重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及該蛋白抗體的製備方法

2023-09-17 01:13:00

重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及該蛋白抗體的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及其重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，屬於生物科學和運載蛋白【技術領域】重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法包括以下步驟：NGAL抗原表位的分析；重組NGAL的合成；重組NGAL的分離純化；製備兔抗重組NGAL蛋白抗體；收集、分離得到含有抗體的抗血清，純化抗體，即得到抗NGAL蛋白抗體。採用該製備方法解決了天然全長蛋白製備多抗產量低的問題，同時採用本發明的製備工藝製備的抗體其特異性良好，解決了現有的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體不能全部滿足用於免疫印跡、免疫組織化學實驗和酶聯免疫吸附實驗的問題。
【專利說明】重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及該蛋白抗體的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物科學和運載蛋白【技術領域】，特別涉及一種重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及其重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法。
【背景技術】
[0002]中性粒細胞明13父酶相關脂質運載蛋白(NGAL)又稱人脂質運載蛋白2或曬鐵蛋白，是1993年由Kjeldsen等人在中性粒細胞中首先發現的。在生理狀態下，中性粒細胞、腎小管上皮細胞、肺泡巨噬細胞、支氣管上皮黏液細胞等分泌少量NGAL，而腦和周圍神經、結腸、子宮和卵巢、胎盤、甲狀腺等組織細胞中NGAL的表達呈陰性。
[0003]NGAL的生理功能尚不完全清楚，可能參與不同的生理、病理過程，涉及胚胎發育、細胞分化、腫瘤的發生發展、細胞凋亡、炎症免疫應答、脂質代謝等。在胚胎期，NGAL發揮類似生長因子的作用，參與各類組織發育、生長及分化，促進乳腺癌、食管癌等腫瘤細胞增殖。NGAL與MMP-9以二硫鍵形成12500bp的複合物，延長MMP的蛋白水解活性，促進MMP-9對細胞基底膜的降解，從而侵潤周圍基質，介導癌細胞轉移。過去研究認為，NGAL促進細胞凋亡，但近年來研究發現NGAL還是一類應激蛋白，在外界有害物質刺激下，細胞分泌NGAL是一種機體自身防禦機制，使組織細胞免於凋亡。NGAL還是一類新的急性期反應蛋白，作為介導鐵離子像胞內運輸的新型載體，通過競爭性奪取螯合物中的鐵來阻止細菌對鐵的吸收，從而抑制細菌生長。
[0004]近年研究發現，NGAL與急性腎損傷(acute kidney in jury, AKI)及各種原因引起的CKD密切相關，是預測AKI的一個新型標記物，同時也是監測CKD進展和腎功能損害的生物學指標，從而為CKD的臨床診斷與治療檢測找到了新的方法。
[0005]鑑於NGAL具有診斷意義，目前有很多公司研發和生產了 NGAL體外診斷試劑盒。2005年由丹麥的BioPorto公司首先推出了 NGAL的ELISA商品檢測試劑盒，可用於血清、血漿、尿液等樣本中的NGAL檢測。到現在已經有多家公司在國家食品藥品監督管理局以及美國FDA註冊了 NGAL檢測試劑盒，其檢測方法都是基於免疫分析方法。在這些檢測產品的開發過程中抗體是試劑盒製備必不可少的原料。但是現有的這些抗體的特異性和靈敏度較差，表達蛋白的序列多選用全長序列，全長序列其表達產量低，容易導致製備多抗量不足，從而限制該檢測指標試劑盒的開發及大規模的推廣和應用，影響試劑盒的品質。因此研究開發高品質的抗體對試劑盒的性能及該指標檢測的推廣應用有著至關重要的作用。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是為解決上述問題而提供了一種重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白以及適用於作為NGAL試劑盒的抗體的製備方法。
[0007]本發明所採用的技術方案是:
[0008]一種重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，該蛋白的基因序列為序列表中SEQ ID N0.1 所述。
[0009]一種要求重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，包括以下步驟:
