至1μM的二環測試化合物的存在下用1μM毛喉素活化細胞。然後將活化的細胞培養在37℃20分鐘，並加入1.2M HC1到終濃度0.1M以終止反應。通過凍融裂解細胞，並用pH7.5的2M HEPES中和裂解物。利用[3H]-cAMP分析系統(Amersham)測量每份50μl的cAMP。
在這個系統中評價兩個參數，觀察達到cAMP最大抑制水平50％的劑量(IC50)以及用1μM的測試化合物所達到的抑制水平。必須指出，因為毛喉素通過多種方式活化cAMP的產生，所以只作用於一種受體或者有限量激活途徑的化合物一定難以預料100％的總抑制。這個實驗首先在CB2受體轉染的細胞上進行。在1μM時，確定下列化合物的IC50和％抑制HU-210作為參考(1.43nM和50％)，化合物A(0.24nM和63％)，L(未確定和33％)，R(0.47nM和64％)，S(0.16nM和58％)以及Y(1.13nM和60％)。對於對照而言，測試化合物也在非轉染的HEK-293細胞中進行測試，並在cAMP的水平上沒有觀察到抑制，這支持了先前描述的結果實際上特異於CB2受體的事實。對CB1結合的IC50為0.328nM的參比化合物HU-210，在CB1轉染的細胞中顯示對cAMP的IC50為0.35nM，在1μM最大的抑制為73％。同樣，化合物A在CB1轉染的細胞中顯示對抑制毛喉素誘導的cAMP產生的IC50為10.3nM，在1μM時最大抑制為69％。CB1結合化合物A的IC50與28nM的值範圍相同。IC50介於結合活性和功能抑制cAMP產生之間的類似性，進一步支持了這個實驗設置的相關性。這些結果顯示二環CB2配體不僅與受體結合而且引起源於足夠受體激活的適當的功能性引發。從這些觀察可以推導出本發明的二環CB2配體起對受體激動劑的作用。
另外，穩定表達外源人類CB1或者CB2受體和連接到環-AMP反應元件(CRE)的螢光素酶報告基因的哺乳動物細胞用諸如毛喉素或者鈣離子載體的不同刺激物活化。激活後，提取細胞並通過螢光素酶分析按照發光單位測量報告基因的活性。環狀-AMP的水平通過螢光素酶活性的增加得以反映。
實施例17化合物模擬精神病的作用。
雄性ICR小鼠(平均體重25g，Harlan，Israel)用於一系列影響精神作用的試驗，具體地為運動活性和直腸溫度。在適當的時候，測試化合物、已知的和特異性CB1和CB2拮抗劑溶於稀釋在鹽水中的介質中，並且以直至3mg/kg i.v.的劑量i.p.或者i.v.注射，所述體積不超過0.05ml/10g體重的小鼠。首次用於實驗的小鼠作為對照。每個處理組由至少6隻動物組成。
i.v.給藥處理後5分鐘或者i.p.注射後30分鐘將動物置於露地(60×50cm)。利用基於計算機系統(ViewPoint，France)的錄象記錄它們的運動活性。記錄下列參數3分鐘總距離，時間和動物移動的速度。在露地檢查結束時，利用恆溫溫度計(Cole Parker型8402-00)和恆溫探針(YSI 400型號402)監控另一參數直腸體溫。
結果表示為平均值±SE，介質和處理之間的差異通過ANOVA繼之以事後Tukey氏試驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
就動物移動的總距離而言，觀察處理組之間的波動。i.v.注射介質的動物在3分鐘隨訪期間移動1000cm。施用0.1，0.5和1mg/kg化合物A的動物顯示增強的運動活性，總距離在1300和1400cm之間。這個增強統計上是不顯著的。施用1，2，3，4，5和6mg/kg化合物R的動物同樣顯示所行總距離的波動，並且這種現象沒有統計顯著性。同樣，介質處理動物的平均速度是5.9秒/cm，而用0.1，0.5和1mg/kg化合物Ai.v.處理的動物的移動速度稍有增加，達7到7.2秒/cm。用1，2，3，4，5和6mg/kg化合物R處理的動物以從4到8秒/cm的速度以劑量依賴的方式移動。這些速度差異在任一方向都不是統計上顯著的。最後，介質處理動物的平均直腸體溫是38.4℃。化合物A和R誘導適中約2℃的低溫症，這在統計學上是顯著的，但是在沒有嚴格生理意義的範圍內。利用i.p.給藥途徑反覆進行這些實驗，並且產生類似的觀察。兩種給藥途徑之間的唯一差異是i.p.注射的試驗劑量約為更高的數量級，測試化合物A直至30mg/kg i.p.，而測試化合物R直至40mg/kg。
雖然化合物A和R顯示一些適中的副作用，但是這些現象只在劑量遠遠超過它們的有效劑量至少6-8倍時觀察到，並且小鼠全部對化合物耐受性良好。沒有觀察到死亡，因此最大耐受劑量遠遠超過40mg/kg i.p。注射後在非常短的周期內監控二環CB2配體的行為作用並且被證明是不僅適中而且是瞬時的，因為注射後24小時所有動物都恢復到基線行為。應該記住本發明的化合物優選地結合CB2受體，但是有些化合物保持對CB1受體的結合能力，所述CB1受體已知介導這種副作用。關於這點，應注意到化合物A和R結合CB1受體，IC50為約30-40nM。因此可以假定以最低親合性結合CB1受體的化合物，表達為置換高於40nM的IC50值，甚至會更安全。
