利用固定化運動發酵單胞菌催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法
2023-10-11 04:56:54 1
專利名稱：利用固定化運動發酵單胞菌催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法
利用固定化運動發酵單胞菌催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法
技術領域：
本發明涉及生物基化學品的生物製造和生物煉製領域，具體地說，是以菊粉和木薯澱粉為原料，利用重組運動發酵單胞菌催化等摩爾濃度菊粉果糖和木薯澱粉葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法。
背景技術：
山梨醇是一種用途廣泛的化工原料，主要用於甜味劑、潤溼劑、調質劑、軟化劑等的生產和製備。目前山梨醇的工業生產技術是採用50%的D-葡萄糖漿催化加氫工藝，但是這種化學法生產山梨醇是一個高耗能、回收成本高昂並產生環境汙染的工藝。而生物法生產山梨醇主要是利用運動發酵單胞菌周質空間內的葡萄糖果糖氧化還原酶轉化果糖和葡萄糖生成，反應過程簡單，反應條件溫和，無需高壓設備，節約能源，並且對環境友好。但是果糖和葡萄糖這兩種基質相對於產物的價格偏高，因此使用一些廉價的替代原料可以大大降低生物法生產山梨醇的成本。菊粉是由一類天然果聚糖的混合物，是由果糖單元通過β _2，1-糖苷鍵連接而成並以葡萄糖單元終止的碳水化合物，主要存在於菊芋、菊苣等植物的塊莖中。目前，菊粉的水解主要是利用菊粉酶，切斷菊粉的β _2，1-糖苷鍵，水解為果糖和葡萄糖。菊粉可以用來生產果糖、乙醇、單細胞蛋白、單細胞油脂、檸檬酸、聚果糖以及其他生物化學產品。而目前木薯澱粉也被廣泛用於生產幹乳酸、檸檬酸等產品。利用菊粉、菊芋或者木薯澱粉這些可再生的、廉價的、豐富的生 物質原料來生產生物化學品具有良好的優勢。近年來，利用菊芋或菊粉來生產山梨醇的研究有一些報導。Dong-man等人將菊粉酶和滲透處理的運動發酵單胞菌共固定後催化菊芋和葡萄糖來生產山梨醇。另外鮑傑等人指出利用菊芋的酸水解液加入適量的葡萄糖後，用運動發酵單胞菌催化菊芋水解液可得到山梨醇和葡萄糖酸(專利號200910199317)。但是，這些研究中首先將細胞經過甲苯、十六烷基三甲基溴化銨或金屬離子處理後進行催化試驗，認為新鮮不經過處理的細胞，在直接催化生產山梨醇和葡萄糖酸是會有大量副產物乙醇產生，且無法進行反覆循環利用會影響整個過程的生產效率和生產成本。同時，這些研究獲得山梨醇和葡萄糖酸的濃度較低，增加了後續產物分離的成本。我們嘗試將新鮮細胞經過固定化來催化高濃度的葡萄糖酸和山梨醇,原料成本低,簡化了生產工藝；減少了後續產品分離的成本。
發明內容本發明目的在於利用商業糖化酶同時水解木薯澱粉和菊粉，在高的菊粉和木薯澱粉底物含量下獲得含有等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液，然後採用固定化的新鮮運動發酵單胞菌催化生產高濃度的葡萄糖酸和山梨醇的方法。本發明的構思:從菊粉和木薯澱粉生產高濃度葡萄糖酸和山梨醇的方法，具體地說是首先將木薯澱粉液化，然後降溫並調整pH。利用商業糖化酶水解菊粉一定時間後，將液化後的澱粉加入菊粉水解液進行共糖化，以獲得含有等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液。將表達有葡萄糖果糖氧化還原酶的運動發酵單胞菌進行細胞固定化，然後循環利用固定化的運動發酵單胞菌催化等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合液生產山梨醇和葡萄糖酸。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其具體步驟為，(I)高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法製備；首先，將質量濃度為50%的菊粉在60°C、pH 4.0、糖化酶酶量lU/g菊粉的條件下酶解48小時，然後加入已在90°C液化I小時的木薯澱粉(質量分數為50% )，在60°C、pH
