球形核酸納米顆粒綴合物的序列特異性細胞攝取的製作方法

2023-09-17 07:16:30 4

相關申請的交叉引用

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政府利益聲明

本發明在由空軍科學研究辦公室(airforceofficeofscientificresearch)授予的授權號fa9550-11-1-0275；以及由美國國家衛生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的授權號u54ca151880和u54ca159341下由政府支持作出。政府在本發明中擁有一定的權利。

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本公開內容涉及用影響球形核酸(sna)納米顆粒通過細胞攝取的多核苷酸和核苷酸序列表面功能化的sna納米顆粒。

背景技術：

球形核酸納米顆粒綴合物(sna)是顯示出與線型核酸相比根本不同性質的一類生物納米材料。sna由高度取向的寡核苷酸鏈組成，其密集地填充到納米顆粒核的表面上[cutler等人，jamchemsoc134：1376-1391(2012)]。與單鏈dna不同，sna可自然地進入哺乳動物細胞內而無需陽離子或親脂轉染試劑的幫助，儘管它們具有高負電荷[rosi等人，science312：1027-1030(2006)]。sna的強大的細胞攝取性質提供了關於開發細胞內診斷[seferos等人，jamchemsoc129：15477-15479(2007)]和基因調節[giljohann等人，jamchemsoc131：2072-2073(2009)]工具的潛力，而沒有傳統上與陽離子或親脂試劑相關的毒性或免疫應答[massich等人，molpharm6：1934-1940(2009)]。實際上，sna在體外和體內調節目的基因的能力已得到證明[zheng等人，procnatlacadsciu.s.a.109：11975-11980(2012)；jensen等人，scitranslmed5，209ra152(2013)]。

機制研究已經將a類清道夫受體(sr-a)鑑定為負責識別這種結構的主要細胞受體，並且sna與sr-a的結合導致質膜微囊介導的胞吞作用[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]。富含鳥苷酸(g)的線型核酸天然被sr-a識別，這已被提出是由於它們摺疊成稱為g-四鏈體(g-quadruplex)的二級結構的能力[pearson等人，jbiolchem268：3546-3554(1993)]。相比之下，腺苷酸(a)、胸苷酸(t)和胞苷酸(c)的線型聚合物不摺疊成被sr-a識別的二級結構，並且像這樣，它們不是天然配體[pearson等人，jbiolchem268：3546-3554(1993)]。

技術實現要素：

由於它們的多價體系結構，sna的細胞相互作用不僅取決於納米結構的尺寸，還取決於配體呈遞[giljohann等人，nanolett7：3818-3821(2007)]。不受理論的束縛，考慮sna能夠進入細胞而無需輔助轉染試劑，因為sna體系結構模擬了該二級結構形成。另外，本公開內容提供了在sna與sr-a的相互作用和隨後的細胞攝取中起重要作用的寡核苷酸序列。

相應地，本文提供的是用多核苷酸和結構域功能化的納米顆粒，結構域(i)位於對於納米顆粒遠側的多核苷酸的末端處，和(ii)包含為至少50％但小於100％鳥苷酸的核苷酸序列。在一些實施例中，結構域位於多核苷酸的5′末端處。在進一步的實施例中，結構域位於多核苷酸的3′末端處。在再進一步的實施例中，結構域位於多核苷酸內的內部區域處。在各種實施例中，結構域長度為約2至約50個核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸是dna。在進一步的實施例中，多核苷酸是rna。在再進一步的實施例中，結構域包含至少三個(ggx)基序。在一些實施例中，x是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在一些實施例中，x是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸或胞苷酸。在某些實施例中，x是鳥苷酸。在一些實施例中，x不是鳥苷酸。在進一步的實施例中，x是經修飾的核苷酸。

在一些實施例中，納米顆粒用另外的多核苷酸功能化。在進一步的實施例中，另外的多核苷酸包含結構域。在一些實施例中，另外的多核苷酸是dna。在進一步的實施例中，另外的多核苷酸是rna。

在各種實施例中，結構域包含聚鳥苷酸(聚g)核苷酸序列，其包含多於一個鳥苷酸。在進一步的實施例中，結構域包含聚鳥苷酸(聚g)序列，其包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十個鳥苷酸核苷酸。

在一些方面，本公開內容還提供了增加多核苷酸功能化的納米顆粒的細胞攝取的方法，其包括修飾納米顆粒以進一步包含結構域的步驟，與缺乏結構域的多核苷酸功能化的納米顆粒相比，所述結構域增加所述寡核苷酸功能化的納米顆粒的細胞攝取。在一些實施例中，結構域包含聚鳥苷酸(聚g)核苷酸序列，其包含多於一個鳥苷酸。在進一步的實施例中，結構域包含聚g序列，其包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十個鳥苷酸核苷酸。在一些實施例中，結構域位於多核苷酸的5′末端處。在一些實施例中，結構域位於多核苷酸的3′末端處。在再進一步的實施例中，結構域位於多核苷酸內的內部區域處。在一些實施例中，結構域與多核苷酸共線(colinear)。在各種實施例中，多核苷酸是dna。在一些實施例中，多核苷酸是rna。

考慮本公開內容的方法中的任一種均用如本文公開的多核苷酸功能化的納米顆粒進行。

在本公開內容的進一步方面，提供了用多核苷酸功能化的納米顆粒，其中多核苷酸的遠端以包含至少三個(ggx)基序的序列終止。在一些實施例中，至少三個(ggx)基序位於多核苷酸的5′末端上。在進一步的實施例中，至少三個(ggx)基序位於多核苷酸的3′末端上。在一些實施例中，x是脫氧核糖核苷酸，並且在進一步的實施例中，x是核糖核苷酸。在再進一步的實施例中，x是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸或胞苷酸。本公開內容還考慮在一些實施例中，x是經修飾的核苷酸。

在各種實施例中，納米顆粒用另外的多核苷酸功能化。在一些實施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是dna。在進一步的實施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是rna。在再進一步的實施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是sirna。

在本公開內容的方面或實施例的任一個中，sna具有淨負電荷。

在一些方面，本公開內容提供了增加多核苷酸功能化的納米顆粒的細胞攝取的方法，其包括修飾多核苷酸使得多核苷酸的遠端(即，與使納米顆粒功能化的末端相反的末端)以包含至少三個(ggx)基序的序列終止的步驟，其中與缺乏修飾的多核苷酸功能化的納米顆粒相比，包含修飾的多核苷酸功能化的納米顆粒的攝取增加。在一些實施例中，至少三個(ggx)基序位於多核苷酸的5′末端上。在進一步的實施例中，至少三個(ggx)基序位於多核苷酸的3′末端上。在另外的實施例中，納米顆粒用另外的多核苷酸功能化。在相關實施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是dna。在一些實施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是rna。在進一步的實施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是sirna。在一些實施例中，細胞是原核細胞。在進一步的實施例中，細胞是真核細胞。在相關實施例中，真核細胞是人細胞。

在一些實施例中，本公開內容還提供了方法，其中所述多核苷酸包含與靶多核苷酸序列充分互補的序列，以在合適的條件下與靶多核苷酸序列雜交。在進一步的實施例中，另外的多核苷酸包含與靶多核苷酸序列充分互補的序列，以在合適的條件下與靶多核苷酸序列雜交。在相關實施例中，雜交導致靶多核苷酸的檢測。在再進一步的實施例中，雜交導致靶基因表達的抑制。

附圖說明

圖1a-1b顯示了sna的表徵。1a)該表列出了使用基於螢光的測定在10nm金納米顆粒上負載寡核苷酸。聚tsna在所有核鹼基類型中含有最高負載，而聚asna具有最低負載。1b)通過乙酸雙氧鈾染色sna清楚地描繪了通過tem成像在金納米顆粒核(黑色)周圍的dna寡核苷酸殼(白色)。殼的厚度與從基於螢光的測定獲得的寡核苷酸負載數據相關聯。比例尺＝50nm。

圖2描繪了動態光散射分析。由不同核鹼基類型組成的寡核苷酸鏈共價附著到10nmaunp的表面上使流體動力學直徑增加了10-15nm，指示寡核苷酸殼的厚度為5-8nm。

圖3顯示了sna的uv-vis吸收光譜。dna寡核苷酸殼與aunp核的共價附著導致表面等離子體峰中的紅移，從對於未經修飾的檸檬酸鹽封端的aunp的519nm到524nm，與殼包含的核鹼基類型無關。

圖4a-4b描繪了寡核苷酸負載的測量。4a)cy5標記的sna用於定量聚a、聚t、聚c和聚gsna的負載。通過添加1m二硫蘇糖醇(dtt)還原au-硫醇鍵從aunp的表面釋放cy5標記的單鏈dna(cy5-ssdna)，並且允許通過cy5螢光的定量。4b)cy5部分附著到組成成分寡核苷酸的5′末端。

圖5a-5c描繪了sna的細胞攝取。5a)聚gsna顯示與c166細胞的最高結合，是由其他核鹼基類型組成的sna的4-10倍。5b)通過tem成像，聚gsna顯示出在c166細胞內的最高累積，如其作為大簇(＞100/簇)在細胞溶質各處廣泛分布所證明的。相比之下，由其他核鹼基類型組成的sna或者在細胞溶質的較為局限的區域中累積，或者出現在包含較少顆粒的簇(＜20個顆粒/簇)中。底行顯示頂行的加框區域的放大圖像。5c)聚gsna還證明除c166之外的其他三種細胞系的最高結合，以sr-a的表達水平的遞減次序包括hacat(永生化人角質形成細胞)、3t3(小鼠成纖維細胞)和a549(人肺上皮腺癌)。對於所有細胞類型，與其他核鹼基類型的sna相比，聚gsna顯示出3-5倍高的與細胞結合。聚gsna與細胞的結合對於相同細胞類型與sr-a表達水平正相關。誤差條指示來自一式三份測量的標準差。

圖6a-6b顯示了攝取對聚g殼的依賴性。6a)通過共聚焦顯微鏡檢查，與富含t的qd-sna相比，聚gqd-sna(紅色)顯示c166細胞中的更高累積。比例尺＝10μm。6b)用富含t的aunp-sna和聚gqd-sna以及富含t的qd-sna和聚gaunp-sna處理的c166細胞中的金和鎘含量的icp-ms分析顯示，聚gaunp-sna與富含t的qd-sna相比優先進入細胞，並且聚gqd-sna與富含t的aunp-sna相比優先進入細胞。誤差條指示來自三次獨立實驗的標準差。

圖7a-7d描述了寡核苷酸鏈的長度影響sna的細胞攝取。7a)在組成成分寡核苷酸的5′末端處增加的鳥苷酸(g)含量增加sna與c166細胞的細胞結合。當與聚t(t30)sna相比時，需要最少四個ggt重複單元來增強sna的細胞結合。7b)在組成成分寡核苷酸的中間中的ggt重複單元的包埋取消了細胞結合的增強。由空心正方形所示的序列是seqidno：27。由空心三角形所示的序列是seqidno：28。所有其他序列在本文中描述。7c)在組成成分dna寡核苷酸的5′末端處增加dspacer單元(其不具有核鹼基)使sna的細胞結合降低高達75％。7d)在組成成分dna寡核苷酸的5′末端處增加c3spacer單元(其既沒有核鹼基也沒有核糖)使sna的細胞結合降低高達75％。誤差條指示來自一式三份測量的標準差。

