楊樹耐鹽基因PtoeIF5A1的應用的製作方法
2023-10-11 12:44:59 1
楊樹耐鹽基因PtoeIF5A1的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種楊樹耐鹽基因PtoeIF5A1的應用。本發明公開了如下任一物質在提高植株耐鹽性中的應用：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白質；（2）SEQ?ID?No.2所示蛋白質的編碼基因；（3）含有（2）的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。PtoeIF5A1基因有耐受高鹽的能力，該基因在使用基因工程手段提高林木或者作物耐鹽方面具有很高的應用價值。
【專利說明】楊樹耐鹽基因PtoelF5A1的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種楊樹耐鹽基因PtoeIF5Al的應用。
【背景技術】
[0002]eIF5A是在真核生物中廣泛存在的一類蛋白質，研究表明，eIF5A是唯一含有羧腐胺賴氨酸(hypusine)殘基的蛋白質。進化分析顯示，eIF5A在各物種間高度保守。實驗表明，eIF5A參與了細胞的多項生理活動，如細胞增殖、蛋白質翻譯、細胞衰老與凋亡等。在酵母體內，當eIF5A功能受到抑制或缺失時，部分蛋白合成減少。eIF5A的活性受到抑制時，細胞的生長延緩或停滯。
[0003]植物中eIF5A確切的生物學功能還不明確。Thompson等研究發現擬南芥中存在3個表達特徵不同的 eIF5A 編碼基因，AteIF5Al, AteIF5A2 和 AteIF5A3。Western Blotting分析表明，AteIF5Al只在衰老組織中表達，AteIF5A2在受機械損傷的組織中高水平表達，而AteIF5A3在細胞分裂很活躍的吸脹的種子中高水平表達。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種楊樹耐鹽基因PtoeIF5Al的應用。
[0005]本發明提供了如下任一物質在提高植物耐鹽性中的應用:
[0006](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白質；
[0007](2) SEQ ID N0.2所不蛋白質的編碼基因；
[0008](3)含有(2)的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
[0009]上述應用中，所述SEQ ID N0.2所示蛋白質的編碼基因如SEQ ID N0.1所示。
[0010]上述任一所述的應用中，所述耐鹽性為耐NaCl的性質。
[0011]上述任一所述的應用中，所述提高植物耐鹽性是指所述植物在含NaCl條件下的生長狀態好；和/或，在含NaCl條件下的種子萌發率高；
[0012]所述生長狀態好是指所述植物的葉片較大、顏色較綠；
[0013]上述任一所述的應用中，所述植物為擬南芥。
[0014]一種製備耐鹽性提高的轉基因植物的方法也屬於本發明的保護範圍，包括如下步驟:將SEQ ID N0.2所示蛋白質的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物；與出發植物相比，轉基因植物的耐鹽性增強。
[0015]上述方法中，所述編碼基因是通過重組表達載體導入的，所述重組表達載體是將所述編碼基因插入出發載體PBI121的多克隆位點得到的。
[0016]上述任一所述的方法中，所述轉基因植物的耐鹽性增強是指所述轉基因植物在含NaCl條件下的生長狀態好於出發植物在含NaCl條件下的生長狀態；和/或，轉基因植物的種子在含NaCl條件下的萌發率高於出發植物在含NaCl條件下的萌發率。
[0017]所述NaCl 的濃度為 150mM-175mM。
[0018]上述任一所述的方法中，所述植物為擬南芥。[0019]上述任一所述的方法中，所述耐鹽性為耐NaCl的性質。
[0020]本發明證明了 PtoeIF5Al基因有耐受高鹽的能力，該基因在使用基因工程手段提高林木或者作物耐鹽方面具有應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為Western-Blotting檢測PtoeIF5Al蛋白在轉基因擬南芥TO代植株以及對照擬南芥TO代植株中的表達。
[0022]圖2為實時螢光定量PCR檢測PtoeIF5Al基因的表達。
[0023]圖3為T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥以及T2代純合轉空載體pBI 121擬南芥的耐鹽性檢測以及PtoeIF5Al蛋白的Western-Blotting檢測。
[0024]圖4為種子萌發實驗。
【具體實施方式】
