一種用於表徵外周調節性t細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法及其應用的製作方法

2023-10-11 21:32:49 2

專利名稱：一種用於表徵外周調節性t細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法及其應用，特別的說是一種用於表徵調節性T細胞抑制活性變化和靶向組織免疫應答機制及其應用，是發現一種用於表徵調節性T細胞中具有抑制活性的細胞群的狀態變化而介導靶向組織免疫應答之間的機制，及其在用於動態監測調節性T細胞抑制活性試劑盒中的應用、及在用於製備篩選胰腺早期病變靶標的試劑盒中的應用。
背景技術：
研究發現自體免疫性糖尿病是一種自發免疫性疾病並呈現漸進性發展過程，由於免疫調節活性下降，降低其對內源性效應T細胞的抑制效應，由效應T細胞而介導的特異性攻擊胰島β細胞一即體內唯一合成分泌胰島素的單位，因此，胰島破壞的結果直接造成胰島素分泌數量減少，而胰島素的功能將血中的葡萄糖運至相應的細胞內，供細胞正常生理活動需要。胰島素數量減少又直接影響到血中的葡萄糖代謝利用。當80 90%的胰島被破壞使得胰島素分泌數量降至臨界值時，尚存的內源性胰島素無法維持生理所需的糖代謝，血中的葡萄糖異常升高，此時發展成為臨床期的I型糖尿病。疾病發展至此，病人表現出相應的臨床症狀和體徵，實驗室檢查發現血液和尿液中的葡萄糖值升高，以及其它的一些輔助檢查都可以幫助診斷，但主要是依據血糖的升高程度診斷糖尿病。目前對I型糖尿病的發病機制和診治中存在局限；首先，雖然學術界對外周免疫耐受失衡是造成自體免疫病發生的成因已經有共識，即耐受平衡調節的關鍵取決於免疫調節細胞群的表達，但一些科學·實驗中發現免疫調節細胞群高低與它應具備的調節功能間存在矛盾，研究發現免疫調節細胞的數量高低與它應該發揮的作用無關(Anne Cooke英國劍橋大學發表在國際免疫學雜誌)，免疫調節細胞群中存在「殭屍細胞」，因此如何界定具有確切調節功能活性的靶位成為關鍵；其次，由於血糖持續的異常升高受到很多因素的影響，波動較大且容易有誤差，而且只有在胰島被破壞減少到臨界值後，內在的病變發展至臨床期後才表現出來。因此，不能全面和系統體現疾病的發生和進展，尤其無法反映免疫攻擊胰島細胞的早期病變，另外，胰腺組織活檢雖然可以反映病變局部的病理變化，它卻受到活檢帶來的手術創傷等併發症以及無法被醫生和患者接受的制約。

發明內容
本發明突破目前自體免疫病發病機制研究中的困局，解決了單純依賴外周免疫調節細胞表達量的高低無法客觀體現它實際發揮的調節功能間的矛盾，找到特異性靶位可以科學地反映調節性T細胞免疫抑制活性，並進一步公開了相應的細胞群檢測方法，從而實現動態監測調節性T細胞抑制活性狀態，以及作為篩選自體免疫糖尿病的靶器官胰腺早期病變的靶標，奠定了重要的基礎。具體地，本發明公開了一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的靶向細胞群的檢測方法，包括以下步驟:
步驟I)將待測樣本處理，形成單細胞懸液；具體來說，將待測外周血或動物脾臟按照常規方法處理，去紅細胞過濾後製備得到淋巴細胞懸液；
步驟2)特徵細胞群的抗體染色:
將上述單細胞懸液分別與標記不同螢光的單抗體⑶3、⑶4、⑶69混勻，冰上孵育30分
鍾；
步驟3)混合液PBS洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻後離心，去上清；
步驟4)新鮮配製脫氧核糖核酸酶液，加入到步驟4)中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻後離心，去上清，
步驟5)加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘；
步驟6)分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3)和脫氧核糖核酸(BrdU)複製的抗體；所述的BrdU、FoxP3分別採用不同螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