[0010](I)重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白NGAL抗原表位分析:通過抗原表位分析選擇目的片段用作蛋白重組表達，所述目的片段為序列表中SEQ ID N0.1所述蛋白質序列；
[0011](2)重組NGAL的合成:將選定的目的片段通過PCR擴增後插入到表達載體，然後進行轉座，最後轉染宿主細胞，病毒在複製的同時，目的蛋白也將得到表達；
[0012](3)重組NGAL的分離純化:採用Ni柱純化，包括蛋白提取和蛋白純化；
[0013](4)製備兔抗重組NGAL抗體:用步驟(3)純化後的重組NGAL作為抗原去免疫兔子,得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
[0014]進一步地，所述步驟(4)後，對抗重組NGAL抗體的抗血清進行分離純化，得到抗重組NGAL抗體乾粉。
[0015]進一步地，所述NGAL蛋白質序列的引物f目息為:
[0016]上遊引物:5』TACGGGATCCGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATG3』(SEQ ID N0.2)
[0017]下遊引物:5』GCTAGTCGACGCCGTCGATACACTGGTCG3』 (SEQ ID N0.3)。
[0018]優選地，所述步驟(2)中表達載體選自為pFastBacTMl、pFastBacTM ΗΤΑ、pFastBacTM HTB、pFastBacTM HTC 和 pFastBacTM Dual。
[0019]優選地，所述步驟(2)中轉染的宿主細胞為昆蟲細胞系，所述昆蟲細胞係為昆蟲sf9細胞系。
[0020]進一步地，所述步驟(3)中蛋白提取為:收集培養的細胞系，離心棄上清；沉澱細胞用NTA-O緩衝溶液溶解；向緩衝體系中加入溶菌酶，置冰上處理一段時間；將反應體系倒入燒杯中於冰上超聲處理；後用離心機離心取上清再離心一次，後過0.22 μ m的濾膜；蛋白純化為:取Ni柱流幹，後水洗Ni柱；用EDTA溶液洗滌Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O緩衝溶液洗滌Ni柱；後用NiS04洗滌Ni柱，流幹；再用NTA-O緩衝溶液洗滌Ni柱至流出液與NTA-O緩衝溶液pH值相同；以lmL/min速度上樣；用NTA-O緩衝溶液洗滌至G250不變藍為止；後用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至檢測G250不變藍為止，分別收集流出液體，跑膠分析溶液中重組NGAL純度。
[0021]進一步地，所述步驟(4)兔抗重組NGAL抗體的製備為:取重組NGAL與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化後在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，首次免疫注射後第2周進行一次加強免疫注射，以後每隔兩周加強免疫注射一次，每次加強免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同，加強免疫時取重組NGAL與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化後在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，靜脈採血，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
[0022]優選地，所述步驟(4)可以採用羊來製備羊抗重組NGAL抗體。
[0023]進一步地，所述抗重組NGAL抗體的抗血清進行分離純化為:1)製備NGAL親和層析柱:將NGAL蛋白與壓積CNBr-Sepharose4B混合,依次經過交聯、清洗、封閉、再次清洗、裝柱、平衡，得到NGAL親和層析柱；2)親和層析:將NGAL抗體溶液通過I)所製備的親和層析柱，去除非特異性吸附後進行解吸，分段收集解吸液；3)抗體獲取:將2)收集解吸液，透析，冷凍乾燥，得到NGAL抗體乾粉。[0024]本發明具有以下優點:
[0025]本發明通過對NGAL的免疫原性分析，把兩端沒有免疫原性的位點去掉，同時採用昆蟲表達系統對選定的序列進行表達，重組NGAL的表達量會大幅度提聞，同時製備的多抗量充足，適合用做診斷試劑原料的開發。同時，採用昆蟲細胞系表達重組NGAL，相較於大腸桿菌表達系統而言，昆蟲細胞系表達系統可以對重組蛋白進行翻譯後修飾，使其特性與天然蛋白更接近，保證了製備出來的抗體能特異性的識別和結合樣本中的天然NGAL蛋白。另外，昆蟲細胞的內源性蛋白與人類蛋白同源性極低，即可以保證蛋白的翻譯後修飾又能避免抗體的特異性差。採用本發明的方法製備出來的抗體可以非常好的用作診斷試劑的原料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發明實施例得到的重組NGAL與對比實驗製備的NGAL表達量對比的SDS-PAGE 膠圖；