4.0的條件下繼續水解12小時，獲得等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液。其中菊粉和木薯澱粉的質量比根據菊粉中果聚糖的含量和木薯澱粉中澱粉的含量而定，原則是在充分水解後得到等摩爾濃度的果糖和葡萄糖；所述的高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法製備中，用於酶解菊粉的糖化酶是混合型商業糖化酶，該酶液中含有糖化酶和菊粉酶等多種酶蛋白，但是本發明中的酶液不限於商業糖化酶，還包括糖化酶和菊粉酶混合液等；(2)重組運動發酵單胞菌的細胞固定化；將表達有葡萄糖果糖氧化還原酶的運動發酵單胞菌在不通氣、30°C、pH6.0、150rpm、接種量10% (v/v)條件下培養18小時後，離心獲得溼細胞並用超純水懸浮至150g/L。然後將12.5% (w/v)的PVA溶液和0.125% (w/v)的海藻酸鈉溶液加熱溶解，冷卻至室溫後與細胞懸浮液混合(PVA溶液和細胞溶液體積比4: I)，將混合溶液在磁力攪拌作用下充分混勻I小時。然後，將混合溶液通過蠕動泵滴加到飽和硼酸溶液中(含有0.3mol/L氯化鈣)，並攪拌3小時。使固定化的細胞顆粒平均直徑為4毫米，並用大量去離子水清洗以除去顆粒表面的硼酸溶液，即得到固定化的運動發酵單胞菌細胞；所述的重組運動發酵單胞菌為表達有葡萄糖果糖氧化還原酶的運動發酵單胞菌，其葡萄糖果糖氧化還原酶酶活比野生菌中的高出2倍；(3)利用固定化運動發酵單胞菌同時催化果糖和葡萄糖獲得含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液；在反應器中加入製備好的混合水解液和固定化的運動發酵單胞菌細胞，在pH
6.4、溫度39°C、150rpm的條件下進行催化，得到含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液。每次催化結束後，進行固液分離，液體進行下一步的山梨醇和葡萄糖酸的分離和純化，固體細胞顆粒則多次循環用於催化反應。所述的用於固定運動發酵單胞菌的溶液為12.5% (w/v)的PVA和0.125% (w/v)的海藻酸鈉的混合溶液。單獨利用海藻酸鈉固定新鮮的運動發酵單胞菌，顆粒易發生膨脹溶解造成催化過程無法進行；而？￥々與硼酸反應速度慢，添加少量海藻酸鈉則有助於PVA顆粒的成型，其中PVA和海藻酸鈉較為合適的質量比為10: I。所述的初始果糖和葡萄糖的總糖濃度500g/L，即果糖和葡萄糖濃度各為250g/L，在此高糖濃度下可以抑制乙醇的產生；細胞濃度則選擇10g/L，在此濃度下，催化可以順利進行，從而降低了細胞催化 劑的使用量。
所述的每一次轉化結束後，對反應體系進行固液分離，液體進行山梨醇和葡萄糖酸的產品分離，固定化的細胞顆粒則留在反應器中，重新加入新鮮的水解液，進行下一次催化過程，整個過程固定化細胞可以進行1-4次循環催化反應。與現有技術相比，本發明的積極效果是:(I)本發明以菊粉和木薯澱粉為原料生產山梨醇和葡萄糖酸，基質成本低廉，來源廣泛豐富，充分利用了可再生資源，能夠滿足葡萄糖酸和山梨醇不斷擴大的市場需求；(2)本發明用於水解菊粉和木薯澱粉的糖化酶，是一個商業化的價格低廉的糖化酶，能夠滿足大規模化生產的需要；(3)本發明將菊粉和木薯澱粉的水解結合，實現同時糖化過程，減少反應器使用，節省生產成本；(4)本發明將新鮮細胞經過固定化來催化高濃度的山梨醇和葡萄糖酸，不儀減少細胞處理程序，減少了催化劑的用量，而且避免細胞催化劑的連續生產；(5)本發明得到含有高濃度的山梨醇和葡萄糖酸的混合液，減少了後續產品分離的成本。
圖1實施例1固定化細胞催化過程曲線圖。
具體實施方式以下提供本發明一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方 法的具體實施方式
。實施例1請參見附圖1，將表達有葡萄糖果糖氧化還原酶的運動發酵單胞菌在不通氣、30°C、pH 6.0、150rpm、接種量10% (v/v)條件下培養18小時後，離心獲得溼細胞並用超純水懸浮至150g/L。然後將12.5% (w/v)的PVA溶液和0.125% (w/v)的海藻酸鈉溶液加熱溶解，冷卻至室溫後與細胞懸浮液混合(PVA溶液和細胞溶液體積比4: I)，將混合溶液在磁力攪拌作用下充分混勻I小時。然後，將混合溶液通過蠕動泵滴加到飽和硼酸溶液中(含有0.3mol/L氯化鈣)，並攪拌3小時。使固定化的細胞顆粒平均直徑為4毫米，並用大量去離子水清洗以除去顆粒表面的硼酸溶液，即得到固定化的運動發酵單胞菌細胞。在500毫升體積的反應器中加入300毫升水解液和固定化的運動發酵單胞菌顆粒，在pH