步驟7)流式細胞儀檢測:` 加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。進一步地，本發明還公開了所述步驟2)中，單細胞懸液與標記了不同螢光的單抗體的混合比例分別為:單細胞懸液與⑶3以體積計算為1:400、單細胞懸液與⑶4以體積計算為1:200、單細胞懸液與⑶69以體積計算為1:150 ;單細胞懸液與BrdU以體積質量比計算為1.5ul:1 ug、單細胞懸液與FoxP3以體積質量比計算為1.5ul:lug。作為進一步的優化，本發明還公開了步驟I)中所述單細胞懸液的終濃度為I X 107/ml,混勻後取IOOul的細胞懸液為實驗對象。同時，本發明還公開了所述步驟2)中，細胞懸液與⑶3、⑶4、⑶69在4°C的條件下結合孵育30分鐘，再用PBS洗滌2次。不僅如此，本發明還公開了所述步驟4)中，所得沉澱用細胞破膜輔液重複洗滌一次，充分混勻後離心，去上清。本發明在總體調節性T細胞中通過發現靶位找到具有實際調節功能的細胞群，並通過本發明公開的抗體染色方法，將這一特徵細胞群同時表徵並定量統計出來，達到科學量化具有抑制活性的調節性T細胞的目的，解決了目前業內普遍存在的因單純關注調節性T細胞總數量，而造成對免疫調控機能狀態錯判的問題；也科學解釋了調節機制在自體免疫病特別是I型糖尿病發生、發展的病理進程中的作用。同時，本發明所公開的特徵細胞群檢測方法，推廣到I型糖尿病患病及潛在發病人群，以外周靜脈血作為檢測樣本，從而為檢測調節性T細胞抑制活性、以及無創傷地篩選胰腺早期病變靶標奠定了基礎。
同時，本發明進一步公開了所述的用於表徵調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法在用於調節性T細胞抑制活性試劑盒中的應用。特別是在用於靶向檢測調節性T細胞抑制活性試劑盒中的應用。以及所述的用於表徵調節性T細胞抑制活性的方法在用於製備篩選胰腺早期病變靶標的試劑盒中的應用。特別是靶向檢測外周調節性T細胞抑制活性的方法在用於製備篩選胰腺早期病變靶標的試劑盒中的應用。從而克服了常規的血糖監測無法客觀並全面反映出自身免疫攻擊胰島細胞不同階段病變的局限，以及胰腺組織活檢帶來的手術創傷等併發症的難題。本文中FoxP3是指轉錄因子；BrdU是指5_溴脫氧尿嘧啶核苷。


圖1-1為處於模型第四周雌鼠的淋巴細胞流式細胞儀檢測結果；
圖1-2為處於模型第十周雌鼠的淋巴細胞流式細胞儀檢測結果；
圖1-3為處於模型第十六周雌鼠的淋巴細胞流失細胞儀檢測結果；
圖2為實施例10中處於疾病進程不同階段的雌鼠對應的特徵細胞群在調節性T細胞總量中佔比的曲線示意 圖3-1為實施例11中A組小鼠的淋巴細胞流式細胞儀檢測結果； 圖3-2為實施例11中B組小鼠的淋巴細胞流失細胞儀檢測結果；
圖4-1為處於模型第四周的雌鼠的胰臟染色標本；
圖4-2為A組小鼠的胰腺染色標本；
圖4-3為處於模型第十周的雌鼠的胰臟染色標本；
圖4-4為B組小鼠的胰腺染色標本；
圖4-5為處於模型第十六周的雌鼠的胰腺染色標本；
圖5為處於胰腺病變不同階段的雌鼠對應的特徵細胞群在調節性T細胞總量中佔比的曲線示意 圖6為實施例13中胰腺病變不同階段的雌鼠的血糖示意 圖7為實施例14中治療組與對照組雌鼠的特徵細胞群在調節性T細胞總量中佔比的最終狀態不意 圖8為實施例14中治療組與對照組雌鼠的血糖示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖進一步說明本發明，在以下實施例中，除非特別說明，否則用到的試劑、儀器、設備均為常規的符合相應功能性要求的市售產品。實施例1
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用 尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成I X lOVml,混勻後取IOOul為實驗對象。然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
混合標記的操作方法按照相關抗體的使用說明操作。經過標記的混合液以流式細胞洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，充分混勻後離心，去上清;
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻後離心，去上清，
得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘；
分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3))和脫氧核糖核酸複製(BrdU)的抗體，所述的BrdU、FoxP3分別不同的螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