圖8a-8f描繪了使用cpt-sna的喜樹鹼分子的遞送。8a)通過文獻先例，喜樹鹼分子(cpt)的-oh基團通過短雙功能接頭修飾，以形成喜樹鹼疊氮化物(cpt-n3)[parrish等人，bioconjugatechem.18：263-267(2006)]。然後通過無銅點擊化學(clickchemistry)將cpt-n3偶聯到二苯並環辛基-dna-硫醇(dbco-dna-sh)，以形成喜樹鹼-dna-硫醇(cpt-dna-sh)。dcc＝n′n′-二環己基碳二亞胺，dmap＝4-二甲基氨基吡啶，＝二氯甲烷，dmso＝二甲基亞碸。8b)基於cpt在440nm的螢光發射的測量揭示，所有四種核鹼基類型的cpt-sna均含有55±15個cpt分子/顆粒。8c)通過用cpt-sna處理的a549細胞的金含量的icp-ms分析，cpt-聚gsna可在所有測試的核鹼基類型中以最高數量進入細胞。cpt-sna(至少aunp核)在處理後看起來不離開細胞。誤差條指示來自一式三份測量的標準差。8d)通過共焦成像，cpt-聚gsna可在所有測試的核鹼基類型的cpt-sna中以最高數量將cpt分子(綠色)遞送到a549細胞內。藍色＝細胞核。比例尺＝20μm。通過mtt測定(8e)和由碘化丙啶染色支持的流式細胞術分析(8f)，cpt-聚gsna在所有測試的核鹼基類型的cpt-sna中也是最細胞毒性的。誤差條指示來自四次測量的標準差。

圖9a-9d描繪了cpt-dna-sh的合成。9a)喜樹鹼-疊氮化物(cpt-n3)的1hnmr。9b)通過maldi-tof分析，在用二苯並環辛基四甘醇接頭(dbco-teg；f.w.：570.6；glenresearch)修飾後，dna鏈的分子量增加預期的量。在通過無銅點擊偶聯與cpt-n3(f.w.：487.5)反應以形成cpt-dna-sh後，dbco-dna-sh的分子量進一步增加預期的量。此處顯示的是a30dna與dbco和cpt的綴合的代表性光譜。9c)通過maldi-tofms測量的分子量與預期分子量一致。9d)四種類型的cpt-dna-sh鏈的序列信息(也顯示於表4中)。

圖10顯示了通過mtt測定的細胞活力。在沒有cpt分子的情況下，通過對用20nmsna處理的a549細胞的mtt測定，4-7天後聚asna、聚tsna、聚csna和聚gsna未顯示明顯的細胞毒性。這種陰性對照顯示通過cpt-sna引起的任何可觀察到的細胞毒性源於cpt分子，而不是sna體系結構。報告的值表示來自三次獨立實驗的平均值的平均值±se。

圖11顯示了用於檢測活化的半胱天冬酶3的elisa結果。在用各種類型的cpt-sna處理a549細胞時，cpt-(ggt)10sna比cpt-a30sna、cpt-t30sna和cpt-(cct)10sna誘導顯著更高的半胱天冬酶3的活化，半胱天冬酶3是凋亡信號傳導蛋白。報告的值表示來自三次獨立實驗的平均值的平均值±se。

圖12顯示了與聚a、聚t和聚csna相比，聚gsna顯示更高的與c166細胞的細胞結合。

圖13顯示了sna的細胞攝取。

具體實施方式

由附著至納米顆粒表面的密集填充的高度取向的寡核苷酸鏈組成的球形核酸(sna)能夠克服核酸遞送的典型挑戰。sna已顯示有效地進入50種不同的細胞類型，而無需使用輔助轉染試劑並顯示出最低限度的細胞毒性。最近，這些結構的胞吞機制顯示依賴於a類清道夫受體(sr-a)。本公開內容涉及通過構建其組成成分寡核苷酸鏈富含鳥苷酸(g)的sna，利用sr-a與聚(鳥苷酸)寡核苷酸鏈的相互作用使sna進入細胞內的攝取達到最大。

相應地，本公開內容證明了寡核苷酸功能化的納米顆粒的效用，其中寡核苷酸還包含調節細胞攝取的結構域。如本文使用的，「結構域」被理解為核鹼基序列。如本文定義的經修飾的核鹼基也預期構成如本文提供的結構域。在一個方面，結構域與在納米顆粒上功能化的寡核苷酸共線。在另一個方面，結構域與納米顆粒直接結合，而不與在納米顆粒上功能化的寡核苷酸結合。在另外一個方面，結構域通過間隔物與納米顆粒結合，而不與在納米顆粒上功能化的寡核苷酸結合。換言之，在一些實施例中，結構域通過間隔物與納米顆粒結合，與和寡核苷酸的任何結合相分離(因此在此類實施例中，間隔物不包含核鹼基)。

如本文使用的，術語「核苷酸」採取其在本領域中的普通含義。因此，例如「a」＝腺苷酸，「t」＝胸苷酸，「c」＝胞苷酸，「g」＝鳥苷酸，並且「u」＝尿苷酸。

此處注意到，如本說明書和所附權利要求中使用的，單數形式「一個」、「一種」和「該/所述」包括複數指示物，除非上下文另有明確規定。

如本文使用的，術語「多核苷酸」(在sna上功能化或作為靶分子)可與術語寡核苷酸互換使用，並且該術語具有本領域公認的含義。

還應注意術語「附著的」、「綴合的」和「功能化的」在本文中也可互換使用，並且指寡核苷酸或結構域與納米顆粒的結合。

「雜交」意指按照沃森-克裡克dna互補性、hoogstein結合或本領域已知的其他序列特異性結合的規則，通過氫鍵在兩條或三條核酸鏈之間的相互作用。雜交可在本領域已知的不同嚴格條件下進行。

如本文使用的，「聚x」結構域(其中「x」是核苷酸，例如鳥苷酸)是在其長度上包含大於50％但小於100％的「x」的序列。例如，長度為30個核苷酸的聚鳥苷酸(聚g)結構域由至少15個(但小於30個)鳥苷酸核苷酸組成。因此，如本文使用的，「聚x」結構域不是均聚物序列。

納米顆粒

本發明提供了納米顆粒，其被功能化以具有與其附著的多核苷酸。一般而言，考慮的納米顆粒包括對如本文所述的多核苷酸具有高負載能力的任何化合物或物質，包括例如且不限於金屬、半導體、脂質體顆粒、絕緣體顆粒組合物和樹枝狀聚合物(有機相對於無機)。

因此，本發明考慮了納米顆粒，其包含各種無機材料，包括但不限於金屬、半導體材料或陶瓷，如美國專利申請號20030147966中所述。例如，基於金屬的納米顆粒包括本文所述的那些。陶瓷納米顆粒材料包括但不限於：透鈣磷石、磷酸三鈣、氧化鋁、二氧化矽和氧化鋯。納米顆粒由其生產的有機材料包括碳。納米顆粒聚合物包括聚苯乙烯、矽酮橡膠、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚酯、聚醚和聚乙烯。生物可降解的生物聚合物(例如多肽，如bsa、多糖等)、其他生物材料(例如碳水化合物)和/或聚合物化合物也考慮用於生產納米顆粒。還考慮了例如如pct/us2014/068429(其以引用的方式全文併入本文)中公開的脂質體顆粒。本文還考慮了例如如美國專利公開號2012/0282186(其以引用的方式全文併入本文)中描述的空心顆粒。

在一個實施例中，納米顆粒是金屬的，並且在各個方面，納米顆粒是膠體金屬。因此，在各種實施例中，可用於實踐該方法的納米顆粒包括金屬(包括例如且不限於金、銀、鉑、鋁、鈀、銅、鈷、銦、鎳或順應納米顆粒形成的任何其他金屬)、半導體(包括例如且但不限於cdse、cds和由zns塗布的cds或cdse)和磁性(例如鐵磁體)膠體材料。可用於本發明實踐的其他納米顆粒還包括但不限於zns、zno、ti、tio2、sn、sno2、si、sio2、fe、fe+4、ag、cu、ni、al、鋼、鈷鉻合金、cd、鈦合金、agi、agbr、hgi2、pbs、pbse、znte、cdte、in2s3、in2se3、cd3p2、cd3as2、inas和gaas。製備zns、zno、tio2、agi、agbr、hgi2、pbs、pbse、znte、cdte、in2s3、in2se3、cd3p2、cd3as2、inas和gaas納米顆粒的方法也是本領域已知的。參見例如weller，angew.chem.int.ed.engl.，32，41(1993)；henglein，top.curr.chem.，143，113(1988)；henglein，chem.rev.，89，1861(1989)；brus，appl.phys.a.，53，465(1991)；bahncmann，在photochemicalconversionandstorageofsolarenergy(pelizetti和schiavello編輯1991)中，第251頁；wang和herron，j.phys.chem.，95，525(1991)；olshavsky，等人，j.am.chem.soc.，112，9438(1990)；ushida等人，j.phys.chem.，95，5382(1992)。

在實踐中，提供了使用具有與其附著的寡核苷酸的任何合適的顆粒來增加細胞攝取且抑制基因表達的方法，所述寡核苷酸不幹擾複合物形成，即與靶多核苷酸的雜交。顆粒的尺寸、形狀和化學組成有助於所得到的寡核苷酸功能化的納米顆粒的性質。這些性質包括例如光學性質、光電性能、電化學性質、電子性質、各種溶液中的穩定性、磁性、以及孔和通道尺寸變化。考慮具有不同尺寸、形狀和/或化學組成的顆粒混合物的使用，以及具有均勻尺寸、形狀和化學組成的納米顆粒的使用。合適的顆粒的例子包括但不限於納米粒子顆粒、聚集物顆粒、各向同性顆粒(例如球形顆粒)和各向異性顆粒(例如非球形杆、四面體、稜柱體)和核-殼顆粒，例如於2002年12月28日提交的美國專利申請序列號10/034,451和於2002年12月28日提交的國際申請號pct/us01/50825中所述的顆粒，所述專利的公開內容以引用的方式全文併入。

製備金屬、半導體和磁性納米顆粒的方法是本領域眾所周知的。參見例如，schmid，g.(編輯)clustersandcolloids(vch，weinheim，1994)；hayat，m.a.(編輯)colloidalgold：principles，methods，andapplications(academicpress，sandiego，1991)；massart，r.，ieeetransactionsonmagnetics，17，1247(1981)；ahmadi，t.s.等人，science，272，1924(1996)；henglein，a.等人，j.phys.chem.，99，14129(1995)；curtis，a.c.，等人，angew.chem.int.ed.engl.，27，1530(1988)。所製備的聚氰基丙烯酸烷基酯納米顆粒的製備在fattal等人，j.controlledrelease(1998)53：137-143和美國專利號4,489,055中描述。用於製備包含聚(d-glucaramidoamine)的納米顆粒的方法在liu等人，j.am.chem.soc.(2004)126：7422-7423中描述。包含聚合的甲基丙烯酸甲酯(mma)的納米顆粒的製備描述在tondelli等人，nucl.acidsres.(1998)26：5425-5431中描述，並且樹枝狀聚合物納米顆粒的製備在例如kukowska-latallo等人，proc.natl.acad.sci.usa(1996)93：4897-4902(starburst聚醯胺-胺樹枝狀聚合物)中描述。