測試化合物對全部運動能力的作用在第二實驗設置中進行評定，其中如Rozas等人所述(Rozas G.等人，J.of Neuroscience Methods 83165-75，1998)利用rotarod裝置進行動物的功能試驗。開始實驗前4天訓練動物雄性ICR小鼠(平均體重40g，Harlan，Israel)。它們的任務是停留在加速竿上不落下12分鐘(每個速度3分鐘)。試驗速度為15，19，23和27rpm。對竿上的動物表現記分如下每個動物以每個速度可以獲得在竿上完全行走的3個點(每分鐘1點)的最大值。因此，動物可以得到12點的滿分(每個速度3點)。對動物圍著的每3周來說，抓住竿的環繞橫梁沒有移動減去0.5點。前3周不影響記分。適當訓練後，每組至少6隻動物i.p.施用各種劑量的測試化合物和對照，體積劑量為5ml/kg。注射化合物前零時間以及施用化合物或者介質後30分鐘，3和24小時在rotarod裝置中確定記分。
結果表示為平均值±SD，介質和處理之間的差異通過ANOVA繼之以事後Tukey氏檢驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。在所有時間點，介質處理的動物顯示最高分12，因為無論如何它們的運動能力不受影響。用10mg/kg化合物A處理的動物顯示統計上是顯著的，但是注射後三十分鐘運動活性瞬時降低，平均分為5.6。以後時點這種效果消失，在3和24小時平均分分別為9.7以及11.9。在第一個半小時觀察到的這種瞬時作用可能由於CB1結合化合物A的能力，這暗示與CB1受體以最低親合性結合的化合物甚至會更安全。基於這些結果，在注射後至少半小時的時間點，測試化合物以保證觀察到的作用如果存在的話可以最低限度受到剩餘CB1結合能力的影響。
實施例18化合物對心血管系統的作用。
這個研究的目的是評價測試化合物對雄性Sprague Dawley大鼠(270-350g，Harlan，Israel)的安全性。測試化合物溶於介質中，以1∶20稀釋在無菌鹽水中，並i.v.或者i.p.注射，i.v.給藥的劑量範圍從0.1到2mg/kg，或者i.p.給藥的劑量範圍為10到40mg/kg，體積為每100g體重0.5ml。每個處理組由至少6隻動物組成。氟烷麻醉(誘導4％並維持)的條件下將一套管(PE 50，Clay Adams，USA)植入股動脈。將導管插入靜脈用於藥物給藥。動脈插管附著於壓力傳感器(Ohmeda DT-XX USA)。轉換器連接一數據收集系統(Biopac，USA)。在處理之前記錄心率(HR)、平均動脈血壓(MABP)和心電圖(ECG鉛2)20分鐘用於確立穩定的基線，直至注射測試化合物後60分鐘。通過一直腸熱敏探示器(YSI模型400，USA)將動物也連接到溫度記錄器，並在研究期間監控直腸溫度。研究結束時，通過i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥鈉處死動物。
介質和處理之間的差異通過單向ANOVA繼之以事後Newman-Keuls檢驗(Prism軟體，獲自Graphpad，San Diego)進行比較。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
介質處理的動物血壓值沒有表現出變化。在約100mmHg的平均值時，MABP保持穩定。化合物A誘導劑量相關的瞬時壓力過低。在最低i.v.試驗劑量，0.1mg/kg注射後5分鐘只引起4mmHg的降低，在以後的時間點(15，30，45和60分鐘)處理動物的MABP恢復到基線。在化合物A的中間劑量0.5mg/kg，在5分鐘MABP減少約25mmHg，注射後30分鐘逐漸升高回到基線範圍，在最高劑量1mg/kg下，5分鐘時的MABP減少約30mmHg，注射後45分鐘逐漸升高回到基線範圍。1mg/kg劑量的化合物R獲得類似的結果。當i.p.注射時，在直至30mg/kg的劑量時化合物A引起不超過15mmHg適中的血壓過低，而在40mg/kg劑量時化合物R引起至多36mmHg的降低。沒有一個試驗劑量是血壓過低致死的，而且在化合物A和R的最高劑量至多45分鐘期間這個現象是瞬時的。如果血壓過低表現為MABP減少超過50％或者表現為效應延長，則該測試化合物的安全性可能受到質疑。
介質處理動物的心率顯示出與穩定的基準值約每分鐘350次具有非常類似的模式，而0.1mg/kg的化合物A引起HR輕微和瞬時的降低，而更高劑量引起HR更清晰並且更延長的降低。HR的最大下降為約每分鐘80次並且不持續超過15分鐘，注射後最多45分鐘內恢復到正常基準值。此外，當i.p.注射化合物時，化合物A高達20mg/kg的劑量和化合物R高達40mg/kg的劑量幾乎對HR沒有影響。在1小時隨訪(從基線5％)的時間內，20mg/kg的化合物A只引起每分鐘約17次的微小降低，而40mg/kg的化合物R引起10％幅度的微小波動，結果平均只降低每分鐘約4次。相比而言，介質處理的動物在HR上也顯示約17次/分鐘的微小降低，與基線相比降低5％。如果對心率的影響表現為每分鐘脈搏的數目減少超過50％或者表現為效應延長，則該測試化合物的安全性可能受到質疑。
在這個研究期間沒有達到最大耐受劑量，並且可以假定經i.p.給藥途徑，這個值比至少40mg/kg更高。根據使用的模型以及試驗的症狀，本發明的化合物在mg/kg的劑量範圍內顯示出治療上顯著的活性(從約0.1直至10mg/kg)。因此治療範圍大大低於尚未確認的毒性範圍，該毒性範圍至少高出4倍。例如在EAE中，1mg/kg i.p.化合物A引起臨床記分AUC顯著減少35％，在這種情況下治療指數至少為40，而在爪浮腫的情況下，i.p.0.5mg/kg的化合物R引起爪厚度減少31％，在這種情況下治療指數至少為80。應該記住在這些模型中，測試化合物的結果可與市售藥物的活性相比較。總而言之，這些結果支持本發明的二環CB2配體對治療很寬範圍的疾病和紊亂都是安全的，並且是有效的替代物。