將沉澱通過流式細胞儀檢測:
加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。針對我們的發明目的，上述染色方法有效地選擇這些代表淋巴細胞特有屬性的分子標誌，並且考慮去除非特異染色的幹擾，既利用各分子的獨有標誌，又可將其和其它分子標誌聯合來界定新的功能標的。

實施例2
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成I X lOVml,混勻後取IOOul為實驗對象。然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
在本實施例中優選單細胞懸液與螢光抗體的稀釋比例分別為:單細胞懸液與CD3以體積計算為1:400、單細胞懸液與⑶4以體積計算為1:200、單細胞懸液與⑶69以體積計算為1:150，不同比例稀釋後達到體積重量比為Iul:1 ug ；而單細胞懸液與BrdU以體積質量比計算為1.5ul:1 ug、單細胞懸液與FoxP3以體積質量比計算為1.5ul:lug。經過標記的混合液以流式細胞洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，充分混勻後離心，去上清;
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻後離心，去上清；
得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘；
將經過抗體Fe阻斷劑作用後的溶液中分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子和脫氧核糖核酸複製的抗體(分別不同螢光標記BrdU、FoxP3)，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。體現了在實驗實施中，優化抗體濃度和劑量，保障統計結果的穩定和抗體高效作用。實施例3
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成I X lOVml,混勻後取IOOul為實驗對象。然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；細胞懸液與
⑶3、⑶4、⑶69在4°C的條件下結合孵育30分鐘，再用PBS洗滌2次。經過標記的混合液以流式細胞洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，洗滌後離心，取沉澱；
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，洗滌， 離心，取沉澱，
得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘；
將經過抗體Fe阻斷劑作用後的溶液中分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3))和脫氧核糖核酸複製(BrdU)的抗體，所述的BrdU、FoxP3分別不同的螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。我們優化實驗需要的溫度、孵化時間等條件，從而在同一個細胞樣品中檢測兩種不同的膜內細胞器的功能狀態，改進了傳統的染色方法。
實施例4
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成I X lOVml,混勻後取IOOul為實驗對象。然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
經過標記的混合液以流式細胞洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，洗滌後離心，取沉澱；
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，洗滌，離心，取沉澱，所得沉澱用細胞破膜輔液重複洗滌一次，離心，取沉澱；得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘；
