用於將dna導入靶細胞的篩選方法

2023-09-16 17:17:55

專利名稱：用於將dna導入靶細胞的篩選方法
技術領域：
本發明一般涉及用於檢測任何靶細胞或生物體的組合物和方法，靶細胞或生物體用外源核酸轉化而不需要可選擇的標記。這些組合物和方法使DNA導入任何可轉化的細胞類型並隨後使用這些細胞用於高通量篩選藥物或其它化合物。
發明的背景迅速和有效鑑製成功地用外源DNA轉化的細胞的測定在多種應用中有用，包括例如鑑別細胞系和/或轉基因生物體和進行高通量藥物篩選。確實，僅有一次外源DNA的插入證實細胞系或轉基因生物體可作為動物模型用於藥物發現、闡明生化途徑、毒性研究等。
最普遍使用的檢測外源核酸是否導入靶細胞的方法是用選擇，或通過由導入DNA補充的營養缺陷或通過藥物抗性。為補充營養缺陷型突變體，受體細胞必須缺乏此基因功能。為了藥物抗性，細胞必須對藥物敏感。不幸的是，許多細胞(如病原體)對藥物選擇技術有抗性。例如白色念珠菌(Candida albicans)顯示對潮黴素、苯菌靈、放線酮、絲裂黴素C和衣黴素的抗性。類似的，其它致病生物(如二甲氧基苯青黴素抗性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和一些結核分枝桿菌(M.tuberculosis)的變種)對許多這些常規使用的抗生素產生抗性。因此，轉化這些細胞並檢測到成功的整合被證明是非常困難的。
二甲氧基苯青黴素抗性的金黃色葡萄球菌菌株(MRSA)是世界上最普遍的醫院病原體。在美國大的教學醫院中超過40％醫院產生的葡萄球菌感染是由MRSA引起的。它們在較小的醫院(200到500病床的醫院中發生率為20％)及在療養院中變得普遍(Wenzel等.，1992，Am.J.Med 91(Supp 3B)221-227)。MRSA菌株不尋常的性質是它們獲得其它抗性因子的能力，這種能力導致這些菌株對化學療法上有用的抗生素敏感性很小或沒有。現在這種多抗性細菌菌株在全世界普遍，且這些病原體中最厲害的攜帶對所有可用的抗菌劑的抗性機制，除了一種抗菌劑(即萬古黴素)(Blumberg等.，1991，J.Inf.Disease(631279-1285))。
另一種醫院病原體糞腸球菌(Enterococcus faecium)因其從一個細胞轉移至另一個攜帶質粒的抗性因子的能力而眾所周知，如萬古黴素抗性。這種抗性因子轉移機制會導致越來越多對已知抗生素的細菌抗性。糞腸球菌的高水平萬古黴素抗性菌株1986年在英格蘭首次分離。在20世紀90年代，文獻記錄萬古黴素抗性腸球菌(VRE)已傳播到全世界。鑑定抗高濃度氨苄青黴素或慶大黴素或抗萬古黴素的多藥物抗性菌株產生嚴重的治療難題。此外，缺乏對抗生素的敏感性極大地幹擾操作這些生物體的能力，尤其是考慮到大部分細菌轉化載體依賴於抗生素抗性選擇。對抗生素抗性的基礎和抗性菌株的出現更完全的解釋可在文獻中發現(如美國專利6,136,587 Tomasz等.，2000年10月24日；Ohno，A等.，NipponRinsho(2001)59(4)673-680)。
某些生物體中缺乏有效篩選系統可嚴重削弱篩選候選藥物的努力。部分由於免疫減弱的病人數目上升，感染藥物抗性生物和通常良性生物的全身性真菌感染增加，例如許多這種感染起因於正常人體菌群白色念珠菌。假絲酵母種現在是醫院血流感染的第四種最普遍的原因(Edmond等.，(1999)Clin InfectDis.29(2)239-44)。與患嚴重假絲酵母感染的人數上升相當的是抗真菌化合物抗性菌株發揮的增加(White，Marr等.，(1998)Clin Microbiol Rev 11(2)382-402)。為與此抵消，必須研究新種類的抗真菌化合物和它們可能的靶。
使用遺傳方法研究白色念珠菌中適合於抗真菌攻擊的新靶已受到一些因素的阻礙。首先用白色念珠菌的質粒通常作為隨機拷貝存在於細胞中且在沒有選擇壓力的情況下迅速丟失(Cannon等.，(1992)Mol Gen Genet.235(2-3)453457；Kurtz等.(1987)Mol Cell Biol.7(1)209-17；Pla等.(1995)Gene 165(1)115-20)。此外，不像釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，沒有著絲粒序列或自主複製序列被克隆，使游離型質粒在沒有任何選擇的情況下維持。
另一個阻礙研究白色念珠菌和產生有效處理的因素是，此生物被認為是其整個生命周期中的二倍體。直到最近顯示假絲酵母可強制交配(Magee(2000)Science289(5477)310-313；Hull等.(2000)Science 289(5477)310-310)，可能經歷四倍體階段。存在類似於釀酒酵母交配等位基因的遺傳因子表明減數分裂可導致單倍體細胞，然而沒有觀察到這種單倍體分離的。因此，為研究一種新的抗真菌靶，候選基因的染色體拷貝必須失活以觀察其對細胞的作用。為敲除兩個拷貝，發展了一個稱為「ura blaster」的構建物(Alani(1987)Genetics 117(1)5-12；Fonzi等.(1993)Genetics 134(3)717-28)。必須使細胞是URA3營養缺陷型，從臨床分離的產生營養缺陷型菌株通常顯著減小毒性或完全去除(Lay等.(1998)InfectImmun.66(11)5301-6；Kirsch等.(1991)Infect Immun.59(9)3297-300；Polak(1992)Mycoses 35(1-2)9-16；Cole等.(1995) FEMS Microbiol Lett.126(2)177-80)。研究顯示即使在強毒株中，恢復URA3功能未必使毒性恢復到野生型水平(Lay等.(1998)，同前)。
第三個因素是極少數異源基因已在白色念珠菌中表達，這是由於其異常的密碼子使用(CTG編碼絲氨酸而不是亮氨酸)(Leuker(1994)Mol Gen Genet.245(2)212-7)。為使異源基因在白色念珠菌中功能性表達，基因中每個CTG密碼子必須突變成其它亮氨酸密碼子(Morschhauser等.(1998)Mol Gen Genet.257(4)412-20)。因此，這些和其它困難限制了假絲酵母基因對URA3或其它營養標記敲除的菌株的研究。許多報導基因由於誘變它們用於表達所需的努力而不使用。
美國專利5,650.135所述方法，有可能在活動物中檢測生物發光細菌，而不需解剖或其它方式打開動物(「體內監控」)-用高靈敏照相機通過肌肉、皮膚、毛皮和其它傳統上「不透明」組織檢測光。儘管綠色螢光蛋白(GFP)在白色念珠菌中表達(Cormack，Bertram等.，(1997)Microbiology 143(Pt2)303-11；Morschhauser，Michel等.，(1998)Mol Gen Genet.257(4)412-20)，產生GFP的白色念珠菌細胞尚未在活動物體內發現。Srikantha等.，((1996)J Bacteriol.178(1)121-9)報導海洋三色堇腎臟形腎海鰓(Renilla reniformis)的螢光素酶在白色念珠菌中表達，但底物coelentrazine的成本使它在活動物中使用不現實。
除了白色念珠菌，許多其它致病生物對大部分或所有抗生素具有抗性，因此如果並非不可能用經典方法導入包括藥物抗性基因的DNA和選擇由用於轉化的DNA賦予的藥物抗性，那麼使轉化這些生物體困難。
因而，仍需要檢測轉化靶細胞的方法，具體是不包括可選擇標記的方法。本發明尤其提供這種方法、表達盒、轉座子盒和其它對產生發光生物有用的工具，例如致病生物(如MRSA、抗生素抗性細菌和白色念珠菌)，致病生物適合涉及體外和整個動物中的感染和/或發病機制的研究。
發明的概述本發明涉及將感興趣的多核苷酸導入細胞的方法，其中沒有使用可選擇的標記，而用篩選光產生來鑑定包括感興趣的多核苷酸的細胞。本發明也涉及由本發明方法生成的細胞以及這些細胞的使用。在本發明的一個實施方案中，細胞是抗生素抗性細菌，如二甲氧基苯青黴素抗性的金黃色葡萄球菌菌株和萬古黴素抗性腸球菌(VRE)菌株通過本發明的方法轉化。
本發明的一個方面是將多核苷酸導入細胞的方法，即轉化靶細胞的方法。在此方法中提供了一群細胞。用感興趣的多核苷酸在有利於由至少一個細胞亞群吸收多核苷酸的條件下處理細胞群體。感興趣的多核苷酸包括發光蛋白編碼序列。在較佳實施方案中，發光蛋白編碼序列編碼生物發光蛋白，如螢光素酶。可使用許多將多核苷酸導入靶細胞的方法，包括但不限於下列脂質-介導的轉移(如用脂質體，包括中性和陽離子脂質)、直接注射(顯微注射)、細胞融合、微粒轟炸(例如生物射彈法，如DNA粒子轟炸)、共沉澱(如用磷酸鈣或醋酸鋰)、DEAE-葡聚糖-或聚乙二醇-介導的轉移和病毒載體-介導的轉移。然後篩選細胞群體中吸收感興趣的多核苷酸的細胞亞群。通過它們表達包括感興趣的多核苷酸的發光蛋白編碼序列的能力來鑑別這些細胞。分離發光的細胞。這些發光細胞是多核苷酸導入的細胞，即轉化的細胞。然後分離這種發光細胞以提供發光細胞的基本上純的菌落(即克隆)，例如通過單克隆的稀釋或劃線。
本發明轉化方法所用的多核苷酸包括發光蛋白的編碼序列。這種發光蛋白可以是，例如生物發光或螢光蛋白。在本發明的一個實施方案中，生物發光蛋白是螢光素酶(如由luc或lux序列編碼的)。
任何可轉化細胞可用於本發明的實踐。通常這種細胞轉化前不發光，儘管如果細胞已產生特定波長的光，產生蛋白的發光蛋白編碼序列可用來轉化這類細胞，序列生成的蛋白產生不同的可鑑別波長。本發明方法可用的細胞包括但不限於原核細胞(如革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌以及其它原核生物)、真核細胞(例如酵母，如假絲酵母或酵母(Saccharomyces)；植物細胞；動物細胞；腫瘤細胞；組織特異的細胞)。昆蟲細胞也可用於本發明的方法。本發明的另一個方面中，細胞群體包括抗生物素抗性細菌，例如二甲氧基苯青黴素抗性的金黃色葡萄球菌菌株和萬古黴素抗性腸球菌(VRE)菌株。在有利於多核苷酸吸收的條件下靶細胞用多核苷酸處理後，在細胞類型和培養基種類(液體或固體)基礎上以適當篩選密度平板培養，在此基礎上根據產生的光篩選細胞。
在本發明的一個實施方案中，導入細胞的多核苷酸包括無啟動子的編碼發光蛋白的多核苷酸序列。通常，這種多核苷酸序列在整合入靶生物體的基因組後表達，例如鄰近靶生物體基因組中的內源啟動子。許多載體可包括這類多核苷酸，包括但不限於整合載體、轉座子(或其它可動遺傳元件，如TY或marnier)。
另一方面，導入靶細胞的多核苷酸包括可操作連接到編碼發光蛋白的多核苷酸序列的啟動子。許多載體可包括這種含啟動子的多核苷酸序列，包括但不限於整合載體、轉座子(或其它可動遺傳元件，如TY或marnier)、複製型質粒、非複製型質粒等。質粒可包括，例如允許在一種細胞類型中通過的穿梭載體序列，以便製備足夠量的用於轉化靶細胞的多核苷酸。用於這種構建物中的啟動子在靶細胞中有功能。
發光蛋白編碼序列用於篩選轉化的細胞，因此其它感興趣的序列發光蛋白編碼序列有關(如在相同的載體構建物中)。其它感興趣的序列可與用於表達發光蛋白的相同控制元件有關，或另外這種感興趣序列的表達可通過獨立與感興趣的序列有關的控制元件來介導。例如，發光蛋白編碼序列的表達可通過第一個啟動子介導，且更多感興趣序列的表達可通過第二個啟動子介導。
本發明的一個方面中，酵母用本文所述的方法轉化。酵母轉化，例如假絲酵母細胞可鋪在提高光產生的培養基上，例如篩選轉化的細胞群體可通過將細胞鋪在SD而不是YPD平板上進行(如補充50μg/ml尿苷的SD-ura平板，含600μg/ml螢光素)。酵母細胞以及其它類型的細胞可以各種密度鋪板用於初步篩選，例如以約2.5×105細胞/140mm平板的密度。在本發明的一個實施方案中，在固體培養基平板上進行篩選。分離轉化細胞可通過許多方法進行，包括從發光細胞的固體培養基的平板區域中挑取樣品細胞、接種樣品到液體培養物中、評估各液體培養物等分樣品的光產生、鑑定包括發光細胞的液體培養物、稀釋和平板接種液體培養的以獲得分離的單一發光細胞並鑑定衍生自單一發光細胞的單一克隆。
因此本發明提供了在細胞群體中篩選轉化細胞的方法，其中方法包括，例如提供細胞群體，其中所述細胞不能產生光，用包括發光蛋白編碼序列的多核苷酸轉化細胞群體，根據細胞產生的光篩選轉化細胞群體，其中所述產生光的細胞是轉化細胞。本發明也包括由本發明的方法和其使用所產生的轉化細胞。
鑑於本文的披露，本領域的普通技術人員易想到本發明的這些和其它實施方案。
附圖的簡述

圖1顯示用於螢光素酶定點突變的互補寡核苷酸對，螢光素酶用於在白色念珠菌中表達編碼序列。
圖2A和2B顯示用於產生螢光素酶表達載體的寡核苷酸，表達載體用於白色念珠菌的轉化。圖2C顯示合成接頭A和合成接頭B的排列。
圖3A、3B和3C圖解pGTV-ENO質粒載體的構建。
發明的詳述除非另有說明，本發明的操作使用常規化學、生化、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA技術，這些技術在本領域的技術範圍內。參見如Sambrook，Frisch，Maniatis，《分子克隆實驗室手冊》(MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL)，第二版(1989)；《新編分子生物學》(CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley和Sons，Inc.，Media，PA(1995))；系列絲書《酶學方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)(Academic Press，Inc.)；《PCR 2A一種實踐方法》(A PRACTICAL APPROACH)(M.J.McPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編，1995)和《動物細胞培養》(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney.編，1987)。
在詳細描述本發明前，要理解此發明不限於具體製劑或過程參數，這些當然可以變化。也要理解本文所用術語僅為了描述發明的具體實施方案，並不想要限制。
定義在描述本發明中，將使用下列術語，且如下所述進行定義。除非另有說明，本文使用的所有術語對本發明領域技術人員有相同的意義。
如在此說明書和所附權利要求書中所用，單數形式「a」、「an」和「the」包括複數，除非上下文清楚地另有所指。因此，例如，提到「一種抗原」包括兩種或更多這種試劑的混合物。
術語「轉化」、「轉化方法」和「轉化細胞的方法」指將核酸分子如載體構建物，轉移或導入靶細胞，這樣轉化後靶細胞包括核酸分子。典型的轉化方法用於的細胞群體，其中細胞亞群最終包括核酸分子。鑑定包括導入核酸分子的亞群細胞通常用，例如選擇(如在選擇性培養基上生長的能力)或篩選(如表型的表達，可鑑別含導入核酸的細胞與不含導入核酸的細胞)。「轉化子」是細胞(如「轉化細胞」)或轉化產生的生物體。這種將核酸分子導入細胞可稱為「遺傳轉化」，以便與「細胞轉化」區分。細胞轉化指將正常細胞轉變成致瘤性(或腫瘤)細胞，轉變通常作為在不同種致癌基因控制下的結果發生。除非另有明確說明，本文所用術語「轉化」是指遺傳轉化，即將核酸分子導入靶細胞。