實施例19反覆施用化合物對耐受進展的影響。
當利用嗎啡處置嚴重疼痛狀況時，醫學團體遇到的主要問題之一是隨時間病人形成對藥物的耐受的事實。為了保持止痛活性，首先可以逐漸增加嗎啡的劑量，但是長期使用將達到飽和點，藥物將不再減輕疼痛。也可能形成大麻鹼對CB1受體的選擇性耐受。上述實施例17和18所述的研究已經證實，一些二環CB2配體的剩餘CB1結合力沒有引起嚴重的和延長的副作用，並且全部耐受性良好。對於進一步加強本發明化合物的安全特性，測試了它們誘導耐受的能力。
在上述的尾部翹起模型中評價耐受性。簡要地，每日二次給每個10隻動物的組i.p.施用測試化合物直至10天。如先前實施例13所述，在第1，4，8和10天第一次給藥後30分鐘測定有害疼痛閾。結果表示為直到動物翹起其尾部的平均潛伏時間±SE。潛伏時間或者各種處理組中顯示痛覺消失的動物的％之間的差異通過方差分析(ANOVA)繼之以事後Tukey氏試驗(對於潛伏時間)或者Fisher氏精確試驗(對於％動物)進行分析。p＜0.05的值被認為是統計學上顯著的。
結果描述在圖10中，其中圖A顯示了與嗎啡相比化合物A對潛伏時間的影響，而圖B顯示了對顯示痛覺消失增加的動物％的影響。每日施用5mg/kg嗎啡兩次，共10天，引起處理動物所期望的耐受性發展，表現為在整個研究期間潛伏時間和痛覺消失增加動物的百分比均逐漸降低。在第1天潛伏時間為7.5秒，在第10天潛伏時間僅僅為5.8秒，而在第1天顯示痛覺消失增加的動物的％為80％，而在第10天僅僅為30％。另一方面，每日兩次注射10mg/kg的化合物A對這些參數沒有顯著的影響，意思指20次以先前證明治療有效的劑量施用化合物A不引起耐受性的發展。具體地，用10mg/kg化合物A處理的動物在第1天觀察到的潛伏時間為8.1秒，而在第10天潛伏時間仍然高達7秒，而在第1天顯示痛覺消失增加的動物為88％，而在第10天仍然為80％。而且，應該注意到在第10天評價直腸體溫，並且發現兩個處理組都在正常範圍內。總而言之，這些研究證實不僅本發明的化合物比嗎啡在止痛中更有效，而且它們也更安全，因為它們不誘導耐受性。
實施例20I型糖尿病NOD小鼠模型。在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型中，測試實驗設置中與人類胰島素-依賴的糖尿病有關的二環結合化合物的預防活性。
在第1天稱重NOD/lt雌性小鼠(研究開始時，70-80天齡，Harlan，Israel)。利用通過切斷尾部的頂端獲得的一滴血液和具有合適的glucosticks的糖度計(Elite，Bayer)確定它們的基線葡萄糖水平。然後以300mg/kg劑量i.p.注射小鼠稀釋在鹽水中的環磷醯胺(Sigma)。每隔一天利用尿multisticks(Bayer)監控動物尿液中葡萄糖的存在。當試驗顯示動物達到葡萄糖尿時，過夜飢餓後連續兩天再評價血液中葡萄糖的水平。如果它們的葡萄糖血液水平高於300mg/dl，動物被確診為患糖尿病。糖尿病診斷後3天，通過i.p.注射戊巴比妥鈉100mg/kg處死動物。取出它們的脾和胰腺進行進一步研究，包括FACS分析脾中的T細胞亞群以及胰腺的組織和免疫病理學評估。
對每個動物在10個Langerhans胰島上進行組織病理學評估，並根據下列方法記分(Sempe P.等人，Eur.J.Immunol.211163，1991)。根據單核細胞浸潤的水平對損傷的嚴重性記分0-沒有浸潤，1-小導管周圍浸潤，2-胰島周圍浸潤，3-胰島內浸潤，4-與β細胞破裂相關的胰島內浸潤。每個動物的胰腺平均分數通過總分除以檢查的胰島數進行計算。
實施例21腎缺血。
在大鼠的急性腎缺血模型中測試二環CB2結合化合物的腎預防活性。
用分別為8和35mg/kg的甲苯噻嗪和戊巴比妥的組合i.p.注射麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(平均體重250g，Harlan，以色列)。然後在兩個腎上雙側誘導45-分鐘的局部缺血。服鎮靜劑的動物仰臥放置。給腹部皮膚剃毛並用70％乙醇消毒。進行中線皮膚切口(2-3釐米長)，並通過切割腹白線打開腹部。輕輕地將腸移動到反方向後仔細研究腎。當進行這些工作時，用溼(溫鹽水37℃)無菌海綿覆蓋腸。通過從周圍脂肪鈍器解剖分離腎動脈，並用動脈用微鑷子(FST加拿大)在腎門與腎靜脈一起封閉。動脈封閉後迅即變蒼白的腎被認為是缺血性的。只有兩個腎都顯示缺血的動物才包括在研究中。在缺血性損傷期間將腸返回腹腔內。用溼海錦(它們通過衝冼溫鹽水保持潮溼)覆蓋傷口。另外，監視直腸溫度保持在37℃-38℃之間。利用熱敏電阻(YSI USA型號400)和計量裝置(Cole Farmer型號8402-00)測量直腸溫度。
局部缺血開始後四十五分鐘，除去動脈鉗。通過腎恢復粉紅色驗證再灌注。然後用3-0絲縫線材料(Assut，瑞士)封閉傷口兩層(腹腔壁和皮膚)。缺血性損傷後第1，3和7天，在麻醉室中用乙醚輕微麻醉動物，並在低眼眶凹處穿刺後收集血樣。血液收集在微量離心管中並離心(4000rpm，5分鐘)。然後分離血清並在評估肌酐和血液尿素氮(BUN)的血液水平前保藏在-20℃。研究結束時，i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥鈉使動物安樂死。取出腎，稱重並保藏在4％甲醛溶液中用於其它可能的用途。
