單鏈非編碼MicroRNA二及其用途的製作方法

2023-09-16 22:44:45 2

專利名稱：單鏈非編碼MicroRNA二及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種MicroRNA的B肝重症病人血漿中的表達水平及其在預測和診斷 B型肝炎重症化中的作用。
背景技術：
目前全球估計有3. 5億慢性B肝病毒(HBV)攜帶者，有三分之一的人口感染過 HBV0在我國，B型肝炎是最為嚴重、最廣泛的傳染病之一，感染率高達60%，約有1. 2億人 攜帶HBV。B型肝炎的發病率居傳染病首位，死亡數居傳染病第三位。B肝重型肝炎是一類表現為短期大量肝細胞壞死導致肝功能衰竭的綜合症，其死 亡率極高，發展迅速，兇險而且臨床預後差。並嚴重威脅人們身體健康的肝疾病，因此，早期 診斷，以便及時採取有效的治療措施尤其重要。MicroRNA是由機體內源基因轉錄的約70nt的髮夾狀結構前體(pre-MicroRNA)被 Dicer酶切割後產生的約22nt的非編碼單鏈RNA片段，在進化過程中高度保守，能通過與靶 基因mRNA特異性的鹼基互補配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，廣泛地負調控 靶基因的表達。MicroRNA作為一種新的基因幹預工具，具有高效、特異、快速等優點，為基因 調控的研究和基因治療的發展帶來了新的視角。MicroRNA非常穩定，用於臨床診斷試劑的 研發具有重複性好、容易操作等優點。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用單鏈非編碼MicroRNA 501-5P製備診 斷試劑盒以診斷重症肝炎。為了解決上述技術問題，本發明提供一種單鏈非編碼，單鏈非編碼MicroRNA 501-5P為SEQ ID NO 1所示的序列。本發明還同時提供了上述單鏈非編碼MicroRNA在製備診斷乙型重症肝炎的試劑 盒中的應用。本發明還同時提供了一種用於診斷乙型重症肝炎的試劑盒，包括PCR試劑、探針、 上遊引物和下遊引物；探針為SEQ ID NO :5所示的序列，上遊引物為SEQ ID NO :3所示的 序列，下遊引物為SEQ ID NO :4所示的序列。作為本發明的用於診斷乙型重症肝炎的試劑盒的改進PCR試劑為 IXTaqManUniversal PCR MasteMix。MicroRNA是一類高度保守的單鏈RNA(約22個核苷酸)，生物信息學分析表明， 每個microRNA可能調節數百個靶基因，提示microRNA可能參與調節細胞生命活動中眾多 的信號轉導途徑，在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應及血管生成等一系列過程中發揮作用。 另外，MicroRNA的異常表達將會導致生理的異常和疾病的產生，相反疾病的產生也將導致 MicroRNA的表達水平的改變，人們可以利用它來反映疾病的程度並做出相應的治療。MicroRNA序列測定相對簡單，通過基因工程技術可以比較容易地分離純化人類外周血中存在的MicroRNA，並對其進行測序。到目前為止已經報導了超過800個MicroRNA序 列，但是由於MicroRNA功能的複雜性，大部分MicroRNA的功能和用途仍屬未知，因此，尋找 和開發有用的MicroRNA用於臨床診斷和治療是當前研究熱點。美國應用生物系統公司根 據目前的研究現狀研發了 MicroRNA晶片(TaqMan MicroRNA Arrays)，它包含大部分已知 的MicroRNA的反轉錄引物，利用該晶片可以檢測出已知序列的這些MicroRNA表達水平的 變化情況。本發明利用該晶片對B型肝炎重症患者血漿中MicroRNA進行檢測，以正常人為 對照，對患者作一個比較全面的MicroRNA圖譜，從中找出與B型肝炎重症化病情變化密切 相關的MicroRNA分子。利用該分子可研發預測和診斷肝炎重症化診斷試劑。在本發明中，發明人通過檢測B型肝炎重症患者血漿中MicroRNA501-5P的表達 水平，觀察B型肝炎重症狀態下MicroRNA的改變情況。本發明選取正常人和已被確診為 B型肝炎重症患者的血漿，從血漿中提取RNA，利用MicroRNA表達譜晶片(美國應用生物 系統公司Taq Human MicroRNA Array A(B))對 MicroRNA 進行分析。結果發現，MicroRNA 501-5P在B型肝炎重症患者血漿中顯著上調，S卩，該MicroRNA在B型肝炎重症患者血漿中 表達較正常人明顯增高。提示MicrORNA501-5P在B型肝炎重症化中起著重要的調控作用， 同時該MicroRNA可以作為B型肝炎重症化的診斷標誌物。採用本發明的方法來早期診斷B型肝炎重症化，具有如下優點本發明確認了 MicroRNA 501-5P作為診斷B肝重型肝炎的潛在靶點，能用於快速 檢測和診斷。microRNA在血漿和血清中非常穩定，它們有效保護以免接觸RNases，在嚴酷環境 的條件下仍能保持穩定。因此，它們的穩定性使得其實際值與在病人身上得到的測試值吻 合的很好。血清中microRNA表達譜的檢測技術已經成熟，目前研究microRNA表達譜的常 用技術主要有Northern雜交、表達晶片、實時螢光定量PCR和Solexa測序等，方法快速、便 捷，精確度和靈敏度可滿足臨床需求。