生產3－o－鈍化－4』－單磷醯基脂a(3d－mla)的方法
2023-10-11 09:29:44 2
專利名稱：生產3－o－鈍化－4』－單磷醯基脂a(3d－mla)的方法
相關申請的引用本申請是2001年3月30日申請的U.S.臨時申請No.60/280,089的非臨時申請，其要求U.S.臨時申請No.60/280,089的利益。
關於在聯邦政府資助的研究和開發下所取得的發明之權利的聲明是不適用的發明背景1.發明領域本發明主要涉及3-O-脫醯基化單磷醯基脂A(3D-MLA)的生物合成生產領域。更特別地，其涉及改善所期望的3D-MLA同系物的收率或者將純化3D-MLA的脂多糖(LPS)前體的成本減到最少的方法。
2.相關領域描述很久以前就已經認識到腸細菌脂多糖(LPS)是免疫系統的有效刺激物。亞微克數量的LPS能夠引起多種反應，包括有益的和有害的。這些反應中的一些是有害的，其中一些可以是致命的，這一事實阻礙了LPS本身的臨床應用。已經觀察到負責內毒素活性的最主要原因的LPS成分是脂A。
因此，已經作了許多努力來減弱LPS或脂A的毒性而不減少這些化合物的免疫刺激益處。這些成果中著名的為Edgar Ribi和其同事的成果，該成果導致生產出脂A衍生物3-O-脫醯基化-4』-單磷醯基脂A(3D-MLA；含有3D-MLA的組合物以商品名MPL從Corixa公司(Seattle，WA)商購可得)。3D-MLA顯示出具有與脂A基本上同樣的免疫刺激特性，但是具有較低的內毒性(Myers等人，U.S.Pat.No.4,912,094)。Myers等人還報導了生產3D-MLA的方法，該方法如下。首先，將從革蘭氏陰性細菌(例如明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota)R595)深度粗糙突變體菌株獲得的LPS或脂A在中等強度的無機酸溶液(例如0.1N HCl)中回流大約30分鐘。這導致在脂A還原性末端葡糖胺的1位上的去磷酸化和在脂A非還原性葡糖胺的6′位上的去糖基化(decarbohydrate)。其次，將去磷酸化並去糖基化的脂A(亦稱為單磷醯基脂A或MLA)進行鹼水解，例如通過將其溶解在有機溶劑如氯仿∶甲醇(CM)2∶1(v/v)中，並用pH 10.5的0.5M Na2CO3水溶液使該溶液飽和，然後快速蒸發溶劑。這導致選擇性地去除在脂A的3位上的β-羥基肉豆蔻酸部分，從而獲得3-O-脫醯基化-4』-單磷醯基脂A(3D-MLA)。
通過上述方法生產所得的3D-MLA的質量高度依賴於從革蘭氏陰性細菌獲得的LPS的純度和組成。例如，LPS的脂A成分為含有大約5-7個脂肪酸部分的緊密相關種類的混和物。從上面的討論中清楚的看出，在3D-MLA的形成中除去了1個脂肪酸部分，從而得到具有大約4-6個脂肪酸部分的3D-MLA。一般認為，根據保留的或增強的免疫刺激益處、減低的毒性和其他所期望的特性(Qureshi和Takayama，「The Bacteria」，Vol.XI(Iglewski和Clark編)，AcademicPress，1990，pp.319-338)的組合，具有至少6個脂肪酸部分的3D-MLA是優選的。
又例如，從革蘭氏陰性細菌中LPS進行商業規模的提取一般包括Chen方法(Chen等人，J.Infect.Dis.128543(1973))；即用CM提取，這導致形成富含LPS和磷脂的CM相，從中隨後能夠純化出LPS。可是，從富含LPS和磷脂的CM相中純化LPS一般需要多重沉澱步驟來獲得對於在免疫刺激應用中的使用(例如用作疫苗佐劑)足夠純的LPS。
因此，期望獲得方便地製備高純度LPS組合物的方法。此外，期望獲得產生LPS組合物的方法，該組合物含有具有增加的己醯基同系物水平的3D-MLA。
已知的發酵技術已用於製備含有能夠容易純化的LPS的革蘭氏陰性細菌培養物。這些已知的技術一般包括在穩定期的早期收穫細菌培養物，這與標準細菌學準則一致。可是發現根據已知條件所產生的LPS的醯基化程度是可變的。例如，明尼蘇達沙門氏菌R595的脂A中庚醯基種類的含量依賴於批次而可以在20％-80％之間變化(Rietschel等人，Rev.Infect.Dis.9S527(1987))。這種庚醯基同系物含量的可變性將導致從這些LPS批次中製備的3D-MLA中己醯基同系物含量的顯著差異。
發明概述在一個實施方案中，本發明涉及生產脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)在培養基中培育深度粗糙突變體細菌菌株的培養物；(b)將該培養物在穩定期保持至少大約2小時；(c)從培養物中收穫細胞；和(d)從細胞中提取LPS。