6.4(14mol/L氫氧化鈉控制pH)、39°C、150rpm進行催化反應。整個過程中，山梨醇的濃度為180g/L，山梨醇的轉化率為97.33%，山梨醇的產率為每克細胞每小時0.492g。本發明所涉及的原料不限於菊粉和木薯澱粉，還可以為木薯、玉米澱粉類的原料，菊芋、菊苣等聚果糖原料。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特徵在於，具體步驟為 (1)高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法製備； 首先，將質量濃度為50%的菊粉在60°C、pH4. O、糖化酶酶量lU/g菊粉的條件下酶解48小時，然後加入已在90°C液化I小時的木薯澱粉，在60°C、pH4. O的條件下繼續水解12小時，獲得等摩爾濃度的果糖和葡萄糖的混合水解液； (2)重組運動發酵單胞菌的細胞固定化； 將表達有葡萄糖果糖氧化還原酶的運動發酵單胞菌在不通氣、30°C、pH6. 0、150rpm、接種量10% (v/v)的條件下培養18小時後，離心獲得溼細胞並用超純水懸浮至150g/L。然後將12. 5% (w/v)的聚乙烯醇溶液和O. 125% (w/v)的海藻酸鈉溶液加熱溶解，冷卻至室溫後與細胞懸浮液混合，其中PVA溶液和細胞溶液體積比4 I，將混合溶液在磁力攪拌作用下充分混勻I小時；然後，將混合溶液通過蠕動泵滴加到飽和硼酸溶液中，並攪拌3小時；使固定化的細胞顆粒平均直徑為4毫米，並用去離子水清洗以除去顆粒表面的硼酸溶液，即得到固定化的運動發酵單胞菌細胞； (3)利用固定化運動發酵單胞菌同時催化果糖和葡萄糖獲得含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液； 在反應器中加入製備好的混合水解液和固定化的運動發酵單胞菌細胞，在pH 6. 4、溫度39°C、150rpm的條件下進行催化，得到含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合液；每次催化結束後，進行固液分離，液體進行下一步的山梨醇和葡萄糖酸的分離和純化，固體細胞顆粒則多次循環用於催化反應。
2.如權利要求I所述的一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(I)中，用於酶解菊粉的糖化酶是混合型商業糖化酶，該酶液中含有糖化酶和菊粉酶和多種酶蛋白，但所述的酶液不限於商業糖化酶，還包括糖化酶和菊粉酶混合液。
3.如權利要求I所述的一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(2)中，所述的重組運動發酵單胞菌為表達有葡萄糖果糖氧化還原酶的運動發酵單胞菌，其葡萄糖果糖氧化還原酶酶活比野生菌中的高出2倍。
4.如權利要求I所述的一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(2)中，用於固定運動發酵單胞菌的溶液為12. 5% (w/v)的PVA和O. 125% (w/v)的海藻酸鈉的混合溶液；PVA和海藻酸鈉較為合適的質量比為10 1。
5.如權利要求I所述的一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(3)中，初始果糖和葡萄糖的總糖濃度500g/L，即果糖和葡萄糖濃度各為250g/L，在此高糖濃度下可以抑制乙醇的產生。細胞濃度則選擇10g/L。
6.如權利要求I所述的一種利用固定化運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產高濃度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其特徵在於，在所述的步驟(3)中，每一次轉化結束後，對反應體系進行固液分離，液體進行山梨醇和葡萄糖酸的產品分離，固定化的細胞顆粒則留在反應器中，重新加入新鮮的水解液，進行下一次催化過程，整個過程固定化細胞可以 進行1-4次循環催化反應。
全文摘要
本發明涉及一種利用固定化重組運動發酵單胞菌同時催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生產山梨醇和葡萄糖酸的方法，具體步驟為(1)高濃度等摩爾的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法製備；(2)重組運動發酵單胞菌的細胞固定化；(3)利用固定化重組運動發酵單胞菌同時催化果糖和葡萄糖獲得含有高濃度山梨醇和葡萄糖酸的混合產品。本發明的優點利用一種糖化酶同步水解菊粉和木薯澱粉生成等摩爾的果糖和葡萄糖，原料成本低且減少了酶用量，簡化了生產工藝；循環利用固定化細胞催化果糖和葡萄糖生產山梨醇和葡萄糖酸，減少了催化劑的用量，避免細胞催化劑的連續生產；得到含有高濃度的山梨醇和葡萄糖酸的混合液，減少了後續產品分離的成本。
文檔編號C12R1/01GK103255181SQ20121003970
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日 公開號201210039707.發明者鮑傑, 安克紅, 胡鳳仙 申請人:華東理工大學