術語「核酸分子」和「多核苷酸」可交換使用且是指任何長度核苷酸的多聚形式，或脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可有任何三維結構，可執行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制例子包括基因、基因片斷、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉運RNA、核醣體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針和引物。
多核苷酸通常包括四種核苷酸鹼基的特異序列腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)(當多核苷酸是RNA時，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))。因此，術語多核苷酸序列是多核苷酸分子的字母表示。此字母表示可輸入有中央處理器的計算機的資料庫中並用於生物信息學應用如功能基因組和同源搜索。
「編碼序列」或「編碼」選擇多肽的序列是在宿主系統中當置於適當調控序列(或「控制元件」)的控制下時，轉錄(在DNA的情況中)和翻譯(在RNA的情況中)成多肽的核酸分子。編碼序列的邊界由5』(氨基)末端的起始密碼子和3』(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限於來自病毒的cDNA、原核或真核mRNA、來自病毒的基因組DNA序列、真核或原核DNA、和甚至合成DNA序列。轉錄終止序列可位於編碼序列的3』。
典型「控制元件」包括但不限於轉錄調節物如啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止信號和聚腺苷酸化序列；翻譯調節物如翻譯起始最優化的序列，例如SD(核糖體結合位點)序列和翻譯終止序列。啟動子可包括誘導型啟動子(可操作連接於啟動子的多核苷酸序列的表達由分析物、輔助因子、調節蛋白等誘導)、阻遏型啟動子(可操作連接於啟動子的多核苷酸序列的表達由分析物、輔助因子、調節蛋白等誘導)和組成型啟動子。
雙鏈DNA分子包括具有「相反方向」的DNA的兩條鏈，一條鏈指定為5』到3』；第二條鏈是它的互補鏈。因此，第一條鏈中的第一個編碼序列和互補鏈中的第二個編碼序列有相互有關的「相反」方向，即第一個和第二個編碼序列是在彼此有關的相反方向。
「分離的多核苷酸」分子是從整個生物體中分離和獨立的核酸分子，分子與生物體在自然界中發現。這種分離的多核苷酸也許全部或部分缺乏通常在自然界中與它有關的序列。
廣義上使用的「多肽」是指兩種或多種亞基胺基酸、胺基酸類似物或其它肽模擬物的化合物。亞基可通過肽鍵或其它鍵例如酯、醚等連接。如本文所用，術語「胺基酸」或指天然和/或非天然胺基酸，或合成胺基酸，包括甘氨酸和D或L光學異構體、胺基酸類似物和肽模擬物。
「可操作連接」指元件的排列，其中所述組分被配置以行使它們通常的功能。因此，當存在適當的酶時，可操作連接於編碼序列(如報導基因)的特定啟動子能影響編碼序列表達。只要啟動子或其它控制元件發揮作用指導編碼序列表達，它們不需與編碼序列毗鄰。例如，幹擾尚未翻譯的轉錄序列可在啟動子序列和編碼序列之間存在，且啟動子序列仍可認為是「可操作連接」於編碼序列。
本文所用的「重組多核苷酸」描述了用分子生物技術獲得的核酸分子，例如通過克隆、PCR擴增、質粒分離，使用表達系統等。關於蛋白或多肽使用的術語「重組體」意味著通過表達重組多核苷酸產生的多肽。
「重組宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」和其它這種術語表示原核微生物或作為單細胞實體培養的真核細胞系，它們可交換使用並指可以或已經用作重組載體或其它轉移DNA的受體的細胞，且包括被轉化的原始細胞的後代。要理解的是單個親代細胞的後代不一定在形態學或基因組或總DNA補體上完全與原始親代相同，這是由於偶然突變或目的性突變。足夠類似於親本的親代細胞的後代通過相關性質表現其特徵，如存在編碼所需肽的核苷酸序列，這些後代包括在此定義中所指的後代並被以上術語涵蓋。
確定核苷酸和胺基酸「序列同一性」的技術也在本領域中已知。通常，這種技術包括確定用於基因的mRNA的核苷酸序列和/或確定從而編碼的胺基酸序列、比較這些序列和第二個核苷或胺基酸序列。一般，「同一性」指分別相應於兩種多核苷酸或多肽序列的精確的核苷酸-核苷酸或胺基酸-胺基酸。兩種或多種序列(多核苷酸或胺基酸)可通過確定它們的「同一性百分比」來比較。不管核酸還是胺基酸序列，兩種序列的同一性百分比是兩種排列的序列間準確配對的數目除以較短序列的長度並乘以100。核酸序列的近似排列由Smith和Waterman，《應用數學的進展》(Advances in Applied Mathematics)2482-489(1981)的局部同源性算法提供。該算法可通過用Dayhoff，《蛋白質序列和結構的圖譜集》(Atlas of ProteinSequences and Structure)，M.O.Dayhoff編，5 suppl.3353-358，全國生物醫學研究基金會(National Biomedical Research Foundation)，Washington，D.C.，USA開發的得分矩陣(scoring matrix)應用於胺基酸序列，並通過Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986)來歸一化。此算法確定序列百分比同一性的一個示範手段用是由Genetics Computer Group(Madison，WI)在「Bestfit」效用應用中提供的。此方法的默認參數描述於《威斯康星序列分析包程序手冊》(Wisconsin Sequence Analysis Package ProGram Manual)第8版(1995)(可從Genetics Computer Group，Madison，WI獲得)。本發明中建立百分比同一性的一個較佳方法是使用MPSRCH程序包，該程序包由愛丁堡大學(University ofEdinburgh)享有版權，由John F.Collins和Shane S.Sturrok開發，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)發行。從此套包中，默認參數用於記分表(例如間隙開放罰分12，間隙延伸罰分1，間隙6)的地方可使用Smith-Waterman算法。從數據產生的「配對」值反映了「序列同一性」。其它計算序列間百分比同一性或類似性的合適程序一般在本領域中已知，例如另一種排列程序是使用默認參數的BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可使用下列默認參數遺傳密碼＝標準；過濾器＝無；鏈＝兩者；中止＝60；預期＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50序列；排序＝高分數；資料庫＝非冗餘，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白質+Spupdate+PIR。這些程序的詳情可發現於下面的網際網路地址http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
「基因」指含至少一個可讀框的多核苷酸，多核苷酸能編碼具體產物(如多肽、蛋白質或RNA)。通常，術語「基因」包括與產物表達相關的控制序列。術語「基因座」指生物體的基因組中基因的物理位置。本文所述的任何多核苷酸序列可用於鑑定與它們相關的基因的較大片斷或全長編碼序列。分離較大片斷序列的方法對本領域技術人員是已知的。
兩種核酸分子間序列相關性的程度影響這種分子間雜交的效率和強度。部分相同的核酸序列至少部分抑制完全相同的序列與靶分子雜交。抑制完全相同的序列雜交可用本領域熟知的雜交試驗評估(如DNA印跡、RNA印跡、溶液雜交等，參見Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL)，第二版(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。這類試驗可用不同程度的選擇性進行，例如用從低到高不同嚴緊性的條件。如果使用低嚴緊性的條件，非特異結合的缺乏可用第二探針評估，第二探針缺乏甚至部分程度的序列同一性(例如具有與靶分子的序列同一性小於約30％的探針)，因此缺少非特異結合時第二探針不與靶雜交。
當使用以雜交為基礎的檢測系統時，選擇與靶核酸序列互補的核酸探針，然後通過適當條件使探針和靶序列「選擇性雜交」，或相互結合以形成雜種分子。在「適度嚴緊性」下能選擇性與靶序列雜交的核酸分子通常在允許檢測靶核酸序列的條件下雜交，靶核酸序列至少約10-14核苷酸長度並與選擇的核酸探針序列有至少約70％的序列同一性。嚴緊的雜交條件一般允許檢測的靶核酸序列至少約10-14核苷酸長度並與選擇的核酸探針序列有大於約90-95％的序列同一性。在探針和靶有特異程度序列同一性的地方對探針/靶雜交有用的雜交條件可如本領域已知的確定(參見，例如《核酸雜交實踐方法》(Nucleic Acid HybridizationA PracticalApproach)，編者B.D.Hames和S.J.Higgins(1985)Oxford；Washington，D.C；IRLPress)。
關於雜交的嚴緊性條件，本領域熟知的是可使用許多相同條件來建立不同的具體嚴緊性，例如下列因素探針和靶序列的長度和性質、多種序列的鹼基組成、鹽和其它雜交溶液成分的濃度、存在或缺乏雜交溶液中的封閉劑(如甲醯胺、硫酸葡聚糖和聚乙二醇)、雜交反應溫度和時間參數以及不同的洗滌條件。具體雜交條件的選擇按下列本領域標準方法選擇(參見，例如Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)ColdSpring Harbor，N.Y.)。
包括確定的鄰近核酸序列的核酸「編碼」相應的多肽或RNA產物。例如，包括可讀框的DNA序列編碼多肽序列與可讀框相符合。另一例子中，DNA序列可編碼相應的rRNA、tRNA或mRNA序列。
「純化的多核苷酸」指感興趣的多核苷酸或其片斷，片斷本質上沒有與多核苷酸天然相連的蛋白，如含少於約50％，較佳的是少於約70％，更佳的是少於約90％的蛋白。純化感興趣的多核苷酸的技術在本領域中熟知，包括例如用離液劑破裂含多核苷酸的細胞和通過離子交換層析、親和層析及依照密度的沉降來分離多核苷酸和蛋白質。
「載體」能轉移基因序列到靶細胞中(如病毒載體、非病毒載體、顆粒運載體和脂質體)。通常，「載體構建物」指能轉移感興趣的序列到靶細胞的核酸載體。核酸載體可暫時存在於靶細胞中或能在其中複製。瞬時載體一般沒有可在靶細胞中發揮作用的複製起點，或在靶細胞中在一定條件下沒有功能(「條件」複製起點)。
「核酸表達載體」指能指導感興趣的序列或基因表達的集合。核酸表達載體包括可操作連接於感興趣的序列或基因的啟動子。其它控制元件也可存在。例如，除了表達盒的組成，質粒構建物也可包括一個或多個複製起點、一個或多個可選擇標記、允許質粒構建物作為單鏈DNA(如M13複製起點)存在的信號、多克隆位點和「哺乳動物」複製起點(如SV40或腺病毒複製起點)。
「表達盒」包括任何含能在細胞中表達的多核苷酸基因或序列的核酸構建物。除了感興趣的多核苷酸基因或序列，表達盒可包含另外的轉錄、翻譯或其它調節或控制元件。為了轉移表達盒到靶細胞中，這種盒通常構建到「載體」、「載體構建物」或「表達載體」(即核酸表達載體)中。
本文所用「轉座子」定義的多核苷酸包括能從一個基因座重新定位到另一個基因座的重複元件(如從一個染色體點到另一個染色體點，或從一個附加體點到另一個染色體點，即轉座子是移動遺傳元件。在本發明的一個較佳實施方案中，「轉座子盒」包括轉座所需的最小單位(如在內部多核苷酸序列側翼的第一個和第二個轉座子反向重複序列，重複序列包括至少一個能誘導轉座的轉座酶，轉座由所述轉座子反向重複介導)。另外，轉座子盒可以是內部多核苷酸序列側翼的第一個和第二個轉座子反向重複序列，其中轉座酶功能以反式提供或由轉座子盒外部編碼(即內部多核苷酸序列側翼的兩種轉座子反向重複的外部)。如本文所述，轉座子盒包括至少兩種內部區域側翼的反向重複序列。內部區域可包含轉座酶編碼序列和/或其它感興趣的序列。轉座子盒的示意圖如下IR-內部區域-IR，其中IR代表反向重複。在另一個實施方案中，示意圖如下IR-tnp-IR，其中tnp代表轉座酶基因。此外，感興趣IR-序列-tnp-IR代表另一個實施方案，能誘導IR序列介導的轉座。更多的序列、反向重複的5』和3』可包括在所示的轉座子盒中。宿主生物中「功能性」轉座子盒能在該生物中發生轉座。術語「轉座體」(transposant)通常指細胞，在其中轉座子整合到細胞基因組中。
「發光蛋白」或「光發射蛋白」是能產生光的生物發光或螢光蛋白，光通常在200nm到1100nm範圍，優選在可見光譜(即在約400nm到750nm間)。生物發光蛋白通過化學反應產生光(通常需要底物、能源和氧)。螢光蛋白通過吸收和重發射輻射產生光(如用綠色螢光蛋白)。生物發光蛋白的例子包括但不限於下列除非另有說明，「螢光素酶」包括原核(如細菌lux-編碼)和真核(如螢火蟲luc-編碼或腎海鰓螢光素酶)螢光素酶，以及具有不同或改變光學性質的變體，如產生不同顏色的光的螢光素酶(如Kajiyama，N.和Nakano，E.，(Protein Engineering4(6)691-693(1991))；和「光蛋白」例如鈣激活光蛋白(如Lewis，J.C.等.，Fresenius J.Anal.Chem.366(6-7)760-768(2000))。螢光蛋白的例子包括但不限於綠色、黃色、青色、藍色和紅色螢光蛋白(如Hadjantonakis，A.K.，等.，Histochem.Cell Biol.115(1)49-58(2001))。
「發光生蛋白底物」或「光發射蛋白底物」描述了發光蛋白的底物，如螢光素酶產生能量衰減的底物(如螢光素)和通常外加能源的光的光子，如ATP或FMNH2和氧。這些底物的例子包括但不限於細菌lux系統中的癸醛(decanal)、螢火蟲螢光素酶(luc)系統中的4，5-二氫-2-(6-羥基-2-苯並噻唑基)-4-噻唑羧酸(或簡稱為螢光素)、生物發光真菌止血扇茹(Panellus stipticus)系統中的「泛醛」(panal)(Tetrahedron 441597-1602，1998)和重胃蚯蚓(Diplocardialonga)系統中的N-異-戊醯-3-氨丙醇(Biochem.151001-1004，1976)。如本文所述，在一些系統中醛可用作發光蛋白的底物。