[0025]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0026]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0027]塔形毛白楊CV-BJHR01 (Populus tomentosa Carr, cv 『BJHR01』)在文獻「張利姣，張杰偉，陳亞娟，等.毛白楊真核細胞翻譯起始因子5A基因(PtoeIF5A4)的克隆與表達分析[J].Journal of Agricultural Biotechnology, 2013，21 (8):949-956.」 中公開過，公眾可從北京市農林科學院獲得。
[0028]擬南芥(Arabidopsisthaliana, Columbia ecotype)在文獻「InitiativeA G.Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsisthaliana[J].Nature, 2000, 408(6814):796-815.」中公開過，公眾可從北京市農林科學院獲得。
[0029]克隆載體pGEM-T easy購自Promega公司，產品目錄號為A1360。
[0030]pBSK-Ω-Flag載體(modified pBluescript vector)在文獻「Su T, Xu J, Li Y, etal.Glutathione-1ndole-3-acetonitrile is required for camalexin biosynthesis inArabidopsis thaliana[J].The Plant Cell, 2011，23 (I): 364-380.」中公開過，公眾可從北京市農林科學院獲得。
[0031]植物表達載體pBI121 在文獻 「Su T, Xu J, Li Y, et al.Glutathione-1ndole-3-acetonitrile is required for camalexin biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J].The Plant Cell, 2011，23(1):364-380.」中公開過，公眾可從北京市農林科學院獲得。
[0032]農桿菌GV3101在文獻「Li J F，Li L, Sheen J.Protocol: a rapid and economicalprocedure for purification of plasmid or plant DNA with diverse applications inplant biology [J].Plant Methods, 2010, 6 (I): 1-8.」中公開過，公眾可從北京市農林科學院獲得。
[0033] 0.5%TBST溶液:該溶液由溶劑和溶質組成，溶劑為Tris-HCl緩衝液、溶質為NaCl和Tween20 ;Tris_HCl緩衝液的濃度為50mM，NaCl在0.5%TBST溶液中的濃度為150mM，Tween20在0.5%TBST溶液中的體積百分含量為0.05%，溶液pH=7.5。
[0034]一抗:鼠抗Flag M2單克隆抗體購自Sigma公司，使用時用0.5%TBST溶液將其稀釋10000倍。
[0035]二抗:辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，使用時用0.5%TBST溶液將其稀釋10000倍。
[0036]實施例1、pBSK- Ω -Flag_PtoeIF5Al 載體的構建
[0037]一、選取生長時間為3個月的塔形毛白楊CV-BJHROI幼苗的葉片，液氮速凍後提取總RNA並反轉錄成cDNA。
[0038]二、通過毛果楊基因組文庫(http:1l genome.jg1-psf.0rg/Poptrll/Poptrll.home, html)分析，獲取預測的毛白楊PtreIF5Al基因的全序列，在其非編碼區設計引物，以步驟一獲得的塔形毛白楊CV-BJHR01的cDNA (以下簡稱毛白楊cDNA)為模板進行巢式PCR擴增。
[0039]巢式PCR體系如下:
[0040]第一輪PCR:
[0041]體系:毛白楊cDNA2.0yL, 10ymol/L 的上下遊引物各 IyL, 2.0U/L 的 PhusionDNA 聚合酶 0.2 μ L，2.5mmol/L 的 dNTPs 混合液 1.6 μ L，5 X HF Buffer4.0 μ L，ddH20 為10.2 μ L0
[0042]上遊引物:5』-CCTCTCTGGTACTCTCTGTG-3』 ；
[0043]下遊引物:5』 -GCAGAACGTTACTTAAATGGGC-3 』。
[0044]PCR 條件:98°C 30s ；98°C 10s，55。。30s，72。。lmin，30 個循環；72°C總延伸 IOmin0`[0045]第二輪PCR:
[0046]體系:第一輪PCR擴增產物2.0 μ L，10 μ mol/L的上下遊引物各lyL，2.0U/L的Phusion DNA 聚合酶 0.2 μ L，2.5mmol/L 的 dNTPs 混合液 1.6 μ L，5XHF Buffer4.0yL,ddH20 為 10.2 μ L0
[0047]上遊引物:5』-CTCTTGATCAATCGCCGCC-3』 ；