[0027]圖2為本發明實施例製備的重組NGAL抗體與對比實驗製備的NGAL抗體特異性實驗對比的Western Blot結果圖。 【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖和實施方式對本發明做進一步詳細的說明。
[0029]實施例1
[0030]一、重組NGAL的表達
[0031]1.克隆序列表中SEQ ID N0.1的序列，其採用的引物為:
[0032]上遊引物:5』TACGGGATCCGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATG3』(SEQ ID N0.2)
[0033]下遊引物:5』GCTAGTCGACGCCGTCGATACACTGGTCG3』(SEQ ID N0.3)
[0034]用此引物對體外擴增出序列SEQ ID N0.1中的重組NGAL片段序列。
[0035]2.將擴增的SEQ ID N0.1中的重組NGAL片段插入到表達載體pFastBacTM Dual。首先用BamHI和SalI對pFastBacTM Dual質粒進行消化處理，使其暴露出可以與NGAL片段進行鹼基互補配對的黏性末端，然後在連接酶的作用下形成完整的環狀質粒。後將環狀質粒轉化到大腸桿菌DH5 α中。
[0036]3.質粒驗證。在得到Amp抗性轉化株後，挑取10個轉化株，在含有100 μ g/mL Amp的LB培養基中過夜培養，抽提質粒，使用BamHI和SalI消化處理質粒DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分析重組質粒是否插入正確的位點，同時用PCR方法對陽性轉化株進行分析，最後，將找到的陽性重組子進行測序，驗證轉化質粒的正確性。
[0037]4.重組杆粒克隆的製備。提取陽性重組子的質粒DNA，並將其轉化進入DHlOBacTMEcoli，轉變為杆粒。利用藍/白斑法篩選出含有重組杆粒的克隆。在LB培養集中培養含有重組杆粒的大腸桿菌，抽提重組杆粒，並凍幹保存，備用。
[0038]5.昆蟲細胞sf9的轉染以及杆狀病毒粒子的收集。①sf9細胞計數，取12.5cm2新細胞培養瓶，每瓶加入9 X 105個細胞，並以全培培養12-24h，使細胞貼壁；②溶解2 μ g純化重組杆狀病毒重組質粒於100 μ L無添加成分的Grace’s Medium中將轉染試劑充分搖勻後，取10 μ L加入100 μ L無添加成分的Grace’s Medium中，混勻；@將②和③所得溶液混勻，室溫孵育30min，同時以2mL含10%FBS的Grace’s Medium洗滌待轉化的細胞並棄去洗漆液；⑤取0.8mL無添加成分的Grace』 s Medium加入④所得質粒於轉染劑的混合液中，輕輕混勻，總體積約lmL，加入④步洗滌完成的待轉化的細胞中，27°C繼續培養5h移除質粒、轉染試劑混合物，加入2mL含10%FBS的Grace’s Medium，27°C孵育，直至病變現象產生；⑦5天後，IOOOrpm離心IOmin收集細胞培養液中的病毒粒子，轉移上清到凍幹管中，貼上標籤，置於4°C冰箱中避光保存。由於昆蟲細胞表達系統具有突出的優點:表達水平高、易於放大、生產的蛋白帶有適當的翻譯後修飾，而且細胞生長條件簡單等優勢。本發明通過研究發現採用昆蟲細胞表達系統表達的重組NGAL其特性與天然蛋白更接近，且蛋白表達產量高。
[0039]6.杆狀病毒病毒粒子的擴增及重組NGAL蛋白的表達。①取適當體積的杆狀病毒粒子原液加入到匯聚度90%的新鮮傳代的sf9細胞中，27°C恆溫培養箱中，靜置lh，每隔15min輕輕晃動一次；②去掉培養瓶中的培養液，加入新鮮的含Medium,27°C恆溫培養箱中恆溫培養3天後，IOOOrpm離心IOmin收集細胞培養液中的病毒粒子，轉移上清液到凍幹管中，貼上標籤，置於4°C冰箱中避光存放；④得到的病毒粒子可重複上述①-③步驟，以獲得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的杆狀病毒病毒粒子到匯聚度達95%的新鮮傳代的sf9細胞中，27°C恆溫培養箱中，靜置lh，每隔15min輕輕晃動一次；⑥去掉培養瓶中的培養液，加入新鮮的含10%FBS的Grace』 s Medium，27°C恆溫培養箱中恆溫培養?』⑦40-44h後，輕輕倒盡細胞上清培養液，加入預冷的細胞裂解液，冰上靜置30min ;⑧收集細胞裂解液，加入等體積的2 X SDS凝膠加樣緩衝液上樣緩衝液，混勻，100°C保持IOmin SDS-PAGE檢測蛋白質的表達情況。
[0040]二、蛋白的分離純化
[0041]本實施例中重組NGAL的分離純化包括蛋白質的提取和蛋白質純化兩個部分，分別如下:
[0042]1.蛋白質提取。①採用上述「重組NGAL蛋白的表達」方法在昆蟲細胞系統中表達重組NGAL蛋白；②收集細胞 培養液，倒入500mL離心管中，於8000rpm離心30min，棄上清；③向細胞中加入PH8.0的NTA-O緩衝液，以每2L細胞培養液加入IOOmL緩衝液計向③步的反應體系中加入一定量的溶菌酶混勻，溶菌酶的用量為1:200，後置於冰上30min;⑤將上述反應體系倒入50mL燒杯內，於冰上超聲波處理，超聲波處理方式為:工作時間3S，間隔時間4S，如此重複99次，超聲波的功率小於200W 將超聲波處理完成的樣本於16000rpm離心30min,保留上清；⑦將上清於16000rpm,4°C,離心20min 將離心完成的上清過0.22 μ m微孔濾膜。