除非另有說明，本文的「光」定義為波長在約200nm(如用於UV-C)和約1100nm(如紅外線)間的電磁輻射。可見光的波長範圍在約400nm到約750nm間(即在約4,000埃和約7,500埃間)。
「動物」通常指非人的動物，包括但不限於農場動物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養哺乳動物如狗和貓；實驗室動物包括雪貂、野兔、兔和齧齒動物，如小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠和豚鼠；非人的靈長類動物包括黑猩猩。術語「動物」也可包括但不限於鳥包含家養、野生和獵鳥如小雞、火雞和其它家禽的鳥、鴨、鵝等以及兩棲動物、魚、昆蟲、爬行動物等，。術語不指定一個具體年齡。因此，涵蓋成年、胚胎、胎兒和新生個體。
「轉基因動物」指遺傳工程動物或遺傳工程動物的後代。轉基因動物通常含來自至少一種不相關生物的物質，如來自病毒、微生物、植物或其它動物。術語「嵌合動物」用於指在其中發現異源基因的動物，或異源基因在動物的一些但不是所有細胞中表達。
本文所用的術語「可選擇標記」描述了一種編碼序列，它賦予轉化生物體相對未轉化生物體在培養基上的生長優勢，生物體用可選擇標記編碼序列轉化。可選擇標記的例子包括但不限於，(i)通過功能基因互補突變體基因，例如營養缺陷型突變的互補，如用URA3基因互補ura3-突變體(這種突變體不能在缺乏尿苷或尿嘧啶的情況下生長)，(ii)將編碼序列導入細胞，編碼序列提供顯性、可選擇的表型，例如編碼藥物抗性核糖體蛋白的序列，(iii)將編碼序列導入細胞，編碼序列賦予對加入培養基中藥物的抗性，如使細菌(大腸桿菌)在含氨苄青黴素的培養基中生長的β-內醯胺酶基因。可選擇標記不包括一種標記，它賦予的表型必須由非生長相關試驗評分，如產生光的能力。如本文所用，菌落根據它們產生光的能力來「篩選」。
如本文所用，「分析物」指任何化合物或物質，它們的效果(如誘導或抑制一個具體的啟動子)可用試驗動物和本發明的方法評估。這種分析物包括但不限於化學化合物、藥物化合物、多肽、肽、多核苷酸和多核苷酸類似物。許多組織(如國立衛生研究院，藥物和化學公司)有大的化學或生物化合物的庫，這些化合物來自天然或合成過程，或發酵液或提取液。這種化合物/分析物可用於本發明的實踐中。
完成發明的方法在詳述本發明前，要理解此發明不限於具體製劑或過程參數，這些當然可以變化。也要理解本文所用術語僅為了描述發明的具體實施方案，並不想要限制。
儘管一些與本文所述類似或相同的方法和材料可在本發明的實踐中使用，本文所述的是較佳的材料和方法。
發明的概述本發明的組合物和方法促進將光產生性質賦予生物體或選擇細胞的能力。此外，本發明的組合物和方法使任何感興趣的多核苷酸導入靶細胞或生物體，用編碼發光蛋白的序列作為可篩選標記以鑑定這種靶細胞或生物體的轉化子。用發光蛋白作為篩選細胞轉化感興趣多核苷酸的能力不需要可選擇標記，例如，難以轉化細胞或生物體。編碼發光蛋白的序列可操作地連接於任何感興趣的異源基因，因此光產生可作為成功轉化具有感興趣異源基因的細胞的報導基因。
本發明的一個方面包括將多核苷酸導入細胞的方法、轉化靶細胞的方法。在此方法中提供了細胞群體。細胞群體在促進至少一個細胞亞群吸收多核苷酸的條件下，用感興趣的多核苷酸處理。感興趣的多核苷酸包括發光蛋白編碼序列。在一個實施方案中，發光蛋白編碼序列編碼生物發光蛋白，如螢光素酶。可使用許多方法將多核苷酸導入靶細胞中，包括但不限於下列方法脂-介導轉移(如用脂質體，包括中性和陽離子脂質)、直接注射(如微注射)、細胞融合、微粒轟擊(例如生物射彈方法，如DNA粒子轟擊)、共沉澱(如用磷酸鈣或乙酸鋰)、DEAE-葡聚糖-或聚乙二醇-介導轉移和病毒載體-介導轉移。然後篩選細胞群體中吸收感興趣多核苷酸的細胞亞群。這些細胞通過它們表達包括感興趣多核苷酸的發光蛋白編碼序列來鑑定。分離光產生細胞。這些光產生細胞是多核苷酸導入的細胞，即轉化細胞。接著分離這種光產生細胞以提供光產生細胞的基本上純的菌落(即克隆)，例如通過單克隆的稀釋或劃線。
此外，攜帶這種編碼發光蛋白的序列的生物體，例如隨後以多種感染模式體內監控或用於追蹤感染和/或發病機理，如在食物工業中。具體來說，賦予生物體這種光產生性質是需要的，該生物體對任何可用的選擇方法有抗性。例如，一些普遍存在的病原體(如白色念珠菌和葡萄球菌的一些種)對抗生素或其它一般可選擇標記有抗性。其它也需要賦予光產生性質的生物體如衣原體、梅毒密螺旋體、幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)和其它難以操作及以前未適用於藥物幹擾的生物體。
本發明講授了質粒和表達盒的使用(如修飾的螢光素酶操縱子和含Tn4001、Tn917等的轉座子盒)以促進感興趣生物體的遺傳操作，包括但不限於革蘭氏陰性菌(包括幽門螺桿菌和其它)；革蘭氏陽性菌(包括相關生物如衣原體和梅毒螺旋體)和真核生物如酵母(包括白色念珠菌和其它)。
一方面，本發明涉及含螢光素酶基因的構建物。具體來說，發明包括再改造真核螢光素酶，例如衍生自熒燭(Photinus pyralis)的螢光素酶。再改造這些螢光素酶操縱子包括，例如定點突變來改變(如最優化)密碼子使用。編碼選擇發光蛋白的核酸編碼序列可按照本發明的講授通過本領域已知的方法在靶生物中表達最優化。
作為例子，已知在大部分真核生物中CTG編碼胺基酸亮氨酸，而在假絲酵母中CTG編碼胺基酸絲氨酸。為了異源基因在假絲酵母中表達，似乎真核螢光素酶中的CTG密碼子必須突變成亮氨酸-編碼序列(如TTG)。然後再改造的螢光素酶操縱子可插入載體，載體包括一種或多種下列可操作連接於螢光素酶編碼序列(1)在靶細胞中活性或高度轉錄的啟動子(如白色念珠菌烯醇酶(ENO1)啟動子)；(2)聚腺苷酸化信號(如白色念珠菌肌動蛋白(ACT1)聚腺苷酸化信號)；和(3)感興趣的異源基因。在一些實施方案中，啟動子和/或聚腺苷酸化信號在螢光素酶操縱子側翼。
另一方面，發明涉及使用無啟動子的螢光素酶盒使感興趣的生物體轉化成光產生表型，轉化通過轉座子的方法將盒整合到那些生物體的基因組中，其中在靶生物中鄰近內源啟動子發生整合。例如，將無啟動子的螢光素酶(如lux)盒插入Tn4001轉座子，然後用攜帶Tn4001螢光素酶構建物的穿梭載體轉化感興趣的細胞。轉化後的轉座導致螢光素酶盒整合到宿主生物的基因組中並導致生物產生光的能力；其它無啟動子的盒整合在活性啟動子序列後面產生具有光產生表型的宿主生物。使用這種方法，使得一些不同屬的革蘭氏陽性菌明亮地發光，或是組成型或是誘導的。
本文所述構建物(如修飾的螢光素酶質粒和轉座子構建物)可插入合適的主鏈中(如穿梭載體)並因此賦予產生編碼感興趣序列的產物的能力(在發光蛋白的情況中，還賦予細胞或動物中產生光的能力)，這種能力是根據感興趣編碼序列(如發光蛋白編碼盒)整合到宿主細胞基因組的活性啟動子區域後面。一方面，本文所述構建的允許產生發光生物體(如革蘭氏陽性菌)和在動物模型中使用這些生物體。
許多發光蛋白序列在本發明實踐中有用且，通常最優化在靶生物中表達。
因此，本文提供了導入核酸(如感興趣的異源基因)到靶細胞的篩選方法而不需可選擇標記。這尤其在致病菌株中有用，如假絲酵母或抗性細菌，在其中沒有有用的可選擇標記。用本文所述構建物轉化靶宿主細胞以提供核酸隨後整合的機會。所得光產生表型可以是組成型、誘導型或阻抑型，這取決於轉座子盒後面的啟動子區域的性質，此種表型可用於檢測成功的轉化。
然後，這種轉化細胞可用於，例如在體外和動物模型中篩選候選效應分子。顯示產生光的細胞(或菌落)可用於鑑定有效藥劑，光產生是由於感染誘導的啟動子的活性。例如，顯示產生光的細胞用於感染實驗動物和對照動物。實驗動物然後用感興趣的藥劑處理。監控實驗動物和對照的光產生和鑑定有效試劑，例如鑑定消除產生光的能力。
本發明的優點包括但不限於(i)轉化多種生物體，包括革蘭氏陽性菌、抗生素抗性生物體、白色念珠菌等；(ii)在那些轉化的生物體中獲得高水平的發光蛋白表達，例如允許在體外和體內更敏感地檢測產生的光；(iii)盒整合到宿主染色體中從而編碼發光蛋白的序列變成可操作連接於宿主細胞啟動子，例如允許鑑定參與發病機理的啟動子；和在生理溫度下(如37℃-42℃)從這些生物體中產生穩定的光。
本發明方法和構建物的具體方面在下面討論。
1.發光蛋白本發明的實踐通常使用編碼發光蛋白的核苷酸序列。當使用本文所述發光報導蛋白時，可準確且非侵染性地評估表達，如前所述(參見，例如Contag，P.R.等.，(1998)Nature Med.4245-7；Contag，C.H.，等.，(1997)PhotochemPhotobiol.66523-31；Contag，C.H.，等.，(1995)Mol Microbiol.18593-603)和本文所述。
發明的一個方面中，發光蛋白是螢光素酶。生物發光提供了用於研究細菌感染的有效的報導系統(如美國專利號5,650,135)。螢光素酶是應用於不同酶家族成員的術語，當提供底物(如螢光素、長鏈醛或colentrazine)、能源(如ATP或FMNH2)和氧時，這些酶共享光產生性質。螢光素酶可廣義分類為真核螢光素酶(由luc基因編碼)和原核螢光素酶(由lux基因編碼)。真核螢光素酶(「luc」)通常由單基因編碼(參見如de Wet，J.R.等.，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827870-7873；de Wet，J.R.等.，(1987)，Mol.Cell.Biol.7725-737)。
細菌螢光素酶(「lux」)通常由兩個亞基(α和β)組成，兩個亞基在lux操縱子上由兩個不同基因(luxA和luxB)編碼。操縱子上其它三種基因(luxC、luxD和luxE)編碼醛底物生物合成所需的酶。細菌lux存在於一些生物發光革蘭氏陰性菌(如發光光杆狀菌中，且野生型操縱子排列為CDABE。
此外，另一細菌基因，從費氏弧菌(Vibrio fischeri)菌株Y-1中分離的luxY編碼黃色螢光蛋白(YFP)，當通過螢光素酶作用時，底物發出λmax為545nm的黃光。參見Baldwin，T.O等.，(1990)Biochem 295509-5515。
本發明的另一個方面中，發光蛋白是螢光蛋白，例如藍色、青色、綠色、黃色和紅色螢光蛋白。
一些發光蛋白編碼序列可商業購買，包括但不限於下列。Clontech(PaloAlto，CA)提供螢光素酶的編碼序列和多種螢光蛋白，包括藍色、青色、綠色、黃色和紅色螢光蛋白。增強的綠色螢光蛋白(EGFP)變體在哺乳動物系統中很好地表達，並往往顯示比野生型GFP更亮的螢光。增強的螢光蛋白包括增強的綠色螢光蛋白(EGFP)、增強的青色螢光蛋白(ECFP)和增強的黃色螢光蛋白(EYFP)。此外，Clontech提供不穩定的增強的螢光蛋白(dEFP)變體，dEFP變體以迅速轉換率為特徵。dEFP變體的較短半衰期使它們在動力學研究和作為定量報導基因上有用。DsRed編碼序列可從Clontech獲得(http//www.clontech.com/techinfo/vectors/vectorsD/text/pDsRed.txt)。Ds Red是表達研究中有用的紅色螢光蛋白。此外，Fradkov，A.F.等描述了來自Discosoma珊瑚的一種新螢光蛋白和其突變體，突變體有獨特的遠紅外螢光(FEBS Lett.479(3)，127-130(2000))(mRNA序列，GENBANK登記號AF272711，蛋白序列GENBANK登記號AAG16224)。Promega(Madison，WI)也提供螢火蟲螢光素酶的編碼序列(例如，如pGL3載體中所包含的)。另外，許多螢光蛋白的編碼序列可從GENBANK獲得，例如登記號AY015995、AF322221、AF080431、AF292560、AF292559、AF292558、AF292557、AF139645、U47298、U47297、AY015988、AY015994和AF292556。
此外，可使用更多的光產生系統，例如當評估細胞中表達時可用。這種系統包括但不限於發光β-半乳糖苷酶遺傳報導系統(Clontech)。
1A.Lux-編碼盒發明的一方面中，提供的基因盒包括編碼結構和底物-編碼lux基因-產物的鑫核苷酸。支持本發明進行的實驗證明重排lux基因和在一個或多個lux基因前插入轉錄和/或翻譯控制序列賦予所得螢光素酶提高光產生能力，重排lux基因例如從野生型CABDE到ABCDE，序列在表達所需的靶生物基礎上選擇。例如，當在轉化革蘭氏陽性菌中使用時，革蘭氏陽性SD序列插入編碼序列的上遊。當用於轉化其它生物體時，可使用適當的轉錄和/或翻譯增強序列(如真核細胞中的Kozak序列，革蘭氏陰性生物的革蘭氏陰性SD序列)。在一些生物體中，例如真核生物，各lux基因可置於單獨啟動子轉錄控制下。luxABCDE盒不僅表達螢光素酶，也表達合成lux螢光素酶底物-醛必需的生物合成酶。因此，當使用這種盒時，氧是生物發光唯一的外部要求。
發明的另一方面中，luxY可加入包括發光蛋白編碼序列的盒。例如，將luxY基因加入luxABCDE基因盒導致生物發光期間發出光的波長範圍變寬，生物發光接近可視光譜的紅外端。般定較長波長的光與較短波長的光相比更容易滲透活組織，因此本發明luxABCDE基因盒的選擇實施方案另外包括luxY編碼序列，作為提高應用敏感性的方法，使用生物發光作為報導基因方式。
一方面，提供了luxAB基因盒。當用於轉化革蘭氏陽性生物時，luxAB盒通常包含革蘭氏陽性核糖體結合位點(也稱為「SD」序列)，結合位點可操作連接各編碼luxA和luxB的多核苷酸的上遊。當用於轉化其它生物體時，可使用適當的轉錄和/或翻譯增強序列(如啟動子序列、真核生物中的Kozak序列、用於革蘭氏陰性生物的革蘭氏陰性SD序列)。當提供外源醛底物時，攜帶luxAB盒的宿主生物顯示現出生物發光。luxAB盒賦予的螢光素酶活性水平比以前已知的構建物中發現的更高，尤其是當它在革蘭氏陽性菌如葡萄球菌(Staphylococcus)或鏈球菌(Streptococcus)中表達時。
lux編碼基因的編碼序列可最優化用於靶生物中的表達。例如，定的lux基因的多肽產物的序列，可選擇適當密碼子來編碼多肽，其中在靶生物中優選密碼子使用的基礎上選擇這種密碼子。
還描述了修飾的lux編碼序列，如Xenogen公司2001年3月15日出版的WO01/18195。
在另外的實施方案中，可提供產生兩種或多種發光多肽的序列作為單獨轉座子盒中第一個感興趣序列，發光多肽在兩個或多個波長產生發射光；轉座子盒可依次或在單載體主鏈或在多載體主鏈中提供。這種構建物可用於產生，例如本發明的單個攜帶多轉座子盒的微生物，其中轉座子盒可各自編碼在不同波長發光的發光多肽。
1B.Luc-編碼盒本發明也包括可在靶細胞中表達真核螢光素酶的基因盒。如上所提到的，已鑑定多種真核螢光素酶並可商業購買，例如質粒pGL2(Promega，Madison，WI)包含熒燭(Photinus pyralis)螢光素酶。
