利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法

2023-09-17 03:54:50

專利名稱：利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法
利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法技術領域
本發明屬於生物轉化技術領域，具體涉及一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法。
背景技術：
熊果苷是源於杜鵑花科熊果屬植物熊果葉的一種成份。研究表明熊果苷具有抑制酪氨酸酶活性、鎮咳、利尿、抗菌等生物活性。熊果苷能有效地與酪氨酸酶結合，使黑色素的合成減少，從而減少皮膚中色素沉積，是目前國內外常用於美白化妝品中的主要原料，國內外市場需求十分巨大。目前熊果苷的生產主要是通過化學合成，但是化學合成需要4 6 步反應完成，合成成本高、汙染大、副產物多。
生物轉化是指通過培養微生物、植物細胞、植物組織，利用其體內的酶對外源底物進行結構修飾而獲得有價值產物的一種技術。該技術與化學合成相比，具有無毒、無汙染、 低能耗、高效率、高選擇性等優點。發明內容
本發明的目的在於提供一種成本低、無汙染並且轉化率高的利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法。
為了達到上述目的，本發明採用了以下技術方案
培養黃芩毛狀根，利用培養後的黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷。
所述培養黃芩毛狀根的培養基為改良MS培養基，該改良MS培養基包含大量元素、 微量元素、鐵鹽和有機成分，pH為5. 4 6. 0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述鐵鹽包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有機成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、 0. 5mg/L鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
上述改良MS培養基通過改變現有MS培養基(1962年由Murashige，T.和Skoo-ge， F. 二人設計的，故簡稱MS培養基。)的組成，更適合黃芩毛狀根的生長。
所述培養黃芩毛狀根的方法為
1)將黃芩毛狀根以4-5g/L接種於黃芩毛狀根種子培養基中於100 150r/min下避光震蕩培養18 20天得黃芩毛狀根種子，培養的溫度25 ^°C，黃芩毛狀根種子培養基為添加40-50g/L蔗糖的改良MS培養基；
2)將黃芩毛狀根種子以4-5g/L接種於培養基中於100 150r/min下避光震蕩培養20 30天，培養的溫度為25 ，培養基為添加30-60g/L蔗糖、葡萄糖或其混合物和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養基。加入一定量的蔗糖、葡萄糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的作用在於促進黃芩毛狀根快速生長，提高了黃芩毛狀根轉化合成熊果苷的能力，有利於節約生產成本，提高經濟效益。
所述轉化的時間為30 40h，轉化時的溫度為20 ^°C。
所述對苯二酚在加入前用體積分數70%的乙醇水溶液進行溶解，溶解比例為每 l-5mL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚。乙醇水溶液的作用在於降低加入對苯二酚的過程中黃芩毛狀根染菌的機率，避免黃芩毛狀根轉化對苯二酚過程中染菌。
所述對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養液中加入15 25mg。當每 IOOmL培養液的加入量超過25mg時，對苯二酚抑制黃芩毛狀根的生長。
與現有的熊果苷生產技術相比，本發明具有以下有益的技術效果
1.與化學合成法相比，本發明生產工藝簡便，底物的轉化率達到50 60 %，具有低汙染、副產物少等優點；2.與從植物提取方法相比，熊果苷生產周期短，條件可控，不受季節限制；3.本發明利用黃芩毛狀根的糖苷轉化功能，可作為新產物的生物反應器，為熊果苷的合成提供了一種新途徑，也為開發新型藥材提供了新途徑和新思路。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步說明，所述實施例是對本發明的解釋而不是限定。
本發明公開了一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，通過預培養黃芩毛狀根，然後將一定量對苯二酚作為底物加入到黃芩毛狀根培養液中，利用黃芩毛狀根細胞內的糖苷酶轉化對苯二酚生成熊果苷。
實施例1
1)將黃芩毛狀根以4g/L接種於黃芩毛狀根種子培養基中J8°C，120r/min，避光培養18天；所述的黃芩毛狀根種子培養基為添加50g/L蔗糖的改良MS培養基；
2)將經過步驟1)培養18天的黃芩毛狀根，以5g/L接種到培養基中，28°C，150r/ min，避光培養28天；所述的培養基為添加50g/L蔗糖的改良MS培養基。
3)將對苯二酚溶於體積分數70%的乙醇水溶液中，溶解比例為每ImL乙醇水溶液溶解20mg，在無菌條件下加入到經過步驟2、培養後的黃芩毛狀根培養液中，利用黃芩毛狀根轉化40h，轉化時的溫度為25°C，轉化在避光條件下進行；所述的對苯二酚的加入量為 20mg/IOOmL 培養液；