將經過抗體Fe阻斷劑作用後的溶液中分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3))和脫氧核糖核酸複製(BrdU)的抗體，所述的BrdU、FoxP3分別不同的螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。從而優化了兩種膜內細胞器的抗體滴度和劑量。實施例5
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成I X lOVml,混勻後取IOOul為實驗對象。然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別 與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
在本實施例中優選單細胞懸液與螢光抗體的稀釋比例分別為:單細胞懸液與CD3以體積計算為1:400、單細胞懸液與⑶4以體積計算為1:200、單細胞懸液與⑶69以體積計算為1:150，不同比例稀釋後達到體積重量比為Iul:1 ug ；而單細胞懸液與BrdU以體積質量比計算為1.5ul:1 ug、單細胞懸液與FoxP3以體積質量比計算為1.5ul:lug。細胞懸液與⑶3、⑶4、⑶69在4°C的條件下結合孵育30分鐘，再用PBS洗滌2次。經過標記的混合液以流式細胞洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，洗滌後離心，取沉澱；
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，洗滌，離心，取沉澱，
得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘；
將經過抗體Fe阻斷劑作用後的溶液中分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3))和脫氧核糖核酸複製(BrdU)的抗體，所述的BrdU、FoxP3分別不同的螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。實施例6
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成I X lOVml,混勻後取IOOul為實驗對象。然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；經過標記的混合液以流式細胞洗液100 μ I調勻，加入細胞破膜裂解液100 μ 1，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，洗滌後離心，取沉澱；
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液100μ 1，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，洗滌，離心，取沉澱，
得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘；
將經過抗體Fe阻斷劑作用後的溶液中分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子和脫氧核糖核酸複製的抗體(分別不同螢光標記BrdU、FoxP3)，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。實施例7
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成IX lOVrnl，混勻後取IOOul為實驗對象。

然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
經過標記的混合液以流式細胞洗液100 μ I調勻，加入細胞破膜裂解液100 μ 1，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，洗滌後離心，取沉澱；
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液100μ 1，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌，離心，取沉澱，
得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑10 μ 1，充分作用20分鐘；