已鑑定的多種螢光素酶編碼基因包括但不限於下列B.A.Sherf和K.V.Wood，美國專利號5,670,356，1997年9月23日出版；Kazami.J.等.，美國專利號5,604,123，1997年2月18日出版；S.Zenno等，美國專利號5,618,722；K.V.Wood，美國專利號5,650,289，1997年7月22日出版；K.V.Wood，美國專利號5,641,641，1997年6月24日出版；N.Kajiyama和E.Nakano，美國專利號5,229,285，1993年7月20日出版；M.J.Cormier和W.W.Lorenz，美國專利號5,292,658，1994年3月8日出版；M.J.Cormier和W.W.Lorenz，美國專利號5,418,155，1995年5月23日出版；de Wet，J.R.等，Molec.Cell.Biol.7725-737，1987；Tatsumi，H.N.，等，Biochim.Biophys.Acta 1131161-165，1992；Wood，K.V.，等，Science244700-702，1989。另一組生物發光蛋白包括水母蛋白家族的發光蛋白(Prasher，D.C.，等，Biochem.261326-1332(1987))。螢光素酶以及水母蛋白質樣分子需要能源如ATP、NAD(P)H等，和底物如螢光素或coelentrazine和氧。
野生型螢火蟲螢光素酶通常最大發射在約550nm。也研究了許多有不同最大發射的變體。例如，Kajiyama和Nakano(Protein Eng.4(6)691-693，1991；美國專利號5,330,906，1994年7月19日出版)講授了五種不同螢火蟲螢光素酶，它們通過改變Luciola cruciata螢光素酶編碼序列的單個胺基酸來產生。變體的發射峰為558nm、595nm、607nm、609nm和612nm。發射峰為約540nm的黃色-綠色螢光素酶可從Promega，Madison，WI在pGL3名下購得。發射峰為約610nm的紅色螢光素酶描述於，例如Contag等.(1998)Nat.Med.4245-247和Kajiyama等.(1991)Prot.Eng.4691-693中。衍生自米氏腎海鰓(Renilla muelleri)的螢光素酶編碼序列也已描述(mRNA，GENBANK登記號AY015988，蛋白質登記號AAG54094)。
本文所述構建物和方法中，真核螢光素酶被優先修飾，以緻密碼子使用反映在靶細胞中更常使用的那些密碼子。可獲得密碼子修飾，例如通過用密碼子使用資料庫，在全球資訊網http//222.kazusa.or.jp/codon/獲得。例如，在假絲酵母中密碼子CTG作為絲氨酸殘基表達，而在許多其它真核生物(包括P.pyralis)中，CTG作為亮氨酸殘基表達。因此，CTG密碼子在P.pyralis中優先修飾成TTG(或其它任何在假絲酵母中作為亮氨酸表達的密碼子)。
位點特異地突變螢光素酶操縱子的一個較佳方法是用PCR。PCR的一般過程講授於MacPherson等.，《PCR一種實踐方法》(PCRA PRACTICAL APPROACH)，(IRLPress at Oxford University Press，(1991))。各應用反應的PCR條件可根據經驗確定。一些參數影響反應的成功。這些參數是退火溫度和時間、延伸時間、Mg2+和ATP濃度、pH、和引物、模板及脫氧核糖核酸的相對濃度。示範引物(如寡核苷酸引物)描述於下面的實施例中。擴增後，可通過瓊脂糖凝膠電泳接著用溴化乙錠染色和紫外照射目視來檢測所得片段。位點特異突變也描述於下面的實施例中，且圖1顯示用於定點突變P.pyralis的寡核苷酸對。優選的是變化不影響所得蛋白質的胺基酸序列。
另一個獲得修飾螢光素酶的方法是隨機突變以隨機改變胺基酸，接著篩選顯示有效發光的克隆。可進行隨機突變，例如通過產生寡核苷酸以隨機改變靶DNA序列。
2.載體編碼發光蛋白的序列可然後用來構建載體，以在用於靶細胞的轉化。一些這種構建物描述於實施例中。用於本發明的載體一般可分成兩組，無啟動子的構建物和含啟動子的構建物。
在一些實施方案中，構建物是無啟動子的(如以下詳述的轉座子穿梭載體)。然而在其它實施方案中，構建物包括可操作連接於螢光素酶序列的啟動子序列。優選的是啟動子在靶細胞中有活性。在靶生物中有功能的啟動子可通過檢查與靶生物相關的先有技術來鑑定(如下面假絲酵母的例子)。類似地，更多轉錄和/或翻譯控制元件從靶生物中優選獲得。
當需要整合到靶生物的基因組時，與發光蛋白關聯的無啟動子的構建物對轉化載體是有用的。在此情況下，發光蛋白的表達和隨後的光產生取決於發光蛋白編碼序列整合到內源活性啟動子附近。含這種無啟動子的發光蛋白編碼序列的載體構建物可以是線狀或環狀的。它們可包括在基因組特異位置靶整合的序列，這種整合可由位點特異性整合介導(如環狀載體中同源序列的單交換，或發生雙交換的同源重組基本上置換一個基因組片斷)。另外，線狀或環狀多核苷酸可導入，隨機整合到基因組中。這種無啟動子的構建物可包括另外的元件，包括但不限於下面所述的那些。
在另一個實施方案中，本發明使用的載體構建物中發光蛋白編碼序列在所選啟動子(即含構建物的啟動子)的轉錄控制下。如上述無啟動子的構建物，含構建物的啟動子可以是線狀或環狀，且它們可包含指導整合到一個或多個位點的元件，或這種載體可導入靶細胞且利用隨機整合以獲得轉化子。
因此，本文所述的發光蛋白編碼序列可插入無啟動子的載體或含啟動子的載體，載體進一步包括一個或多個下列各項(1)一個或多個聚腺苷酸化信號、(2)一個或多個整合靶序列、(3)一個或多個複製起點、(4)一個或多個轉錄終止元件和(5)一個或多個感興趣的編碼序列。感興趣的編碼序列通常包括它們自身的轉錄和/或翻譯控制元件。例如，如果使用無啟動子的發光蛋白構建物且在靶生物中有功能的啟動子可操作連接於感興趣的編碼序列，載體可進一步包括轉錄終止序列以防止發光蛋白編碼序列的通讀轉錄受轉錄控制元件影響，轉錄控制元件與感興趣的編碼序列相聯。在另一個示範實施方案中，例如當轉化革蘭氏陽性菌時，感興趣的無啟動子編碼序列可與無啟動子發光蛋白編碼序列串聯，其中感興趣的編碼序列包括可操作連接的革蘭氏陽性SD序列以基本上產生提供多順反子信息的序列。
本發明的另一方面中，無啟動子的構建物包括一個轉座或可動遺傳因子。
2A.轉座或可動遺傳元件一方面，本發明的實踐使用轉座或可動遺傳元件。具體的轉座或可動元件在靶生物的基礎上選擇。示範靶生物和相關轉座或可動元件包括但不限於下列各項細菌(如革蘭氏陽性、革蘭氏陰性)、酵母(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ty元件，Boeke，Garfinkel等.(1985)Cell 40(3)491-500)、植物(如玉米)和昆蟲(如果蠅中的mariner)。為用於本發明，修飾轉座子或可動遺傳元件包括無啟動子的發光蛋白構建物或含啟動子的發光蛋白構建物。可修飾轉座子或可動遺傳元件以進一步包括其它元件，如另外的感興趣的多核苷酸序列。通常，所有加入轉座子的組分或可動遺傳元件包括在功能轉座子或可動遺傳元件的邊界間，如反向重複，當轉座子或可動遺傳元件重定位時，加入的組分與轉座子或可動遺傳元件一起移動。
用於本發明的一個示範轉座子是Tn4001，這是一種I類複合型轉座子，最初分離自金黃色葡萄球菌(GeneBank登記號M18086，序列的1-1，324個鹼基對；參見Byrne，M.E.，Rouch，D.A.和Skurray，R.A.(1989)Gene 81361-367)。此元件能以高度的隨機性插入革蘭氏陽性生物的細菌染色體中。為支持本發明而進行的實驗表明，轉座子也在革蘭氏陰性宿主細胞中有功能。
Tn4001轉座子的組分包括(1)IS256插入序列的兩個相同拷貝，作為定義插入序列的反向重複(IR’s)存在和(2)一個位於反向重複內的轉座酶基因，反向重複定義插入。一般，當提到轉座子時，認為反向重複是功能轉座子單位的邊界。如下所討論的，此基本結構可進一步修飾並置於多種載體主鏈中。
例如，其它感興趣的序列可插在反向重複(如5』-IR-發光蛋白編碼序列--感興趣的序列-IR 3』)之間，以及發光蛋白編碼序列間。在一個實施方案中，其它感興趣的序列缺乏一個相關的啟動子區域。在此情況中，轉錄增強序列可加在各蛋白編碼序列間(即用於產生多順反子信息)。在另外的實施方案中，靶生物中有功能的啟動子可操作連接於感興趣的序列。
當使用包括發光蛋白編碼序列的無啟動子構建物時，發光蛋白編碼序列和另外感興趣的序列優先導入Tn4001轉座子，這樣插入序列的轉錄方向與轉座酶編碼序列的方向相反，所以不在轉座酶啟動子的影響之下。因此序列不轉錄，除非且直到插入序列的整合發生在活性或可活化啟動子區域後面。作為推論，這意味著在DNA中感興趣序列的可讀框的編碼序列與轉座酶是在相反方向。另外，倘若轉座酶序列位於感興趣序列下遊，轉座酶序列可以和感興趣序列相同的方向存在，這是為了避免內源轉座酶啟動子的通讀和在整合前表達發光蛋白基因產物。
當無啟動子的構建物用於本發明的實踐時，發光蛋白序列通常在轉座元件內不含啟動子時使用。即無啟動子的序列通常存在於轉座子中，轉座子可介導發光蛋白的轉錄。在一個較佳實施方案中，發光蛋白序列插入5』反向重複序列的3』端附近或非常接近處，如5』-IR-發光蛋白序列-IR-3』。此外，序列以與轉座酶序列相反的方向插入，這樣即使轉錄轉座酶序列，在感興趣序列(如發光多肽編碼序列)整合到感興趣的生物基因組前沒有感興趣序列的轉錄，基因組在活性宿主啟動子區域附近。
轉座子盒通常克隆到穿梭載體中以容易操作和分離大量載體DNA。一些這種穿梭載體普遍可用，如pAUL-A(Chakraborty等.(1992)J Bacteriol 174568-574)；pE194(Sozhamannan，s.，等.(1990)J Bacteriol 1724543-4548；此載體的圖譜參見http//phage.atcc.org/vectors/gifs/68359.gif；全長序列參見ftp//ftp.atcc.org/pub/vector-seqs/pE194.html)；pMK4(Sullivan，M.，等.，(1984)Gene 2921-26)、pDL289(Buckley，N.，等.，(1995)J Bacteriol1775028-5034)、pSK+BLUESCRIPT(Stratagene，La Jolla，CA)；和pSUM系列分枝桿菌穿梭載體(Ainsa，J.A.，等.，(1996)Gene 17623-26)。在轉座子或可動遺傳元件待導入宿主(即靶)細胞的基礎上，可選擇類似的載體主鏈用於任何給定轉座子或可動遺傳元件。
對於TN4001，這種載體主鏈可包括(1)革蘭氏陰性複製起點(可以是條件性的，如溫度-敏感)、(2)革蘭氏陽性複製起點(可以是條件性的，如溫度-敏感)、(3)多接頭區域和(4)轉錄終止區域。
實施例1描述了本發明示範轉座元件的構建，轉座子包括無啟動子的發光蛋白編碼序列。實施例2描述了將轉座子導入一些載體中，這些載體對導入轉座子到一些不同細菌中有用。實施例3描述了使用一種載體/轉座子構建物以獲得轉化的生物發光菌落。由本發明方法轉化的細胞從在固體培養基上高密度平板培養的菌落中分離，用眼檢測和手工分離。
本發明的一方面中，載體主鏈具有轉錄終止序列，序列在轉座子或可動遺傳元件一邊或兩邊的側翼，這是為了防止在盒整合到宿主生物DNA前表達發光多肽。這種區域在本領域中已知。參見如Henkin，T.M.，(1996)Ann Rev Genet 3035-37；MacDonald L.E.，等.(1993)J.Mol.Biol.232-1030-1037；Jeng，S.T.，等.(1997)Can J Microbiol 431147-1156。
複製起點在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性生物中都有功能的較佳實施方案中，革蘭氏陰性複製起點的存在允許載體在革蘭氏陰性生物中複製，從而在避免革蘭氏陽性宿主生物的限制性內切酶系統時有助於操作插入序列，以及允許分離大量的載體構建物DNA。在此情況中，可選擇標記可包括在載體中以有助於通過革蘭氏陰性生物，其中所得DNA用於轉化革蘭氏陽性生物。可選擇標記在宿主生物中用於通過載體以便獲得一些DNA。在本發明的這一方面中，可選擇標記不用於鑑定轉座體(transposant)，篩選靶細胞中表達發光蛋白序列是用來鑑定轉座體的篩選。
另外，可使用在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性生物中都有功能的複製起點，如一些鏈黴菌質粒中的複製起點(如pCK1)。
攜帶轉座子或可動遺傳元件的載體中的複製起點可以是連續活性或是條件性的，如來自pE194的溫度-敏感起點，如在pAUL-A穿梭載體中所發現的。將條件性複製起點包括在本發明載體構建物中的一個優點是這種元件使載體構建物在感興趣生物中在容許條件下穩定，而當在限制性條件下生長時因子使宿主生物中的載體被「除去」(如轉座發生後溫度上升到非容許的水平)。
因此，用載體轉化靶生物後，轉化子通過它們產生光的能力來鑑定，載體含轉座子或可動遺傳元件(包括含啟動子或無啟動子的編碼發光蛋白的序列)。通常在轉化操作後，平板培養細胞並鑑定含產光細胞的平板區域。然後通過這些區域來提供更純的轉化細胞培養物，細胞表達發光蛋白編碼序列。這種操作也可在液體或半固體培養物中進行，使用如微量滴定板。
2B.載體和質粒本明的方法可用於轉化多種細胞類型，使用適當表達載體，載體包括選擇的表達控制元件。可由本領域普通技術人員根據本說明書和表達載體領域中已知信息來選擇用於任何給定細胞類型的適當載體和控制元件。
例如，發光蛋白編碼序列可插入載體中，載體包括可操作連接於編碼序列的控制元件，這使基因在選擇細胞類型中表達。用於哺乳動物細胞表達的示範啟動子包括但不限於SV40早期啟動子、CMV啟動子、HIV-LTR、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子(MMLV-LTR)、FIV-LTR、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)和單純皰疹病毒啟動子。其它非病毒啟動子也可用於哺乳動物表達，如衍生自鼠金屬硫蛋白基因的啟動子。通常，轉錄終止和聚腺苷酸化序列也存在於翻譯終止密碼子的3』。優選的是也存在最優化翻譯起始的序列，序列位於編碼序列的5』。轉錄終止子/聚腺苷酸化信號的例子包括那些衍生自SV40以及牛生長激素終止子序列，如描述於Sambrook等.，同上。含剪接供體和受體位點的內含子也可設計到構建物中，用於本發明(Chapman等.，Nuc.Acids Res.(1991)193979-3986)。
增強子元件可用來提高哺乳動物載體構建物的表達水平。示範增強子包括但不限於SV40早期基因增強子，如描述於Dijkema等.，EMBO J.(1985)4761、衍生自勞斯肉瘤病毒的長末端重複(LTR)的增強子/啟動子，如描述於Gorman等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)796777、和衍生自人CMV的元件，如描述於Boshart等.，Cell(1985)41521，如包括在CMV內含子A序列中的元件(Chapman等.，Nuc.Acids Res.(1991)193979-3986)。