[0048]下遊引物:5』 -CTACAACTATCAGCAGTCAACC-3 』。
[0049]PCR 條件:98°C 30s ；98°C 10s，55。。30s，72。。lmin，72°C總延伸 10min，30 個循環。
[0050]三、第二輪PCR結束後，回收500bp的片段並連接到pGEM_T easy載體上，得到重組載體，將重組載體測序，結果正確，將此重組質粒命名為PGEM-T easy-PtoeIF5Al。
[0051]四、設計引物克隆PtoeIF5Al的編碼區，在上遊引物的5』端引入NdeI酶切位點。
[0052]引物序列如下:
[0053]上遊引物PtoeIF5AlF:5』 -CATATGTCTGACGAGGAGCAT-3，
[0054]下遊引物PtoeIF5AlR:5』 -TTACTTGGGGCCAATGTCC-3，
[0055](下劃線所示序列為酶切識別位點)
[0056]五、以pGEM-T easy_PtoeIF5Al 質粒為模板，以 PtoeIF5AlF 和 PtoeIF5AlR 為引物進行PCR擴增，得到PtoeIF5Al基因，將基因片段與pGEM_T easy載體連接得到重組質粒。將重組質粒進行測序，測序正確。
[0057]PtoeIF5Al基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。PtoeIF5Al蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0058]六、用NdeI和SpeI (SpeI位點是pGEM_T easy載體上的位點)雙酶切步驟五得到的重組載體，得到PtoeIF5Al基因片段；用NdeI和SpeI雙酶切pBSK- Ω -Flag載體，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到pBSK-Q-Flag-PtoeIF5Al重組質粒。
[0059]七、XhoI和 SpeI 雙酶切 pBSK-Ω-Flag_PtoeIF5Al，得到 Flag-Ω-PtoeIF5Al 基因片段；XhoI和SpeI雙酶切PBI121，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到PBI121-Ω -Flag-PtoeIF5Al重組質粒，將質粒送測序，測序正確。
[0060]八、將pBI121-Q-Flag_PtoeIF5Al轉化農桿菌GV3101，得到重組菌，將重組菌提質粒，送測序，結果證明重組菌正確。同時將空載體PBI121轉化農桿菌GV3101，得到對照重組菌。
[0061]實施例2、花芽浸泡法轉化擬南芥
[0062]擬南芥轉基因的方法採用Clough等人的花芽浸泡法，具體過程如下:
[0063]一、挑取實施例1得到的重組菌和對照重組菌單菌落分別接入5ml LB中(含Kan5O μ g/ml、Gent25 μ g/ml), 28°C 培養一天。
[0064]二、以體積比1:100將培養得到的菌液分別轉接到200ml含同樣抗生素的LB中，繼續培養至0D_=1.0, 5000g室溫離心lOmin，將菌體沉澱分別重懸於200ml 1/2MS培養基中(含5(^/1蔗糖、20(^1/1 Silwet L-77)中，得到重組菌和對照重組菌懸液。
[0065]三、將待轉基因的擬南芥倒置，使蓮座葉以上的花序在步驟二得到的重組菌或對照重組菌懸液中浸泡5min，期間輕微晃動2-3次，分別得到轉PtoeIF5Al基因的擬南芥(以下簡稱轉基因擬南芥)和轉空載體PBI121的擬南芥(以下簡稱對照擬南芥)。
[0066]四、將轉基因擬南·芥和對照擬南芥植株水平放置於22°C環境中，用不透光的塑膠袋封住盆缽，約16h後將其取出，豎直培養直至收穫轉基因擬南芥和對照擬南芥的TO代種子，種子經室溫乾燥後備用。
[0067]實施例3、轉基因擬南芥的篩選
[0068]一、用體積百分含量為70%的乙醇水溶液將轉基因擬南芥和對照擬南芥TO代種子處理Imin,滅菌水洗2min,再用次氯酸鈉處理13min,然後用無菌水洗5次,每次2min,將處理後的種子置於4°C春化2-3天。
[0069]二、將春化後的種子均勻鋪於1/2MS篩選培養基上(10g/l鹿糖、50 μ g/ml Kan、8g/l瓊脂、ρΗ=5.7)，移入22°C培養箱(16hr光照，8hr黑暗，光照強度為80_100Lux)萌發。
[0070]三、約6天後轉基因擬南芥幼苗的葉片綠、根較長，而對照擬南芥雖然也能在1/2MS篩選培養基上萌發，但是幼苗較同時期轉基因幼苗葉片黃、根很短。分別將轉基因擬南芥和對照擬南芥的幼苗移入新的1/2MS瓊脂平板(1(^/1蔗糖、5(^8/1111 Kan、8g/1瓊脂、pH=5.7)上，繼續培養至出現4片葉子，將其移入土中生長。
[0071]四、提取轉基因擬南芥TO代植株以及對照擬南芥TO代植株的總蛋白進行Western-Blotting檢測，一抗為鼠抗Flag M2單克隆抗體，該抗體可以與Flag-tag與PtoeIF5Al的融合蛋白結合，二抗為辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgG，結果如圖1所示。