該方法允許LPS的生產，其中該LPS可生產出具有相對高比例的(即至少大約20mol％)含有6個脂肪酸部分的同系物的3D-MLA。
在另一個實施方案中，本發明涉及從深度粗糙突變體細菌菌株細胞的培養物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1-4個碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細胞，從而產生出具有減少的磷脂含量的細胞；(b)用含有氯仿和甲醇的溶液(CM)提取具有減少的磷脂含量的細胞，從而獲得LPS的CM溶液。
該方法提供了LPS的CM溶液，其具有減少的磷脂含量，並因此適合於進行進一步的修飾和純化而得到3D-MLA。該方法包括相對簡單和不貴的步驟。
附圖簡述下面的附圖形成本說明的一部分，並被包括在本發明之中來進一步證明本發明的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖並結合此處給出的特定實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。
圖1顯示了在乙醇提取期間用不同溫度獲得的乙醇提取物和LPS樣品的TLC板。左邊的平板從左至右顯示了於22℃、37℃和50℃的溫度時的乙醇提取物。該平板最右邊的樣品為真正的LPS樣品。右邊的平板顯示了從各個製備物中獲得的LPS。道3、4和5中的樣品分別相應於從經過在22℃、37℃和50℃用乙醇預提取的細胞中獲得的LPS。在Rf～0.6的濃重的帶相應於磷脂和脂肪酸雜質。這些雜質的水平通過增加乙醇提取的溫度而減少，其在於50℃預提取的樣品中是非常低的。
說明性實施方案的描述在一個實施方案中，本發明涉及生產脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)在培養基中培育深度粗糙突變體細菌菌株的培養物；(b)將該培養物在穩定期保持至少大約2小時；(c)從培養物中收穫細胞；和(d)從細胞中提取LPS。
脂多糖是革蘭氏陰性細菌外膜的外小葉中主要的脂類組分。除了其他成分之外，革蘭氏陰性細菌的脂多糖部分還含有脂A。正如已經描述的，脂A能夠進行去糖基化和部分去磷酸化從而生產單磷醯基脂A(MLA)，MLA能夠在3位選擇性地進行脫醯基化從而產生3-O-脫醯基化-4』-單磷醯基脂A(3D-MLA)。
可是，通過革蘭氏陰性細菌產生的脂A一般含有許多具有相同的總的脂A結構但在它們含有的脂肪酸部分的數量上不同的種類。具有相同脂肪酸數量的脂A種類的群體此處被稱為「同系物」。通過革蘭氏陰性細菌如明尼蘇達沙門氏菌R595的標準商業規模培養可生產出具有4-7個脂肪酸部分的脂A同系物。因此，從例如明尼蘇達沙門氏菌R595脂A中生產出的3D-MLA具有一般為3-6個脂肪酸部分的同系物組成(因為3D-MLA經歷了1個脂肪酸部分的損失)。
3D-MLA(通過脂A和MLA)同系物組成中的異質性可歸因於兩個原因(1)在脂A裝配中生物合成的可變性和(2)在加工成3D-MLA期間從脂A主鏈上脂肪酸部分的損失。雖然不想受制於理論，但是除了其他解釋之外相信是由於參與脂A生物合成最終步驟的醯基轉移酶的非完全底物特異性，所以生物合成的可變性才會發生。在一般於3D-MLA產生中使用的酸和鹼水解期間也可能發生從脂A主鏈上脂肪酸部分的損失。
令人驚訝地發現通過改變培養產生脂A的深度粗糙突變體細菌菌株的過程的參數能夠改變3D-MLA同系物組成。特別是發現在收穫之前將深度粗糙突變體細菌菌株的培養物在穩定期保持至少大約5小時可導致如此生產的脂A同系物比例的改變，以致一般地至少大約20mol％的隨後從脂A生產出的3D-MLA含有6個脂肪酸。優選地，至少大約50mol％的3D-MLA含有6個脂肪酸。已經發現在穩定期大約5.5小時的保持時間是特別有效的。這有別於本領域中已知的一般的培養程序，在一般的培養程序中收穫幾乎在培養進入穩定期之後立即進行；在已知的程序中，LPS的同系物含量是高度可變的，並導致具有可變己醯基同系物含量的3D-MLA。
「深度粗糙突變體細菌菌株」表示具有深度粗糙表型的革蘭氏陰性細菌。「深度粗糙」表型表示連接到脂A上的多糖部分只由大約2-3個2-酮-3-脫氧-D-甘露辛酮糖酸(mannooctulonic acid)(KDO)殘基組成。優選地，深度粗糙突變體細菌菌株選自沙門氏菌(Salmonella)屬。如果深度粗糙突變體細菌菌株屬於沙門氏菌屬，則更優選地其屬於明尼蘇達沙門氏菌種，更加優選地其為明尼蘇達沙門氏菌R595菌株。可以使用其他深度粗糙突變體細菌菌株，除了別的以外例如奇異變形菌(Proteus mirabilis)菌株。