合適的原核載體包括，例如質粒，如能在大腸桿菌(例如pBR322、ColE1、pSC101、PACYC184、itVX、pRSET、pBAD(Invitrogen，Carlsbad，CA)等)中複製的質粒。這種質粒由Sambrook披露(參閱《分子克隆實驗室手冊》(MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL)，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis編，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989))且，許多這類載體可商業購買。桿菌質粒包括pC194、pC221、pT127等，並由Gryczan披露(《桿菌的分子生物學》TheMolecular Biology of the Bacilli)，Academic Press，NY(1982)，pp.307-329)。合適的鏈黴菌質粒包括pli101(Kendall等.J.Bacteriol.1694177-4183，1987)、鏈黴菌噬菌體如□C31(Chater等.，《第六屆國際放線菌生物學討論會》，AkademiaiKaido，Budapest，Hungary(1986)，pp.45-54)。假單胞菌質粒由John等(Rev.Infect.Dis.8693-704，1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol.33729-742，1978)綜述。
合適的真核質粒包括，例如BPV、EBV、牛痘、SV40、2微米環形、pcDNA3.1、pcDNA3.1/GS、pYES2/GS、pMT、pIND、pIND(Spl)、pVgRXR(Invitrogen)等或它們的衍生物。這種質粒在本領域中熟知(Botstein等.，Miami Wntr.SyTnp.19265-274，1982；Broach，在《酵母的分子生物學》生命周期和遺傳」(TheMolecular Biology of the Yeast SaccharomycesLife Cycle and Inheritance)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，p.445-470，1981；Broach，Cell 28203-204，1982；Dilon等.，J.Clin.Hematol.Oncol.1039-48，1980；Maniatis，《細胞生物學》綜合論文集(Cell BiologyA ComprehensiveTreatise)，第3卷，基因序列表達，Academic Press，NY，pp.563-608，1980。
發光蛋白編碼序列可克隆到一些商業購買的載體中以產生發光多肽的表達，用作適當宿主系統中的轉化標記。這些系統包括但不限於下列各項用於杆狀病毒轉化的載體，Reilly，P.R.，等.，《杆狀病毒表達載體實驗室手冊》(BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORSA LBORATORY MANUAL)(1992)、Beames，等.，Biotechniques11378(1991)，Pharmingen；Clontech，Palo Alto，CA)；用於細菌轉化的載體，Ausubel，F.M.等.，《新編分子生物》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John Wiley和Sons，Inc.，Media PA，Clontech；用於酵母轉化的載體，Rosenberg，S.和Tekamp-Olson，P.，美國專利號RE35,749，1998年3月17日出版，、Shuster，J.R.，美國專利號5,629,203，1997年5月13日出版、Gellissen，G.，等.，Antonie VanLeeuwenhoek，62(1-2)79-93(1992)、Romanos，M.A.，等.，Yeast8(6)423-488(1992)、Goeddel，D.V.，《酶學方法》(Methods in Enzymology)185(1990)、Guthrie，C.，和G.R.Fink，《酶學方法》194(1991)；用於哺乳動物細胞轉化的載體，Clontech；Life Technologies/Gibco-BRL，Grand Island，NY、Haynes，J.等.，Nuc.Acid.Res.11687-706(1983)、Lau，Y.F.等.，Mol.Cell.Biol.41469-1475(1984)、Kaufman，R.J.，「在哺乳動物細胞中選擇和共擴增異源基因」(Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells)，《酶學方法》第185卷，pp537-566，Academic Press，Inc.，San Diego CA(1991)；和用於植物細胞轉化的載體，植物克隆載體，Clontech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA和Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Pistcataway，NJ，Hood，E.，等.，J.Bacteriol.1681291-1301(1986)、Nagel，R.，等.，FEMSMicrobiol.Lett.67325(1990)、AN等.，「二元載體」(Binary Vectors)、其它在《植物分子生物學手冊》(Plant Molecular Biology Manual)A31-19(1988)，Miki，B.L.A.等.，pp249-265中的載體、另外的載體在《植物DNA感染劑》(Plant DNA Infectious Agents)(Hohn，T.，等.，編)Springer-Verlag，Wien，Austria(1987)、《植物分子生物學基本技術》(Plant MolecularBiologyEssential Techniques)，P.G.Jones和J.M.Sutton，NewYork，J.Wiley，1997、Miglani Gurbachan《植物遺傳學和分子生物學詞典》(Dictionary of Plant Genetics and Molecular Biology，New York，FoodProducts Press，1998、Henry，R.J.，《植物分子生物學的實踐應用》(PracticalApplications of Plant Molecular Biology)，New York，ChapmanHall，1997中。
包括發光蛋白編碼序列的載體也包括有助於單位點重組到靶生物基因組的序列(如與一個或多個靶基因組中的位點同源的單個DNA序列用來促進整合)或有助於同源重組的序列(如兩個與靶基因組中基因座同源的序列，其中兩個序列在發光蛋白編碼序列的側翼(以及任何有關控制元件和更多感興趣的序列)。一旦鑑定，可容易地分離靶序列，例如通過設計引物和用PCR擴增序列。然後擴增的產物可插入含發光蛋白編碼序列的構建物中，例如需要待整合的側翼序列。整合載體可以是環狀或線狀。此外，使用本發明的方法，攜帶發光蛋白編碼序列的載體(和有關控制元件以及更多感興趣的序列)可導入細胞中並通過轉化靶細胞檢測隨機整合併鑑定轉化子。
實施例4描述了用於白色念珠菌的整合基因組靶載體的構建，其中靶載體包括含發光蛋白編碼序列的啟動子。此外，實施例4描述了用此載體進行的轉化實驗。實施例4中的結果證明含發光蛋白編碼序列的構建物可用作細胞中的報導基因構建物，這些細胞不適於可選擇標記。實施例4中所述方法使用來自螢火蟲(Photinuspyralis)的螢光素酶基因，該基因被改變使其在白色念珠菌中表達。通過篩選光產生來分離轉化的白色念珠菌細胞，沒有使用任何營養缺陷型或以藥物為基礎的選擇。
本文所述的高密度篩選不包括選擇且提供用於獲得轉化子的有效方法。成功的轉化以約5×10-5到10-6頻率發生(5-10個生物發光菌落/20平板；實施例4)。在大大過量的非轉化細胞中鑑定轉化子(即光產生細胞)是直接且可重複的。本文證明成功的轉化已用來自ATCC的一些強毒株重複。在本發明的一個實施方案中，轉化混合物在含螢光素酶的非選擇培養基上平板培養。生長出一菌苔的細胞。使產生光的菌苔成像(使用例如Xenogen公司IVISTM成像系統(Xenogen公司，Alameda，CA))以鑑定包含和表達發光蛋白編碼序列(如螢光素酶基因)的細胞區域。從平板上各明亮區域挑出四到八個小樣品並用於接種過夜液體培養物。然後在微量滴定板的孔中用螢光素混合過夜培養物的小等分樣品，評估各等分樣品的光產生。稀釋包括發光蛋白編碼序列的過夜培養物並平板培養單菌落以獲得單菌落分離物，發光蛋白編碼序列含有/表達細胞。
因此這些結果證明含發光蛋白編碼序列的構建物可用於高密度篩選以檢測轉化，此外可在整體動物中觀察。
本發明的載體包括發光蛋白編碼序列，可製成試劑盒。這種試劑盒的組成可包括但不限於容器、說明書、溶液、緩衝液、一次性使用物和硬體。示範硬體可包括強化的光子計數照相機或冷卻的積分照相機。
因此，可使用以光為基礎的篩選方法，而不使用常規選擇或篩選方法來確定轉化細胞中載體的存在。在一個實施方案(即含啟動子的構建物)中，發光多肽編碼序列置於感興趣生物中活性啟動子的控制下。這種控制元件可以是組成型或條件型的。例如，可操作連接於啟動子序列的luxABCDE盒可導入合適載體中，啟動子序列在感興趣的靶生物中有功能。然後轉化感興趣生物並篩選所得生物產生光的能力。在此方法中，光產生用來鑑定感興趣的轉化子。光產生菌落(或菌斑)通常用標準方法(如，稀釋平板例如用微量滴定孔，或單菌落劃線)克隆(即物理分離)。本發明的一方面提供了包括發光多肽序列的載體，可操作連接於啟動子序列，發光多肽序列在感興趣的靶生物中有功能。使用這種載體提供了轉化生物的方法，此類生物沒有可用的可選擇標記(如藥物抗性標記)。
2C.製備發光蛋白構建物的方法本文所述的發光蛋白盒、轉座子盒和穿梭載體構建物可用分子生物領域中已知的方法(參見，例如Ausubel，F.M.等.，《新編分子生物學》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)、John Wiley和Sons，Inc.，Media PA，(1995)、或Sambrook等.，)根據本說明書的講授來裝配。通常，裝配包括編碼發光多肽序列的基因盒。啟動子、控制元件和/或其它核苷酸序列也可在合適位點導入構建物中。
獲得多核苷酸、合適調節序列和短的隨機核苷酸序列的一個較佳方法是PCR。PCR的一般步驟講授於MacPherson等.，《PCR一種實踐方法》(A PRACTICALAPPROACH)，(IRL Press at Oxford University Press，(1991))。各應用反應的PCR條件可根據經驗確定。一些參數影響反應的成功。這些參數是退火溫度和時間、延伸時間、Mg2+和ATP濃度、pH、和引物、模扳及脫氧核糖核苷酸的相對濃度。示範引物(如寡核苷酸引物)描述於下面的實施例中。擴增後，可通過瓊脂糖凝膠電泳接著用溴化乙錠染色和紫外照射目視來檢測所得片段。另一種獲得多核苷酸的方法是，例如酶消化。所需載體的組成可以任何合適方向和/或構型建立。
2D.將核酸導入靶細胞的方法將核酸導入細胞(或細胞的原生質體，如弱化或去除酵母或植物細胞壁)的方法對本領域技術人員已知，包括但不限於下列各項脂質-介導轉移(如用脂質體，包括中性和陽離子脂質)、直接注射(微注射)、細胞融合、微粒轟擊(例如生物射彈方法，如DNA粒子轟擊)、共沉澱(如用磷酸鈣或乙酸鋰)、DEAE-葡聚糖-或聚乙二醇-介導轉移和病毒載體-介導轉移。
轉化方法的選擇通常取決於細胞類型和可用於該方法的核酸的量。轉化後細胞可以促進篩選光產生的密度平板培養。細胞可以一些密度平板培養，例如通過製備一系列轉化細胞群體的稀釋度。細胞平板培養密度根據細胞類型不同；然而初始篩選一般優選高密度平板培養以提高在用轉化方法處理的細胞群體中檢測轉化細胞的可能性。
本領域的普通技術人員可應用本發明以光為基礎的篩選方法，結合本文給出的指導使用任何選擇的轉化方法。
3.在細胞培養中評估發光多肽序列如上面和實施例中所述的發光蛋白編碼序列構建物可用於轉化多種宿主細胞和分析成功的轉化。合適宿主細胞包括但不限於真核生物(例如酵母，如白色念珠菌和酵母屬)；植物細胞；哺乳動物細胞(如BHK、VERO、HT1080、293、RD、COS-7或CHO細胞)；組織特異性細胞；腫瘤細胞；昆蟲細胞；原核生物如革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和其它不包括在前面分類的屬(如立克次氏體屬spp.；羅卡利馬氏體屬spp.；考克斯氏體屬spp.；密螺旋體屬spp.，包括引起梅毒的梅毒密螺旋體；枝原體屬spp.和衣原體屬spp.)。
關於革蘭氏陰性宿主細胞，本發明的構建物可用來轉化生物體包括但不限於下列各項梭菌屬spp.、弧菌屬spp.、布魯氏菌spp.、博德特氏菌屬spp.、彎曲桿菌屬spp.、假單胞菌屬spp.、埃希氏菌屬spp.、腸桿菌屬spp.、克雷伯氏菌屬spp.、沙雷氏菌屬spp.、檸檬酸細菌屬spp.、變形桿菌屬spp.、沙門氏菌屬spp.、志賀氏菌屬spp.和耶爾森氏菌屬spp.。
關於革蘭氏陽性宿主細胞，本發明的構建物可用來轉化生物體包括但不限於下列各項
革蘭氏陽性球菌家族微球菌利(微球菌spp.、口腔球菌屬spp.、動性球菌屬spp.和葡萄球菌屬spp.)、異常球菌科(異常球菌屬spp.)成員和其它球菌屬的種類包括鏈球菌屬spp(如化膿溶血鏈球菌spp.、口腔鏈球菌spp.、腸球菌spp.、乳酸鏈球菌spp.、厭氧鏈球菌spp.和其它鏈球菌種)；明串珠菌屬spp.、片球菌屬spp.、氣球菌屬spp.、孿生球菌屬spp.、消化球菌屬spp.、消化鏈球菌屬spp.、瘤胃球菌屬spp.、糞球菌屬(Coprococcus)spp.和八疊球菌屬的種。
形成內生孢子的革蘭氏陽性桿菌和球菌包括芽孢桿菌屬spp.、芽孢乳桿菌屬spp.、梭菌屬spp.、脫硫腸狀菌屬spp.、芽孢八疊球菌屬spp.和顫螺菌屬種。
規則、非芽孢的革蘭氏陽性桿菌包括乳酸菌屬spp.、李斯特氏菌屬spp.(包括在食品、飲用水中和食品製劑表面上作為汙染物發現的致病種單核細胞增生李斯特氏菌、丹毒絲菌屬spp.、索絲菌屬(Brochothrix)spp.、腎桿菌屬spp.、庫特氏菌屬spp.和顯核菌屬的種。