[0043]2.蛋白質純化。①取Ni柱流幹，後用水洗3-5個柱體積，再用0.1M的EDTA溶液洗3個柱體積，之後再用水洗3-5個柱體積，然後再用pH8.0的NTA-O緩衝液洗3個柱體積，之後再用0.1M NiS04溶液洗5個柱體積並流幹；②用pH4.2的0.2M醋酸鈉平衡液洗3個柱體積，之後再用PH8.0的NTA-O緩衝液洗柱子，直到流出液與洗脫液的pH —致時，停止洗脫；③用lmL/min的流速將提取的蛋白質溶液上柱子上樣完成後用pH8.0的NTA-O緩衝液洗柱子至G250不變藍為止；⑤後分別用20mM、60mM、200mM和500mM的咪唑溶液洗脫柱子，直至檢測G250不變藍為止，洗脫過程中分別收集流出的液體，並將液體測定濃度後冷凍乾燥既得重組NGAL蛋白乾粉。[0044]三.抗體製備
[0045]用分離純化得到的蛋白質免疫兔子，製備抗重組NGAL多克隆抗體，具體的操作流程如下:①準備2月齡、體重1.5±0.5kg的雄性健康紐西蘭大白兔，隨機分組，待免疫。免疫前一周，分別於耳靜脈採血留作陰性對照取一定量重組NGAL蛋白粉末用無菌PBS緩衝液配製成濃度為lmg/mL溶液，並與等量的弗氏完全佐劑充分乳化後注射免疫事先準備好的大白兔，注射量為0.5mg/只首次免疫注射後第二周進行一次加強免疫注射，以後每隔兩周加強免疫一次，免疫所有的試劑為lmg/mL重組NGAL蛋白PBS緩衝液於等體積不完全弗氏佐劑混合,加強免疫注射量為0.5mg/只，共免疫六次，至第三次免疫開始，每次免疫7-10天後耳靜脈採血,並用Western Blot實驗驗證抗體的特異性。
[0046]四.抗重組NGAL抗體分離純化
[0047]抗體分離純化主要包括以下幾個步驟:①NGAL親和層析柱的製備:將NGAL蛋白(購自R&D公司)與壓積CNBr_Sepharose4B (Pharmacia產品)按照5_7mg/mL比例混合，4攝氏度搖動18小時，使其交聯。然後用0.lmol/L pH8.0碳酸鹽緩衝液清洗3此，加等量0.lmol/L乙醇胺-HC14攝氏度搖動I小時，以封閉殘留的活化基團。最後用0.0lmol/LTris-HCl(TB)清洗、裝柱、平衡，柱子的容積選用IOmL ;②親和層析:將製備得到的兔多抗血清以IOmL/小時流速通過步驟①製備的親和層析柱、依次用lmol/L NaCl-TB,
0.5%NP-40-TB、TB和雙蒸水清洗，以去除非特異性吸附。然後用3mol/L KSCNlOmL/小時進行解吸。紫外檢測分段收集解吸液。③抗體獲取:將②收集解吸液，透析，冷凍乾燥，既得NGAL抗體乾粉。
[0048]對比實驗:
[0049]對比實驗中採用NGAL全長序列序列，其餘步驟和上述步驟系一致。從圖1中可以看出採用本發明的方法，利用昆蟲表達系統截斷表達NGAL片段其製備的重組蛋白的量明顯高於對比實施例，重組的重組蛋`白量非常有利於後期抗體的製備。圖1中A為對比實施例，B為本實施例。
[0050]從圖2中可以看出，採用本發明的方法製備的抗體其特異性要明顯優於對比實施例所製備的抗體，這就保證了採用本發明的方法所製備出來的抗體能適用於各種實驗過程。圖2中A為本實施例製備的抗體，B為對比實施例製備的抗體。
[0051]實施例2
[0052]該實施例與實施例1不同的是抗體製備步驟與實施例1不同。其抗體製備步驟為:
[0053]抗體製備
[0054]用分離純化得到的蛋白質免疫山羊，製備抗重組NGAL多克隆抗體，具體的操作流程如下:①雄性健康青壯波爾山羊，體重15KG以上，隨機分組，待免疫。免疫前一周，分別於頸靜脈採血留作陰性對照取一定量重組NGAL蛋白粉末用無菌PBS緩衝液配製成濃度為lmg/mL溶液，並與等量的弗氏完全佐劑充分乳化後注射免疫事先準備好的大白兔，注射量為0.6-0.Smg/只；③首次免疫注射三周後進行一次加強免疫注射，以後每隔三周加強免疫一次，免疫所有的試劑為lmg/mL重組NGAL蛋白PBS緩衝液於等體積不完全弗氏佐劑混合,加強免疫注射量為0.6mg/只，共免疫六次，至第四次免疫開始,每次免疫7-10天後頸靜脈採血，並用Western Blot實驗驗證抗體的特異性。[0055]對比實驗:
[0056]對比實驗中採用NGAL全長序列，其餘步驟和上述步驟系一致。
[0057]從實驗結果可知，採用本發明的方法製備的重組蛋白的量要明顯多於對比實施實驗，且製備得到的抗體其特異性也優於對比實驗，保證採用本發明所製備出來的抗體能充分滿足各種實驗的需求。
[0058]最後所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。
【權利要求】
1.一種重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，其特徵在於，該蛋白的基因序列為SEQ ID N0.1 所示。