[0072]圖1中，Vector代表對照擬南芥TO代植株；1、2、3代表三株轉基因擬南芥TO代植株。
[0073]圖1表明，轉基因擬南芥TO代植株有Flag-tag與PtoeIF5Al的融合蛋白的表達，從而有19kD目的條帶的出現，而對照擬南芥TO代植株沒有目的條帶。
[0074]挑選轉基因擬南芥和對照擬南芥TO代植株收穫得到Tl代種子。
[0075]五、將對照擬南芥和轉基因擬南芥Tl代種子繼續種於1/2MS篩選培養基(10g/l蔗糖、50 μ g/ml Kan、8g/1瓊脂、pH=5.7)，選擇後代植株的抗性與非抗性按孟德爾規律發生分離(3:1)的群體,再用Western-Blotting鑑定轉基因擬南芥Tl代植株。
[0076]收穫鑑定為陽性的對照擬南芥和轉基因擬南芥Tl代種子，通過抗性及蛋白檢測得到轉基因擬南芥T2代植株，收穫轉基因擬南芥T2代種子，如果T2代種子在1/2MS篩選培養基上(10g/l蔗糖、50 μ g/ml Kan、8g/1瓊脂、pH=5.7)全部具有抗性，則對應的T2代種子便是純合體；同樣通過抗性檢測得到對照擬南芥T2代植株，收穫對照擬南芥T2代種子，如果T2代種子在1/2MS篩選培養基上(10g/l蔗糖、50 μ g/mlKan、8g/l瓊脂、pH=5.7)全部具有抗性，則對應的T2代種子便是純合體，通過此方法最終得到T2代純合轉空載體PBI121的擬南芥株系和T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系(PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2 和 PtoeIF5Al_0E3)。
[0077]實施例4、轉基因植株的實時螢光定量PCR的檢測
[0078]一、取實施例3獲得的T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3以及T2代純合轉空載體pBI121的擬南芥株系，分別提取總RNA，反轉錄獲得cDNA。
[0079]二、分別以四種植株的cDNA為模板，用引物Fl和Rl對基因PtoeIF5Al的cDNA進行實時螢光定量PCR擴增，同時用引物PtoACT9-F和PtoACT9-R對內參基因PtoACT9進行實時螢光定量PCR擴增。一次平行試驗設3次重複。利用2_ΛΛετ計算各株系中PtoeIF5Al基因的相對表達量。
[0080]其中Λ ACT= (CT Target — CT Actin) Time x — (CT Target — CT Actin) TimeO
[0081]Time x表示任意時間點，TimeO表示經PtoACT9校正後I倍量的目標基因表達。
[0082]Target 代表 PtoeIF5Al 基因，Actin 代表內參基因 PtoACT9。
[0083]實時螢光定量PCR引物如下:
[0084]PtoeIF5Al基因檢測引物:
[0085]Fl:5』 -TGTCACTTCGTTGGGATTGA-3』 ；
[0086]Rl:5，-CAAGATCTTTCCCCTCACCA-3，；[0087]內參基因PtoACT9檢測引物:
[0088]PtoACT9-F:5， -TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3，；
[0089]PtoACT9-R: 5，-AATCCACATCTGCTGGAAGG-3，。
[0090]結果如圖2所示，圖2中Vector代表T2代純合轉空載體pBI121的擬南芥株系；5-0Ε1、5-0Ε2和5-0E3分別代表三個T2代純合轉PtoeIF5A1基因的擬南芥株系PtoeIF5Al-0El、PtoeIF5Al-0E2 和 PtoeIF5Al_0E3。
[0091]圖2表明，轉空載體pBI 121的擬南芥不表達基因PtoeIF5Al，而轉PtoeIF5Al基因的擬南芥植株中PtoeIF5Al的表達量均很高。
[0092]實施例5、轉PtoeIF5Al基因植株的耐鹽性
[0093]一、將4°C春化2天的T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個轉基因株系的種子以及T2代純合轉空載體ΡΒΙ121擬南芥株系(對照組)的種子置於含OmM NaCl的1/2MS平板上，在22°C，16hr光照/8hr黑暗條件下培養，12天後，三個T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系的幼苗的生長狀態與對照組植株的幼苗沒有明顯區別。[0094]二、將4°C春化2天的T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個轉基因株系的種子以及T2代純合轉空載體ΡΒΙ121擬南芥株系(對照組)的種子置於含150mM和175mM NaCl的1/2MS平板上，22°C，16hr光照/8hr黑暗條件下培養，12天後，與對照組相比，轉PtoeIF5Al基因株系的幼苗均表現出較好的生長狀態，其葉片較大、顏色較綠。