合適的納米顆粒也從例如tedpella，inc.(金)、amershamcorporation(金)和nanoprobes，inc.(金)商購可得。

還如美國專利申請號20030147966中所述的，包含本文所述材料的納米顆粒是商購可得的，或它們可由溶液中的逐步成核(例如通過膠體反應)，或者通過各種物理和化學氣相沉積工藝例如濺射沉積來產生。參見例如havashi，(1987)vac.sci.technol.july/august1987，a5(4)：1375-84；hayashi，(1987)physicstoday，december1987，第44-60頁；mrsbulletin，january1990，第16-47頁。

如在美國專利申請號20030147966中進一步描述的，使用本領域已知的方法，使用haucl4和檸檬酸還原劑產生考慮的納米顆粒。參見例如marinakos等人，(1999)adv.mater.11：34-37；marinakos等人，(1998)chem.mater.10：1214-19；enustun&turkevich，(1963)j.am.chem.soc.85：3317。具有約140nm的分散聚集物粒徑的氧化錫納米顆粒從日本chiba的vacuummetallurgicalco.，ltd.商購可得。各種組成和尺寸範圍的其他商購可得的納米顆粒可例如得自burlingame，calif的vectorlaboratories，inc.。

納米顆粒的尺寸範圍可為平均直徑約1nm至約250nm、平均直徑約1nm至約240nm、平均直徑約1nm至約230nm、平均直徑約1nm至約220nm、平均直徑約1nm至約210nm、平均直徑約1nm至約200nm、平均直徑約1nm至約190nm、平均直徑約1nm至約180nm、平均直徑約1nm至約170nm、平均直徑約1nm至約160nm、平均直徑約1nm至約150nm、平均直徑約1nm至約140nm、平均直徑約1nm至約130nm、平均直徑約1nm至約120nm、平均直徑約1nm至約110nm、平均直徑約1nm至約100nm、平均直徑約1nm至約90nm、平均直徑約1nm至約80nm、平均直徑約1nm至約70nm、平均直徑約1nm至約60nm、平均直徑約1nm至約50nm、平均直徑約1nm至約40nm、平均直徑約1nm至約30nm、或平均直徑約1nm至約20nm、平均直徑約1nm至約10nm。在其他方面，納米顆粒的尺寸為約5nm至約150nm(平均直徑)、約5至約50nm、約10至約30nm、約10至150nm、約10至約100nm、或約10至約50nm。納米顆粒的尺寸為約5nm至約150nm(平均直徑)、約30至約100nm、約40至約80nm。在方法中使用的納米顆粒的尺寸如通過其特定用途或應用的要求而變。尺寸的變化有利地用於優化納米顆粒的某些物理特徵，例如光學性質或可如本文所述功能化的表面積的量。

寡核苷酸

如本文使用的，術語「核苷酸」或其複數與本文所討論的和本領域另外已知的修飾形式是可互換的。在某些情況下，本領域使用術語「核鹼基」，其包含天然存在的核苷酸和包括經修飾的核苷酸的非天然存在的核苷酸。因此，核苷酸或核鹼基意指天然存在的核鹼基a、g、c、t和u。非天然存在的核鹼基包括例如且不限於黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-n6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、n4，n4-乙醇基胞嘧啶、n′，n′-乙醇基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mc)、5-(c3-c6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑並吡啶、異胞嘧啶、異鳥氨酸、肌苷以及在benner等人，美國專利號5,432,272以及susanm.freier和karl-heinzaltmann，1997，nucleicacidsresearch，第25卷：第4429-4443頁中描述的「非天然存在的」核鹼基。術語「核鹼基」還不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環，還包括其雜環類似物和互變異構體。進一步的天然和非天然存在的核鹼基包括下述中公開的那些核鹼基：美國專利號3,687,808(merigan等人)，sanghvi在antisenseresearchandapplication的第15章中，s.t.crooke和b.lebleu編輯，crcpress，1993，以及englisch等人，1991，angewandtechemie，國際版本，30：613-722(尤其參見第622和623頁，以及conciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering，j.i.kroschwitzed.，johnwiley&sons，1990，第858-859頁，cook，anti-cancerdrugdesign1991，6，585-607中，所述參考文獻各自以引用的方式全文併入本文)。在各個方面，多核苷酸還包括一種或多種「核苷鹼基」或「鹼基單元」，其是一類非天然存在的核苷酸，其包括化合物例如可如核鹼基起作用的雜環化合物，包括在最經典意義上並非核苷鹼基，但充當核苷鹼基的某些「通用鹼基」。通用鹼基包括3-硝基吡咯，任選取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任選取代的次黃嘌呤。其他期望的通用鹼基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本領域已知的那些通用鹼基。

經修飾的核苷酸在ep1072679和wo97/12896中描述，所述專利的公開內容以引用的方式併入本文。經修飾的核鹼基包括但不限於5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-滷代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶鹼基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-滷代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-滷素、特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-f-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。進一步的經修飾的鹼基包括三環嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1h-嘧啶並[5，4-b][1，4]苯並噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶並[5，4-b][1，4]苯並噻嗪-2(3h)-酮)、g夾例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶並[5，4-b][1，4]苯並噁嗪-(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶並[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶並吲哚胞苷(h-吡啶並[3′，2′:4，5]吡咯並[2，3-d]嘧啶-2-酮)。經修飾的鹼基還可包括其中嘌呤或嘧啶鹼被其他雜環替代的那些鹼基，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核鹼基包括美國專利號3,687,808中公開的那些核鹼基，theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering，第858-859頁，kroschwitz，j.i.，編輯johnwiley&sons，1990中公開的那些核鹼基，由englisch等人，1991，angewandtechemie，國際版本，30：613公開的那些核鹼基，以及由sanghvi，y.s.，第15章，antisenseresearchandapplications，第289-302頁，crooke，s.t.和lebleu，b.，編輯，crcpress，1993公開的那些核鹼基。這些鹼基中的某些鹼基可用於增加結合親和力，並且包括5-取代嘧啶，6-氮雜嘧啶以及n-2、n-6和o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙鏈體穩定性提高0.6-1.2℃，並且在某些方面與2′-o-甲氧基乙基糖修飾相結合。參見美國專利號3,687,808，美國專利號4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，所述專利的公開內容以引用的方式併入本文。

製備預定序列的多核苷酸的方法是眾所周知的。參見例如sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual(第2版1989)和f.eckstein(編輯)oligonucleotidesandanalogues，第1版(oxforduniversitypress，newyork，1991)。固相合成方法對於聚核糖核苷酸和聚脫氧核糖核苷酸兩者均為優選的(合成dna的眾所周知的方法也可用於合成rna)。聚核糖核苷酸也可酶促製備。非天然存在的核鹼基也可摻入多核苷酸內。參見例如美國專利號7,223,833；katz，j.am.chem.soc.，74：2238(1951)；yamane等人，j.am.chem.soc.，83：2599(1961)；kosturko等人，biochemistry，13：3949(1974)；thomas，j.am.chem.soc.，76：6032(1954)；zhang等人，j.am.chem.soc.，127：74-75(2005)；和zimmermann等人，j.am.chem.soc.，124：13684-13685(2002)。

所提供的如本文定義的用多核苷酸或其修飾形式和結構域功能化的納米顆粒一般包含長度約5個核苷酸至約100個核苷酸的多核苷酸。更具體而言，納米顆粒用多核苷酸功能化，所述多核苷酸長度約5至約90個核苷酸、長度約5至約80個核苷酸、長度約5至約70個核苷酸、長度約5至約60個核苷酸、長度約5至約50個核苷酸、長度約5至約45個核苷酸、長度約5至約40個核苷酸、長度約5至約35個核苷酸、長度約5至約30個核苷酸、長度約5至約25個核苷酸、長度約5至約20個核苷酸、長度約5至約15個核苷酸、長度約5至約10個核苷酸，以及具體公開至多核苷酸能夠實現所需結果的尺寸長度的所有多核苷酸中間體。相應地，考慮了長度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500個或更多個核苷酸的多核苷酸。

在一些實施例中，附著到納米顆粒的多核苷酸是dna。當dna附著到納米顆粒時，在一些實施例中，dna由這樣的序列組成，所述序列與多核苷酸的靶區域充分互補，使得附著到納米顆粒的dna寡核苷酸與靶多核苷酸發生雜交，由此將靶多核苷酸與納米顆粒結合。在各個方面，dna是單鏈或雙鏈的，只要雙鏈分子還包括與靶多核苷酸的單鏈區域雜交的單鏈區域。在一些方面，在納米顆粒上功能化的寡核苷酸的雜交可與雙鏈靶多核苷酸形成三鏈體結構。在另一個方面，可通過將在納米顆粒上功能化的雙鏈寡核苷酸與單鏈靶多核苷酸雜交來形成三鏈體結構。

在一些實施例中，本公開內容考慮附著至納米顆粒的多核苷酸是rna。在一些方面，rna是小幹擾rna(sirna)。

如本文定義的，寡核苷酸還包括適體。一般而言，適體是能夠與靶配體緊密結合併且謹慎區分靶配體的核酸或肽結合種類[yan等人，rnabiol.6(3)316-320(2009)，其以引用的方式全文併入本文]。在一些實施例中，適體可通過稱為通過指數富集的配體系統進化(selex)方法的技術獲得[tuerk等人，science249：505-10(1990)，美國專利號5,270,163和美國專利號5,637,459，所述參考文獻各自以引用的方式全文併入本文]。核酸適體的一般討論在例如且不限於nucleicacidandpeptideaptamers：methodsandprotocols(mayer編輯，humanapress，2009)和crawford等人，briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics2(1)：72-79(2003)中發現。適體的另外討論，包括但不限於rna適體的選擇、dna適體的選擇、能夠共價連接到靶蛋白的適體的選擇、經修飾的適體文庫的使用、以及適體作為診斷劑和治療劑的用途在由molekulyarnayabiologiya，第34卷，no.6，2000，第1097-1113頁翻譯的kopylov等人，molecularbiology34(6)：940-954(2000)中提供，所述參考文獻以引用的方式全文併入本文。在各個方面，適體為長度約10至約100個核苷酸、或長度約100至約500個核苷酸。適體的生產和使用是本領域普通技術人員已知的。

在一些方面，多個寡核苷酸被功能化至納米顆粒。在各個方面，多個寡核苷酸各自具有相同的序列，而在其他方面，一個或多個寡核苷酸具有不同的序列。在進一步的方面，多個寡核苷酸串聯排列並且由間隔物分離。間隔物在本文下文中更詳細地描述。

考慮用於附著至納米顆粒的多核苷酸包括調節從靶多核苷酸表達的基因產物的表達的多核苷酸。這樣的多核苷酸包括如本文下文定義的dna、rna及其修飾形式。相應地，在多個方面而非限制性地，考慮了與靶多核苷酸雜交並且引發靶多核苷酸的轉錄或翻譯降低的多核苷酸，與雙鏈多核苷酸雜交並抑制轉錄的三螺旋形成多核苷酸，以及與靶多核苷酸雜交且抑制翻譯的核酶。

在各個方面，如果靶向特異性多核苷酸，則單一功能化寡核苷酸-納米顆粒組合物具有結合相同轉錄物的多個拷貝的能力。在一個方面，提供了用相同的多核苷酸功能化的納米顆粒，即每個多核苷酸具有相同的長度和相同的序列。在其他方面，納米顆粒用兩個或更多個不相同的多核苷酸進行功能化，即所附著的多核苷酸中的至少一個與至少一個其他附著的多核苷酸不同之處在於它具有不同的長度和/或不同的序列。在其中不同的多核苷酸附著到納米顆粒的方面，這些不同的多核苷酸結合相同的單個靶多核苷酸但在不同的位置處，或結合編碼不同基因產物的不同靶多核苷酸。