缺血性損傷的結束後迅即對每組10隻動物以5ml/kg劑量i.v.施用處理物到股靜脈中。結果與缺血性(介質處理的)和偽品(相同的方法，沒有腎動脈封閉)相比。利用方差比較(ANOVA)繼之以Duncan氏post-hoc檢驗比較BUN和肌酐的血液水平。
實施例22用於測量心臟保護的Langendorff灌注模型。
最近內源性大麻鹼被證明參與LPS抗心肌缺血的心臟保護效應(Lagneux，C. Lamontagne，D.，Br.J.Pharmacol.132793-6，2001)。在分離灌注的大鼠心臟的Langendorff模型中檢驗新二環化合物的心臟保護效應。遵照實驗動物的管理和使用的NIH指南(NIH公布No.85-23，修訂版1996)稱重280±20g的雄性Sprague-Dawley大鼠用於灌注實驗。給動物腹腔內注射肝素鈉(500U)並用戊巴比妥(30mg/動物)麻醉。迅即取出心臟並放入肝素化的冰冷鹽溶液中。將主動脈通過導管插入Langendorff灌注器，並切開肺動脈以提供流出物的自由排放。用改性的Krebs-Henseleit(KH)溶液保持逆行主動脈灌注。用95％氧和5％二氧化碳的混合物對KH充氣。保持主動脈灌注在37℃，90cmH2O的恆定壓力下。
正常體溫的短期局部缺血。
心臟經歷20min的KH灌注，25分鐘的不流動性全身局部缺血(在37℃)，以及45分鐘的KH再灌注。這已經顯示降低工作指標(LVDPxHR)恢復到約40％，通過藥物可能得以改善。在預缺血性灌注、再灌注或者二者期間添加不同濃度的化合物。
血液動力學測量。
將一頂端帶膠乳球的導管插入左側心房的一小切口並穿過二尖瓣推進到左側心室。該球通過一壓力轉換器與記錄系統(Hewlett Packard7758B，USA)相連。使球充氣並平衡到產生0mm Hg的末端舒張壓。在收縮(+dP/dt)和鬆弛(-dP/dt)期間，測量左心室的心臟收縮壓和舒張壓以及壓力延續的時間。由心臟收縮壓和舒張壓之間的差異計算左心室的展開壓力(LVDP)。由LVDP的積和心率(HR)計算心臟的工作指標(LVDPxHR)。在預缺血期間和再灌注過程中通過收集從肺動脈流出的流出物測量冠脈血流量(CF)。如果發生心律不齊，形成血栓，或者前20分鐘的灌注後LVDP以及心率分別小於60mm Hg和210次/分鐘，從研究中排除所述的心臟。
結果表示為平均值±SEM。心臟組之間統計學上的差異利用ANOVA以及Mann-Whitney秩檢驗進行計算。p＜0.05被認為是統計學上顯著的。
實施例23化合物對腫瘤細胞系和腫瘤的作用。體外。在存在我們的測試化合物的條件下，測試幾個衍生自腫瘤的細胞系的細胞增殖能力。腫瘤細胞系獲自ATCC，並根據供應商的說明書培養。細胞接種在24微孔板(105細胞/ml/微孔)並培養過夜。用測試化合物(1-100μM)或者介質(0.1％DMSO終濃度)培養細胞。24小時以後利用標準結晶紫染色確定細胞的存活力。除去微孔的培養基並通過添加1ml/微孔的2％甲醛的PBS溶液固定10分鐘。細胞固定後，用PBS洗滌細胞3次，並給每個微孔添加250μl的0.5％(W/V)結晶紫，以及在室溫下輕輕攪拌培養板30分鐘。然後用重蒸餾水洗滌染色的細胞3次，並通過向每個微孔添加250μl的10％乙酸提取顏色。在室溫下攪動板15分鐘，一式兩份轉移100μl到96微孔板中用於讀數。在620nm處用ELISA讀數器測量細胞的光密度(OD)，結果表示為活細胞％。未經處理的細胞的吸光度記錄為100％。確定IC50(劑量抑制細胞生長50％)。
此外，染色細胞的活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)以確定它們是否通過細胞程序性死亡機制死亡。棄去微孔的培養基並通過添加1ml的4％甲醛的PBS溶液固定10分鐘。細胞用PBS-0.1％Tween20(PBS-T)洗滌兩次並用冷甲醇滲透20分鐘。細胞用PBS-T洗滌兩次，並與1ml封閉溶液(3％BSA，PBS-T)溫育30分鐘。添加初級抗體(兔抗切割的半胱氨酸蛋白酶3(asp175)細胞信號傳導技術，用封閉溶液1∶50稀釋)，並在37℃培養細胞60分鐘。用PBS-T洗滌細胞兩次。向微孔添加二級抗體(HRP共軛的抗兔IgG，用封閉溶液以1∶200稀釋)並在室溫下培養60分鐘。用PBS-T洗滌細胞兩次，並與螢光素酪醯胺試劑(NEN，用擴增稀釋劑稀釋1∶50)培養10分鐘。用PBS-T洗滌細胞兩次，並通過螢光或者共焦顯微鏡觀察信號。除監控活化的caspase-3之外，將用dexanabinol及其類似物處理的細胞與未經處理的細胞比較細胞程序性死亡相關基因的表達。如前所述進行實時RT-PCR。用於每個基因而言，設計一對特異性PCR引物，並根據ABI方案進行反應。每個基因表達的定量分析水平規格化到管家基因，並與來自未處理細胞的RNA樣品相比較。
體內。一旦我們已經選擇了其增殖通過二環CB2結合測試化合物體外抑制的腫瘤細胞系，我們就測試其體內的效力。根據供應商的說明書培養細胞。在裸CD-1雄性小鼠(平均體重20-25g，Harlan，Israel)的右股骨關節以上s.c.注射預定量(每動物0.12ml恆定體積的1×106細胞)。每個處理組由至少7隻動物組成。每日臨床監控每隻動物。在每日訪問期間也監控腫瘤的生長但是每周一次記錄實際的測量。當腫瘤達到合適的大小時，用介質，5ml/kg/天或者用我們的測試化合物在2.5到10mg/kg/天的劑量範圍內處理動物。
