細菌的保護的製作方法
2023-09-17 09:42:25
專利名稱：細菌的保護的製作方法
技術領域：
本發明涉及到一種具有抗脅迫保護的細菌細胞，這些脅迫包括極端溫度改變和滲透休克的影響；一種含有受保護細菌細胞的營養或藥物組合物；以及保護細菌抗脅迫的方法。
在這份說明書的上下文中，「含有」的意思是「除其他之外還包括」的意思。不應被解釋為「僅由…組成」。另外，「脅迫」一詞可被與術語「逆境」互換使用。其包括但不限於溫度(熱休克、冷休克)，鹽(滲透休克)，pH(pH休克)，化學脅迫(抗生素，醇，雙氧水等)，營養脅迫，紫外脅迫，冷脅迫和氧濃度(氧化脅迫)的逆境。
本說明書使用IUB生物化學命名委員會定義的標準胺基酸，RNA和DNA代碼。
眾所周知，細菌如乳酸細菌(LAB)在環境中是無所不在的，並且它們被大量地用於發酵產品的生產。例如，在食品工業中，細菌被用於奶製品的發酵和曲引培養物的生產。在曲引培養物的生產、食品發酵、加工和儲藏過程中，被使用的細菌必需用不同種類的逆境處理，這些逆境通常有顯著地降低它們的生活力、穩定性和活性的效果。這些逆境隨生產需要而變化，包括熱休克(冰凍-乾燥或噴霧-乾燥)、滲透休克(乾燥)和pH休克(發酵)。人們認識到，在細菌被大規模使用的條件下，細菌對這些脅迫的敏感性或無法應付這些脅迫是一個問題。
在人類腸道主要是小腸和大腸中雙歧桿菌或乳桿菌的存在通常被公認為是有益於健康的促進因子。此外，認為雙歧桿菌或乳桿菌在疾病包括胃腸感染的預防或治療中可能是有用的。據此，已經有人建議在腸道中維持大量的雙歧桿菌或乳桿菌群體和服用包括這種細菌的產品。通常這些產品包括不同種的雙歧桿菌或乳桿菌。然而，產品加工和儲藏過程中雙歧桿菌和乳桿菌被暴露於其中的這些脅迫能顯著地降低它們的生活力和/或生理活性。
細菌培養物對亞致死溫度改變或其它亞致死脅迫(包括暴露於氧和滲透休克)的自然應答包括一組叫做「應激蛋白」的獨特多肽的快速表達。這些蛋白已被表明能使革蘭氏陽性細菌例如乳酸乳球菌，枯草芽孢桿菌，嗜酸乳桿菌，清酒乳桿菌，糞腸球菌和約氏乳桿菌適應其它的限制生長的條件。
研究的最多的一種應激蛋白是熱休克蛋白或伴侶蛋白。這些蛋白通常涉及到新合成蛋白的成熟，並且它們協助變性蛋白的重新摺疊。在LAB中，許多的應激基因已被描述，包括那些編碼涉及到新合成蛋白的正確摺疊和那些變性蛋白復性的兩種主要伴侶機制(groES/groEL和hrcA/grpE/dnaK/danJ)的基因。
引人注目地是，現在已經發現細菌包括雙歧桿菌或乳桿菌能被保護，抵抗在非保護細菌中是致死的脅迫水平。令人驚訝地是，其可通過使細菌經受一種亞致死水平的脅迫處理而實現。令人驚訝地發現，在這種初始的脅迫處理後要對細菌有不利影響需要更高的脅迫水平。這是出乎意料的，因為一般認為被脅迫損害的細胞應付進一步的脅迫的可能性更小。事實上，相反的情況已被發現，預脅迫的細胞比未經預脅迫的對照細胞能忍受更高水平的脅迫。
通過用不相關的脅迫方式處理獲得的抵抗一種脅迫的保護作用被稱作為「交叉保護作用」。這是出乎意料的，因為一般認為經受過一種脅迫處理損害的細胞對其它的亞致死或致死脅迫更為敏感。
因此，第一方面，本發明提供一種細菌細胞，其具有抵抗對於非保護細菌細胞是致死的條件的保護作用，其中，這種被保護的細胞是通過使細菌細胞經受亞致死水平的脅迫處理而獲得。
第二方面，本發明提供一種營養組合物，該組合物含有具有抵抗對於非保護細菌是致死的條件的保護作用的細菌，其中，這種受保護的細菌是通過使細菌經受亞致死水平的脅迫處理並使其恢復而獲得的。
再一方面，本發明提供一種保護細菌細胞抗脅迫的方法，該方法包括，用選自熱休克、滲透休克、pH休克、氧化脅迫、化學脅迫、營養脅迫、紫外脅迫、冷脅迫的亞致死水平脅迫處理細菌細胞的步驟。
優選，該方法包括允許該細胞恢復的步驟。
優選，化學脅迫通過用抗生素、醇、或雙氧水處理提供。
優選，該細菌細胞選自雙歧桿菌、乳酸細菌、腸球菌、鏈黴菌和桿菌。