可以使用任何適合於培養深度粗糙突變體細菌菌株的技術。一般地，這將包括至少一種商業規模生物反應器的使用。在一個實施方案中，技術包括將深度粗糙突變體細菌菌株的細胞接種入相對小的(例如15L)生物反應器中，培養深度粗糙突變體細菌菌株直至穩定期，隨後將15L細胞培養液無菌轉移到大的(例如750L)生物反應器中。
該培養可以在任何已知或發現能夠讓深度粗糙突變體細菌菌株生長的培養基上進行。在一個優選的實施方案中，培養基為M9，其為補充了葡萄糖和酪蛋白胺基酸的無機鹽混和物。M9的組成對於本領域的普通技術人員是熟知的。
將深度粗糙突變體細菌菌株在穩定期保持至少大約5小時之後，可以從培養物中收穫細胞並從細胞中提取LPS。雖然下面描述了用於從細胞中提取LPS的優選的技術，但是可以使用已知的技術來從培養物中收穫細胞和從細胞中提取LPS。
收穫可以通過任何已知的技術來進行。在一個優選的實施方案中，將細胞培養物在穩定期保持至少大約5小時之後，將生物反應器的內含物抽至切向過濾裝置以分離開用過的培養基和細胞。
然後通過任何適當的技術從細胞中提取LPS。已知的技術包括Galanos方法，其包括用苯酚、氯仿和石油醚的混和物(PCP)提取LPS，隨後蒸發掉氯仿和石油醚，添加丙酮和水以沉澱LPS，和通過離心或過濾回收LPS(Galanos等人，Eur.J.Biochem.9245(1969))；和上面引用的Chen方法，其包括用氯仿和甲醇(CM)的混和物提取LPS，隨後進行一系列的甲醇沉澱步驟。
Chen方法的改進描述於下，其對於用於商業應用的LPS及其衍生物的生產是優選的。
不管提取技術，結果是基本上純的乾燥LPS，其可以通過順次的酸水解和鹼水解進一步進行加工從而形成3D-MLA，Ribi(U.S.Pat.No.4,436,727)和Myers等人(U.S.Pat.No.4,912,094)教導了這一點，因此於此處引用這些文獻作為參考。概括這些參考文獻的技術為用於形成3D-MLA的優選實施方案，將LPS與有機或無機酸反應，然後經過凍幹而生產出MLA。無機酸優選地為鹽酸、硫酸或磷酸。有機酸優選地為甲苯磺酸或三氯乙酸。反應可以在大約90℃至大約130℃的溫度進行足夠的時間以完全水解，通常進行大約15分鐘至大約60分鐘。MLA可以用溶劑(優選的為丙酮)處理以溶解脂肪酸和其他雜質，然後除去富含雜質的脂肪酸溶劑。
此後將MLA經歷溫和的鹼處理以選擇性地從MLA的3位上去除β-羥基肉豆蔻酸(在溫和的鹼性條件下，只有在3位上的β-羥基肉豆蔻酸是不穩定的)。溫和的鹼處理可以在含水的或有機的介質中進行。除了別的以外，合適的有機溶劑還包括甲醇或其他醇、二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、氯仿、二氯甲烷或者其混和物。也可以使用水和與水易混和的有機溶劑的聯合物。
用於進行水解的鹼優選地選自氫氧化物、碳酸鹽、磷酸鹽或胺。除了別的以外，舉例說明的無機鹼還包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀。除了別的以外，舉例說明的有機鹼還包括烷基胺(除了別的以外，例如二乙胺和三乙胺)。
在含水的介質中，pH一般為大約10至大約14，優選地為大約10至大約12。水解反應一般在大約20℃至大約80℃進行，優選地在大約50℃至大約60℃進行，該反應進行大約10分鐘至大約48小時的時間。
用於鹼水解的一個優選技術包括將MLA溶解在CM 2∶1(v/v)中，用pH 10.5的0.5M Na2CO3緩衝水溶液使該溶液飽和，然後在真空抽吸裝置(大約100mmHg)下於45-50℃快速蒸發溶劑。
在另一個實施方案中，本發明涉及從深度粗糙突變體細菌菌株細胞的培養物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1-4個碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細胞，從而產生出具有減少的磷脂含量的細胞；(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有減少的磷脂含量的細胞，從而獲得LPS的氯仿和甲醇溶液。
深度粗糙突變體細菌菌株細胞、其培養物和製備培養物的方法如上所述。優選地，深度粗糙突變體細菌菌株選自沙門氏菌屬或埃希氏菌(Escherichia)屬。如果深度粗糙突變體細菌菌株屬於沙門氏菌屬，則更優選地其屬於明尼蘇達沙門氏菌種，更加優選地其為明尼蘇達沙門氏菌R595菌株。如果深度粗糙突變體細菌菌株屬於埃希氏菌屬，則更優選地其屬於大腸桿菌(Escherichia coli)種，更加優選地其為大腸桿菌D31m4菌株。
第一個提取步驟可以用任何短鏈脂族醇來進行。脂族醇可以是線性的、分枝的或環狀的。優選地，脂族醇具有2-4個碳原子並易於和水混和。更優選地，脂族醇為乙醇。