實施例24化合物在炎性腸病模型中的作用。
在大鼠乙酸誘導的IBD掩蔽研究中測試二環CB2結合化合物的抗炎活性。
通過i.p.注射克他命∶rompun組合(分別為100∶10mg/kg)，輕微麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(10周齡，200-250g，Harlan，Israel)。將聚乙烯導管(外徑1.7mm)插入直腸5cm進入結腸內。然後慢慢地將2ml的5％乙酸施用到結腸內。15秒後，用3ml鹽水清洗結腸，15秒以後用另外的3ml鹽水洗滌。其後迅即，用任一種合適的處理物處理每個動物組。所有的處理物每天施用一次，共7天。臨床跟蹤動物1周。在這期間，每日監控並記錄下列參數體重、糞便中血液的存在以及糞便的稠度。這些發現根據表1進行記分。
表1IBD疾病活性指數(DAI#)的記分標準(Murthy S.N.等，Dig.Dis.Sci.381722-34，1993)。
#DAI-(重量損失，糞便稠度以及出血的組合記分)/3。
*正常的糞便-形成良好的小球；稀糞-蒼白糞便不粘住肛門；以及腹瀉-液體糞便粘住肛門。
誘導動物疾病後7天用戊巴比妥100mg/kg i.p.處死動物。切除全部結腸，縱向切開並在放大鏡下檢驗，記錄所有明顯的損傷並根據表2記分。
表2評價IBD嚴重性的總的病理學記分方法(Wong等，J.Pharm.Exp.Ther.274475-80，1995)。
利用方差分析(ANOVA)繼之以post-hoc試驗分析臨床結果。非參數檢驗(Wilcoxon秩和檢驗)用於評價總的病理學發現。
製劑實施例用於復溶的凍乾粉末。如上所述，一些本發明的化合物高度親脂，計算的LogP高於5，使它們十分不溶於水。雖然這些化合物可以配製在多種組合物中，使所述組合物具有它們的親脂性，但是已經使用了基於母體化合物化學修飾的方法以改善水溶性從而擴大製劑的範圍以及適合於所述化合物的給藥途徑。一種這樣的例子為化合物R，其是化合物A的半琥珀酸酯衍生物。這個酯化步驟顯著提高了pH7時化合物計算的logD。化合物A具有6.21的logD，雖然其半琥珀酸酯衍生物化合物R只有3.76的logD(利用ACD軟體計算)。根據水溶性，這指的是在中性pH時，化合物A預計溶於水，濃度為7.6×10-5g/l，而化合物R預計可溶解至0.024g/l。提高的溶解性打開了替代製劑，諸如製備用於復溶的凍乾粉末。
30毫克的化合物R溶於0.3ml的叔丁醇中。為了獲得最終5mg/ml的藥物濃度，添加6ml的磷酸鹽緩衝液(NaH2PO4以及Na2HPO4，pH7.8，80mM)。然後添加150mg的乳糖獲得最終25mg/ml的乳糖濃度。隨著化合物的溶解，溶液的pH趨向降低，並且利用0.2N的NaOH再調整到pH7.8。所得溶液冷凍乾燥過夜獲得凍乾粉末。化合物R的凍乾粉末隨後用水重新溶解獲得約5mg/ml終濃度範圍的酯衍生物的透明溶液，所述終濃度與最初的76ng/ml化合物A母體藥物相比溶解性意外的顯著增加。也製備除了磷酸鹽緩衝液以外還包含濃度為9mg/ml的苯甲醇的相同製劑。可以添加5％的蔗糖或者5％的甘露糖醇，或者2％的甘油，或者5％的葡聚糖，或者直至5％，優選地1-2.5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30或者PVP K-10代替乳糖作為稀釋劑以及冷凍乾燥過程中的防凍劑。用無菌水重新溶解凍幹化合物R用於衝洗，並且如HPLC所監控，顯示至少穩定長達2小時。在這期間高達14％的化合物R水解成母體化合物A。如上所述，當配製在CREMOPHOREL∶乙醇時，化合物R具有生物學活性。初步研究顯示重新溶解的凍幹化合物R也實現了化合物的治療目標。例如，配製在助溶劑中的化合物R在大約1μM/kg時使爪浮腫程度最大減少31％，而重新溶解的凍幹化合物R在約0.5μM/kg時相同的模型中使爪浮腫減少29.5％。這個研究結果表明本發明的化合物可以製備成藥用鹽或者酯衍生物，從而使得各種劑型的製備以及通過各種途徑施用這種化合物處理由上述模型所引發的疾病成為可能。
雖然本發明僅僅為了說明目的提出各種不同的具體實施方案而已加以描述，但是這種具體公開的實施方案不應該理解為限制性的。根據申請人在這裡的公開內容，本領域技術人員可以得出很多其它這樣的實施方案，並且申請人認為本發明的實質和範圍僅受所附權利要求書的限制。
權利要求
1.一種通式(I)的化合物及其藥用鹽，酯或溶劑化物式I 式I具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中R1選自(a)O或者S，(b)C(R′)2，其中每次出現的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，並且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)滷素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基，每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現的R如前所定義，(b)飽和或者不飽、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義被進一步取代；附帶條件是當R1為O並且R2和R3為OH時，那麼R4不是直鏈或者支鏈的C5-C10烷基、C5-C10烯基、C5-C8環烷基以及C5-C8環烯基。