更優選，該細菌是長雙歧桿菌，青春雙歧桿菌，短雙歧桿菌或約氏乳桿菌。這些細菌所提供的優勢是它們有能力快速地酸化它們的底物，從而生產微生物學上安全的產品。此外，它們有益於人類和動物的健康。而且，它們顯示出了抗腸道病原物攻擊的保護作用，並被與抗致癌物質、抗誘變和抗致腫瘤的活性相關聯。若不囿於理論，最近的報導顯示它們可以在腸道中通過抗微生物活性直接地起作用，通過經由腸道細胞的免疫調節或通過改變土著微生物菌系而間接地起作用。
優選細菌，更優選雙歧桿菌和乳桿菌，被亞致死濃度的鹽處理以保護它們抗致死的鹽濃度，或細胞被亞致死的熱脅迫處理保護它們抗致死的溫度。此外，結果表明鹽處理(如NaCl)能保護這些細菌抗致死的熱脅迫或抗致死的反覆凍融。據此，本發明也包括用鹽處理細胞以保護抗熱脅迫或用不利的溫度條件處理以保護抗鹽脅迫的步驟。
優選該細菌細胞選自長雙歧桿菌，青春雙歧桿菌或約氏乳桿菌。更優選該細菌選自長雙歧桿菌，NCC481，青春雙歧桿菌NCC251或約氏乳桿菌Lal。
優選，抗致死鹽濃度(如0.1％～0.4％)的保護作用通過用大約0.01～0.1％的鹽處理大約15～60分鐘來進行。優選該鹽為膽汁鹽。
優選，抗致死的熱脅迫(如大約50～60℃)的保護作用通過用大約37℃-50℃處理大約15-60分鐘或通過大約1％-4％的鹽濃度處理大約30-60分鐘來進行。
優選，抗凍融(如1-10循環)的保護作用通過用1％～4％的鹽濃度處理該細胞來進行。
優選長雙歧桿菌NCC481細胞被保護。更優選，長雙歧桿菌NCC48 1細胞抵抗致死的膽汁鹽濃度(如大約0.2％～0.3％，30分鐘)的保護作用，在它們生長周期的對數期通過在致死刺激之前使該細胞經受0.1％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優選，長雙歧桿菌NCC481細胞抵抗致死的膽汁鹽濃度(如大約0.075％～0.15％，大約30分鐘)的保護作用，在它們生長周期的穩定期通過在致死刺激之前使該細胞經受0.05％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優選，青春雙歧桿菌NCC251細胞被保護。更優選，(如大約0.3％～0.4％，30分鐘)的青春雙歧桿菌NCC251細胞抵抗致死膽汁鹽濃度的保護作用，在它們生長周期的對數期通過在致死刺激之前使該細胞經受0.1％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優選，青春雙歧桿菌NCC251細胞抵抗致死的膽汁鹽濃度(如大約0.15％，大約30分鐘)的保護作用，在它們生長周期的穩定期通過在致死刺激之前使該細胞經受0.1％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優選，青春雙歧桿菌NCC251細胞抵抗否則會致死的凍融(如大約3～4次循環)(大約-80℃～大約室溫(優選大約20℃～30℃，更優選25℃))作用保護作用，在它們生長周期的穩定期通過使該細胞經受大約2％NaCl處理大約1小時而獲得。
優選，青春雙歧桿菌NCC251細胞抵抗否則會致死的55℃20分鐘處理的保護作用，在它們生長周期的對數期通過在大約45℃處理該細胞大約30分鐘，在大約47℃大約15分鐘或用1％或2％NaCl處理大約1小時來進行。
優選，約氏乳桿菌Lal細胞被保護。更優選，約氏乳桿菌Lal細胞抵抗否則會致死的55℃達1小時的保護作用，在它們生長周期的對數期通過用大約3.5％NaCl處理該細胞大約15分鐘或大約48℃處理15分鐘來進行。
優選，約氏乳桿菌Lal細胞抵抗否則會致死的55℃達1小時的保護作用，在它們生長周期的對數期通過用大約48℃處理15分鐘或大約3.5％NaCl處理該細胞大約15分鐘來進行。
參考本發明的附圖，本發明的實施方案將被進一步詳細描述如下