含有脂族醇的溶液可以含有任何比例的75wt％或更高的脂族醇。優選地，溶液含有大約85wt％至大約95wt％的脂族醇。溶液的平衡基本上是水。作為脂族醇和溶液的水成分的不完全純或其他汙染的結果，可以存在微量的其他化合物。
進行第一個提取步驟的溫度可以是任何對於從培養細胞中充分提取磷脂有效的溫度。優選地，溫度為大約35℃至大約65℃。更優選地，溫度為大約45℃至大約55℃。
第一個提取步驟的其他參數(除了別的以外)為例如脂族醇溶液的添加速率、溶液和細胞的接觸持續時間以及攪拌或不攪拌，這些參數可由本領域的一般技術人員按常規進行改變。
第一個提取步驟導致形成(i)富含磷脂的脂族醇溶液相和(ii)具有減少的磷脂含量的細胞。細胞膜的LPS成分基本上完全和具有減少的磷脂含量的細胞分離開。
第二個提取步驟包括用氯仿∶甲醇(CM)的溶液提取具有減少的磷脂含量的細胞。
在第二個提取步驟中可以使用已知適合用於從細胞膜提取LPS(例如在Chen方法中)的任何比例的氯仿和甲醇。一般地，氯仿和甲醇的比例為大約2∶1至大約9∶1。具有和CM相等特性的溶劑混和物也可以用於從具有減少的磷脂含量的細胞中獲得LPS。
本方法超過Chen方法的優點為在第一個提取步驟中除去了磷脂。本發明的第二個提取步驟對於具有減少的磷脂含量的細胞來進行，從而導致形成基本上無磷脂的富含LPS的溶液，然而Chen方法的CM提取導致形成含有相當高水平的磷脂的LPS溶液。產生相對無磷脂的LPS製備物的其他可選擇的方法如Galanos的方法(見上)就不那麼令人期望，因為它們不適宜於大規模產生，它們使用引起健康和安全擔憂的溶劑混和物(例如苯酚∶氯仿∶石油醚)，或者兩者都有。
由於LPS溶液中磷脂的明顯缺乏，根據本方法的LPS的進一步純化一般比Chen方法更簡單和更便宜。已經發現通過將氯仿和甲醇從LPS溶液中蒸發能夠形成足夠純度的乾燥LPS剩餘物。
可選擇地，可以例如通過上述的酸水解和鹼水解來進一步加工LPS，從而產生MLA或3D-MLA。
按照上述方法所生產出的3D-MLA可用於多種用途。一個優選的用途為作為用於藥物組合物的免疫刺激劑或佐劑，該藥物組合物含有免疫原性的多核苷酸、多肽、抗體、T-細胞或抗原呈遞細胞(APC)。免疫刺激劑或佐劑本質上是指任何能夠提高或增強對於外源抗原的免疫反應(抗體和/或細胞介導的)的物質。
根據本發明生產出的MLA或3D-MLA可以刺激的一種免疫反應是Th1類型的。
已經觀察到單磷醯基脂A(MLA)(優選的為3-O-脫醯基化單磷醯基脂A(3D-MLA))與鋁鹽的聯合物作為用於引起主要Th1型反應的佐劑是有效的。高水平的Th1型細胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)傾向於促進誘導針對所施用抗原的細胞介導的免疫反應。相反地，高水平的Th2型細胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向於促進誘導體液的免疫反應。在應用含有MLA或3D-MLA的藥物組合物之後，患者將支持包括Th1和Th2型反應的免疫反應。當反應主要為Th1型時，Th1型細胞因子的水平將增長至比Th2型細胞因子的水平更高的程度。這些細胞因子的水平可以容易地用標準的測定法進行評定。為了了解細胞因子的家族，可見Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
在一個優選的實施方案中，佐劑系統包括單磷醯基脂A(MLA)(優選的為3D-MLA)和皂苷衍生物(如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals公司，Framingham，MA)；七葉皂苷；毛地黃皂苷；或者石頭花(Gypsophila)或昆諾藜(Chenopodium quinoa)皂苷)的聯合物，例如WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MLA佐劑的聯合物，或者WO 96/33739中所描述的其中QS21用膽固醇淬滅的具有較少反應原性的組合物。其他優選的配劑含有水包油的乳狀液和生育酚。WO 95/17210中描述了另一個特別優選的佐劑配劑，其使用水包油乳狀液中的QS21、3D-MLA和生育酚。
將下面的實施例包括在內以說明本發明的優選實施方案。本領域的技術人員應當意識到，下面的實施例中所公開的技術代表了由發明者發現能夠在本發明的實施中很好地起作用的技術，因此可以認為這些技術構成了用於其實施的優選模式。可是，根據本公開內容，本領域的技術人員應當意識到在公開的特定實施方案中可以作出許多改變，並且仍獲得同樣或相似的結果，但並不離開本發明的精神和範圍。