所述改良MS培養基採用以下配方
包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH為5. 4 6. 0 ；
所述的大量元素為KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；水解乳蛋白:500mg/L ；
微量元素為KI 0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；
鐵鹽為 Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；
有機成分為肌醇100mg/L、甘氨酸dmg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/L 和煙酸0. 5mg/L ；
4) HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量為4. 42%，對苯二酚的轉化率為51. 6%。
實施例2
1)將黃芩毛狀根以5g/L接種於黃芩毛狀根種子培養基中，28°C，100r/min，避光培養20天；所述的黃芩毛狀根種子培養基為添加40g/L蔗糖的改良的MS培養基；
2)將經過步驟1)培養20天的鮮嫩黃芩毛狀根種子以5g/L接種到培養基中， 28 0C，100r/min,避光培養20天；所述培養基為添加50g/L蔗糖和10g/L葡萄糖以及 0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養基；所述改良MS培養基採用如實施例1的配方；
3)將對苯二酚溶於體積分數70%的乙醇水溶液中，溶解比例為每2mL乙醇水溶液溶解20mg，在無菌條件下加入到經過步驟2、培養後的黃芩毛狀根培養液中，利用黃芩毛狀根轉化40h，轉化時的溫度為；轉化在避光條件下進行，所述的對苯二酚的加入量為 20mg/IOOmL 培養液；
4)HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量為4. 71%，對苯二酚的轉化率為56. 13%。與實施例1相比，通過在毛狀根培養階段的的培養基中加入葡萄糖以及苯丙氨酸，提高了對苯二酚的轉化率。
實施例3
培養黃芩毛狀根，利用培養後的黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷，所述轉化的時間為30h，轉化時的溫度為20°C，轉化在避光條件下進行，所述對苯二酚在加入前用體積分數70%的乙醇水溶液進行溶解，溶解比例為每ImL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚，對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養液中加入15mg。
所述培養黃芩毛狀根的方法為
1)將黃芩毛狀根以5g/L接種於黃芩毛狀根種子培養基中於150r/min下避光震蕩培養19天得黃芩毛狀根種子，培養的溫度25°C，黃芩毛狀根種子培養基為添加40g/L蔗糖的改良MS培養基；
2)將黃芩毛狀根種子以4g/L接種於培養基中於120r/min下避光震蕩培養30天， 培養的溫度為25°C，培養基為添加30g/L葡萄糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養基。
上述改良MS培養基，包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH為5. 4 6.0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述鐵鹽包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有機成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、 0. 5mg/L鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量可達4 6%，對苯二酚的轉化率可達50 60%。
實施例4
培養黃芩毛狀根，利用培養後的黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷，所述轉化的時間為35h，轉化時的溫度為22°C，轉化在避光條件下進行，所述對苯二酚在加入前用體積分數70%的乙醇水溶液進行溶解，溶解比例為每5mL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚，對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養液中加入25mg。
所述培養黃芩毛狀根的方法為
1)將黃芩毛狀根以4g/L接種於黃芩毛狀根種子培養基中於130r/min下避光震蕩培養19天得黃芩毛狀根種子，培養的溫度^rc,黃芩毛狀根種子培養基為添加50g/L蔗糖的改良MS培養基；
2)將黃芩毛狀根種子以4g/L接種於培養基中於140r/min下避光震蕩培養對天， 培養的溫度為27°C，培養基為添加60g/L蔗糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養基。