圖1顯示了暴露於不同種類的脅迫10分鐘後，來自於長雙歧桿菌NCC481和青春雙歧桿菌NCC251細胞RNA的點雜交結果。NCC481和NCC251分別用特異性探針GSR8和GSR5進行雜交。
圖2顯示了在對數期經不同前誘導後，青春雙歧桿菌NCC251在55℃的存活圖。在MRS和半胱氨酸中，37℃下培養細胞至OD600為0.4～0.7。細胞被分為幾等份並使之分別經受47℃處理15分鐘、45℃處理30分鐘、或1.5％或2％NaCl處理1小時；對照維持在37℃。樣品被轉移至55℃並在10分鐘和20分鐘後測定存活細胞數。
圖3顯示了經3和4次反覆凍融後青春雙歧桿菌NCC251的存活圖。取穩定期細胞並使之經受2％NaCl處理1小時，對照不加鹽。樣品被轉移至-80℃並在室溫融化。在測定存活細胞數之前，這種循環被重複3～4次。
圖4顯示了在對數期致死膽汁鹽條件下長雙歧桿菌NCC481的存活圖。細胞培養至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7並使之經受0.1％牛膽汁處理30分鐘。對照不加牛膽汁。樣品被分成幾等份並轉移至0.2％、0.25％和0.3％的牛膽汁處理30分鐘，並測定存活細胞數。
圖5顯示了在穩定期致死膽汁鹽條件下長雙歧桿菌NCC481的存活圖。細胞經0.05％牛膽汁處理30分鐘。對照不加牛膽汁。樣品被分成幾等份並轉移至0.075％、0.1％和0.15％的膽汁處理30分鐘，並測定存活細胞數。
圖6顯示了在對數期致死膽汁鹽條件下青春雙歧桿菌NCC251的存活圖。細胞培養至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7並使之經受0.1％牛膽汁處理30分鐘。對照不加任何牛膽汁。樣品被分成幾等份並轉移至0.3％和0.4％的牛膽汁處理30分鐘，並測定存活細胞數。
圖7顯示了在穩定期致死膽汁鹽條件下青春雙歧桿菌NCC251的存活圖。細胞經受0.1％牛膽汁處理30分鐘。對照不加任何牛膽汁。樣品被分成幾等份並轉移至0.15％的牛膽汁處理30分鐘，並測定存活細胞數。
圖8顯示了在致死溫度條件下約氏乳桿菌Lal的存活圖。在MRS中，37℃下培養細胞至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7。取出樣品並使之經受3.5％NaCl或48℃處理15分鐘。對照維持在37℃。然後樣品被轉移至55℃並在30和60分鐘後測定存活細胞數。
圖9顯示了在生長周期的穩定期在致死溫度條件下約氏乳桿菌Lal的存活圖。取出樣品並使之經受3.5％NaCl或48℃處理15分鐘。對照維持在37℃。然後樣品被轉移至55℃並在60分鐘後測定存活細胞數。
菌株及生長條件在補充有0.5g/l半胱氨酸的MRS培養基中，37℃、厭氧條件下(98％N2和2％H2)培養青春雙歧桿菌NCC251，長雙歧桿菌NCC481，長雙歧桿菌NCC490，長雙歧桿菌NCC585，和短雙歧桿菌NCC298。在MRS培養基中，30℃培養乳酸乳球菌MG1363。在Laria-Bertani培養基中，37℃培養大腸桿菌TG1(Amersham)。在MRS中，37℃培養約氏乳桿菌Lal。
脅迫處理細胞培養至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7或在穩定期取出並使之經受不同時間不同脅迫條件的處理。用於凍融試驗的細胞在使之經受-80℃處理之前被濃縮於鹽溶液中。通過向樣品中加入NaCl來實施鹽脅迫，而OXGALL(商標)(Difco)被用於膽汁鹽脅迫。
雙歧桿菌的脅迫處理在厭氧條件下進行，而存活細胞數的測定在好氧條件下進行。在微好氧條件下培養乳桿菌，在好氧條件下進行脅迫處理和存活細胞數測定。
雙歧桿菌誘導及致死刺激的範圍前誘導致死刺激pH(如HCl)pH6.0-3.5 pH2.5-2膽汁(如牛膽汁) 0.01％-0.1％0.075％-0.4％溫度 37℃-48℃ 50℃-60℃鹽(如NaCl) 0.5％-3％ 3％-8％前誘導及致死刺激的時間可根據菌株和脅迫條件在5分鐘-2小時間變化。