不規則、非芽孢的革蘭氏陽性桿菌包括棒狀桿菌屬(包括棒狀桿菌的植物致病種，加德納氏菌屬spp.、隱秘桿菌屬spp.、節桿菌屬spp.、短桿菌屬(Brevibacterium)spp.、短小桿菌屬spp.、乳酪桿菌屬spp.、微桿菌屬(Microbacterium)spp.、金桿菌屬(Aureobacterium)spp.、纖維單孢菌屬spp.、壤黴菌屬(Agromyces)spp.、球網菌屬spp.、羅氏菌屬spp.、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)spp.、真桿菌屬spp.、醋桿菌屬spp.、毛螺菌屬spp.、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)spp.、好熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)spp.、放線菌屬spp.和雙岐桿菌屬的種。
分枝桿菌科家族的生物體，即分枝桿菌屬spp.。
諾卡氏菌形包括諾卡氏菌屬spp.、紅球菌屬(Rhodococcus)spp.、類諾卡氏菌屬spp.、假諾卡氏菌屬spp.、厄氏菌屬spp.、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)spp.、小多孢菌屬(Micropolyspora)spp.、原小單孢菌屬spp.和間孢囊菌屬的種。
特別感興趣的生物體包括梭菌屬spp.、弧菌屬spp.、布魯氏菌屬spp.、博德特氏菌屬spp.、彎曲桿菌屬spp.、假單胞菌屬spp.、埃希氏菌屬spp.、腸桿菌屬spp.、克雷伯氏菌屬spp.、沙雷氏菌屬spp.、檸檬酸桿菌屬spp.、變形桿菌屬spp.、沙門氏菌屬spp.、志賀氏菌屬spp.和耶爾森氏菌屬spp.。
原核細胞和真核細胞的轉化方法在本領域已知(如Sambrook等)，包括但不限於磷酸鈣沉澱、顯微注射或電穿孔。含合適調節元件和多克隆位點的載體可廣泛地在市場上購得(如Stratagene，La Jolla，Calif.；Clontech，Palo Alto，Calif.)且可用作主鏈載體來攜帶發光蛋白編碼序列。
如上所述，本文所述的一些表達盒需要加入外源底物用於產生光(如luc和luxAB表達盒)。在本發明的一個實施方案中，底物是醛。當給予細胞時，醛可作為蒸氣應用於培養基周圍空氣中或者作為液體或固體直接用於培養基。
檢測和量化光產生用例如強化的光子計數照相機(HamamatsuPhotonics2400-32型)完成。具體有助於用本發明方法產生篩選的轉化子的一個系統是Xenogen公司的IVISTM成像系統(Alameda，CA)。IVISTM成像系統包括一個高度敏感的照相機(如冷卻的積分照相機(Roper Scientific LN/CCD 1300-EB/1型；Spectral Instruments 620型冷卻的CCD照相機，從SpectralInstruments，Inc.，Tucson，Arizona)購得、一個特別設計的成像室和運行它的軟體。此外，LivingImageTM軟體分析、建立和存儲數據。系統組成的標準說明如表1各項。
表1

多個發光蛋白編碼序列可用本文所述構建物和方法摻入單個生物體中。在一個實施方案中，各盒可編碼發光多肽，這些多肽在相對彼此不同的特徵波長發射光。另外，可使用一些攜帶發光多肽的盒，多肽在特徵波長發射光。盒的組合包括發光蛋白編碼序列，有多種這類在不同特徵波長發射光的發光多肽的混合物，盒的組合可根據本說明書的講授來構建。
4.動物中螢光素酶表達載體的評估除了本發明用於轉化選擇細胞或細胞類型的構建物和方法外，攜帶包括發光蛋白編碼序列的構建物的微生物對在整個動物中非侵襲性成像有用。在整個動物中非侵襲性成像描述於Contag等.共同擁有的美國專利號5,650,135(也參見Contag等.，(1998)Nature Medicine 4(2)245-247；Contag等.，(1996)OSA TopsonBiomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics的3220-224；Contag等.，(1997)Photochemistry and Photobiology，66(4)523-531；和Contag等.，(1995)Mol.Microbiol.18593-603)。
在成像方法中，偶聯物含生物相容實體(如攜帶本發明構建物的轉化細菌整合到其基因組中)和產光部分(如螢光素酶)。光發射偶聯物一般通過多種方法之一給予受試者，可在受試者中定位並成像。由於成像或測量受試者的光子發射可持續至幾十分鐘，受試者在成像過程中通常但未必固定。
光發射實體的成像包括使用能檢測非常低水平光的光檢測器-通常是單個光子-和結合光子發射，直到可構建出圖像。這種敏感光檢測器的例子包括在單個光子被照相機檢測前強化單個光子的裝置，照相機(例如用液氮冷卻)能在檢測系統內在的背景噪聲上檢測單個光子。
一旦產生光子發射圖像，它通常表現為疊加在受試者「照相」反射光圖像上的偽彩色圖像，以提供發射光子來源的參考框架(即根據受試者定位光發射偶聯物)。然後分析這種「合成」圖像以確定受試者中報導基因的位置和/或表達水平。
4A.動物感染本文所述盒對在動物中評估各種原核和真核細胞有用。例如，所述盒可整合到致病生物(如假絲酵母、革蘭氏陽性菌等)的基因組中並隨後導入整個動物中。接著動物可用於進行體內感染過程並評估潛在的抗感染藥物抑制感染的效率，如新的抗生素。因此，一方面，本文所述表達盒對非侵襲性成像和/或檢測哺乳動物受試者(如用攜帶螢光素酶表達盒的細菌或真菌細胞感染)中的光發射偶聯物有用。轉化細胞可給予受試者這樣它們定位於細胞或組織類型。另外，可給予轉化細胞使它們均一地分布在受試者中。
4B.底物給予如上所述，本文所述的一些表達盒需要加入外源底物(如螢光素)用於產生光(如luc和luxAB表達盒)。在本發明的一個實施方案中，底物是醛。底物也可給予整個動物。可根據經驗確定各試驗動物系構建的適當底物濃度。底物(通常是螢光素)可在給予感興趣的分析物前、同時、或之後給予。底物的給予途徑可如分析物所述的途徑。底物給予的優選途徑包括但不限於靜脈內或局部給予或者通過在空氣中提供底物，例如作為一種蒸汽提供。
5.本發明構建物的使用一方面，本發明針對含啟動子或不含啟動子的發光蛋白編碼序列構建物用作各種細胞類型的轉化載體。本發明可鑑定本發明構建物成功地導入其中的細胞。本文所述此方法使用光產生作為轉化的報導基因，尤其是用於轉化的細胞類型沒有已知的可選擇標記可用，例如抗生素抗性細菌、沒有營養缺陷型標記的酵母。本發明的轉化方法包括下列步驟。首先製備所需靶細胞的細胞群體，然後用發光蛋白編碼序列轉化細胞，轉化用本領域已知的方法，例如(鈣沉澱；聚乙二醇沉澱；乙酸鋰/聚乙二醇轉化，Braun和Johoson(1997)Science 277(5322)105-9；和電穿孔，De Backer，Maes等.，(1999)Yeast 15(15)1609-18)。鑑定具有吸收發光蛋白編碼序列構建物並表達發光蛋白的細胞，例如用成像系統。通常進一步純化轉化細胞以產生轉化細胞的基本上純的培養物，例如通過稀釋平板或單菌落劃線。
在本發明的一方面中，使用無啟動子的發光蛋白編碼序列構建物。在此情況中，發光蛋白編碼序列的表達通常取決於整合到靶細胞基因組中，最普遍的整合是鄰近靶細胞中活性轉錄控制元件。
在本發明的另一方面中，使用含啟動子的發光蛋白編碼序列構建物。在此情況中，發光蛋白編碼序列可整合到靶細胞的基因組中或在質粒上進行(或其它附加體或染色體外載體)。
本發明的盒在多種應用中有用。例如，它們可結合感興趣的基因或核酸序列用於測定靶細胞是否轉化感興趣的基因或核酸序列。換句話說，光用作為指示成功的靶細胞轉化(如致病生物)的指示器，這是通過例如電穿孔或者噬菌體-介導的轉導或接合。這在不能使用可選擇標記(如藥物抗性)的細胞中特別有用，可選擇標記通常用於分析轉化。
也可使用轉化子來鑑定有效的藥劑和確定它們的作用點。分離出成功轉化的靶細胞後，靶細胞可然後用於感染多組實驗動物，每組含一個或多個感興趣的基因或核酸序列和/或活性啟動子。然後用感興趣的藥劑處理組，監控實驗動物和感染、未處理對照動物的光產生。有效抑制轉錄和/或翻譯(直接或間接)或幹擾轉化細胞發揮正常功能能力的試劑抑制處理的實驗動物中的光產生，而在相應感染的未處理對照動物中觀察到光產生。另外，也可鑑定提高光產生的化合物。
如本發明講授的修飾產生光的生物體可用來監控微生物的存在，例如在感染、食品、飲用水中和食品製劑表面上監控。
具體來說，本發明的方法對核酸(如DNA)導入細胞中有用，在這些細胞中選擇轉化子是困難的，例如致病真核生物(如假絲酵母)和抗生素抗性細菌，包括但不限於醫院病原體(如二甲氧基苯青黴素抗性菌株金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和其它抗生素抗性腸球菌)。
下面是產生本發明的具體實施方案的例子。提供這些例子僅用於說明目的，不想以任何方式限制本發明的範圍。
材料和方法除非另有說明，細胞、蛋白質和核酸(如DNA)的操作用標準方法進行，方法描述於如Sambrook，等.，和Ausubel，F.M.等.，《新編分子生物》(CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John Wiley和Sons，Inc.，Media，PA(1995)。除非另有說明，限制性酶從New England Biolabs獲得，修飾酶從Promega或Boehringer Mannheim獲得，其它實驗室化學品從Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)獲得。
我們努力確保所用數字(如量、溫度等)的準確性，但當然應該允許一些實驗誤差和偏差。
在外源醛存在的情況下體外篩選在不含luxCDE基因的細菌平板或培養物成像前加入外源醛底物。對於平板成像，n-癸醛(癸醛；Sigma Chemical Company)鋪在覆蓋平板的蓋的內表面上，平板含待成像的細菌(「醛蒸汽成像」)，然後平板用強化的CCD照相機(HamamatsuPhotonics 2400-32型)成像，如美國專利5,650,135所述。對於液體培養物成像，加入1μl的1％癸醛溶液(在50％乙醇中)到1ml的適當10倍稀釋的培養物中。
製備DNA和克隆除非另有說明，用一種或多種限制性內切酶消化後，DNA樣品加熱到85℃，15分鐘以使限制性酶失活。連接在16℃過夜進行。
轉化細菌細胞製備感受態細胞。除非另有說明，細菌細胞轉化如下。細菌培養物在LB中生長過夜。用5ml的各培養物接種新鮮的500ml LB。這些培養物在37℃振搖直到O.D(600nm)達到約0.6。然後細胞在冰上冷卻30分鐘，然後3000xg、4℃離心10分鐘收集。細胞重懸浮在50ml冷的0.5M蔗糖(金黃色葡萄球菌)或ddH2O(大腸桿菌)中，隨後再離心並再懸浮在5ml冷的0.5M蔗糖(金黃色葡萄球菌)或ddH2O(大腸桿菌)中。在此階段，細胞在冰上放置30分鐘，然後再離心並再懸浮在5ml冷的10％甘油中。冷凍各細胞類型的等分樣品並保存在-80℃。
電穿孔。質粒DNA用Qiagen柱純化、透析、用「Gene Pulser」(BioRad)電穿孔到感受態細胞中。設置是25μF、2.5kV，100ohms電阻用於金黃色葡萄球菌或400ohm電阻用於大腸桿菌和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)。細胞在37℃1ml的培養基中復原2小時，然後鋪在含必需的選擇抗生素的合適瓊脂上。
樣品成像樣品成像基本上如Contag，等描述.，美國專利5,650,135，具有較小修改如以下所述。
在支持本發明所進行的實驗中(下面詳述)，樣品產生光的量用強化的光子計數照相機(Hamamatsu Photonics 2400-32型)或冷卻的集成照相機量化。關於冷卻的積分類型照相機，所用的具體儀器選自三種製造/型號(1)PrincetonInstruments LN/CCD 1340-1300-EB/1型；(2)Roper LN-1300EB型冷卻的CCD照相機(購自Roper Scientific，Inc.，Tucson，Arizona)；和(3)Spectral Instruments600型或620型冷卻的CCD照相機(購自Spectral Instruments，Inc.，Tucson，Arizona)。優選設備分別是Hamamatsu Photonics照相機編號XEN-3和Princeton Instruments照相機編號XEN-5，兩者位於Xenogen公司，Alameda，California。兩種照相機類型都使用電荷-偶聯裝置列(CCD列)來產生與各選擇單位區域光子數目成比例的信號。選擇單位區域可以小到由單個CCD像素檢測，或如果使用重新分級(binning)，由任何選擇的像素組檢測。信號可任選地通過一個圖像處理器，如來自Hamamatsu Photonics的Argus，然後發送給計算機(運行Windows NT的個人計算機(Dell Computer公司；Microsoft公司，Redmond，WA)或運行圖像處理軟體應用的Macintosh(Apple Computer，Cupertino，CA)，如「LivingImage」(Xenogen公司，Alameda，CA)。軟體和/或圖像處理器用於獲得圖像，作為計算機數據檔案保存。數據一般採用(x，y，z)值形式，其中x和y代表信息收集的點或區域的空間坐標，z代表點或區域的信號量，以「相對光單位」(RLUs)表示。
為有利於判讀，數據通常顯示為「偽彩色」圖像，其中色譜用於表示具體點的z值(信號量)。此外，偽彩色信號圖像通常疊加在反射光或「照相」圖像上以提供參考的框架。
將會意識到如果信號在用穩定光-發射標準校準的照相機(購自，如Xenogen公司)上獲得較佳，任何照相機的RLU信號值可與任何其它用相同光-發射標準校準的照相機的RLUs比較。此外，校準用於絕對光子通量(單位時間發射自單位區域的光子)光-發射標準後，本領域技術人員可將任何這種照相機的RLU值轉換成光子通量值，然後可估計每單位時間樣品中轉化細胞發射的光子量。
用96-孔微量滴定板量化光輸出通過平板稀釋溶液到96-孔板的孔中定量溶液中細胞產生光的量，如上所述在Xen-3照相機中成像平板。然後使用LivingImage軟體在各圖像區域周圍疊加定義的邊界，顯示與來自具體孔的光相應的信號。然後量化來自各個這些區域的信號，信號作為各孔的單一RLU值表示。這些RLUs用於下面詳述的一些研究中，包括實施例13、14和15。
實施例1構建革蘭氏陽性lux轉座子Tn4001 luxABCDE kmRluxABCDE kmR構建如下來自pDL289(Buckley，N.D.等.(1995)J.Bacteriol.1775028-5034)的革蘭氏陽性卡那黴素盒用引物KanF2(5』-CTG TAGACT CGA GGA GGG AAA TAA TAA ATG GC；SEQ ID NO1；粗體字母代表XhoI位點)和KanR2(5』-CAG AGT GTC GAC AGT TGC GGA TGT AC；SEQ ID NO2；粗體字母代表SalI位點)PCR擴增。擴增用30個在90℃15秒、50℃30秒和72℃2分鐘的加熱/冷卻循環進行。