實施例1-一般方法A.培養基的製備細胞生長在M9培養基上進行，M9培養基可通過將無機鹽的無菌溶液、酪蛋白胺基酸和葡萄糖組合在一起來製備。M9鹽溶液一般在發酵罐中製備，其含有下列鹽2.0g/L NaCl、0.2g/L MgSO4·7H2O、3.0g/L KH2PO4、6.0g/L Na2HPO4和1.0g/L NH4Cl。然後向發酵罐中無菌地加入20％(w/v)酪蛋白胺基酸(20ml/L)和50％(w/v)葡萄糖(32ml/L)的無菌溶液，從而獲得完全的培養基。
B.種子生長一般地，一個無菌的250ml錐形瓶中裝入50ml無菌的M9培養基。將一個種子瓶的明尼蘇達沙門氏菌R595(大約108cfu)解凍並加入錐形瓶中，然後用紗布塞子塞住瓶口。將培養物於37℃培養6-8小時，直至明顯出現旺盛的生長。
C.細胞生長明尼蘇達沙門氏菌R595的培養物在裝備了2.5L玻璃容器的BioFlo III發酵罐(New Brunswich Scientific公司)中生長。在一般的運作中，容器裝入2.0L的M9鹽溶液並經過高壓滅菌，然後無菌地加入酪蛋白胺基酸和葡萄糖的無菌溶液。發酵罐裝備有用於防沫劑(0.1％SAG-471，Witco公司)和NH4OH(30％)的給料管以及用於pH、dO2和泡沫的探針。通過NH4OH給料將培養基調節至pH 6.9。然後將發酵罐用全部的種子培養物進行接種，並在空氣噴射(一般為2.0Lpm)和攪拌(一般為50rpm)的同時於37℃進行培養。通過於590nm測量光密度監測培養的生長期。通過離心或切向流過濾(tangential flow filtration)收穫細胞，並用水洗滌，然後凍幹。
D.脂多糖(LPS)的提取根據經過較小修改的Qureshi等人(1986)的程序分離出LPS。在一般的運作中，首先將乾燥的細胞在90％乙醇(v/v)中以20mg/ml的濃度於室溫攪拌1小時，然後通過真空過濾進行回收。將細胞經過第二次乙醇提取，隨後順次用丙酮和乙醚(每次15分鐘，都為40mg/ml，基於起始重量)進行提取，然後讓結果所得的醚粉末空氣乾燥過夜。其間，製備苯酚(89％)∶氯仿∶石油醚19∶45∶72(v/v/v，縮寫為PCP)的溶液並讓其靜置過夜。將醚粉末以70mg/ml的濃度懸浮在PCP(傾去過量的水)中。將溶液攪拌30分鐘，然後離心(3000g，15分鐘，0-5℃)。將上清液部分倒入圓底燒瓶中，然後用PCP再次提取細胞沉澱。合併上清液部分，然後在40℃旋轉蒸發直至所有的揮發性溶劑大部分被除去。然後測量剩下的體積。逐滴加入水直至明顯出現持續的混濁，然後在迅速攪拌的同時向苯酚溶液中加入5體積的丙酮並隨後加入1體積的乙醚(都在冰浴中冷凍)。將溶液置於冰浴中30分鐘，然後通過離心(5000g，15分鐘，0-5℃)回收沉澱出的LPS。重力過濾上清液部分以回收任何沒有剩餘在沉澱中的LPS一般來說是必需的。用最小體積的冷丙酮洗滌一次LPS，並通過離心/過濾進行回收，然後在真空中乾燥。基於初始的細胞乾重，一般的收率為4-5％。
E.4′-單磷醯基脂A(MLA)的製備將LPS以10mg/ml的濃度懸浮在水中，並於45-55℃用水浴超聲處理(bath-sonication)以幫助分散固體物質。結果所得的溶液應當是輕微混濁的，但無肉眼可見的固體。向該溶液中加入1體積的0.2N HCl，然後將其置於沸水浴中15分鐘。在冰浴中淬滅反應，然後用5體積(相對於起始的LPS溶液)的氯仿∶甲醇2∶1(v/v)提取。將二相溶液渦旋振蕩，並通過低速離心(500-1000g)分離兩相。回收較低的相併在氮氣中蒸發，從而收穫粗製的MLA。
F.3-O-脫醯基化-4』-單磷醯基脂A(3D-MLA)的製備將粗製的MLA以大約1-5mg/ml的濃度溶解在氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中，並將3.0ml的該溶液轉移至16×100mm的試管中。將附加的0.4ml甲醇加入試管中，然後將其置於50℃的水浴中10分鐘。通過加入40μl的0.5M KHCO3(pH 10.5)來起始反應，並將溶液於50℃溫育20分鐘。在這段時間的最後，將試管從水浴中取出，並通過在添加2.0ml 0.1N HCl(冷凍的)之後進行渦旋振蕩來淬滅反應。通過下列步驟來回收3D-MLA加入1.0ml甲醇，渦旋振蕩，離心(500-1000g)，和在氮氣中將較低(有機)相蒸發至幹。