乳桿菌誘導及致死刺激的範圍前誘導致死刺激pH(如HCl，乳酸) pH6.0-4.5 pH4.0-2溫度 40℃-50℃ 50℃-60℃鹽(如NaCl) 0.5％-3.5％4％-8％前誘導及致死刺激的時間可根據菌株和脅迫條件在5分鐘-2小時間變化。
DNA技術染色體DNA的提取按照標準方法進行。
mRNA的分析至於斑點雜交，按照標準方法將總RNA提取、變性、轉移至無電荷的尼龍膜(GeneScreen，NEN)。膜經預雜交(1小時，40℃)並隨後用100pmol地高辛標記的探針(Boehringer)雜交4小時。在含有0.1％SDS的2×SSC中40℃洗膜兩次，每次5分鐘，並在對應於探針的溫度下洗一次，對於兩個dnaK特異性探針GSR5(5』-CATCGAAGGTGCCGCCAC-3』)和GSR8(5』-TCGTCACCACCGAGGTG-3』)，溫度分別為46℃和48℃，對於通用探針1028R(5』-CCTTCTC CCGAAGTTACGG-3』)，溫度為51℃。檢測按照操作說明進行。
PCR擴增用簡併引物HS1(5』-ATIACIGTICCIGCITA(T/C)TT(T/C)AA(T/C)GA-3』)和HS2(5』-CATIGT(T/C)TCIATICIA(A/G)IGAIA(G/A)IGG-3』)及1μg的染色體DNA作為模板擴增dnaK的核心區域。
擴增在100μl體系(含dATP，dCTP，dGTP及dTTP各200μM，引物各50pmol，2.5單位的Super-TaqDNA聚合酶(HT Biotechnology)，和相應的1×PCR緩衝液)中進行。反應用Perkin-Elmer熱循環儀進行在95℃預變性5分鐘，接著95℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘循環30次；最後72℃延伸10分鐘。
DnaK基因的鑑定在Barril等(1994)的序列比對的基礎上，我們選擇具有相同胺基酸序列的乳酸乳球菌，大腸桿菌和巨大芽孢桿菌的DnaK的兩個區域並設計了兩個簡併引物HS1和HS2，這兩個引物分別對應乳酸乳球菌DnaK的114-122位和366-374位的胺基酸。這一對引物用於以NCC481，NCC490，NCC585，NCC251和NCC298的染色體DNA作為模板的PCR擴增。每個菌株獲得兩個片段。所有菌株中，大小與兩個陽性對照大腸桿菌和巨大芽孢桿菌相對應的片段被從瓊脂糖凝膠中分離、純化並測序。每個片段鑑定出一個開放閱讀框，顯示了與已知的DnaK蛋白高度的序列相似性。尤其是與鏈黴菌和藍細菌及清酒乳桿菌，桿菌和鏈球菌有高度同一性。
dnaK基因表達的mRNA分析將細胞暴露於熱休克和其它通常的脅迫條件下研究dnaK的轉錄誘導。對數期的長雙歧桿菌NCC481和青春雙歧桿菌NCC251細胞經受0.1％膽汁鹽、1.5％NaCl或42℃和45℃熱休克10分鐘處理，NCC481和NCC251分別進行了最高溫度為47℃和50℃的試驗。始終用來自於對數期和穩定期的未誘導細胞作對照。提取總RNA並進行點雜交。DnaK特異性探針GSR8和GRS5分別被用於NCC481和NCC251。通用探針被選用以檢查膜上RNA的量和質量。隨著處理溫度的升高，觀察到被處理細胞的dnaK特異性mRNA的濃度隨之增加(圖1)。與NCC251相反，NCC481的dnaK在進入穩定期時細胞中僅被微弱地誘導。而且在膽汁鹽和NaCl處理後，在NCC251中觀察到dnaK的微弱的誘導。在同樣的條件下在NCC481中沒有獲得顯著的誘導。
存活和交叉保護作用在不同溫度、膽汁鹽和鹽條件下進行約氏乳桿菌Lal，青春雙歧桿菌NCC251和長雙歧桿菌NCC481的生長和存活試驗。