所得擴增產物提供了一個無啟動子的kmR抗生素抗性基因。擴增產物然後用XhoI/SalI切割並連接到pSK-luxABCDE質粒構建物的SalI位點中(更多關於質粒構建的細節參見共同待批和共同擁有的申請美國序列號09/657,289)，SalI位點直接在luxABCDE盒的下遊。
pSK luxABCDE kmR質粒構建物電穿孔到大腸桿菌DH5α細胞中，且轉化細胞鋪在含25μg/ml卡那黴素的LB平板上。37℃培養過夜後，用光子計數CCD照相機(Hamamatsu Photonics，Shizuoka具，Japan；2400-32型)篩選所得轉化株的光產生(參見材料和方法)。大腸桿菌(革蘭氏陰性)中卡那黴素和生物發光的表達都由pBluescript II SK+或SK-載體主鏈中發現的lacZ啟動子介導。DNA從生物發光菌落中製備。卡那黴素盒(即編碼序列)相對於luxABCDE編碼序列的正確方向通過用限制性酶消化具有SalI的DNA和分析所得限制性圖式來確定。
為構建含lux和kmR基因的Tn4001盒，luxABCDE kmR盒從pSK luxABCDE kmR構建物中切除，用SpeI/SalI如上製備。片斷末段用核苷酸補平以產生平端分子。這些分子連接到質粒pMGC57(Lyon等.(1998)EMBO J.176263-6275)的EcoRV位點中且構建物電穿孔到DH5α細胞中。轉化細菌鋪在含15μg/ml氯黴素的LB平板上。篩選所得轉化子的光產生、氯黴素-抗性(CmR)和卡那黴素-抗性(KanR)。DNA從產光、CmR、KanR菌落中製備。luxABCDEkmR盒的正確方向，即luxA序列5』端定位相對於Tn4001轉座子5』端，通過限制性消化(XhoI/NdeI和XhoI/EcoRV)和限制性圖式分析以及PCR分析DNA來證實。PCR用引物MGC-CAT-F1(5』-GGT GTC CCTGTT GAT ACC G-3』，SEQ ID NO3)和LuxA-Rev(5』-CCA CAC TCC TCA GAG ATG CG-3』，SEQ ID NO4)在同上詳述的條件下進行。用片斷大小鑑定正確的方向。
實施例2Tn4001 luxABCDE kmR穿梭載體構建物的構建A.構建pAUL-A Tn4001 luxABCDE kmR穿梭載體含lux和kmR基因的Tn4001盒(命名為IR luxABCDE kmRtnp IR，其中IR代表反向重複，tnp代表編碼Tn4001轉座酶的基因)插入廣範圍穿梭載體中，載體具有革蘭氏陰性複製起點和革蘭氏陽性複製起點(組成型或條件型，如溫度敏感)。這種穿梭載體的一個例子是pAUL-A載體(Chakraborty，等.(1992)J.Bacteriol.174568-574)，它含有在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中都有功能的紅黴素抗性基因。此載體含革蘭氏陰性複製起點和溫度敏感pE194革蘭氏陽性複製起點。
本發明轉座子盒的圖示如下。反向重複(IR)一般指示轉座因子的末端。相應地，轉座子的名稱是IR-tnp-IR，其中tnp代表編碼轉座酶的基因。更多的因子可加入轉座子中並類似的表示，如luxABCDE kmR盒的加入圖示為IR luxABCDE kmRtnp IR。
IR luxABCDE kmRtnp IR盒用酶EcoRI/XhoI從pMGC57中切除並連接到pAUL-A穿梭載體的EcoRI/SalI位點中以產生穿梭載體構建物pAUL-A Tn4001 luxABCDEkmR。
通過電穿孔用穿梭載體構建物轉化大腸桿菌(DH5α)，鋪在含濃度為150μg/ml紅黴素的LB平板上，37℃培養過夜。篩選所得轉化子的光產生、紅黴素抗性(EmR)和卡那黴素抗性(KanR)。然後從產光、ErR、KanR菌落中分離質粒DNA。
B.構建pSK Tn4001 luxABCDE kmRpE194穿梭載體除了用pAUL-A作為Tn4001 luxABCDE構建物的傳遞系統，質粒pSK和pE194可組合使用。
Tn4001盒從pMGC57移入pSK如下Tn4001盒用XhoI/PstI從pMGC57切割並與類似酶切的pSK連接。此連接電穿孔到感受態大腸桿菌DH5α中，轉化子在含100μg/ml氨苄青黴素、IPTG、X-gal的LB上選擇。通過PCR篩選白色菌落，PCR使用的引物包括來自Tn4001轉座酶基因的序列。PCR指示為陽性的菌落是預製備質粒，且這些DNA用XhoI/PstI切割以確定它們含正確大小的片斷。
luxABCDE kmR盒然後移入pSK Tn4001這樣它位於兩個IR序列間。首先，氨苄青黴素盒用酶AhdI/KpnI從pSK luxABCDE kmR去除(為了協助隨後克隆lux盒到pSK Tn4001中)。然後luxABCDE kmR盒用BamHI/XhoI從氨苄青黴素缺失的pSK主鏈中切除。接著pSK Tn4001 DNA用EcoRV切割並與平端luxABCDE kmR盒連接。
連接電穿孔到感受態大腸桿菌DH5α中，轉化子在含100μg/ml氨苄青黴素的LB上選擇。光轉化子斑點在氯黴素或卡那黴素上。陽性克隆的正確方向通過PCR確定，PCR使用引物M13F和LuxA-R。
其次，pSK Tn4001 luxABCDE kmR用SacI線性化且是平端。最後，此DNA與平端ClaI-酶切的pE194連接，得到pSK Tn4001 luxABCDE kmR pE194穿梭載體構建物。
此構建物電穿孔到感受態大腸桿菌DH5α中。轉化子在含150μg/ml紅黴素的LB上選擇。然後所得光克隆斑點在含100μg/ml氨苄青黴素的LB和含50μg/ml卡那黴素或15μg/ml氯黴素的LB上。
C.構建pE194 Tn4001 pSK luxABCDE kmR穿梭載體構建Tn4001 luxABCDE kmR穿梭載體，其中革蘭氏陰性起點位於兩個IR序列的內部。首先，含質粒pMGC57的革蘭氏陰性Tn4001與革蘭氏陽性紅黴素抗性質粒pE194融合。pMGC57用PstI/BamHI切割且是平端。同時pE194用ClaI切割且是平端。然後連接這兩個線性質粒，且此混合物電穿孔到感受態大腸桿菌DH5α中，轉化子在含150μg/ml紅黴素的LB上選擇。
第二，氯黴素抗性盒和革蘭氏陰性起點從pMGC57/pE194組合物中去除。從上述一些紅黴素抗性菌落中純化的質粒DNA用KpnI/XhoI切割(氯黴素抗性盒和革蘭氏陰性起點的側翼位置)，且各消化物的部分在瓊脂糖凝膠上展開以鑑定正確大小的質粒。然後大小似乎正確的質粒消化的剩餘物是平端的並連接。此連接電穿孔到金黃色葡萄球菌N4220中，並鋪在含0.3μg/ml紅黴素的巧克力瓊脂上。
最後，將pSK luxABCDE km質粒導入Tn4001的IR中。質粒DNA從10個pMGC57/pE194 ori cmR金黃色葡萄球菌克隆中純化，質粒DNA用EcoRV切割且各消化物的部分在瓊脂糖凝膠上展開以鑑定正確大小的質粒。然後顯示正確大小(約6kb)的質粒消化的剩餘物與平端BamHI切割的pSK luxABCDE kmDNA連接。此連接電穿孔到DH5α中，且轉化子在含150μg/ml紅黴素的LB上選擇。然後生物發光菌落以雙份斑點在含50μg/ml卡那黴素或100μg/ml氨卡青黴素的LB平板上以確定後一個抗生素盒的活性。由於pSK luxABCDE km以正確方向連接到前一個質粒的概率應為約50％，所以判定這種變體可通過金黃色葡萄球菌中的表型鑑定(只有以正確方向具有lux的質粒轉座作用後產生生物發光)。
實施例3高密度篩選生物發光轉座體除了使用選擇性培養基，生物發光菌落以高密度從鋪在固體培養基上的菌落中分離，用眼檢測和手工分離。
金黃色葡萄球菌8325-4細胞用pE194 Tn4001 luxABCDE轉化，以每平板104到105細胞的密度鋪在固體非選擇性培養基平板上，37℃生長過夜。用ICCD照相機檢測強生物發光的單菌落，用一次性微量移液管頭挑出那些菌落；所需菌落的發光表型用照相機確定。菌落用於接種一體積的液體生長培養基，然後在新鮮培養基平板上劃線。平板在37℃過夜培養。重複過程直到確定分離到純菌落，是通過觀察到劃線平板上單菌落中基本上一致的光強度確定的。
前述示範的方法避免需要抗生素選擇作為分離感興趣生物的方法，這些生物用本發明的轉座子盒轉化。
實施例4構建用於白色念珠菌的整合基因組靶載體，轉化和篩選白色念珠菌，使用轉化的菌株A.載體構建為了在白色念珠菌中表達螢光素酶，螢光素酶基因可讀框(ORF)中的CTG密碼子改變如下。首先，pGL2-Basic中的螢光素酶基因切成兩段以促進所有九個CTG密碼子突變成TTG密碼子。一個片斷含四個CTG密碼子且另一個含五個CTG密碼子。這些分別克隆到pBluescript II KS(+)中。用QuikChangeTM定點突變試劑盒(Stratagene)改變密碼子。每個突變步驟後，測序產物以確定摻入所需突變。
簡言之，含Photinus pyralis螢光素酶基因的質粒pGL2-Basic(Promega)用XbaI和EcoRI限制性酶切，含四個螢光素酶基因可讀框中CTG密碼子的540bp片斷被克隆到pBluescript II KS(+)(Stratagene)中。含另外五個CTG密碼子的第二個751bpEcoRI-EcoRV片斷單獨克隆到pBluescript II KS(+)中。這九個CTG密碼子用QuikChangeTM定點突變試劑盒(Stratagene)突變成TTG。構建互補引物對和定點突變試劑盒一起使用。圖1顯示用於定點突變螢光素酶的互補寡核苷酸對。這些寡核苷酸用於通過定點突變使沉默突變摻入質粒pGL2-Basic的Photinuspyralis螢光素酶基因中。粗體突出的寡核苷酸是從CTG變成TTG所需的變化。有下劃線的核苷的是引物穩定所需的鹼基變化。這些變化不影響蛋白質的胺基酸序列。此外，對於引物RR45T和RR45B，兩個CTG到TTG的突變足夠接近這樣兩者在一個反應中摻入。
突變所有九個密碼子後，含突變的XbaI-EcoRI和EcoRI-EcoRV片斷從pBluescript II KS(+)中切除，並克隆回pGL2-Basic中以產生pLucT9。
除了修飾螢光素酶密碼子，也製備構建物以來包括啟動子和聚腺苷酸化信號，兩者均衍生自假絲酵母。為此，pBluescript II KS+用NotI切割，補平末端，磷酸化的AscI接頭(5』-AGGCGCGCCT-3』；SEQ ID NO21)連接到平端位點以產生pBS-ASC。含九個TTG密碼子的螢光素酶可讀框通過PCR從pLucT9擴增，PCR用引物LUCB和LUCP(圖2A)，生成的產物含側翼直接有BamHI和PstI位點的修飾螢光素酶可讀框。擴增產物用BamHI和PstI限制性酶切並克隆到pBS-ASC中以產生質粒pBS-L。白色念珠菌肌動蛋白(ACT1)基因的轉錄終止區域(Delbruck和Ernst(1993)Mol Microbiol 10(4)859-66)用引物ACT-TP和ACT-TH(圖2A)通過PCR從CAI4基因組DNA擴增，用PstI和HindIII切割，並連接到pBS-L中以產生pBS-LA。
白色念珠菌烯醇酶基因(ENO1)的啟動子(Sundstrom和Aliaga(1992)JBacteriol 174(21)6789-99)用引物ENOA和ENOB(圖2A)通過PCR從白色念珠菌菌株CAI4 DNA擴增。選擇ENO1啟動子是因為它顯示有不可調節的組成型表達(Postlethwait和Sundstrom(1995)J Bacteriol 177(7)1772-9)。
擴增的PCR產物用AscI和BamHI切割並克隆到用相同限制性酶切的pBS-LA中以產生pBS-ELA。因此，融合ENO1啟動子以通過立即插入螢光素酶起始密碼子上遊的BamHI位點來改變螢光素酶可讀框。PstI位點立即置於螢光素酶基因的終止密碼子後。
pBluescript II KS(+)從NotI位點到XhoI位點的多克隆位點用含限制性酶位點NotI、AscI、HindIII、FseI、SbfI和XhoI的合成接頭置換(圖2A；合成接頭A，SEQ ID NO34；合成接頭B，SEQ ID NO35；和圖2C顯示這兩種合成接頭的互補對)以產生pBS-NX。啟動子-螢光素酶-終止子盒用AscI和HindIII從pBS-ELA中切除，並克隆到pBS-NX中以產生pNX-ELA。用引物URAH和URAF(圖2A)通過PCR從白色念珠菌-大腸桿菌穿梭質粒pRC2312(Cannon(1992)，同上)擴增URA3基因。擴增的產物用HindIII和FseI切割並連接到pNX-ELA中以產生pNX-ELAU。
對於ura3∷imm434/ura3∷imm434 CAI4菌株中的中間試驗，靶載體包含完整白色念珠菌URA3基因，URA3基因使細胞恢復尿嘧啶原養型。在高密度篩選中(見下)，URA3功能的選擇不用臨床分離菌ATCC 32032、10261和90234進行。
所有質粒分離和酶反應在標準條件下(Ausubel，同上；Sambrook，同上)或根據生產商的說明書進行。所有連接電穿孔到大腸桿菌菌株DH5α(LifeTechnologies，RockvilleMD)中，並在每ml含100μg氨苄青黴素的Luria-Bertani(LB)培養基中生長。PCR用GeneampPCR系統9700自動熱循環儀(AppliedBiosystems)進行。反應在薄壁200μl的PCR管中以50μl體積進行，50μl體積中含25μl pmole的各寡核苷酸引物(Operon)、5μl的10×PCR緩衝液(和Taq DNA聚合酶一起提供；Life Technologies)、2mM MgCl2、0.2mM的各脫氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP；Amersham)、1U的Taq DNA聚合酶(Life Technologies)和1ng的模板DNA。擴增在下列條件下進行於94℃30秒、50℃30秒、72℃1-2分鐘的40個循環(取決於產物的預期大小)和72℃5分鐘的最後延伸步驟。在PCR產物的限制前，反應混合物通過旋轉柱(PCR純化試劑盒；Qiagen)。