結構域

如本文所述，其為寡核苷酸功能化的納米顆粒的部分的結構域顯示影響納米顆粒被細胞攝取的效率。相應地，結構域增加或(通過結構域的缺乏)降低效率。如本文使用的，「效率」指細胞中/通過細胞的納米顆粒攝取的數目、量或速率。因為進入和離開細胞的納米顆粒的過程是動態過程，所以可通過攝取更多的納米顆粒或通過保留進入細胞的那些納米顆粒更長的時間段來提高效率。類似地，可通過攝取更少的納米顆粒或通過保留進入細胞的那些納米顆粒更短的時間段來降低效率。

在一些方面，結構域位於寡核苷酸的末端處。在一些實施例中，結構域位於寡核苷酸的5′末端處，並且在進一步的實施例中，結構域位於寡核苷酸的3′末端處。

在一些實施例中，結構域位於未功能化至納米顆粒的寡核苷酸的末端處。換言之，在這些實施例中，結構域位於對於納米顆粒表面遠側的寡核苷酸的末端處。在進一步的實施例中，結構域位於對於納米顆粒表面遠側的寡核苷酸的末端處，並且結構域也不與任何其他分子附著。

在一些方面，結構域與寡核苷酸連續/共線。在一些方面，結構域位於寡核苷酸內的內部區域處。在進一步的方面，結構域位於附著至納米顆粒的第二寡核苷酸上。在一個方面，在功能化至納米顆粒的寡核苷酸中存在多於一個結構域。相應地，在一些方面，多於一個結構域串聯或個別地存在於寡核苷酸的5′末端處、和/或3′末端處、和/或內部區域處。

在另一個方面，在一些實施例中，考慮將結構域作為與寡核苷酸分開的實體附著至納米顆粒，即在一些實施例中，結構域直接附著到納米顆粒，與寡核苷酸分開。

進一步考慮，在一些實施例中，寡核苷酸包含位於本文所述位置中的一個或多個處的多於一個結構域。

在一些實施例中，結構域提高了寡核苷酸功能化的納米顆粒通過細胞的攝取效率。在各種實施例中，結構域為長度約2至約1000、約2至約500、約2至約100、約2至約50、約2至約30、約2至約20、約2至約10、約5至約100、約5至約50、約5至約30、約5至約20、約5至約10、約10至約100、約10至約50、約10至約30、約10至約20、約10至約15、約20至約100、約20至約50、約20至約40、約20至約30個核苷酸。在進一步的實施例中，結構域為長度小於100、小於80、小於60、小於50、小於40、小於30、小於20、小於10、或小於5個核苷酸。如本文公開的，該結構域包含鳥苷酸核苷酸(聚g)序列。在各個方面，結構域包含兩個鳥苷酸。在進一步的方面，結構域包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個、至少30個、至少31個、至少32個、至少33個、至少34個、至少35個、至少36個、至少37個、至少38個、至少39個、至少40個、至少41個、至少42個、至少43個、至少44個、至少45個、至少46個、至少47個、至少48個、至少49個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少125個、至少150個、至少175個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個或更多個鳥苷酸核苷酸。

在本公開內容的各個方面和實施例中，結構域包含為至少約50％但小於100％鳥苷酸核苷酸的序列。因此，在一些實施例中，結構域包含為至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％鳥苷酸核苷酸的序列。在進一步的實施例中，結構域包含小於55％、小於60％、小於65％、小於70％、小於75％、小於80％、小於85％、小於90％、或小於95％鳥苷酸核苷酸的序列。在再進一步的實施例中，結構域包含約50％至99％、約60％至99％、約65％至99％、約70％至99％、約75％至95％、約80％至99％、約85％至99％、約90％至約99％或約95％至約99％鳥苷酸核苷酸的序列。在一些實施例中，結構域包含為99％鳥苷酸核苷酸的序列。均聚鳥苷酸序列，即為100％鳥苷酸的序列，未被考慮用作本文的結構域。

因此，鑑於結構域的潛在的核苷酸長度和結構域中存在的各種百分比的鳥苷酸核苷酸，各自如上所述，考慮到結構域的剩餘核苷酸序列(即，並非鳥苷酸但是結構域的部分的核苷酸序列)是任何核苷酸或其修飾形式。例如且不限於，一些實施例中的結構域是(ggx)n序列，其中x是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸，胞苷酸(或其修飾形式)，並且n是約1至約500。在一些實施例中，x是鳥苷酸(條件是在這樣的實施例中，結構域不是均聚的鳥苷酸序列)。在一些實施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在一些實施例中，考慮用寡核苷酸和結構域功能化的納米顆粒被細胞攝取的效率高於用相同寡核苷酸功能化但缺乏結構域的納米顆粒。在一些方面，用寡核苷酸和結構域功能化的納米顆粒被細胞攝取比用相同寡核苷酸功能化但缺乏結構域的納米顆粒更有效1％。在各個方面，用寡核苷酸和結構域功能化的納米顆粒被細胞攝取比用相同寡核苷酸功能化但缺乏結構域的納米顆粒更有效2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。或是約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約l0倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約350倍、約400倍、約450倍、約500倍、約550倍、約600倍、約650倍、約700倍、約750倍、約800倍、約850倍、約900倍、約950倍、約1000倍、約1500倍、約2000倍、約2500倍、約3000倍、約3500倍、約4000倍、約4500倍、約5000倍、約5500倍、約6000倍、約6500倍、約7000倍、約7500倍、約8000倍、約8500倍、約9000倍、約9500倍、約10000倍高或更高。

在一些實施例中，結構域的缺乏降低寡核苷酸功能化的納米顆粒通過細胞的攝取效率。在一些實施例中，考慮用寡核苷酸功能化但缺乏結構域的納米顆粒被細胞攝取的效率低於具有比用包含結構域的相同寡核苷酸功能化的納米顆粒。在一些方面，用寡核苷酸功能化但缺乏結構域的納米顆粒被細胞攝取的效率比用包含該結構域的相同寡核苷酸功能化的納米顆粒低1％。在各個方面，用寡核苷酸功能化但缺乏結構域的納米顆粒被細胞攝取的效率比用包含該結構域的相同寡核苷酸功能化的納米顆粒低2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或是約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約350倍、約400倍、約450倍、約500倍、約550倍、約600倍、約650倍、約700倍、約750倍、約800倍、約850倍、約900倍、約950倍、約1000倍、約1500倍、約2000倍、約2500倍、約3000倍、約3500倍、約4000倍、約4500倍、約5000倍、約5500倍、約6000倍、約6500倍、約7000倍、約7500倍、約8000倍、約8500倍、約9000倍、約9500倍、約10000倍低或更低。

經修飾的寡核苷酸

如上文討論的，經修飾的寡核苷酸被考慮用於功能化納米顆粒。在各個方面，在納米顆粒上功能化的寡核苷酸被完全修飾或部分修飾。因此，在各個方面，多核苷酸中的核苷酸單元的一個或多個或所有糖和/或一個或多個或所有核苷酸間鍵合被「非天然存在的」基團替代。

在一個方面，該實施例考慮了肽核酸(pna)。在pna化合物中，多核苷酸的糖主鏈被含醯胺的主鏈替代。參見例如美國專利號5,539,082；5,714,331；和5，719，262，以及nielsen等人，science，1991，254，1497-1500，所述參考文獻的公開內容以引用的方式併入本文。

對於所公開的多核苷酸考慮的核苷酸和非天然核苷酸之間的其他鍵合包括下述中所述的那些鍵合：美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920；美國專利公開號20040219565；國際專利公開號wo98/39352和wo99/14226；mesmaeker等人，currentopinioninstructuralbiology5：343-355(1995)以及susanm.freier和karl-heinzaltmann，nucleicacidsresearch，25：4429-4443(1997)，所述參考文獻的公開內容以引用的方式併入本文。

寡核苷酸的具體例子包括含有經修飾的主鏈或非天然核苷間鍵合的那些寡核苷酸。具有經修飾的主鏈的寡核苷酸包括在主鏈中保留磷原子的那些寡核苷酸和在主鏈中不具有磷原子的那些寡核苷酸。在其核苷間主鏈中不具有磷原子的經修飾的寡核苷酸視為在「寡核苷酸」的含義內。

含有磷原子的經修飾的寡核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-亞烷基膦酸酯、5′-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正常3′-5′鍵合的硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯、這些的2′-5′鍵合的類似物、以及具有反轉極性的那些，其中一個或多個核苷酸間鍵合為3′至3′、5′至5′或2′至2′鍵合。還考慮的是具有反轉極性的多核苷酸，其包含在最3′核苷酸間鍵合處的單個3′至3′鍵合，即可為無鹼基(核苷酸缺失或在其位置中具有羥基)的單個反轉核苷殘基。還考慮了鹽、混合鹽和游離酸形式。

教導上述含磷鍵合的製備的代表性美國專利包括美國專利號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，所述專利的公開內容以引用的方式併入本文。

不包括磷原子的經修飾的多核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵合、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵合、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵合形成的主鏈。這些包括具有下述的那些：嗎啉鍵合；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸和碸主鏈；甲醯乙醯基和硫代甲醯乙醯基主鏈；亞甲基甲醯乙醯基和硫代甲醯乙醯基主鏈；核糖乙醯基主鏈；含烯烴主鏈；氨基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸鹽和磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；以及具有混合的n、o、s和ch2組分部分的其他。在另外其他實施例中，提供了具有硫代磷酸酯主鏈的多核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核苷酸，並且該寡核苷酸包括美國專利號5,489,677和5,602,240中所述的-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-。參見例如美國專利號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，所述專利的公開內容以引用的方式全文併入本文。