很顯然，對數期的NCC251在經過亞致死的熱脅迫後，顯示出對一般致死的溫度55℃的更強抗性。在熱休克10分鐘和20分鐘前使細胞經受47℃處理15分鐘，熱耐受能力分別提高几乎24倍和128倍(圖2)。這些數字是值得注意的，因為它們表明細胞的前誘導對保護它們抵抗否則是致死的刺激具有出乎意料的效果。通過1.5％NaCl前處理1小時實現了抗55℃的9倍和15倍的細胞交叉保護。通過45℃前誘導30分鐘或2％NaCl前誘導1小時，相等的抗熱脅迫的保護作用也被觀察到(圖2)。
約氏乳桿菌Lal的處於生長周期對數期的細胞被用3.5％NaCl預處理或48℃預處理15分鐘後，顯示了抗55℃30分鐘400倍高的保護作用。在55℃1小時後，用3.5％NaCl預處理或48℃預處理15分鐘的樣品，分別觀察到抗55℃的10倍和5倍高的保護作用(圖8)。
在48℃用3.5％NaCl處理15分鐘後，約氏乳桿菌La1的穩定期的細胞顯示了抗55℃1小時20倍高的顯著的保護作用(圖9)。
如果用2％NaCl預脅迫1小時，處於穩定期青春雙歧桿菌NCC251的細胞在連續的反覆凍融後顯示出了14倍高的存活(圖3)。在4次反覆凍融後，觀察到10倍高的存活。
抗致死膽汁鹽濃度的保護作用可在青春雙歧桿菌NCC251和長雙歧桿菌NCC481的對數期及穩定期被觀察到。在青春雙歧桿菌NCC251的對數期用0.1％的膽汁鹽預處理細胞(如30分鐘)導致分別抗0.3％和0.4％膽汁鹽的300倍和21倍的保護作用(圖6)。在0.15％膽汁鹽的致死濃度下青春雙歧桿菌NCC251(用0.1％膽汁鹽前誘導)的穩定期細胞的81倍高的存活被觀察到(圖7)。從長雙歧桿菌NCC481得到了相似的結果。對數期細胞，用0.15％牛膽汁前誘導，顯示了分別抗0.2％、0.25％、0.3％牛膽汁的400倍、1800倍及580倍的存活(圖4)。當穩定期的細胞被用0.05％的牛膽汁前誘導30分鐘時，顯示出了抗0.075％、0.1％及0.15％的牛膽汁30分鐘的3倍、29倍及150倍的存活(圖5)。
與Flahaut等(1996)發表的糞腸球菌細胞抗0.3％膽汁鹽的保護作用僅能達到30秒的結果相反，顯然細胞能被保護抗致死的膽汁鹽濃度30分鐘。這是沒有預料到的。
長雙歧桿菌NCC481，長雙歧桿菌NCC490，長雙歧桿菌NCC585，青春雙歧桿菌NCC251，和短雙歧桿菌NCC298的dnaK的核心區域被PCR擴增並鑑定。隨後的mRNA分析揭示了在NCC251和NCC481中，dnaK的誘導在轉錄水平被調控。轉錄通常被熱誘導，而且對於NCC251也被鹽和膽汁鹽處理誘導。
根據這些結果得出結論雙歧桿菌和/或乳桿菌的脅迫預處理能導致在否則是致死的相似的或不同的脅迫條件下顯著增加的存活機會。
權利要求
1.一種具有抵抗對非保護細菌細胞是致死的條件的保護作用的細菌細胞，其中，這種受保護的細胞通過使細菌細胞經受亞致死水平的脅迫處理而獲得。
2.根據權利要求1的細菌細胞，選自雙歧桿菌、乳酸細菌、腸球菌、鏈黴菌和桿菌。
3.根據權利要求1或2的細菌細胞，選自長雙歧桿菌NCC481，青春雙歧桿菌NCC251和約氏乳桿菌Lal。
4.一種營養組合物，該組合物含有具有抵抗對非保護細菌是致死的條件的保護作用的細菌，其中，這種受保護的細菌通過使細菌經受亞致死水平的脅迫處理而獲得。
5.一種保護細菌細胞抵抗脅迫的方法，該方法包括用選自熱休克、滲透休克、pH休克、氧化脅迫、化學脅迫營養脅迫、紫外脅迫和冷脅迫的亞致死水平的脅迫處理細菌細胞的步驟。
6.根據權利要求5的方法，該方法包括用大約0.01％～0.1％的鹽處理大約30分鐘的步驟。
全文摘要
具有抵抗對非保護細菌細胞是致死的條件的保護作用的細菌細胞,其中受保護的細胞通過使細菌細胞經受亞致死水平的脅迫處理獲得。
文檔編號A61K35/66GK1378591SQ00808820
公開日2002年11月6日 申請日期2000年6月9日 優先權日1999年6月11日
發明者G·施米德特, R·青克 申請人:雀巢製品公司