也選擇白色念珠菌靶序列並插入載體中。構建靶載體時，六個含白色念珠菌基因組DNA的粘粒序列從GenBank下載(登記號AL033501、AL033497、AL033503、AL033502、AL033396和AL033391)。從序列數據註解推定的可讀框用DNA構建試劑盒2TM(Textco，West Lebanon，NH)繪圖。檢測不含任何推定可讀框的一些約3kb的區域的重複假絲酵母序列(Chibana，Magee，等.，(1998)Genetics 149(4)1739-52)或與其它可能可讀框(ORFs)同源的序列。不含任何推定可讀框的大區域(~3kb)被分成500bp部分且各部分用於那時所有已知的假絲酵母序列的blast搜索(Altschul，S.F.等.，(1990)J Mol Biol 215(3)403-10；Altschul，S.F.等.，(1997)Nucleic Acis Res.25(17)3389-3402)(Stanford DNA測序和技術中心網址在http//www-sequence.stanfod.edu/group/candida.)與已知基因或重複序列顯著同源的區域從考慮中去除。選擇粘粒CA41C10(GenBank登記號AL033501)中從核苷酸2356到5858的區域。在此3502bp區域中，第一個和最後一個1000bp從考慮中去除以致不包括任何可存在於鄰近可讀框的啟動子。所選用於載體的5』和3』靶區域的片斷是由在假絲酵母基因組中的125bp分離的。所用菌株的基因組靶區域從PCR產物中測序，PCR產物擴增自基因組DNA。公布的粘粒序列中的區域和ATCC 32032相同，除了ATCC 32032在核苷酸4745有腺嘌呤殘基而不是鳥嘌呤殘基。其它三個菌株在核苷酸3942有鳥嘌呤、在核苷酸4645有胸苷和有核苷酸4007-4131的串聯重複。
選擇靶區域克隆到靶載體中，靶載體在螢光素酶表達盒和URA3基因的側翼。具體來說，CA41C10的核苷酸3852到4307用引物TAR5N和TAR5A(圖2B)通過PCR從CAI4 DNA中擴增。擴增產物用NotI和AscI切割並克隆到pNX-ELAU中以產生pNX-5ELAU。另一個從核苷酸4436到4789的區域，用引物TAR3F和TAR3S(圖2B)通過PCR從CAI4 DNA中擴增。擴增產物用FseI和SbfI切割並克隆到pNX-5ELAU中以產生pGTV-Eno。KpnI位點位於各個這些靶區域外端附近。使用構建物轉化白色念珠菌前，構建物用KpnI切割。
pGTV-ENO的構建圖示於圖3A、3B和3C。
B.轉化白色念珠菌菌株靶構建物然後用於轉化白色念珠菌，使用Braun和Johnson的方法修飾(Braun和Johnson(1997)Science 277(5322)105-9)(http//www.sacs.ucsf.edu/home/Johnson Lab/burk/burk.html)，該方法用於所有白色念珠菌轉化。100ml培養物在添加50mg/ml尿苷(Sigma)的YPD中生長，30℃過夜。過夜細胞培養物用相同的培養基稀釋並生長到OD600為1-1.5。細胞以4000rpm 5分鐘沉澱並重懸浮於20ml LATE緩衝液(100mM乙酸鋰、10mM Tris-HCl(PH7.5)、1mM EDTA)。細胞再次沉澱並重懸浮於1ml LATE緩衝液。混合100μl細胞和10μl的10mg/ml變性、剪切的鮭精DNA(Sigma)及1-10μ KpnI消化的質粒DNA。加入700μl PLATE(在LATE緩衝液中的40％聚乙二醇3350)並用微量移液管溫和混合。轉化反應在30℃溫育3小時並在42℃熱激45分鐘。沉澱細胞並重懸浮於400μl YPD中，鋪在含螢光素的非選擇性培養基上。
白色念珠菌CAI4(ura3∷imm434/ura3∷imm434)(Fonzi和Irwin(1993)Genetics 134(3)717-28)由美國明尼蘇達大學Judith Berman博士友情提供。白色念珠菌菌株ATCC 32032、10261和90234獲得自美國模式培養物保藏所(Manassas，VA)。YPD培養基(Qbiogene，Carlsbad，CA)含2％(w/v)蛋白腖、1％(w/v)酵母膏和2％(w/v)葡萄糖。合成的已知成分(SD)(Qbiogene)培養基含0.17％(w/v)沒有胺基酸的酵母氮鹼基、0.5％(w/v)硫酸銨、2％(w/v)葡萄糖和0.077％(w/v)沒有尿嘧啶的完全補充混合物(CSM-ura)。CSM-ura的配方組成以mg/L給出如下腺嘌呤10；L-精氨酸50；L-天冬氨酸80；L-組氨酸-HCl 20；L-異亮氨酸50；L-亮氨酸100；L-賴氨酸50；L-甲硫氨酸20；L-苯丙氨酸50；L-蘇氨酸100；L-色氨酸50；L-酪氨酸50；和纈氨酸140；總共770mg。加入770mg(.77g)此粉末到1L的SD中以產生SD-ura。為在平板上生長，加入瓊脂(Difco，BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)至1.5％(w/v)。
C.高密度篩選為了高密度篩選，轉化細胞用線性化的pGTV-Eno構建物轉化，且轉化細胞重懸浮於1ml YPD中，鋪在20個140mm補充50μg/ml尿苷的SD-ura平板上，平板含600μg/ml螢光素(Biosynth，Naperville，IL)(以約2.5×105細胞/平板的密度)，30℃生長過夜。鋪在此培養基上提供更好的光產生(相對於細胞鋪在YPD培養基上)。所用培養基允許未轉化和類似的轉化細胞生長，因此不提供選擇性壓力。結果，一菌苔細胞在各平板上生長。
第二天早上平板在IVISTM成像系統上成像5分鐘，使用IVISTM成像系統(Xenogen公司)。使用LivingImageTM軟體(Xenogen公司，Alameda，CA)來獲得和分析圖像。在一些情況中，液體培養物和平板用光子計數強化的電荷偶聯裝置(ICCD)照相機(2400-32型，Hamamatsu Photonics，Bridegewater，NJ)成像。
生物發光的少量轉化細胞可在許多未轉化細胞的暗背景上檢測。在高密度平板培養中，挑出一個生物發光細胞的純菌落是困難的。因此，細胞在生物發光菌落位置上和周圍從平板中挑出，挑出的細胞轉移到1.5ml微離心管並在補充50μg/ml尿苷的SD-ura中30℃生長過夜。各管的等分樣品置於96孔微量滴定板的孔中，孔中有含600μg/ml螢光素的SD-ura。平板成像5分鐘且稀釋含生物發光細胞的培養物並鋪於補充50μg/ml尿苷的SD-ura平板上用於分離單菌落。所得生物發光細胞重複地通過且穩定沒有信號損失。此外，含構建物的假絲酵母包在靶區域整合，其生長速度與親代細胞相同。
D.DNA印跡法根據Fujimura和Sakuma從臨床酵母菌株ATCC 32032、10261和90234的轉化子分離基因組DNA(Fujimura和Sakuma(1993)Biotechniques 14(4)538-40)。基因組DNA是DNA印跡的且用跨越基因組靶區域的片斷探測。在所有三個轉化菌株中，構建物在基因組的正確位置整合。
E.陰道感染使用＞6周令的雌性BALB/c小鼠。為引起假動情期，100μl戊酸雌二醇以2mg/ml溶解於麻油，並在感染前72到96小時和之後每周一次腹膜內注射。50ml白色念珠菌菌株培養物30℃生長過夜。細胞以4,000rpm 10分鐘沉澱，重懸浮於25ml磷酸緩衝鹽水(PBS)並在10ml PBS中重複兩次。細胞然後用血細胞計數器計數並在PBS中稀釋到適當感染密度。20μl接種物(包括5×104個細胞)從移液管給予陰道腔內。動物接種後保持倒轉位置1分鐘(Romani(1991)《新編免疫學》(Current Protocols in Immunology)19.6.1-19.6.16)。在獲得第一個圖像前，接種物原位放置6小時。
例如，感染小鼠在感染後第1、2、3、5、6、7、9、13、15和21天用假絲酵母的發光菌株成像(成像通過固定小鼠和遵循本文上面所述的步驟進行，所述步驟包括給予底物)。體內的時間數列、整個鼠的圖像顯示感染的進行性進程，感染通過監控發光的假絲酵母清楚地成像。在第21天，動物安樂死並切除和檢測陰道組織。成像此組織且清楚地證明感染劑即發光的假絲酵母的存在。
立即成像前，用異氟醚麻醉小鼠5分鐘。除了上述整體成像，當各小鼠睡著時，保持倒轉位置並用100μl含16.6mg/ml螢光素和16.6mM ATP的PBS灌洗。移液管頭插入陰道腔內並排出灌洗溶液。上下吸出灌洗溶液以衝洗腔壁。灌洗後，取出大部分螢光素溶液並保存在微離心管中，留下約10-20μl剩餘在腔中。匯集和成像來自各組3隻小鼠的灌洗。在PBS中連續稀釋(10x、100x和1000x)鋪在含50mg/ml尿苷和15μg/ml氯黴素的YPD上。平板在30℃生長24-48小時並計數。用光學顯微鏡檢測獲得自灌洗的細胞的細胞形態，毒性菌絲的表明存在毒性菌絲的假絲酵母細胞。
因此，這些結果證明含螢光素酶的構建物可用作細胞中的報導基因構建物，這些細胞不適於可選擇標記。此外，這些結果證明含螢光素酶的構建物可用於高密度篩選以檢測轉化，另外可在整個動物中觀察。使用來自螢火蟲Photinuspyralis的螢光素酶基因，該基因被改編使其在白色念珠菌中表達，通過篩選光產生來分離轉化的白色念珠菌細胞，沒有使用遺傳選擇(即使用可選擇標記)。通常檢測轉化細胞的方法使用選擇，或是用由導入的DNA代替的營養缺陷，或是用藥物抗性。對於營養缺陷型突變體的替代，受體細胞必須缺少此基因。對於藥物抗性，細胞必須對此藥物敏感。然而，白色念珠菌對潮黴素、苯菌靈、放線酮、絲裂黴素C和衣黴素有抗性(Beckerman，Chibana，等.，(2001)Infect Immun 69(1)108-114)。本文所述高密度篩選不包括遺傳選擇並提供獲得轉化子的有效方法。成功的轉化以約5×10-5到10-6頻率發生(5-10個生物發光菌落/5微克酶切割DNA)，且在大大過量的非轉化細胞中檢測轉化子(即發光細胞)是沒有問題的。本文所證明成功的轉化已用來自ATCC的一些強毒株重複。
所有白色念珠菌感染的現有動物模型包括將死亡作為終點或犧牲動物、收集組織、平板培養勻漿液用於細胞計數和/或用於組織學的切片組織。這種方法一般考慮疾病過程中的單個、晚期時間點且不能在單個動物中追蹤感染進程。本發明描述的方法提供可然後在活感染動物中成像的生物發光細胞。它允許檢測感染的許多時空方面，這些用其它方法是可能的。
儘管詳述了主題發明的較佳實施方案，應理解的是可不偏離發明的精神和範圍作出明顯的變化，發明的精神和範圍如所附權利要求書所限定。
權利要求
1.一種將多核苷酸導入細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括提供細胞群體；在有利於至少一個細胞吸亞群收多核苷酸的條件下，用多核苷酸處理所述細胞群體，其中所述多核苷酸包括發光蛋白編碼序列；篩選所述細胞群體中的產光細胞；分離產生光的細胞，其中能產生光的細胞是多核苷酸導入其中的細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述發光蛋白是生物發光或螢光蛋白。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述生物發光蛋白是螢光素酶。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述細胞群體是原核細胞群體。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述原核細胞是抗生素抗性細菌。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述原核細胞是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述原核細胞是革蘭氏陽性菌。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述革蘭氏陽性菌是葡萄球菌屬。
9.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述細胞群體是真核細胞群體。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述細胞群體是酵母。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述酵母是白色念球菌。
12.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述真核細胞是哺乳動物細胞。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸包含編碼發光蛋白的無啟動子多核苷酸序列。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸包含整合載體。
15.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸包含轉座或可動遺傳元件，其中所述轉座或遺傳元件包含所述發光蛋白編碼序列。
16.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸包含啟動子可操作連接子編碼發光蛋白的所述序列。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸包含整合載體。
18.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸包含轉座或可動遺傳元件，其中所述轉座或可動遺傳元件包含所述啟動子可操作連接於所述發光蛋白編碼序列。
19.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸包含環狀質粒。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述載粒進一步包含在所述細胞的複製功能起點。
21.如權利要求1-20中任一項所述的方法，其特徵在於，所述核苷酸進一步包含第一個感興趣的編碼序列。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述第一個感興趣的編碼序列可操作連接於所述細胞中的啟動子功能。
23.如權利要求1-22中任一項所述的方法，其特徵在於，所述篩選發生在固體培養基的平板上，所述分離包括從包含產光細胞的固體培養基平板的區域中挑取細胞樣品，將所述樣品接種到液體培養物中，細胞在液體培養物中生長，測定每液體培養物等分樣品的光產生，鑑定包含產光細胞的液體培養物，稀釋並平板接種液體培養物以獲得單一產光細胞，並鑑定衍生自單一產光細胞的單一克隆。
24.一種篩選細胞群體中的轉化細胞的方法，其特徵在於，所述方法包括提供細胞群體，其中所述細胞不能產光；在有利於至少一個細胞亞群吸收多核苷酸的條件下，用多核苷酸處理所述細胞群體，其中所述多核苷酸包括發光蛋白編碼序列；篩選所述處理的細胞群體中的產光細胞，其中所述產光細胞是轉化細胞。
全文摘要
本發明提供了將多核苷酸導入靶細胞的方法，其中該方法使用發光蛋白編碼序列作為報導基因。本文所述方法的一個重要優點是可有效地轉化藥物抗性靶細胞或不具有有用的營養缺陷型標記的靶細胞。本發明也包括由本文所述方法產生的轉化細胞。還描述了發光蛋白編碼序列修飾、各種載體和使用本發明轉化細胞的方法。
文檔編號G01N33/53GK1596306SQ02808721
公開日2005年3月16日 申請日期2002年3月7日 優先權日2001年3月7日
發明者K·P·弗朗西斯, T·C·多伊爾, K·A·納沃特卡 申請人:熒合金股份有限公司