實施例2-分析方法A.MLA和相關樣品的薄層層析法(TLC)所有的TLC分析用覆蓋有Silica Gel 60(E Merck)的5×10cm平板來進行。樣品一般以10mg/ml的氯仿∶甲醇4∶1(v/v)溶液應用於TLC平板，在操作時通過用毛細吸管將3μl溶液(30μg樣品)以小點的方式列成5mm的線來進行應用。用含有氯仿/甲醇/水/氫氧化銨50∶31∶6∶2(v/v)的溶劑系統來展開平板。展開的平板上的條帶通過下列步驟來顯現噴灑10％(w/v)磷鉬酸的乙醇溶液，隨後於150-160℃進行焦化。在一些情況下，點的相對強度可通過於520nm的掃描波長用Shimadzu CS9000U Dual Wavelength FlyingSpot Scanner(Shimadzu公司)進行掃描光密度分析法來定量。
B.MLA/3D-MLA的高效液相色譜法(HPLC)分析首先將需要分析的樣品轉變成游離酸形式，這是通過用2ml的0.1N HCl洗滌3-5mg樣品於5ml氯仿∶甲醇(2∶1v/v)中所形成的溶液來實現的。將二相系統渦旋振蕩，離心，然後將較低(有機)相轉移至試管中並在氮氣流中蒸發。然後將剩餘物通過用重氮甲烷處理進行甲基化。簡要地說，重氮甲烷的醚溶液通過下列步驟來製備將60-100mg1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(MNNG，Aldrich)置於2英錢的小瓶中，每毫克MNNG加入60μl乙醚，然後每毫克MNNG加入9μl的5N NaOH，同時於＜-10℃攪拌溶液。在反應完全之後，通過下列步驟將檸檬黃色的醚相干燥將其轉移到含有幾顆NaOH的第二個小瓶中，然後將其渦旋振蕩，這都在＜-10℃進行。將經酸洗滌的樣品溶解在1ml氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，並置於＜-10℃的浴中，然後在攪拌的同時逐滴加入重氮甲烷溶液直至暗黃色的色調持續出現。然後將溶劑在氮氣流中於環境溫度蒸發，並進一步在真空中乾燥至少30分鐘。
色譜分析在C18反相柱(Nova-Pak，4μm的顆粒直徑，8mm×10cm[Waters])上進行。將甲基化的樣品以100μg/ml的濃度溶解在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，並通過0.45μm的PTFE注射器過濾器。一般使用20-25μl的注射體積，隨後以2ml/分鐘的流速用20-80％異丙醇的乙腈溶液的線性梯度洗脫60分鐘，同時在210nm進行監測。
C.LPS同系物含量的HPLC分析LPS傾向於為高度異質的物質，這是由於下列部分中的可變性1)O-抗原和核心區域中糖殘基的數量；2)在核心區域中和在脂A中的磷酸酯上的極性取代；和3)連接到脂A主鏈上的脂肪酸的數量和位置。正是該後面的可變性來源對於3D-MLA(MPL)的同系物含量具有影響。LPS水解成MLA和3D-MLA消除了O-抗原和核心區域中的可變性，可是由於O-聯接的脂肪酸不可控的損失其也引入了附加的異質性。這妨礙了準確獲知完整的LPS中的醯基化模式。作為避開這一點的辦法，開發出了一種方法，即在不會導致O-聯接的脂肪酸損失的溫和條件下去除磷酸酯和核心區域。然後可以用HPLC分析結果所得的去磷酸化脂A(零磷醯基脂A，或ZPL)，從而獲得親本LPS中醯基化模式的準確反映。
該方法一般按照下述進行。將0.5-5.0mg的LPS樣品於27℃在200μl濃縮的氫氟酸中水解3-4小時。該反應必須在緊緊蓋住的特氟隆管中並在有良好通風的通風櫥內進行。通過在氮氣流中於環境溫度蒸發來除去HF，然後將水解產物溶解在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中並轉移到16×100mm的玻璃試管中，隨後在氮氣流中蒸發溶劑。使用水浴超聲處理將剩餘物懸浮在1.0ml 0.1％三乙胺中，加入1.0ml 40mMNaOAc，然後將試管懸浮在沸水浴中30-45分鐘。通過在冰浴中冷卻來淬滅反應，並通過用5ml氯仿∶甲醇2∶1(v/v)提取來回收ZPL。將有機相轉移至小的螺口瓶中，然後在氮氣中蒸發溶劑。ZPL通過加入200μl的10mg/ml鹽酸O-(3，5-二硝基苄基)羥胺(RegisTechnologies公司)的吡啶溶液進行衍生化，緊緊蓋住小瓶，然後於60℃溫育3小時。在氮氣中蒸發除去吡啶，剩餘物進一步在真空中乾燥＞30分鐘。然後將剩餘物懸浮在500μl氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中，並上載至0.5-1.0ml已經在同樣的溶劑中預平衡的Accell-QMA(乙酸鹽形式；Waters)床上。用總共5.0ml的氯仿∶甲醇2∶1(v/v)以分成幾個小部分的方式漂洗柱，並收集洗脫液至16×100mm的試管中。向洗脫液中加入2.0ml的0.1N HCl，將二相系統渦旋振蕩，於500-1000g簡短離心，然後將較低(有機)相轉移至另一個試管中並在氮氣中蒸發。