在各種形式中，寡核苷酸中的兩個連續單體之間的鍵合由選自-ch2-、-o-、-s-、-nrh-、＞c＝o、＞c＝nrh、＞c＝s、-si(r″)2-、-so-、-s(o)2-、-p(o)2-、-po(bh3)-、-p(o，s)-、-p(s)2-、-po(r″)-、-po(och3)-和-po(nhrh)-的2至4個，優選3個基團/原子組成，其中rh選自氫和c1-4-烷基，並且r″選自c1-6-烷基和苯基。這些鍵合的舉例說明性例子是-ch2-ch2-ch2-、-ch2-co-ch2-、-ch2-choh-ch2-、-o-ch2-o-、-o-ch2-ch2-、-o-ch2-ch＝(當用作與連續單體的鍵合時包括r5)、-ch2-ch2-o-、-nrh-ch2-ch2-、-ch2-ch2-nrh-、-ch2-nrh-ch2--、-o-ch2-ch2-nrh-、-nrh-co-o-、-nrh-co-nrh-、-nrh-cs-nrh-、-nrh-c(＝nrh)-nrh-、-nrh-co-ch2-nrh-o-co-o-、-o-co-ch2-o-、-o-ch2-co-o-、-ch2-co-nrh-、-o-co-nrh-、-nrh-co-ch2-、-o-ch2-co-nrh-、-o-ch2-ch2-nrh-、-ch＝n-o-、-ch2-nrh-o-、-ch2-o-n＝(當用作與連續單體的鍵合時包括r5)、-ch2-o-nrh-、-co-nrh-ch2-、-ch2-nrh-o-、-ch2-nrh-co-、-o-nrh-ch2-、-o-nrh、-o-ch2-s-、-s-ch2-o-、-ch2-ch2-s-、-o-ch2-ch2-s-、-s-ch2-ch＝(當用作與連續單體的鍵合時包括r5)、-s-ch2-ch2-、-s-ch2-ch2--o-、-s-ch2-ch2-s-、-ch2-s-ch2-、-ch2-so-ch2-、-ch2-so2-ch2-、-o-so-o-、-o-s(o)2-o-、-o-s(o)2-ch2-、-o-s(o)2-nrh-、-nrh-s(o)2-ch2-；-o-s(o)2-ch2-、-o-p(o)2-o-、-o-p(o，s)-o-、-o-p(s)2-o-、-s-p(o)2-o-、-s-p(o，s)-o-、-s-p(s)2-o-、-o-p(o)2-s-、-o-p(o，s)-s-、-o-p(s)2-s-、-s-p(o)2-s-、-s-p(o，s)-s-、-s-p(s)2-s-、-o-po(r″)-o-、-o-po(och3)-o-、-o-po(och2ch3)-o-、-o-po(och2ch2s-r)-o-、-o-po(bh3)-o-、-o-po(nhrn)-o-、-o-p(o)2-nrhh-、-nrh-p(o)2-o-、-o-p(o，nrh)-o-、-ch2-p(o)2-o-、-o-p(o)2-ch2-和-o-si(r″)2-o-；在其中考慮了-ch2-co-nrh-、-ch2-nrh-o-、-s-ch2-o-、-o-p(o)2-o-o-p(-o，s)-o-、-o-p(s)2-o-、-nrhp(o)2-o-、-o-p(o，nrh)-o-、-o-po(r″)-o-、-o-po(ch3)-o-和-o-po(nhrn)-o-，其中rh選自氫和c1-4-烷基，並且r″選自c1-6-烷基和苯基。進一步的舉例說明性實例在mesmaeker等人，1995，currentopinioninstructuralbiology，5：343-355以及susanm.freier和karl-heinzaltmann，1997，nucleicacidsresearch，第25卷：第4429-4443頁中給出。

多核苷酸的另外其他修飾形式在美國專利申請號20040219565中詳細描述，所述專利的公開內容以引用的方式全文併入本文。

經修飾的多核苷酸還可含有一個或多個取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2′位置處包含下述之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可為取代或未取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。其他實施例包括o[(ch2)no]mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2)non[(ch2)nch3]2，其中n和m為1至約10。其他多核苷酸在2′位置處包含下述之一：c1至c10低級烷基、取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲矽烷基、rna切割基團、報導基團、嵌入劑、用於改善多核苷酸的藥代動力學性質的基團、或用於改善多核苷酸的藥效學性質的基團、以及具有相似性質的其他取代基。在一個方面，修飾包括2′-甲氧基乙氧基(2′-o-ch2ch2och3，也稱為2′-o-(2-甲氧基乙基)或2′-moe)(martin等人，1995，helv.chim.acta，78：486-504)即烷氧基烷氧基。其他修飾包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基團，也稱為2′-dmaoe，以及2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領域也稱為2′-o-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-dmaeoe)，即2′-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2。

另外其他的修飾包括2′-甲氧基(2′-o-ch3)、2′-氨基丙氧基(2′-och2ch2ch2nh2)、2′-烯丙基(2′-ch2-ch＝ch2)、2′-o-烯丙基(2′-o-ch2-ch＝ch2)和2′-氟(2′-f)。2′-修飾可在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置中。在一個方面，2′-阿拉伯糖修飾是2′-f。類似的修飾也可在多核苷酸上的其他位置處作出，例如在3′末端核苷酸上的糖的3′位置處或2′-5′連接的多核苷酸中和在5′末端核苷酸的5′位置處。多核苷酸還可具有糖模擬物，例如環丁基部分代替戊呋糖基糖。參見例如美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，所述專利的公開內容以引用的方式全文併入本文。

在一個方面，糖的修飾包括鎖核酸(lna)，其中2′-羥基連接到糖環的3′或4′碳原子，由此形成雙環糖部分。該鍵合在某些方面是橋接2′氧原子和4′碳原子的亞甲基(-ch2-)n基團，其中n為1或2。lna及其製備在wo98/39352和wo99/14226中描述，所述專利的公開內容以引用的方式併入本文。

與納米顆粒的寡核苷酸附著

考慮用於該方法的寡核苷酸包括通過任何方式與納米顆粒結合的寡核苷酸。不管寡核苷酸通過其與納米顆粒附著的方式，通過5′鍵合、3′鍵合、某種類型的內部鍵合或這些附著的任何組合來實現在各個方面的附著。

附著方法是本領域普通技術人員已知的，並且在美國公開號2009/0209629中描述，所述專利以引用的方式全文併入本文。將rna附著到納米顆粒的方法一般在pct/us2009/65822中描述，所述專利以引用的方式全文併入本文。

因此提供了具有與其附著的寡核苷酸的納米顆粒，其中進一步包含結構域的寡核苷酸與納米顆粒結合。

間隔物

在某些方面，考慮了功能化納米顆粒，其包括其中寡核苷酸和結構域通過間隔物附著到納米顆粒的那些納米顆粒。如本文使用的，「間隔物」意指這樣的部分，其不參與調節基因表達本身，但作用於增加納米顆粒和功能性寡核苷酸之間的距離，或者當以多個拷貝附著至納米顆粒時增加各個寡核苷酸之間的距離。因此，考慮將間隔物串聯定位在各個寡核苷酸之間，無論寡核苷酸具有相同的序列還是具有不同的序列。在其中結構域直接附著到納米顆粒的本發明的方面，結構域任選地通過間隔物功能化至納米顆粒。在另一個方面，結構域在與間隔物末端相對的寡核苷酸末端上。在其中串聯的結構域功能化至納米顆粒的方面，間隔物任選地在串聯結構中的一些或全部結構域單元之間。在一個方面，當存在時，間隔物是有機部分。在另一個方面，間隔物是聚合物，包括但不限於水溶性聚合物、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂質、乙二醇或其組合。

在某些方面，多核苷酸具有它通過其與納米顆粒共價結合的間隔物。這些多核苷酸是與上文描述相同的多核苷酸。由於間隔物與納米顆粒的結合，多核苷酸與納米顆粒的表面間隔開，並且對於與其靶的雜交更容易接近。在間隔物是多核苷酸的情況下，在各種實施例中，間隔物的長度至少約10個核苷酸、10-30個核苷酸或甚至大於30個核苷酸。間隔物可具有不幹擾多核苷酸變得與納米顆粒或靶多核苷酸結合的能力的任何序列。在某些方面，多核苷酸間隔物的鹼基全部是腺苷酸、全部是胸苷酸、全部是胞苷酸、全部是鳥苷酸、全部是尿苷酸、或全部是一些其他經修飾的鹼基。相應地，在其中間隔物由所有鳥苷酸組成的一些方面，考慮間隔物可如本文所述充當結構域。

表面密度

本文提供的納米顆粒具有在納米顆粒的表面上的多核苷酸的填充密度，其在各個方面都足以導致納米顆粒之間和單個納米顆粒上的多核苷酸鏈之間的協同行為。在另一個方面，在納米顆粒之間的協同行為增加了多核苷酸對核酸酶降解的抗性。在另外一個方面，通過細胞的納米顆粒攝取受與納米顆粒結合的多核苷酸密度的影響。如以引用的方式全文併入本文的美國專利申請公開號2008/0306016中所述，在納米顆粒的表面上較高密度的多核苷酸與通過細胞的納米顆粒的增加攝取有關。本公開內容提供了其中由於納米顆粒表面上更高密度的多核苷酸而增加的納米顆粒攝取與本文所述的結構域的存在組合起作用的實施例。例如且不限於，在納米顆粒表面上具有給定密度的多核苷酸的納米顆粒(其中納米顆粒還包含如本文公開的聚g結構域)，將證明相對於在納米顆粒表面上具有相同密度的多核苷酸的納米顆粒(其中納米顆粒缺乏聚g結構域)通過細胞的功能化納米顆粒的攝取增加。在各個方面，還包含聚g結構域的功能化納米顆粒通過細胞的攝取增加相對於缺乏聚g結構域的功能化納米顆粒為1％。在進一步的方面，還包含聚g結構域的功能化納米顆粒通過細胞的攝取增加相對於缺乏聚g結構域的功能化納米顆粒為2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或是約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約350倍、約400倍、約450倍、約500倍、約550倍、約600倍、約650倍、約700倍、約750倍、約800倍、約850倍、約900倍、約950倍、約1000倍、約1500倍、約2000倍、約2500倍、約3000倍、約3500倍、約4000倍、約4500倍、約5000倍、約5500倍、約6000倍、約6500倍、約7000倍、約7500倍、約8000倍、約8500倍、約9000倍、約9500倍、約10000倍高或更高。

足以使納米顆粒穩定的表面密度和對於納米顆粒和多核苷酸的所需組合獲得它必要的條件可憑經驗來確定。一般地，至少約2pmole/cm2的表面密度將足以提供穩定的納米顆粒-寡核苷酸組合物。在一些方面，表面密度為至少15pmole/cm2。還提供了其中多核苷酸以下述表面密度與納米顆粒結合的方法：至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少約15pmol/cm2、至少約19pmol/cm2、至少約20pmol/cm2、至少約25pmol/cm2、至少約30pmol/cm2、至少約35pmol/cm2、至少約40pmol/cm2、至少約45pmol/cm2、至少約50pmol/cm2、至少約55pmol/cm2、至少約60pmol/cm2、至少約65pmol/cm2、至少約70pmol/cm2、至少約75pmol/cm2、至少約80pmol/cm2、至少約85pmol/cm2、至少約90pmol/cm2、至少約95pmol/cm2、至少約100pmol/cm2、至少約125pmol/cm2、至少約150pmol/cm2、至少約175pmol/cm2、至少約200pmol/cm2、至少約250pmol/cm2、至少約300pmol/cm2、至少約350pmol/cm2、至少約400pmol/cm2、至少約450pmol/cm2、至少約500pmol/cm2、至少約550pmol/cm2、至少約600pmol/cm2、至少約650pmol/cm2、至少約700pmol/cm2、至少約750pmol/cm2、至少約800pmol/cm2、至少約850pmol/cm2、至少約900pmol/cm2、至少約950pmol/cm2、至少約1000pmol/cm2或更多。

寡核苷酸靶序列和雜交

在一些方面，本公開內容提供了靶向特異性核酸的方法。可靶向任何類型的核酸，並且所述方法可用於例如基因表達的治療性調節(參見例如美國專利申請公開號2009/0209629，其公開內容以引用的方式併入本文)。可通過本發明的方法靶向的核酸的例子包括但不限於基因(例如，與特定疾病相關的基因)、細菌rna或dna、病毒rna、或mrna、rna或單鏈核酸。

術語「起始密碼子區」和「翻譯起始密碼子區」指包含從翻譯起始密碼子開始的在任一方向(即5′或3′)上的連續核苷酸的mrna或基因的一部分。類似地，術語「終止密碼子區」和「翻譯終止密碼子區」指包含從翻譯終止密碼子開始的在任一方向(即，5′或3′)上的連續核苷酸的這種mrna或基因的一部分。因此，「起始密碼子區域」(或「翻譯起始密碼子區域」)和「終止密碼子區域」(或「翻譯終止密碼子區域」)都是可用功能化納米顆粒上的寡核苷酸有效靶向的區域。