[0095]結果如圖3A所示，圖3B為各組幼苗的位置示意圖。
[0096]圖3B中，Vector代表對照組幼苗，5_0E1、5_0E2和5-0E3分別代表T2代純合轉PtoeIF5Al 基因的擬南芥株系 PtoeIF5Al-0El、PtoeIF5Al_0E2 和 PtoeIF5Al_0E3 這三個轉基因株系的幼苗。 [0097]三、提取T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個轉基因株系和T2代純合轉空載體pBI121擬南芥(對照組)的總蛋白進行Western-Blotting檢測,一抗為鼠抗Flag M2單克隆抗體,該抗體可以與Flag-tag與PtoeIF5Al的融合蛋白結合，二抗為辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgG。
[0098]結果如圖3C所示。
[0099]圖3C中，Vector代表對照組擬南芥；5-0Ε1、5_0Ε2和5-0E3分別代表三個T2代純合轉 PtoeIF5Al 基因的擬南芥株系 PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al_0E2 和 PtoeIF5Al_0E3。
[0100]圖3C 表明，PtoeIF5Al-0El、PtoeIF5Al_0E2 和 PtoeIF5Al_0E3 這三個楊樹PtoeIF5Al基因超量表達株系均能檢測到PtoeIF5Al蛋白，而對照組中沒有檢測到目的條帶。
[0101]四、種子萌發實驗
[0102]將4°C春化2天的T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個轉基因株系的幼苗以及T2代純合轉空載體pBI 121擬南芥株系(對照組)的種子分別置於含O、150和175mM NaCl的1/2MS平板上，22°C，16hr光照/8hr黑暗條件下培養，從第I天起開始統計各株系的萌發率(種子露白)，連續統
計一周。
[0103]結果如圖4所示。圖4中，Vector代表對照組；5-0Ε1、5_0Ε2和5-0E3分別代表三個T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al_0E2和PtoeIF5Al-0E3。
[0104]圖4A表明，T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al-0E3在OmM NaCl條件下的萌發率與對照組擬南芥沒有明顯差
巳升。
[0105]圖4B表明，T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al-0E3株系在150mM NaCl條件下的萌發率從第3天起明顯較對照組擬南芥高，為其2.3至2.6倍，從第4天至第7天均約為對照組擬南芥的1.3倍。
[0106]圖4C表明，T2代純合轉PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al-0E3株系在175mM NaCl條件下的萌發率從第3天起明顯較對照組擬南芥高，為其1.7至2倍，從第4天至第7天約為其1.3至1.8倍。
[0107]結果表明楊樹PtoeIF5Al基因的超量表達可以提聞植株的耐受聞鹽能力。
【權利要求】
1.如下任一物質在提高植物耐鹽性中的應用: (1)SEQID N0.2所示的蛋白質； (2)SEQ ID N0.2所示蛋白質的編碼基因； (3)含有(2)的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於:所述SEQID N0.2所示蛋白質的編碼基因如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於:所述耐鹽性為耐NaCl的性質。
4.根據權利要求1-3任一所述的應用，其特徵在於:所述植物為擬南芥。
5.一種製備耐鹽性提高的轉基因植物的方法，包括如下步驟:將SEQ ID N0.2所示蛋白質的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物；與出發植物相比，轉基因植物的耐鹽性增強。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述編碼基因是通過重組表達載體導入的，所述重組表達載體是將所述編碼基因插入出發載體PBI121的多克隆位點得到的。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於:所述植物為擬南芥。
8.根據權利要求5-7·任一所述的方法，其特徵在於:所述耐鹽性為耐NaCl的性質。
【文檔編號】C07K14/415GK103709238SQ201310700593
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】張杰偉, 魏建華, 王宏芝, 李瑞芬, 張中保, 陳亞娟, 丁莉萍 申請人:北京市農林科學院