將剩餘物溶解在100-300μl氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，然後通過0.45μm的PTFE注射器過濾器進行過濾。用氯仿∶甲醇4∶1(v/v)漂洗過濾器兩次，並將濾液在氮氣中蒸發。濾液最後溶解在50-150μl氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，並轉移至自動注射器小瓶中以用於HPLC分析。HPLC條件如下C18反相柱(例如Waters)；10μl注射體積；20-80％異丙醇的乙腈溶液的線性梯度，經過60分鐘，流速為2ml/分鐘；於254nm進行監測。
實施例3-來自不同時間收穫的培養物中的MLA/3D-MLA的同系物組成的比較用下列參數進行一系列發酵罐的運行2.0L M9培養基(起始pH6.84-6.87)，2Lpm的空氣流量，於50rpm進行攪拌，37℃，無pH控制。通過於590nm測量光密度監測培養，並在獲得所期望的生長階段時終止培養。按照上述方法處理和提取細胞以獲得LPS樣品，然後將該樣品水解成MLA和3D-MLA，並用HPLC進行分析(見實施例1和2)。結果概括在表1中。
表1.來自不同年齡收穫的細胞中的MLA和3D-MLA的同系物組成
這些數據表明明尼蘇達沙門氏菌R595的培養物在穩定期期間改變了它們的LPS的醯基化模式，結果導致源自該LPS的MLA中3-O-脫醯基化己醯基加上庚醯基種類的全部含量的增加，並順次引起從該MLA製備的3D-MLA中3-O-脫醯基化己醯基種類的含量增加。
實施例4-來自不同時間收穫的培養物中的LPS的同系物組成的比較用下列參數進行一系列發酵罐的運行2.0L M9培養基(起始pH6.84-6.87)，2Lpm的空氣流量，於225rpm進行攪拌，37℃，無pH控制。通過於590nm測量光密度監測培養物的生長階段。按照實施例1中描述的方法處理和提取細胞以獲得LPS樣品。按照實施例2中描述的方法將LPS樣品水解成ZPL並用HPLC進行分析。結果概括在表2中。
表2.來自不同年齡收穫的細胞中的LPS的同系物組成
在來自穩定期早期細胞的LPS中沒有檢測到3-O-脫醯基化己醯基成分(運行A)。因此，從該LPS製備的3D-MLA中己醯基化同系物的唯一來源為庚醯基化的物質(24％)。相反地，來自在穩定期晚期收穫的細胞的LPS含有庚醯基和3-O-脫醯基化己醯基種類(分別為19％和17％)。這些種類都對於從該LPS製備的3D-MLA(MPL)中的己醯基含量有所貢獻。想不到的是發現細胞在某些條件下產生3-O-脫醯基化己醯基LPS種類。
實施例5-預提取溫度對於明尼蘇達沙門氏菌R595 LPS的純度的影響明尼蘇達沙門氏菌R595的細胞用與實施例1中概述的基本上相同的條件在80L發酵罐(New Brunswick Scientific)中生長。細胞通過切向流過濾進行濃縮而不是離心，所得的漿狀物含有51.5mg幹細胞質量/ml。製備三種溶液，在這些溶液中150ml細胞懸浮液的等分試樣各與600ml乙醇混和。將乙醇溶液於22℃、37℃和50℃攪拌1小時，並過濾。將細胞在相同條件(除了使用95％乙醇之外)下進行第二次乙醇提取。通過抽吸過濾回收細胞，然後於50℃在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中提取過夜。將溶液過濾，然後將濾液旋轉蒸發至幹，從而得到LPS製備物。將於各個溫度所獲得的第一和第二次乙醇提取濾液的樣品以及從預提取的細胞中獲得的LPS根據實施例2中的方法用薄層層析法進行分析。TLC板的圖象顯示在圖1中。
圖1顯示了在乙醇提取期間用不同溫度獲得的乙醇提取物和LPS樣品的TLC板。左邊的平板從左至右顯示了於22℃、37℃和50℃的溫度時的乙醇提取物。該平板最右邊的樣品為真正的LPS樣品。右邊的平板顯示了從各個製備物中獲得的LPS。道3、4和5中的樣品分別相應於從經過在22℃、37℃和50℃用乙醇預提取的細胞中獲得的LPS。在Rf～0.6的濃重的帶相應於磷脂和脂肪酸雜質。這些雜質的水平通過增加乙醇提取的溫度而減少，其在於50℃預提取的樣品中是非常低的。
從圖1的TLC板中可以明顯地看出在升高的溫度下用乙醇進行預提取對於去除雜質是有效的，否則這些雜質會被氯仿∶甲醇4∶1(v/v)共提取。於50℃的預提取導致形成基本上無這些雜質的LPS。