2.權利要求1的化合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，並且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附帶條件如對式(I)的限定。
3.權利要求1的化合物，其中R1為O，R2以及R3為OH，而R4為1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基或者1-甲基-1-對氯苯基-乙基。
4.權利要求1的化合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基庚基，以及R2和R3都為H、OCH3、二乙基磷酸酯或者琥珀酸酯。
5.權利要求1的化合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基-庚基，R2為OH，以及R3為OCH3、二乙基磷酸酯、延胡索酸酯或者琥珀酸酯。
6.權利要求1的化合物，其中R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，並且R4為1，1-二甲基-戊基。
7.權利要求1的化合物，其中R1為CH2，R4為1，1-二甲基-庚基，R2和R3都為OCH3或者二乙基磷酸酯。
8.權利要求1的化合物，其中R1為NOH，R2和R為OH，並且R4為1，1-二甲基-庚基。
9.一種通式(II)的化合物及其藥用鹽、酯或溶劑化物式II 式II具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式，並且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中R5選自(a)滷素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現的R″如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)-Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)滷素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基，而且每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；並且選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2，SR，和C(S)R，其中每次出現的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那麼R4不是直鏈或者支鏈的C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選末端碳由苯基取代，並且直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
10.權利要求9的化合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，以及在C-2和C-3之間有一個任選的雙鍵，附帶條件如對式(II)的限定。
11.權利要求9的化合物，其中R5為OH，R4為1，1二甲基-庚基，R2和R3都為H、OH或者二乙基磷酸酯，並且在C-2和C-3之間有一單鍵。
12.權利要求9的化合物，其中R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者CH2OC(O)(CH2)3CH3，並且在C-2和C-3之間有一個雙鍵。
13.權利要求9的化合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-戊基，並且在C-2和C-3之間有一雙鍵。
14.含有通式(III)化合物作為活性成分以及進一步含有藥用稀釋劑或載體的藥物組合物式III 式III具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質子為反式；並且其中R1選自(a)O或者S，(b)C(R′)2，其中每次出現的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，並且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)滷素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈的或者環狀的C1-C6烷基，並且每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現的R如前所定義，(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義進一步取代。