2.一種要求I所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白NGAL抗原表位分析:通過抗原表位分析選擇目的片段用作蛋白重組表達，所述目的片段為序列表中SEQ ID N0.1所述蛋白質序列； (2)重組NGAL的合成:將選定的目的片段通過PCR擴增後插入到表達載體，然後進行轉座，最後轉染宿主細胞，病毒在複製的同時，目的蛋白也將得到表達； (3)重組NGAL的分離純化:採用Ni柱純化，包括蛋白提取和蛋白純化； (4)製備兔抗重組NGAL抗體:用步驟(3)純化後的重組NGAL作為抗原去免疫兔子，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
3.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，所述步驟(4)後，對抗重組NGAL抗體的抗血清進行分離純化，得到抗重組NGAL抗體乾粉。
4.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，所述NGAL蛋白質序列的引物信息為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
5.根據權利要求2所述的 重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於,所述步驟(2)中表達載體選自為pFastBacTM UpFastBacTM HTA、pFastBacTMHTB、pFastBacTM HTC 和 pFastBacTM Dual。
6.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中轉染的宿主細胞為昆蟲細胞系，所述昆蟲細胞係為昆蟲sf9細胞系。
7.根據權利要求2或6所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，所述步驟(3)中蛋白提取為:收集培養的細胞系，離心棄上清；沉澱細胞用NTA-O緩衝溶液溶解；向緩衝體系中加入溶菌酶，置冰上處理一段時間；將反應體系倒入燒杯中於冰上超聲處理；後用離心機離心取上清再離心一次，後過0.22 μ m的濾膜；蛋白純化為:取Ni柱流幹，後水洗Ni柱；用EDTA溶液洗滌Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O緩衝溶液洗滌Ni柱；後用NiS04洗滌Ni柱，流幹；再用NTA-O緩衝溶液洗滌Ni柱至流出液與NTA-O緩衝溶液pH值相同；以lmL/min速度上樣；用NTA-O緩衝溶液洗滌至G250不變藍為止；後用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至檢測G250不變藍為止，分別收集流出液體，跑膠分析溶液中重組NGAL純度。
8.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，所述步驟(4)兔抗重組NGAL抗體的製備為:取重組NGAL與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化後在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，首次免疫注射後第2周進行一次加強免疫注射，以後每隔兩周加強免疫注射一次，每次加強免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同，加強免疫時取重組NGAL與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化後在兔背部皮下注射，注射量為500 μ g/只，靜脈採血，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。
9.根據權利要求8所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，所述步驟(4)可以採用羊來製備羊抗重組NGAL抗體。
10.根據權利要求3所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的製備方法，其特徵在於，所述抗重組NGAL抗體的抗血清進行分離純化為:I)製備NGAL親和層析柱:將NGAL蛋白與壓積CNBr-Sepharose4B混合,依次經過交聯、清洗、封閉、再次清洗、裝柱、平衡，得到NGAL親和層析柱；2)親和層析fNGAL抗體溶液通過I)所製備的親和層析柱，去除非特異性吸附後進行解吸，分段收集解吸液；3)抗體獲取:將2)收集解吸液，透析，冷凍乾燥，得到 NGAL抗體乾粉。
【文檔編號】C12N15/12GK103451187SQ201310362187
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】華權高, 劉瑾, 易汪雪, 閆彩霞, 馬峰, 沈鶴霄, 舒芹 申請人:武漢華美生物工程有限公司