其他靶區域包括5′非翻譯區(5′utr)，從翻譯起始密碼子開始的在5′方向上的mrna的一部分，包括5′帽位點和mrna的翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的相應核苷酸)，以及3′非翻譯區(3′utr)，從翻譯終止密碼子開始的在3′方向上的mrna的一部分，包括翻譯終止密碼子和mrna的3′末端之間的核苷酸(或基因上的相應核苷酸)。mrna的5′帽位點包含經由5′-5′三磷酸鍵合連接到mrna的最5′殘基的n7-甲基化鳥苷殘基。mrna的5′帽區域被認為包括5′帽結構本身以及與帽位點相鄰的前50個核苷酸。

對於原核靶核酸，在各個方面，核酸是由基因組dna轉錄的rna。對於真核靶核酸，核酸是動物核酸、植物核酸、真菌核酸包括酵母核酸。如上文，靶核酸是由基因組dna序列轉錄的rna。在某些方面，靶核酸是線粒體核酸。對於病毒靶核酸，核酸是病毒基因組rna或由病毒基因組dna轉錄的rna。

所提供的用於抑制基因產物表達的方法包括這樣的方法，其中與不存在寡核苷酸功能化的納米顆粒的基因產物表達相比，靶基因產物的表達被抑制至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％。換言之，所提供的方法包括導致靶基因產物表達的基本上任何程度的抑制的那些方法。

抑制程度從體液樣品或活組織檢查樣品或通過本領域眾所周知的成像技術在體內進行測定。可替代地，在細胞培養測定中測定抑制程度，一般作為來源於使用特定類型的納米顆粒和特定寡核苷酸在體內可預期的抑制程度的可預測量度。

實例

調查了球形核酸納米顆粒綴合物(sna)的序列依賴性細胞攝取。該過程通過與a類清道夫受體(sr-a)相互作用和質膜微囊介導的胞吞作用而發生。已知線型聚(鳥苷酸)(聚g)是sr-a的天然配體。下文描述的實例測試了具有較高g含量的sna是否能夠以比由其他核苷酸組成的sna更大的量進入細胞，並且像這樣根據組成成分寡核苷酸序列測量sna的細胞內化。如下所示，具有富集g含量的sna顯示最高的細胞攝取。接下來，將小分子(喜樹鹼)與sna化學綴合，以產生藥物-sna綴合物，並且觀察到聚gsna將大多數喜樹鹼遞送至細胞，並且在癌細胞中具有最高的細胞毒性。本文提供的數據闡明了用於增強球形核酸的細胞內轉運的重要設計考慮。

在四種細胞類型a549(人肺腺癌上皮)、nih-3t3(小鼠成纖維細胞)、c166(小鼠內皮)和hacat(人角質形成細胞)中調查富含g的sna的增強的細胞攝取。另外，通過設計負載有dna-化學治療綴合物的sna，研究了序列依賴性細胞攝取的後果，並且與富含a、t、s的sna相比，用富含g的sna增加了喜樹鹼化學治療分子遞送至a549細胞和後續細胞毒性。

實例1

sna上的核鹼基類型決定了金納米顆粒的表面上的dna寡核苷酸殼的負載和厚度。

首先，通過將相同量的不同核鹼基類型的烷基硫醇修飾的30-鹼基對長的單鏈dna寡核苷酸(ssdna)(圖1a；關於序列信息參見下表1)加入檸檬酸鹽封端的10納米(nm)直徑金納米顆粒(aunp)的水性懸浮液內，來製備由不同核鹼基類型(a、t、c或g)組成的sna。為了製備富含c(聚csna)和g(聚gsna)的sna，沿著c和g的線型聚合物以規律間隔有意地插入t，分別獲得(cct)10和(ggt)10的序列。對於聚csna和聚gsna，這些設計特徵減弱了由於i-基序[gehring等人，nature363：561-565(1993)]和g-四鏈體[sen等人，nature334：364-366(1988)]形成而難以合成的合成聚c和聚g序列的挑戰。相反，a和t的線型聚合物不會自然地摺疊成穩定的二級結構，當製備富含a(聚asna)和t(聚tsna)的sna時，不需要用另一種核鹼基稀釋a和t的線型聚合物。通過動態光散射測量，所有sna均具有22±4nm的流體動力學直徑，提示關於寡核苷酸殼5-8nm的厚度(圖2)。厚度的變化可能是由於負載的變化(參見下文)。通過uv-vis光譜法，所有的sna一般在大小上是單分散的，並且與未經修飾的aunp相比(524nm相對於520nm)，顯示出在表面等離子體峰中大約4nm的紅移，這是由於在寡核苷酸殼的共價附著後的局部折射率的變化[kumar等人，natprotoc3：314-320(2008)](圖3)。然後通過製備其寡核苷酸在其5′末端處含有cy5螢光團的sna，根據核鹼基類型測量寡核苷酸負載(圖4)。鑑於30個鹼基的恆定寡核苷酸長度，富含嘧啶鹼基(即c和t)的sna具有顯著更高的寡核苷酸負載，由此聚tsna和聚csna分別具有大約180個ssdna和大約140個ssdna/aunp。相比之下，富含嘌呤鹼基的sna具有較低的寡核苷酸負載：聚gsna和聚asna分別只有大約75個ssdna和大約45個ssdna/aunp(圖1a)。

表1.sna納米顆粒綴合物及其dna寡核苷酸序列的列表。製備由表1中列出的dna寡核苷酸組成的sna，以分別使用icp-ms和tem檢查核鹼基類型對其細胞攝取動力學和細胞內分布的作用(圖5)。圖2和圖3呈現了這些sna的流體動力學尺寸和吸收光譜的dls和uv-vis光譜數據。圖1中的tem成像數據揭示了sna的形態。

為了通過透射電子顯微鏡檢查(tem)直接顯現寡核苷酸殼，利用了用於sna的乙酸雙氧鈾染色方案[huxley等人，jbiophysbiochemcytol11：273-296(1961)]。與負載數據一致，聚tsna的寡核苷酸覆蓋率在所有測試的核鹼基類型中最密集，如在aunp的整個圓周上通過其乾燥厚度為4-6nm的均勻寡核苷酸殼證明的(圖1b)。chen等人使用單分子fret(smfret)和小角度x射線散射(saxs)，以證明在生理水平的鹽(150mmnacl)的存在下，40個鹼基長的單鏈聚tdna(t40)的端對端距離為大約6.6nm[chen等人，procnatlacadsciu.s.a.109：799-804(2012)]。因此，如通過tem圖像揭示的聚tsna的乾燥殼厚度提示，當它們徑向延伸遠離aunp的中心時，聚tdna連結近由aunp的彎曲表面提供的最大負載。聚asna具有厚度僅1-2nm的最薄的寡核苷酸殼，但它們的殼仍是均勻的。鑑於其中等寡核苷酸負載，聚csna和聚gsna具有2-4nm厚的寡核苷酸殼，但是它們的殼不像聚tsna和聚asna那樣均勻。儘管這種技術受到乾燥影響，但數據與來自寡核苷酸負載研究的結果一致(圖1a)。簡言之，寡核苷酸負載和tem成像數據與文獻先例一致，即嘧啶鹼基(c和t)比其嘌呤配對物(a和g)更不強烈地吸附至金表面demers等人，jamchemsoc124：11248-11249(2002)；hurst等人，78，8313-8318(2006)；storhoff等人，langmuir18：6666-6670(2002)；kimura-suda等人，journaloftheamericanchemicalsociety125：9014-9015(2003)；opdahl等人，procnatlacadsciu.s.a.104：9-14(2007)]，支持了前者延伸遠離金表面而後者與表面相互作用的觀點。

實例2

聚gsna在所有測試的核鹼基類型中以最高量進入多種哺乳動物細胞類型。

接下來，通過電感耦合等離子體質譜法(icp-ms)監測不同核鹼基類型的sna的細胞攝取動力學。選擇c166細胞是因為其表達sr-a[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]，sr-a是介導sna的細胞攝取的關鍵受體(圖5a)。在兩小時溫育後，聚gsna顯示出在所有測試的核鹼基類型中最高水平的細胞結合，累積5×105個顆粒/細胞。與聚gsna形成對比，聚tsna顯示超過5倍低的細胞結合，是所有核鹼基類型中細胞結合的最低水平。與聚tsna和聚gsna相比，聚a和聚csna顯示出中等水平的細胞結合。類似的數據呈現於圖13中。還參見圖12，其證明了聚gsna顯示比聚a、聚t和聚csna更高的與c166細胞的細胞結合。經修飾的elisa測定顯示聚gsna證明與重組a類清道夫受體(sr-a)的最高結合，sr-a負責聚gsna增加的細胞結合。

然而，icp-ms，允許敏感定量與細胞結合的金的大量含量的技術，不提供關於sna的細胞內分布的任何信息。因此，tem用於確定sna是進入細胞還是僅與細胞膜結合(圖5b)。與細胞一起溫育2小時後，由所有核鹼基類型組成的sna可進入c166細胞，如通過其在細胞溶質或初級內體內的累積所證明的。與icp-ms數據一致，代表性tem圖像顯示聚gsna在所有核鹼基類型中是細胞中最豐富的，在顆粒簇數目/細胞的橫截面積和顆粒數目/簇(通常＞100個sna/簇)兩個方面。相比之下，儘管tem圖像不允許精確定量細胞中的顆粒，但聚asna、聚csna和聚tsna以比聚gsna顯著更小的量(＜20個sna/簇)進入細胞。

總之，當組成成分寡核苷酸鏈保持恆定在30個鹼基長時，比其他核鹼基類型(即a、c、t)更高部分的g的摻入使sna對c166細胞的遞送達到最大。為了確定這種g依賴性攝取是否僅適用於c166細胞，對於三種其他哺乳動物細胞類型，即hacat、3t3和a549，進一步跟蹤sna的細胞攝取動力學(圖5c)。這些細胞系連同c166，具有一系列的sr-a的表達水平；以表達水平的遞減次序，它們是hacat、c166、3t3和a549[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]。與c166細胞的攝取數據一致，聚gsna證明對於這些細胞類型的最大的結合程度，顯示出比由其他核鹼基類型組成的sna的4-10倍高的細胞結合。值得注意的是，聚gsna的細胞結合也與sr-a的表達水平正相關；當與相同濃度的聚gsna一起溫育時，hacat、3t3和a549細胞分別顯示出最高、中等和最低的細胞結合。因此，g的摻入以與sr-a的表達水平相關的方式使sna對多種哺乳動物細胞類型的遞送達到最大。另外，這些數據顯示當核鹼基類型不保持恆定時，寡核苷酸負載不決定細胞攝取動力學；儘管它們的寡核苷酸負載較低，但聚gsna以比聚tsna更高的量進入細胞。