15.權利要求14的藥物組合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，並且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
16.權利要求14的藥物組合物，其中R1是O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
17.權利要求14的藥物組合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基-庚基，以及R2和R3都為H、OCH3、二乙基磷酸酯或者琥珀酸酯。
18.權利要求14的藥物組合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基-庚基，R2為OH，以及R3為OCH3、二乙基磷酸酯、延胡索酸酯或者琥珀酸酯。
19.權利要求14的藥物組合物，其中R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，並且R4為1，1-二甲基-戊基。
20.權利要求14的藥物組合物，其中R1為CH2，R4為1，1-二甲基-庚基，R2和R3都為OCH3或者二乙基磷酸酯。
21.權利要求14的藥物組合物，其中R1為NOH，R2和R為OH，並且R4為1，1-二甲1，1-二甲基-庚基。
22.含有通式(II)化合物作為活性成分以及進一步含有藥用稀釋劑或載體的藥物組合物式II 式II具有特異性立體化學結構，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質子彼此之間為順式，在C-4和C-5位置的質子為反式，並且C-2------C-3為任選的雙鍵；並且其中R5選自(a)滷素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR」以及C1-C6烷基-N(R」)2，其中每次出現的R」如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)-Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)滷素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C6烷基，而且每次出現的Re選自氫和如前所定義的Rd；以及選自(a)R，其中R選自氫、滷素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR，和C(S)R，其中每次出現的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環作為末端，所述芳香環可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那麼R4不是直鏈或者支鏈的飽和C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選地末端碳由苯基取代，以及直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
23.權利要求22的藥物組合物，其中R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基，或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，並且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
24.權利要求22的藥物組合物，其中R5為OH，R4為1，1二甲基-庚基，R2和R3都為H、OH或者二乙基磷酸酯，並且在C-2和C-3之間具有一單鍵。
25.權利要求22的藥物組合物，其中R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者CH2OC(O)(CH2)3CH3，並且在C-2和C-3之間具有一個雙鍵。
26.權利要求22的藥物組合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-戊基，並且在C-2和C-3之間具有一雙鍵。
27.根據權利要求14到26任一項的藥物組合物，其中稀釋劑包括含有藥用助溶劑的助溶劑水溶液，用天然或者合成的離子或者非離子表面活性劑製備的膠束溶液或者乳劑，或者這種助溶劑和膠束或者乳劑溶液的組合。
28.根據權利要求27的藥物組合物，其中載體包括乙醇，表面活性劑和水的溶液。
29.根據權利要求27的藥物組合物，其中載體為含有甘油三酯、卵磷脂、甘油、乳化劑和水的乳液。
30.根據權利要求14到26任一項的藥物組合物，其是單位劑型。
31.根據權利要求30的藥物組合物，適用於口服。
32.根據權利要求30的藥物組合物，適用於腸胃外給藥。
33.一種預防，緩解或者治療對CB2受體調節敏感的疾病或者紊亂的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