血清microRNA作為臨床診斷和預後的標誌物，主要有以下優點檢測的損傷小、 穩定性好、靈敏度高，可應用於疾病早期變化的檢測。目前尚未見用於診斷B型肝炎重症 化的microRNA，但是microRNA用於診斷其他疾病已經獲得許多令人鼓舞效果例如血漿 miR-92被成功用作結直腸癌的分子標誌物，靈敏度可達89 %，特異性達到70 %，且腫瘤切 除後miR-92的表達量較術前顯著降低；早期診斷可以大大提高生存率和改善預後。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是MicroRNA表達譜晶片檢測結果，正常人中MicroRNA 501-5P幾乎不表達， 而B型肝炎重症患者則明顯的高表達。
具體實施例方式實施例1血漿中總RNA的提取選取浙江大學醫學院附屬第一醫院，B型肝炎重症患者4例，同時選取4例年齡、 性別相匹配的正常人，抽取細1全血；即抽取B型肝炎重症患者的全血和正常人的全血各4 例。以TOsnRNA作為內參，MicroRNA的相對表達水平用表示，檢測方法相同。實時螢光定量PCR根據美國應用生物系統公司提供的TaqMan MicroRNA Arrays進行操作。為了減少個體差異我們把不同組的血漿進行混合(即，4例患者的血漿進行混合， 4例正常人的進行混合)。利用mirVana PARIS Kit來從血漿樣品中提取總RNA，提取方 法根據該試劑盒的說明書操作，過程依次如下1.將血漿樣品(最大體積625 μ L)(冰上凍融)與等體積的2Χ Denaturing Solution室溫混勻。如果血漿樣品少於lOOul，先加Cell Disruption Buffer到彡100 μ L， 再加入等體積的2X Denaturing Solution，立刻充分混勻(渦旋30s)，冰上孵育5min。2.加入試劑盒中所提供的酸化的酚/氯仿到上述混合液。3.渦旋震蕩30-60s混勻。4.室溫10，OOOXg離心5min分離出水相和有機相(水相在上層)。5.轉移位於上層的水相到新的EP管，並標註體積。6.加入水相1. 25倍體積的100%乙醇(室溫)到水相，充分混勻。7.將過濾柱置於Collection Tube (收集管)中，吸取裂解物和乙醇的混合物(即 步驟6所得)到過濾柱上。8. 10，000 Xg 離心 30s。9.棄濾液，重複離心，直到所有的裂解物/乙醇混合物都濾過過濾柱為止。將過濾 柱重新置於收集管中。加入700 μ LMicroRNA Wash Solution 1到過濾柱。10，000 Xg離心 15s。10.棄濾液，置過濾柱到相同的收集管。11.加入 500 μ L Wash Solution 2/3 到過濾柱。10，000 X g 離心 15s，棄濾液，置 過濾柱到相同的收集管。12.重複步驟11。13. 10，000X g 空離 Imin014.轉移過濾柱到新的收集管。15.加入IOOyL預熱(95 °C )的洗脫液或者無核酶水到過濾柱中央，閉蓋， 10，OOOXg離心30s，棄柱，收集總RNA，-20°C保存或更低溫度保存。以下實施例中所用的試劑均為常規試劑，能通過市購的方式獲得，例如，可購自美 國ABI公司實施例2預擴增1.進行逆轉錄(RT)(1)融解以下試劑Megaplex RT PrimersTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit componentSMgCl2反應體系3 μ L (1 to 350ng) total RNA (實施例 1 所得)4. 5μ L of RT reaction mix(如表 1)(2)混合以下試劑(如表1所述)到1. 5ml微離管。表 權利要求
1.一種單鏈非編碼MicroRNA，其特徵是單鏈非編碼MicroRNA 501-5P為SEQ ID NO: 1所示的序列。
2.如權利要求1所述的單鏈非編碼MicroRNA在製備診斷乙型重症肝炎的試劑盒中的應用。
3.一種用於診斷乙型重症肝炎的試劑盒，其特徵是包括PCR試劑、探針、上遊引物和 下遊引物；所述探針為SEQ ID NO :5所示的序列，上遊引物為SEQ ID NO :3所示的序列，下 遊引物為SEQ ID NO 4所示的序列。
4.根據權利要求3所述的用於診斷乙型重症肝炎的試劑盒，其特徵是所述PCR試劑 % 1X TaqMan Universal PCR MasteMix。
全文摘要
本發明公開了一種單鏈非編碼MicroRNA，該單鏈非編碼MicroRNA501-5P為SEQIDNO1所示的序列。本發明還同時公開了上述單鏈非編碼MicroRNA在製備診斷乙型重症肝炎的試劑盒中的應用。本發明還同時公開了一種用於診斷乙型重症肝炎的試劑盒，包括PCR試劑、探針、上遊引物和下遊引物；探針為SEQIDNO5所示的序列，上遊引物為SEQIDNO3所示的序列，下遊引物為SEQIDNO4所示的序列。
文檔編號C12Q1/70GK102127548SQ20101060791
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者劉東成, 李淑萍, 鄭敏, 陳 峰, 陳智 申請人:浙江大學