實例3

不管核組成如何，聚g殼使細胞內遞送達到最大。

為了證明與聚a、聚t和聚csna相比，聚gsna的聚g殼促進了增加的細胞攝取，合成了具有不同核組成的富含t的sna和聚gsna，5nmaunp或硒化鎘(cdse)量子點(qd)(關於序列信息參見表2)。製備由表2中列出的寡核苷酸組成的5納米aunp-sna和qd-sna，以研究聚g殼對不同核組成的sna的細胞攝取的作用(圖6)。所有序列均為28個鹼基長，並且以二苯並環辛基(dbco)基團封端。使用先前描述的策略合成aunp-sna和qd-sna[zhang等人，natmater12：741-746(2013)，其以引用的方式全文併入本文]。在一組實驗中，用等濃度的富含t的qd-sna和聚gaunp-sna處理c166細胞。在另一組實驗中，用等濃度的富含t的aunp-sna和聚gqd-sna處理細胞。然後使用共聚焦顯微鏡檢查來跟蹤進入細胞的qd的螢光信號。用富含t的qd-sna和聚gaunp-sna處理的c166細胞顯示非常少的細胞內螢光。然而，用富含t的aunp-sna和聚gqd-sna處理的c166細胞顯示顯著更高的細胞內螢光(圖6a)，指示具有聚g殼的sna進入c166細胞內的更高攝取。為了進一步證實，icp-ms用於分析用單獨的富含t的aunp-sna或qd-sna、單獨的聚gaunp-sna或qd-sna、富含t的aunp-sna和聚gqd-sna的組合、以及富含t的qd-sna和聚gaunp-sna的組合處理的c166細胞中的au含量和cd含量。用聚gaunp-sna處理的c166細胞具有的au含量是用富含t的aunp-sna處理的細胞的3倍。相比之下，用聚gqd-sna處理的細胞顯示的cd含量是用富含t的qd-sna處理的細胞的三倍(圖6b)。用聚gaunp-sna和富含t的qd-sna處理的細胞具有與cd含量相比更高的au含量，並且對於用富含t的aunp-sna和聚gqd-sna處理的細胞，這種趨勢是相反的(圖6b)。這種競爭性細胞攝取測定顯示，具有聚g殼的sna優先進入細胞，而不管核組成如何，指示聚g殼對細胞表面受體具有更大的親和力。

表2.sna納米顆粒綴合物及其dna寡核苷酸序列的列表。

實例4

寡核苷酸的最外周大約10個鹼基決定了sna的細胞攝取。

為了從幾何角度來表徵細胞攝取性質，調查了顯著促成sna的細胞攝取的dna寡核苷酸的部分。再次，比較了當所有組成成分寡核苷酸保持恆定在30個鹼基時sna的細胞結合(關於序列信息參見表3)。製備由表3中列出的寡核苷酸組成的sna，以探測核苷酸位置對sna的細胞攝取的作用(圖7)。所有序列均為30個鹼基長，並且在3′末端處含有最少6個胸苷酸(t)殘基。在3′末端處的聚(t)基序允許寡核苷酸在aunp的表面上幾乎恆定的負載，而不依賴於序列。寡核苷酸的部分不含任何核鹼基；通過使用dspacerce亞磷醯胺(d；具有核糖單元和磷酸鹽主鏈兩者)或spacer亞磷醯胺c3(c；僅具有磷酸鹽主鏈)來製備這些無鹼基區域。

首先，通過icp-ms比較了聚tsna以及含有不同量的在5′末端處的g(以重複ggt單元的形式)和在3′末端處的t的sna之間的細胞結合。在dna寡核苷酸的3′末端處的聚t區段允許在aunp的表面上幾乎恆定的寡核苷酸負載。一般而言，sna的細胞結合隨著在組成成分寡核苷酸的5′末端處的g含量增加而增加(圖7a)。看起來需要在組成成分寡核苷酸的5′末端處的最少四個ggt重複，以顯著增強細胞結合；與聚tsna相比，兩個ggt重複的添加並不顯著增加細胞結合。

d＝具有核糖單元和磷酸鹽主鏈兩者的無鹼基位點

c＝僅具有磷酸鹽主鏈的無鹼基位點

表3.sna納米顆粒綴合物及其dna寡核苷酸序列的列表

還比較了由ggt重複在5′末端處暴露或埋在鏈中間的寡核苷酸組成的sna的細胞結合(參見表3中的序列信息)。當與其中ggt重複在5′末端處暴露的情況相比時，在5′末端上放置t12基序以將ggt重複埋在dna寡核苷酸鏈的中間使細胞結合降低大約70％，有效地遏制了ggt重複對sna的細胞攝取的優異作用(圖7b)。這些觀察顯示在30個鹼基長的組成成分dna寡核苷酸的5′末端處的大約10個鹼基主要決定了sna的細胞攝取性質。除了經由引入更多的g增加聚tsna的細胞攝取之外，還探測了與聚tsna的細胞攝取最相關的sna納米結構的一部分。為此，構建了在組成成分dna寡核苷酸的5′末端處含有不同長度的無鹼基間隔物的sna(參見表3中的序列信息)。這些無鹼基間隔物包括不包含核鹼基的dspacer(glenresearch)和既不具有核鹼基也不具有環結構的c3間隔物(glenresearch)。具有較高無鹼基間隔物含量的sna顯示與聚tsna相比低大約75％的細胞結合(圖7c和7d)，當將多於10個無鹼基間隔物單元添加到5′末端時其被拉平。再次，這些數據證明在sna納米顆粒的最外圍部分處暴露的組成成分寡核苷酸鏈的大約三分之一(在5′末端處的總共30個鹼基中的10個)在確定其細胞結合中是幾何學上最必需的。它們還再次肯定核鹼基而不是磷酸鹽主鏈或核糖單元是決定sna的細胞結合的生化活性組分。

實例5

聚gsna可使小分子化學治療劑(例如喜樹鹼)對癌細胞的細胞內遞送達到最大。

除通過icp-ms測量和tem成像提供的經驗數據之外，還通過證明含有藥物的sna的細胞攝取的增加對應於其針對癌細胞的細胞毒性的增加，來提供聚gsna在所有核鹼基類型中最有效地進入哺乳動物細胞的功能證據。作為概念證明，通過將喜樹鹼(cpt)(小分子化學治療劑)共價附著到其組成成分寡核苷酸的最外圍位置，並且隨後根據核鹼基類型檢查其殺死癌細胞的能力，製備了含有喜樹鹼的sna(cpt-sna)。選擇a549人肺腺癌上皮細胞(如圖5c中討論的)作為模型細胞系，因為它們的sr-a和窖蛋白-1的低表達，這兩者都是sna的細胞攝取的必需蛋白質[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]。鑑於通過a549細胞的sna細胞攝取的適度程度，任何可觀察到的細胞毒性都突出了根據核鹼基類型的cpt-sna效力。為了將cpt分子附著到dna鏈上，遵循文獻先例以使cpt的-oh基團與含有疊氮化物的接頭反應，以合成喜樹鹼-疊氮化物(cpt-n3)[parrish等人，bioconjugchem18：263-267(2007)]。無銅點擊化學用於將cpt-n3直接偶聯到雙功能單鏈dna(ssdna)上，所述雙功能單鏈dna具有在一個末端上的二苯並環辛基(dbco)基團以及在另一個末端上的硫醇基團。然後所得的綴合物喜樹鹼-dna-硫醇(cpt-dna-sh)可如先前所述共價附著到aunp的表面，獲得cpt-sna(圖8a和9)。

表4.序列如圖9d所示。

使用該方法製備了cpt-聚asna、cpt-聚tsna、cpt-聚csna和cpt-聚gsna。鑑於聚tsna和聚csna的寡核苷酸負載顯著高於聚asna和聚gsna的寡核苷酸負載量，用未經修飾的t30-sh鏈有意地稀釋cpt-t30-sh鏈，並且用未經修飾的(cct)10-sh鏈稀釋cpt-(cct)10-sh鏈，因為鏈被功能化到aunp上，以便獲得在由所有核鹼基類型組成的sna上的cpt分子的類似負載，這允許直接比較聚gsna的增強的細胞攝取對cpt遞送的作用。實際上，喜樹鹼分子/顆粒的負載被確定為大致相等(大約55±15個cpt分子/aunp)(圖8b)。接下來通過使用icp-ms測量與細胞結合的金含量來研究核鹼基類型對通過a549細胞的cpt-sna攝取的作用。在溫育9小時和18小時後，與由其他核鹼基類型組成的cpt-sna相比，cpt-聚gsna顯示與a549細胞6-9倍高的結合。這一觀察加強了下述結論：在aunp的表面上共價功能化的dna寡核苷酸的10個最外圍鹼基在決定sna的細胞攝取性質方面是最顯著的。即，放置在sna外周處的小分子藥物並不顯著幹擾dna寡核苷酸與細胞表面sr-a之間的相互作用。使cpt-sna與a549細胞進一步溫育18小時，用新鮮的無納米顆粒培養基補充，並且允許生長另外54小時。在72小時後，與細胞結合的金含量類似於在18小時後與細胞結合的金含量，暗示cpt-sna幾乎沒有明顯的胞吐作用(圖8c)。除了通過icp-ms跟蹤cpt-sna的aunp核之外，通過共聚焦成像顯現a549細胞中的cpt分布，利用了在440nm處cpt分子的螢光發射[zamai等人，molcancerther2：29-40(2003)]。在使cpt-sna與a549細胞一起溫育18小時後，去除顆粒，用新鮮培養基補充，並且在處理後3和5天成像。在3天後，cpt-聚gsna顯示在所有測試的核鹼基類型中最高的cpt細胞內累積。在5天後，用cpt-聚gsna處理的細胞仍然顯示最高的螢光，但螢光更為擴散(圖8d)。基於icp-ms和共聚焦成像數據，並且不受理論的束縛，考慮cpt-sna在細胞中持續足夠的時間段，以通過細胞內酯酶的作用逐漸釋放cpt分子並且發揮細胞毒性效應[cheng等人，bioconjugchem14：1007-1017(2003)]。為了測試這點，將20nmcpt-sna(或等價地，大約1.1μmcpt分子)與不同的序列和a549細胞一起溫育18小時，用新鮮培養基補充細胞，並且在幾天後通過使用經修飾的mtt測定來測量其活力。在cpt-sna處理後4至7天之間，cpt-聚gsna比由其他核鹼基類型組成的cpt-sna明顯更細胞毒性。在7天後，與用由其他核鹼基類型組成的cpt-sna處理的細胞的80-100％存活率相比，用cpt-聚gsna處理的細胞僅顯示大約20％的細胞存活率(圖8e)。作為陰性對照，a549細胞也與由所有核鹼基類型組成的20nm無cpt的sna一起溫育18小時，並且在處理後7天未觀察到明顯的細胞毒性(圖10)，證實了所觀察到的通過cpt-sna處理誘導的細胞毒性源於所附著的cpt分子，而不是sna體系結構本身。

另外，在用cpt-sna處理後6天，用碘化丙啶染色細胞以檢測cpt誘導的細胞凋亡。染色細胞的流式細胞術揭示cpt-(ggt)10sna是最細胞毒性的(圖8f)。為了進一步確保cpt在細胞中是活性的，活化的半胱天冬酶3(已知由cpt活化的細胞凋亡信號傳導蛋白)[stefanis等人，jneurosci19：6235-6247(1999)]的量在5天後通過elisa在細胞中進行測量。用cpt-聚gsna處理的細胞顯示比用cpt-a30、cpt-t30和cpt-(cct)10sna處理的細胞更高量的活化的半胱天冬酶3(圖11)。總之，cpt-聚gsna比由其他核鹼基類型組成的cpt-sna明顯更有效，如通過聚gsna增加的cpt對癌細胞的遞送和增加的細胞毒性所證明的。這個實例強調了g依賴性遞送的功能優點，並且證明了以更高效率遞送其他治療實體的潛力。