34.一種預防，緩解或者治療自身免疫病和炎症，類風溼性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬、炎性腸病、器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合症、脂瀉病、肺疾病、哮喘以及Sjgren氏綜合症的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
35.一種預防，緩解或者治療神經系統紊亂、中風、偏頭痛、叢發性頭痛、神經退行性疾病，帕金森氏症、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化、亨廷頓氏舞蹈症、朊病毒相關疾病、中樞神經系統中毒以及肌肉痙攣和震顫的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
36.一種預防，緩解或者治療包括外周、內臟、神經性、炎性以及關聯痛的疼痛的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
37.一種預防，緩解或者治療心血管紊亂、心律不齊、高血壓和心肌缺血性損傷的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
38.一種預防，緩解或者治療癌症的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
39.一種預防，緩解或者治療神經性疼痛的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇作為活性成分。
40.一種預防，緩解或者治療帕金森氏症的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇作為活性成分。
41.根據權利要求33到40任一項的方法，其中組合物通過口服、腸胃外、靜脈內、肌內、損傷內、皮下、透皮、鞘內、直腸和鼻內進行給藥。
42.權利要求14到26任一項的組合物在製備用於預防，緩解或者治療對CB2受體調節敏感的疾病或者紊亂的藥物中的應用。
43.權利要求14到26任一項的組合物在製備用於預防，緩解或者治療自身免疫病和炎症，類風溼性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬、炎性腸病、器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合症、脂瀉病、肺疾病、哮喘以及Sjgren氏綜合症的免疫調節及抗炎性藥物中的應用。
44.權利要求14到26任一項的組合物在製備用於預防，緩解或者治療神經系統紊亂、中風、偏頭痛、叢發性頭痛、神經退行性疾病、帕金森氏症、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化、亨廷頓氏舞蹈症、朊病毒相關疾病、中樞神經系統中毒以及肌肉痙攣和震顫的神經保護性藥物中的應用。
45.權利要求14到26任一項的組合物在製備用於預防，緩解或者治療包括外周、內臟、神經性、炎性以及關聯痛的疼痛的止痛藥物中的應用。
46.權利要求14到26任一項的組合物在製備用於預防，緩解或者治療心血管紊亂、心律不齊、高血壓和心肌缺血性損傷的藥物中的應用。
47.權利要求14到26任一項的組合物在製備用於預防，緩解或者治療癌症的藥物中的應用。
48.(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇在製備用於預防，緩解或者治療神經性疼痛的藥物中的應用。
49.(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇在製備用於預防，緩解或者治療帕金森氏症的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及非典型的大麻鹼(cannabinoids)，也就是外周大麻鹼受體CB2的配體，及其包括作為活性成分的新(+)α－蒎烯衍生物的藥物組合物，其可用於預防和治療自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病包括但不限於如說明書中所示的風溼性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬和免疫相關的紊亂，包括但不限於器官移植中的組織排斥、吸收不良症候群諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合症，包含炎性腸病的炎症，包含外周、內臟、神經性、炎性以及關聯痛的疼痛，肌肉痙攣，包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發性頭痛的神經系統紊亂，包含帕金森氏症、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化、亨廷頓氏舞蹈症、朊病毒相關神經退行性病變的神經退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌症。
文檔編號C07F9/12GK1627939SQ03803173
公開日2005年6月15日 申請日期2003年1月30日 優先權日2002年1月31日
發明者阿倫·加爾松, 喬治·芬克, 達利特·埃絲特·達爾, 納伊姆·梅納什, 阿耶萊特·努德爾曼, 奧裡特·格林伯格, 阿維海.亞科萬 申請人:法瑪氏公司