將經過抗體Fe阻斷劑作用後的溶液中分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3))和脫氧核糖核酸複製(BrdU)的抗體，所述的BrdU、FoxP3分別不同的螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
將沉澱通過流式細胞儀檢測:
加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。實施例8
採集受檢者外周靜脈血，將待測外周靜脈血處理並從中分離T細胞，具體的分離方式可以參照現有技術。採用尼龍膜網過濾分離法得到單核細胞後，製備形成單細胞懸液，為了便於後續的染色等操作，通常我們將單細胞懸液濃度製備成I X lOVml,混勻後取IOOul為實驗對象。然後我們對單細胞懸液中的特徵細胞群進行抗體染色，具體的操作步驟如下: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
在本實施例中優選單細胞懸液與螢光抗體的稀釋比例分別為:單細胞懸液與CD3以體積計算為1:400、單細胞懸液與⑶4以體積計算為1:200、單細胞懸液與⑶69以體積計算為1:150，不同比例稀釋後達到體積重量比為Iul:1 ug ；而單細胞懸液與BrdU以體積質量比計算為1.5ul:1 ug、單細胞懸液與FoxP3以體積質量比計算為1.5ul:lug。細胞懸液與⑶3、⑶4、⑶69在4°C的條件下結合孵育30分鐘，再用PBS洗滌2次。經過標記的混合液以流式細胞洗液100 μ I調勻，加入細胞破膜裂解液100 μ 1，混勻後，在冰上或者與冰上相同的溫度條件下孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液進行洗滌，洗滌後離心，取沉澱；
將新鮮配製脫氧核糖核酸酶液100μ 1，加入到前述步驟中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌，離心，取沉澱，
得到的沉澱中加入抗體Fe阻斷劑10 μ 1，充分作用20分鐘； 將經過抗體Fe阻斷劑作用後的溶液中分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3))和脫氧核糖核酸複製(BrdU)的抗體，所述的BrdU、FoxP3分別不同的螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清；
將沉澱通過流式細胞儀檢測:
加入流式細胞洗液充分混勻後離心，去上清，加入500ul流式細胞洗液，流式細胞儀檢測得到染色的活性調節性T細胞的佔比。實施例10 調節性T細胞抑制活性檢驗
本實施例的設計思路，是通過造模技術，人工構造由於遠端器官免疫應答直接攻擊胰島細胞發生I型糖尿病模型，利用這一模型構造可預測的調節性T細胞抑制活性的相應變化模型，並根據本發明所公開的技術手段跟蹤監測模型不同階段的小鼠特徵細胞群的動態變化狀態，期待形成一個具有規律性的關係。為了更為準確的獲得相關的關係，我們以每半周為一個時間點，按照如下的方式獲得了相關曲線。在本實施例中為了便於說明，我們僅選取了其中具有代表性的三個時間點進行相關說明，但是其他的時間點均在此曲線允許的平均值、標準值偏移範圍內。操作方式:
第一步，I型糖尿病的動物模型建立NOD小鼠分取三組作為實驗對象:
A.1組4周齡雌性鼠隨機抽取8隻；
2組10周齡雌性鼠且連續2天尾靜脈血糖低於200mg/dl隨機抽取8隻；
3組16周齡雌性鼠且連續2天尾靜脈血糖高於350mg/dl隨機抽取8隻作為實驗對象。B.各組實驗NOD小鼠分別服用含有DNA precursor 一 5-bromo-2_deoxyuridine (市售)的無菌水，濃度為lmg/ml充分溶解,連續5天飲養,期間觀察一般狀態包括:活動、飲食、飲水、糞便無明顯異常，並監測記錄尾靜脈血糖值。注意將5-bromo-2-deoxyuridine每天新鮮配製並避光操作。C.將各實驗組動物的脾臟、胰腺周圍淋巴結製備單細胞懸液，終濃度為1X107 / ml。D.將製備好脾臟及淋巴細胞單細胞懸液用於抗體染色，單細胞懸液與螢光抗體的稀釋比例分別為:單細胞懸液與⑶3以體積稀釋為1:400、單細胞懸液與⑶4以體積稀釋為1:200、單細胞懸液與⑶69以稀釋計算為1:150，不同比例稀釋後達到抗體體積重量比為Iul:1 ug;單細胞懸液與BrdU抗體以體積重量比計算為1.5ul:1 ug、單細胞懸液與抗體FoxP3以體積重量比計算為1.5ul:lug。