結論

由上述非限制性實例證明的是用於增加sna納米顆粒綴合物進入細胞的攝取的方法。具有含有高g含量的三維寡核苷酸殼的sna以比主要由a、t和c組成的sna更高的量通過細胞內化。此外，富含g的sna可用於增強核酸和小分子藥物兩者的細胞內遞送。這指示序列組成是除濃度之外的另一種可調諧性質，其可用於定製sna的細胞內遞送。這種定製序列組成的策略是用於基於納米顆粒的診斷和治療應用的強大工具，因為它使得能夠合理設計具有所需細胞攝取性質的納米顆粒構建體。

實例6

材料和方法

下述材料和方法用於生成前述實例中所述的數據。

dna寡核苷酸的合成。使用標準固相合成和試劑(glenresearch)在mm48寡核苷酸合成儀(bioautomation)上合成dna。除非另有說明，否則所有dna均使用具有microsorbc18柱(varian)的prostarhplc(varian)進行純化。表1含有dna的詳細序列信息。

球形核酸(sna)納米綴合物的製備。將硫醇化dna以1oddna/ml補充有0.1％tween20的10nmaunp的濃度加入10nm檸檬酸鹽加帽的aunp中。在室溫下攪拌1小時後，伴隨nacl的逐漸加入經過6小時使溶液老化，以使最終的nacl濃度達到0.5m。使用50-kdaamiconmwco膜(millipore)，經由針對nanopure水的透析，使功能化的aunp與游離dna鏈分離。通過在cary5000uv-vis分光光度計(agilent)上分別測量其在524nm和260nm處的消光來測定aunp和dna濃度。為了製備含有喜樹鹼的sna(cpt-sna)，溶液用nacl經過5小時老化，以使最終的nacl濃度達到0.3m。

寡核苷酸負載的測量。將10微升(μl)10nmcy5標記的不同核鹼基類型的sna加入100μl的1mdtt內。將混合物在40℃下伴隨振蕩溫育15分鐘，隨後為以14000×g的離心，以去除任何金沉澱物。將100μl上清液置於96孔板中，並且使用synergyh4multimodemicroplatereader(biotek)測量螢光信號(激發：633nm；發射濾光片：660-710nm)。通過與校準標準曲線比較來確定寡核苷酸的濃度。將寡核苷酸濃度除以aunp濃度(通過uv-vis光譜法在520nm處測量的)獲得寡核苷酸負載。

寡核苷酸殼的顯現。將20μl100nmsna滴鑄到塗布有碳和formvar(electronmicroscopysciences)的每個輝光放電的200目銅網格上。乾燥後，將20μl的2％乙酸雙氧鈾添加到網格上，以染色寡核苷酸殼1分鐘。使用一張濾紙將過量的乙酸雙氧鈾吸掉。使用hd-2300(hitachi)顯微鏡在tem模式下在80kv的束電壓下使乾燥的網格成像。oriussc1000ccd相機(gatan)用於記錄圖像。

細胞攝取動力學。提前12小時以5×104個細胞/孔的群接種在24孔板中，將c166(小鼠內皮)、3t3(小鼠成纖維細胞)、hacat(人角質形成細胞)或a549(人肺腺癌上皮)細胞在37℃和5％co2下與0.3mlsna(在optimem中10nm)/孔一起溫育。在不同的時間點取出sna，隨後為optimem衝洗，受胰蛋白酶作用用於使用血細胞計數器計數，並且以8000rpm離心5分鐘以形成團塊。細胞團塊在室溫(rt)下用0.3ml濃hno3中的3％hcl消化過夜，用於後續icp-ms分析。

icp-ms。在加入5μl5ppm銦(內部標準)和5ml基質溶液(2％hcl和2％hno3)後，在扣除未經處理的細胞的本底金含量後，通過xseriesiiicp-ms(thermofisher)測量所得溶液的au-197含量。報告的值表示來自三次獨立實驗的平均值的平均值±se。

tem。將細胞團塊在0.2ml在50mm磷酸鈉緩衝液(ph＝8)中的熔融2％瓊脂糖中在40℃下混合5分鐘。細胞-瓊脂糖混合物在rt下使用玻璃移液管輕輕地清除到水中，以形成包覆的麵條形果凍。在該瓊脂糖果凍中埋入，將細胞固定在100mm二甲胂酸鈉緩衝液(ph＝7.4)中的2.5％戊二醛中，用1％oso4以及0.9％oso4和0.3％k4fe(cn)6染色，其中所有步驟均在4℃下進行2小時。在用乙醇和環氧丙烷逐漸脫水後，將細胞團塊包埋在epon812樹脂(electronmicroscopysciences)中。將80納米厚的切片沉積到200目銅網格(ems)上，並且用2％乙酸雙氧鈾(spisupplies)和reynolds檸檬酸鉛染色，用於使用80kv的束電壓在jem1230顯微鏡(jeol)下顯現。oriussc1000ccd相機(gatan)用於記錄圖像。

量子點和金納米顆粒sna的合成。代替將dna鏈直接共價附著到納米顆粒表面，首先用具有疊氮化物的兩親性聚合物塗布cdse量子點和5nm金納米顆粒，然後使用應變促進的疊氮化物-炔環加成將dna偶聯到聚合物塗布的顆粒。簡言之，商購可得的疏水-配體加帽的納米顆粒首先用含有疏水性烷基鏈和親水性羧酸鹽和疊氮化物修飾的乙二醇基團兩者的兩親聚合物功能化，以將顆粒溶解在水性溶劑中。然後通過疊氮化物-炔點擊化學用二苯並環辛基(dbco)-封端的dna鏈功能化顆粒，以在納米顆粒周圍產生緻密的dna殼。

喜樹鹼-疊氮化物的製備。喜樹鹼-疊氮化物(cpt-n3)的製備由先前公開的程序修改和修飾[parrish等人，bioconjugatechem.18：263-267(2006)]。向具有攪拌器的經烘乾的50ml圓底燒瓶中加入喜樹鹼(200mg，0.54mmol)、6-疊氮基己酸(170mg，1.08mmol)、4-二甲基氨基吡啶(8mg)和乾燥二氯甲烷(10ml)。將懸浮液冷卻至0℃，並且加入1，3-二環己基碳二亞胺(220mg，1.08mmol)。將反應混合物在惰性大氣下攪拌12小時，加熱至rt，然後傾入100ml乙醚內。將醚懸浮液冷卻至0℃以沉澱二環己基脲(dcu)，並且通過真空過濾去除固體。將濾液冷卻至-40℃，並且收集所得到的黃色沉澱物，並且由甲醇重結晶，以得到20-o-(6-疊氮基己醯)喜樹鹼(108mg)。回收的dcu用甲醇反覆洗滌，獲得另外一批產物(120mg；總得率228mg，87％)。

喜樹鹼-dna-硫醇(cpt-dna-sh)綴合物的製備。通過使用dbco-teg亞磷醯胺(glenresearch，10-1941)的固態合成，製備在其5′末端處全部具有二苯並環辛基(dbco)基團的各種序列的單鏈dna(圖9d)。通過收集在310nm處具有dbco吸收峰的級分，使用1200serieshplc(agilent)進行dna-dbco綴合物的純化。為了通過無銅點擊化學將cpt部分附著到dna，將80nmol的dna-dbco和3mg的cpt-疊氮化物(大約100倍過量)溶解於1.5ml的無水二甲基亞碸中。將反應在40℃下連續振蕩18小時。這之後，向混合物中加入3.5ml去離子水以沉澱出過量的cpt，隨後加入5ml乙酸乙酯以去除cpt。液-液萃取過程再重複四次。將水相(dmso/水中的dna-cpt)冷凍乾燥，以回收產物，其化學種類通過maldi-tof證實。

共焦顯微鏡檢查。接種在35mmfluorodish(worldprecisioninstruments)中，將a549細胞與20nm在optimem中的cpt-sna一起溫育18小時。從細胞中取出cpt-sna，並且替換為完全dmem(補充有10％胎牛血清和1％青黴素/鏈黴素的dmem)共3或5天。經處理的細胞用pbs衝洗，在pbs中的3.7％多聚甲醛中固定15分鐘，並且用hoechst核染劑染色，用於在zeisslsm510倒置共焦掃描顯微鏡下成像。cpt的激發波長和發射波長分別為370nm和440nm。

mtt測定。以104個細胞/孔的群接種在24孔板中，將a549細胞與0.3mlsna(在optimem中20nm)一起溫育18小時。這之後，從細胞中取出sna，然後將其與1ml完全dmem一起溫育。在不同持續時間後，將20μlmtt原液(pbs中的5mg/mlmtt；molecularprobes)加入與300μl完全dmem預溫育的細胞的每個孔內。在2小時後，向每孔中還加入300μlsds溶液(在50％二甲基甲醯胺中200mg/ml)，隨後為充分抽吸以使細胞重懸浮。在溫育過夜後，將細胞裂解產物以14000×g離心10分鐘，以去除任何金聚集物。使用synergyh4multimodemicroplatereader(biotek)，測定從細胞裂解產物收集的上清液級分在620nm處的吸光度。報告的值表示來自三次獨立實驗的平均值的平均值±se。

流式細胞術。接種在6孔板中，a549細胞與1mlsna(在optimem中20nm)一起溫育18小時。在處理後，去除cpt-sna，並且使細胞在完全dmem上生長126小時。然後使細胞受胰蛋白酶作用，洗滌並且懸浮於0.5mlpbs中。將0.5ml3.7％多聚甲醛加入來自每個孔的細胞懸浮液中15分鐘。在兩次pbs衝洗後，使用1ml在pbs工作溶液(50mg/ml)中的碘化丙啶(santacruzbiotechnology，sc-3541)染色溶液來染色細胞。染色樣品在4℃下貯存，並且在流式細胞術分析前保護免受光照。使用bdlsrii流式細胞儀測量10,000個細胞的螢光強度。

化學品。6-疊氮基己酸購自emdmillipore(billerica，ma)。cdse量子點購自oceannanotech。十二烷基硫醇功能化的金納米顆粒購自nanoprobes。dbco-nhs酯購自clickchemistrytools。所有其他試劑購自sigma-aldrich(st.louis，mo)，並且按原樣使用。

動態光散射。使用nanozetasizer(malverninstruments)進行測量，使用0.47作為aunp的折射率。流體動力學直徑(hd)測量從數量平均值得出。每個直方圖表示六次重複測量後aunp的尺寸分布。

maldi-tofms。在採用2，5-二羥基苯乙酮(dhap)作為基質材料的brukerautoflexiiimaldi-tof質譜儀上，收集基質輔助雷射解吸/電離飛行時間(maldi-tof)數據。

1hnmr。在brukeravance400mhznmr光譜儀上記錄1hnmr光譜。1hnmr光譜內部參考氘代溶劑中的殘留質子信號。

活化的半胱天冬酶3的檢測。將a549細胞以100,000個細胞/孔的密度在6孔板中鋪平板，並且用在optimem中的20nmcpt-sna處理。在18小時後，用pbs洗滌細胞，並且還與完全dmem(補充有10％胎牛血清和1％鏈黴素/青黴素)一起溫育。在6天後，將細胞裂解並提取蛋白質。根據製造商的說明書(cellsignaling7190s)，通過elisa檢測活化的半胱天冬酶3的相對水平。