實施例6-有和沒有經過乙醇提取而獲得的LPS的比較三批明尼蘇達沙門氏菌R595的細胞用與實施例1中概述的基本上相同的條件在750L發酵罐(B.Braun)中生長。通過切向流過濾收穫細胞，從每批中獲得細胞懸浮液的樣品並凍幹。細胞塊經過兩次1小時的於50℃用90％乙醇進行的預提取。在兩次提取之間用切向流過濾回收細胞。然後細胞在回流的同時用氯仿∶甲醇4∶1(v/v)提取過夜。通過切向流過濾回收提取物並蒸發至幹。將凍幹的細胞樣品在回流的氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中提取過夜，然後將溶液過濾並將濾液蒸發至幹。有和沒有經過乙醇預提取而獲得的LPS樣品基本上按照實施例2中描述的方法用TLC進行分析。於大約Rf＝0.01-0.90掃描TLC板，並對於每個樣品計算出LPS區域(Rf＝0.01-0.20)中的強度與總強度的比率。結果給出在表3中。
表3.來自有和沒有用乙醇預提取的細胞的LPS純度
注1LPS區域中總強度的百分數＝[(Rf＝0.01-0.20中的強度)/(Rf＝0.01-0.90中的強度)]×100表3中的結果證明，在於50℃用90％乙醇預提取明尼蘇達沙門氏菌R595細胞之後獲得的LPS顯著比從沒有預提取的細胞中獲得的材料更純。
此處公開和要求的所有方法可以根據本公開內容進行和實行，而不需要不適當的試驗。雖然本發明的組合物和方法已經用優選的實施方案進行了描述，但是對於本領域的技術人員來說顯而易見的是可以對此處描述的方法的步驟或步驟順序施行改變而不會離開本發明的理念、精神和範圍。更明確地，明顯的是可以用某些化學和生理學相關的試劑替代此處描述的試劑，而同時可獲得相同或相似的結果。所有這些對於本領域的技術人員來說明顯的類似替代和修改可認為處於附加的權利要求所定義的本發明的精神、範圍和理念之中。
權利要求
1.從深度粗糙突變體細菌菌株細胞的培養物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1-4個碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細胞，從而產生出具有減少的磷脂含量的細胞；(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有減少的磷脂含量的細胞，從而獲得LPS的氯仿和甲醇溶液。
2.權利要求1的方法，其中深度粗糙突變體細菌菌株屬於沙門氏菌屬或埃希氏菌屬。
3.權利要求2的方法，其中沙門氏菌屬的深度粗糙突變體細菌菌株屬於明尼蘇達沙門氏菌種。
4.權利要求3的方法，其中明尼蘇達沙門氏菌種的深度粗糙突變體細菌菌株為明尼蘇達沙門氏菌R595菌株。
5.權利要求2的方法，其中埃希氏菌屬的深度粗糙突變體細菌菌株屬於大腸桿菌種。
6.權利要求5的方法，其中大腸桿菌種的深度粗糙突變體細菌菌株屬於大腸桿菌D31m4菌株。
7.權利要求1的方法，其中脂族醇具有2-4個碳原子。
8.權利要求7的方法，其中脂族醇為乙醇。
9.權利要求1的方法，其中含有脂族醇的溶液含有大約85wt％至大約95wt％的脂族醇。
10.權利要求1的方法，其中用脂族醇的提取在大約35℃至大約65℃的溫度進行。
11.權利要求10的方法，其中溫度為大約45℃至大約55℃。
12.權利要求1的方法，其進一步包含從LPS溶液中蒸發氯仿和甲醇，從而獲得乾燥的LPS剩餘物。
13.權利要求12的方法，其進一步包含將乾燥的LPS剩餘物經過順次的酸水解和鹼水解從而形成3D-MLA。
14.根據權利要求12的方法形成的LPS。
15.根據權利要求13的方法形成的3D-MLA。
全文摘要
此處公開了生產脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)在培養基中培育深度粗糙突變體細菌菌株的培養物；(b)將該培養物在穩定期保持至少大約5小時；(c)從培養物中收穫細胞；和(d)從細胞中提取LPS。該方法允許LPS的生產，其中該LPS可用於生產具有至少大約20mol％己醯基同系物基團的3－O－脫醯基化單磷醯基脂A(3D－MLA)。此處還公開了從深度粗糙突變體細菌菌株細胞的培養物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1－4個碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細胞，從而產生出具有減少的磷脂含量的細胞；和(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有減少的磷脂含量的細胞，從而獲得LPS的氯仿和甲醇溶液(CM)。該方法提供了LPS的CM溶液，其具有減少的磷脂含量，並通過相對簡單和不貴的加工步驟來生產。
文檔編號C12N1/21GK1928107SQ20061015364
公開日2007年3月14日 申請日期2002年3月28日 優先權日2001年3月30日
發明者K·R·米爾斯, D·S·斯尼德 申請人:利裡克薩有限公司