細胞懸液與⑶3、⑶4、⑶69在4°C的條件下結合孵育30分鐘，再用PBS洗滌2次。E.細胞懸液以流式細胞洗液IOOul調勻，加入細胞破膜裂解液lOOul，混勻冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200ul洗滌細胞懸液，離心後倒掉上清。F.新鮮配製DNase液，IOOul加入細胞，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液200ul洗滌細胞懸液，離心後倒掉上清，重複洗滌一次。G.加入抗體Fe阻斷劑，IOul充分作用20分鐘。H.加入細胞核轉錄因子和分化活化檢測抗體，分取1.5ul螢光標記抗體冰上孵育，再用細胞破膜輔液200ul洗滌細胞懸液，離心後倒掉上清，最後流式細胞洗液200ul再次洗滌細胞，離心後倒掉上清，最終加入500ul流式細胞洗液，上流式細胞儀檢測。檢測結果如圖1-1至圖1-3所示，隨著模型中小鼠的患病時間延長，其調節性T細胞的抑制活性應該逐漸降低，我們分別統計圖1-1至圖1-3中的染色後的特徵細胞群中的細胞數量，並通過統計學分析，計算特徵細胞群組在調節性T細胞總量中的佔比，得到如圖2所示的曲線圖，發現隨著時間的推移，特徵細胞群細胞在調節性T細胞總量中的佔比逐漸下降，與調節性T細胞的抑制活 性是相對應，並呈現正相關。我們將圖2中所示的曲線及其相關數據作為調節性T細胞的抑制活性標準參考數據；並且以特徵細胞群組的佔比作為活性指標衡量參數。位於曲線上端的點相應的調節性T細胞抑制活性高，向曲線下端移動，越靠近下端的點其對應的調節性T細胞抑制活性越低。實施例11 調節性T細胞抑制活性曲線圖的應用與驗證
第一步驟:按照實施例10中的I型糖尿病的動物模型建立方式造模。第二步驟:隨機選取不同階段的小鼠進行實驗。第三步驟:
3-1.分別採集小鼠A組、B組的外周靜脈血，並按照實施例8中的方式進行處理、分析，獲得對應的染色的調節性T細胞數量，如圖3-1和圖3-2所示。通過統計學分析，計算特徵細胞群組在調節性T細胞總量中的佔比，其中小鼠A組的佔比數據為29，小鼠B組的佔比數據為16。3-2.將3-1中採集完外周靜脈血的小鼠A組、B組進行胰腺摘取、染色，用於檢驗相應胰腺狀態下所呈現的調節性T細胞抑制活性是否與3-1中通過標準曲線獲得的的數據對應。具體的操作可以參考如下步驟，
1.在無菌條件下，常規麻醉和手術操作，分離胰腺組織。2.胰腺組織以福馬林固定，胰腺組織石蠟包塊，常規製備成4um的切片。3.切片經過脫蠟、水化、染色及封片完成。每個小鼠的胰腺組織至少連續備片10張作為標本。每隔3張單染一片蘇木精一伊紅染色，顯微鏡檢查。4.蘇木精一伊紅染色之間的白片分別以DAPI和德克薩斯紅標記的胰島素抗體進行單片同染，胰島素抗體為1:50倍稀釋，2小時孵育後PBS洗片，加孵DAPI染色，PBS清洗，以螢光顯微鏡檢查。5.蘇木精一伊紅染色可以形態上顯現健康狀態下的胰島結構或是淋巴細胞侵潤破壞胰島時的狀態。6.而DAPI和德克薩斯紅染色可以同比顯示胰島形態和結構，周邊是否有淋巴細胞侵潤，侵潤後的胰島結構首否破壞，並且胰島分泌胰島素的數量是否正常 或減少，通過病理檢查可以診斷免 疫攻擊胰島β細胞狀態以及病變程度和所處階 段。胰臟的切片標本染色結果參見圖4-2 (小鼠A組)和圖4-4 (小鼠B組)，為了便於觀察我們將實施例10中，第四周、第十周、第十六周的胰臟按照本實施例3-2中的標本製作方式進行處理，分別如圖4-1、4-3、4-5所示。可以看出小鼠A的胰臟病理表現出一道周圍淋巴細胞浸潤、形態改變以及胰島素分泌減少，且其嚴重程度位於圖4-1與圖4-3顯示的病理表現之間；也就是說位於第四周與第十周之間，與佔比數據16所對應的小鼠所處的病理時間相對應。同時我們可以看出小鼠B的胰臟病理表現出更為嚴重淋巴細胞侵入胰腺，造成胰島素染色明顯減少的狀態。觀察其染色結果，其病理表現位於圖4-3與4-5顯示的病理表現之間，也就是說此小鼠B位於第十周到第十六周的模型階段，與佔比數據29所對應的小鼠所處的病理時間相對應。實施例12篩選胰腺早期病變靶標
本實施例的設計思路，是通過造模技術，人工構造由於遠端器官免疫應答直接攻擊胰島細胞發生I型糖尿病模型，並根據本發明所公開的技術手段跟蹤監測模型不同階段的小鼠特徵細胞群的動態變化狀態，並期待形成一個具有規律性的關係。為了更為準確的獲得相關的關係，我們以每半周為一個時間點，按照如下的方式獲得了相關曲線。在本實施例中為了便於說明，我們僅選取了其中具有代表性的三個時間點進行相關說明，但是其他的時間點均在此曲線允許的平均值、標準值偏移範圍內。第一步驟:按照實施例10中的I型糖尿病的動物模型建立方式造模。第二步驟:分取三組作為實驗對象，