上述改良MS培養基，包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH為5. 4 6.0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述鐵鹽包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有機成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、 0. 5mg/L鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
HPLC測定毛狀根中熊果苷的含量可達4 6%，對苯二酚的轉化率可達50 60%。
HPLC測定黃芩毛狀根中熊果苷的方法收穫轉化後的毛狀根，80°C烘乾，95% 乙醇，以1 100料液比，回流提取^!;HPLC法測定毛狀根中熊果苷含量的測定條件 waters-2487, Symmetry_C18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m),、流速 0. 8mL/min,、流雲力才目V 甲醇V水= 15 85，檢測波長287nm。
本發明所述利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，該方法是通過培養黃芩毛狀根，利用黃芩毛狀根細胞內的糖苷酶，轉化對苯二酚，生成熊果苷。轉化後的黃芩毛狀根中熊果苷的含量可達4 6%，對苯二酚的轉化率可達50 60%。本發明具低汙染、 副產物少等特點，為熊果苷生產提供了一種新技術、新途徑。
權利要求
1.一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特徵在於包括以下步驟 培養黃芩毛狀根，利用培養後的黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷。
2.根據權利要求1所述一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特徵在於所述培養黃芩毛狀根的培養基為改良MS培養基，該改良MS培養基包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH為5. 4 6. 0 ；所述大量元素包含 950mg/L 的 ΚΝ03、42· 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 7H20,220mg/ L的CaCl2 · 2H20和500mg/L的水解乳蛋白；所述微量元素包含 0. 83mg/L 的 KI、6. 2mg/L 的 H3B03、22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4Η20、8· 6mg/ L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 禾口 0. 025mg/L 的 CoCl2 ；所述鐵鹽包含 18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；所述有機成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的鹽酸硫胺素、0. 5mg/L 鹽酸吡哆醇和0. 5mg/L的煙酸。
3.根據權利要求2所述一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特徵在於所述培養黃芩毛狀根的方法為1)將黃芩毛狀根以4-5g/L接種於黃芩毛狀根種子培養基中於100 150r/min下避光震蕩培養18 20天得黃芩毛狀根種子，培養的溫度25 ^°C，黃芩毛狀根種子培養基為添加40-50g/L蔗糖的改良MS培養基；2)將黃芩毛狀根種子以4-5g/L接種於培養基中於100 150r/min下避光震蕩培養 20 30天，培養的溫度為25 ^°C，培養基為添加30-60g/L蔗糖、葡萄糖或其混合物和 0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培養基。
4.根據權利要求1或3所述一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特徵在於所述轉化的時間為30 40h，轉化時的溫度為20 ^°C。
5.根據權利要求1所述一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特徵在於所述對苯二酚在加入前用體積分數70%的乙醇水溶液進行溶解，溶解比例為每 l-5mL乙醇水溶液溶解20mg對苯二酚。
6.根據權利要求1所述一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，其特徵在於所述對苯二酚的加入量為每IOOmL黃芩毛狀根的培養液中加入15 25mg。
全文摘要
本發明公開了一種利用黃芩毛狀根轉化對苯二酚合成熊果苷的方法，該方法是通過培養黃芩毛狀根，利用黃芩毛狀根細胞，轉化對苯二酚，生成熊果苷。轉化後的黃芩毛狀根中熊果苷的含量可達4～6％，對苯二酚的轉化率可達50～60％。本發明具低汙染、副產物少等特點，為熊果苷生產提供了一種新技術、新途徑。
文檔編號A01H4/00GK102505031SQ20111030040
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者彭飛宇, 施春陽, 錢衛東, 齊香君 申請人:陝西科技大學