I組4周齡雌性鼠隨機抽取8隻；
2組10周齡雌性鼠且連續2天尾靜脈血糖低於200mg/dl隨機抽取8隻；
3組16周齡雌性鼠且連續2天尾靜脈血糖高於350mg/dl隨機抽取8隻作為實驗對象。第三步驟:3-1.分別採集小鼠I組、2組、3組的外周靜脈血，並按照實施例8中的方式進行處理、分析，獲得對應的染色的調節性T細胞數量，如圖1-1、圖1-2和圖1-3所示。通過統計學分析，計算特徵細胞群組在調節性T細胞總量中的佔比，其中小鼠I組的佔比數據為32，小鼠2組的佔比數據為18.5，小鼠3組的佔比數據為13。3-2.將3-1中採集完外周靜脈血的小鼠I組、2組、3組進行胰腺摘取、染色，具體的操作可以參考如下步驟，
1.在無菌條件下，常規麻醉和手術操作，分離胰腺組織。2.胰腺組織以福馬林固定，胰腺組織石蠟包塊，常規製備成4um的切片。3.切片經過脫蠟、水化、染色及封片完成。每個小鼠的胰腺組織至少連續備片10張作為標本。每隔3張單染一片蘇木精一伊紅染色，顯微鏡檢查。4.蘇木精一伊紅染色之間的白片分別以DAPI和德克薩斯紅標記的胰島素抗體進行單片同染，胰島素抗體為1:50倍稀釋，2小時孵育後PBS洗片，加孵DAPI染色，PBS清洗，以螢光顯微鏡檢查。5.蘇木精一伊紅染色可以形態上顯現健康狀態下的胰島結構或是淋巴細胞侵潤破壞胰島時的狀態。6.而DAPI和德克薩斯紅染色可以同比顯示胰島形態和結構，周邊是否有淋巴細胞侵潤，侵潤後的胰島結構首否破壞，並且胰島分泌胰島素的數量是否正常
或減少，通過病理檢查可以診斷免疫攻擊胰島β細胞狀態以及病變程度和所處階 段。檢測結果如 圖1-1至圖1-3所示，隨著模型中小鼠的患病時間延長，其調節性T細胞的抑制活性應該逐漸降低，我們分別統計圖1-1至圖1-3中的染色後的特徵細胞群中的細胞數量，並通過統計學分析，計算特徵細胞群組在調節性T細胞總量中的佔比，得到如圖2所示的曲線圖，發現隨著時間的推移，特徵細胞群細胞在調節性T細胞總量中的佔比逐漸下降。我們將圖4-1、圖4-3以及圖4-5中反應出的胰腺狀態作為橫坐標的參考基礎，並以其所在的模型階段作為橫坐標，得到圖5中所示的曲線，並以這一曲線作為胰腺病變狀態的參考標準。位於曲線上端的點相應的胰腺處於病變初期，向曲線下端移動，越靠近下端的點其對應的胰腺處於病變越晚期。實施例13 不同方式篩選胰腺早期病變靶標的對比試驗
第一步驟1:按照實施例 ο中的I型糖尿病的動物模型建立方式造模。第二步驟:分取三組作為實驗對象，
I組4周齡雌性鼠隨機抽取8隻；
2組10周齡雌性鼠且連續2天尾靜脈血糖低於200mg/dl隨機抽取8隻；
3組16周齡雌性鼠且連續2天尾靜脈血糖高於350mg/dl隨機抽取8隻作為實驗對象。第三步驟:分別採集小鼠I組、2組、3組的外周靜脈血，然後分別進行以下實驗， 3-1.按照實施例8中的方式進行處理、分析，獲得對應的染色的調節性T細胞數量，如
圖1-1、圖1-2和圖1-3所示。通過統計學分析，計算特徵細胞群組在調節性T細胞總量中的佔比，其曲線圖如圖5所示。
3-2.按照血糖的檢測方法，分別檢測I組、2組、3組對應的血糖含量，其曲線圖對應如圖6所示。圖中橫線所在縱坐標值為正常的臨界值，位於臨界值以下的為血糖正常，位於臨界值以上的為血糖異常。3-3.將採集完外周靜脈血的小鼠I組、2組、3組進行胰腺摘取、染色，具體的操作可以參考如下步驟，
1.在無菌條件下，常規麻醉和手術操作，分離胰腺組織。2.胰腺組織以福馬林固定，胰腺組織石蠟包塊，常規製備成4um的切片。3.切片經過脫蠟、水化、染色及封片完成。每個小鼠的胰腺組織至少連續備片10張作為標本。每隔3張單染一片蘇木精一伊紅染色，顯微鏡檢查。4.蘇木精一伊紅染色之間的白片分別以DAPI和德克薩斯紅標記的胰島素抗體進行單片同染，胰島素抗體為1:50倍稀釋，2小時孵育後PBS洗片，加孵DAPI染色，PBS清洗，以螢光顯微鏡檢查。5.蘇木精一伊紅染色可以形態上顯現健康狀態下的胰島結構或是淋巴細胞侵潤破壞胰島時的狀態。6.而DAPI和德克薩斯紅染色可以同比顯示胰島形態和結構，周邊是否有淋巴細胞侵潤，侵潤後的胰島結構首否破壞，並且胰島分泌胰島素的數量是否正常
或減少，通過病理檢查可以診斷免疫攻擊胰島β細胞狀態以及病變程度和所處階 段。染色的標本結果見圖4-1、圖4-3以及圖4-5。由以上實驗結果可以看出，當模型處於10周時，小鼠的胰腺已經發生病變，但是血糖測試中，仍然處於正常狀態範圍內，因此通過血糖作為I型糖尿病發生、發展的監測手段具有缺陷性，不能及時篩選出早期病變的靶標，延誤治療時機。而通過本發明所公開的染色方法獲得的調節性T細胞中特徵細胞群的佔比數據，可以及時反映胰腺的病理變化進程，特別是在12周之前，也就是臨界血糖值以下的盲點範圍內。如果直接通過胰腺組織活體檢驗雖然可以準確獲得胰腺病變的判斷，但是這種方式需要活體採樣，對患者造成手術創傷和手術風險。基於準確性的原則，我們將利用本發明公開的特徵細胞群檢測為基礎的方法與傳統的活檢方式進行了應用價值的比對，結果如表2 。表權利要求
1.一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法，其特徵是該方法包括以下步驟: 步驟I)將待測樣本處理，形成單細胞懸液； 步驟2)特徵細胞群的抗體染色: 將上述單細胞懸液分別與螢光抗體⑶3、⑶4、⑶69混合； 步驟3)混合液以流式細胞洗液調勻，加入細胞破膜裂解液，混勻冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻後離心，去上清； 步驟4)新鮮配製脫氧核糖核酸酶液，加入到步驟4)中所得沉澱中，混勻後孵育60分鐘，再用細胞破膜輔液，充分混勻後離心，去上清， 步驟5)加入抗體Fe阻斷劑，充分作用20分鐘； 步驟6)分別加入檢測標記調節細胞表位的轉錄因子(FoxP3)和脫氧核糖核酸複製(BrdU)的抗體；所述的BrdU、FoxP3分別採用不同螢光標記，分取1.5 μ I抗體冰上孵育30分鐘，再用細胞破膜輔液200 μ 1，洗滌細胞懸液，充分混勻後離心，去上清； 步驟7)流式細胞儀檢測: 加入流式細胞洗液500ml，充分混勻後離心，去上清，加入流式細胞洗液，流式細胞儀上機檢測。
2.根據權利要求1所述的一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的染色檢測方法，其特徵是:所述步驟2)中，單細胞懸液與螢光抗體的稀釋比例分別為:單細胞懸液與⑶3以體積計算為1:400、單細胞懸液與⑶4以體積計算為1:200、單細胞懸液與⑶69以體積計算為1:150，不同比例稀釋後達到體積重量比為Iul:1 Ug ；而單細胞懸液與BrdU以體積質量比計算為1.5ul:1 ug、單細胞懸液與FoxP3以體積質量比計算為1.5ul:lug。
3.根據權利要求1所述的一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法，其特徵是:步驟I)中所述單細胞懸液的終濃度為lX107/ml。
4.根據權利要求1所述的一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法，其特徵是:所述步驟2)中，細胞懸液與⑶3、⑶4、⑶69在4°C的條件下結合孵育30分鐘，再用PBS洗滌2次。
5.根據權利要求1所述的用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法，其特徵是:所述步驟4)中，所得沉澱用細胞破膜輔液重複洗滌一次，混勻後離心，去上清。
6.權利要求1至5中任意一項所述的檢測方法在用於製備調節性T細胞抑制活性檢驗試劑盒中的應用。
7.權 利要求1至5中任意一項所述的檢測方法在用於製備篩選胰腺早期病變靶標的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥領域，特別是涉及一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法及其應用，更為具體的說是涉及一種用於表徵外周調節性T細胞抑制活性的特徵細胞群的檢測方法及其在用於製備調節性T細胞抑制活性檢驗試劑盒中的應用、以及在用於製備篩選胰腺早期病變靶標的試劑盒中的應用。否定了外周免疫調節細胞群與它應具備的調節功能間存在矛盾，免疫調節細胞的數量高低與它應該發揮的作用無關的業內普遍理論，找到了一組對調節性T細胞抑制活性具有表徵價值的細胞群，並進一步公開了相應的細胞群檢測方法，從而對調節性T細胞抑制活性，以及篩選胰腺早期病變靶標奠定了重要的基礎。
文檔編號G01N33/66GK103235135SQ20131015013
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月26日 優先權日2013年4月26日
發明者史其新 申請人:史其新