長座線蟲草在製備保肝藥物和保健品中的應用的製作方法

2023-10-11 20:54:34

長座線蟲草在製備保肝藥物和保健品中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了長座線蟲草及其提取物的製備方法及應用。其長座線蟲草提取物從麥角菌科線蟲草屬長座線蟲草中提取，提取物中各組分重量佔比如下，甾醇含量在5％～25％，環肽含量在2％～10％，核苷含量在2％～10％，多糖含量在5％～25％，海藻糖含量在0.5％～5％，麥芽糖含量在1％～5％，胺基酸含量在5％～25％，其他成分含量在10％～80％。其採用乙醇水溶液提取，濃縮，乾燥，製得。長座線蟲草全草及其提取物可用於製備保肝藥物或保健品。
【專利說明】長座線蟲草在製備保肝藥物和保健品中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蟲草屬真菌長座線蟲草全草及其提取物、製備方法及應用，還涉 及長座線蟲草提取物的檢測方法。

【背景技術】
[0002] 肝損傷是人類最常見的疾病之一，可由多種因素引起，主要包括化學性肝損傷、藥 物性肝損傷、酒精性肝損傷、免疫性肝損傷等。其中，免疫性肝損傷通常由生物性因素等引 起，常見的原因為病毒感染，如臨床上B型肝炎病毒（HBV)、C型肝炎病毒（HCV)等病毒的 感染，其重要的特徵是肝組織內大量的炎症細胞浸潤，產生免疫/炎症應答，導致免疫反應 為基礎的肝損傷，可進一步發展為肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。現代醫學認為，免疫性 肝損傷的發病機制與免疫應答和免疫調節紊亂有關。T細胞是機體免疫系統內最重要的一 大細胞亞群，當不同淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時，就可導致機體免疫紊亂並發 生一系列的病理變化。目前認為肝炎患者的免疫系統都處於超反應性的狀態，對免疫性肝 損傷的治療措施主要有抗病毒治療、免疫調節治療和一般治療（恢復肝功能、抗肝纖維化 等）。常用的藥物主要集中在幹擾素、胸腺素、Th細胞因子、疫苗等的應用，但對多數患者副 作用大，容易引起病毒耐藥株的產生，停藥後易復發，且療程長、治療費用高。中醫藥以其多 種有效成分整體協同作用，在預防和治療肝臟疾病具有一定優勢，能有效降低耐藥性。真菌 在與寄主長期協同進化中，形成了獨特的免疫調節機制，日漸成為免疫性疾病治療藥物研 究的熱點。
[0003] 蟲草是寄生於昆蟲體上的真菌與其寄主昆蟲形成的蟲菌複合體，隸屬於子囊 菌門（Ascomycota)，核菌綱（Pyrenomycetes)，麥角菌科（Clavicipitaceae)，線蟲草屬 (Ophiocordyceps)。由於蟲生真菌和昆蟲的長期協同進化，使得蟲生真菌不僅是重要的生 物防治材料，同時還是寶貴的藥用資源。研究表明，蟲草屬真菌含有蟲草素、蟲草酸、多糖、 腺苷、留醇、多肽等多種有效成分，在降血脂，保護心、腦組織，鎮靜催眠，增強免疫力，抗炎、 抗癌、抗菌、抗衰老等方面都有良好功效。近年來，隨著人們對蟲草的滋補保健作用和藥用 價值認識的提高，而野生冬蟲夏草資源有限，價格高昂，一些蟲草的人工子實體及相關無性 型真菌陸續被開發。
[0004] 本發明涉及的蟲草為長座線蟲草（Ophiocordyceps longissima (Kobayasi) Sung)，長座線蟲草是寄生於同翅目蟬若蟲上的一種重要的蟲生真菌，1963年首次在日本被 發現並命名。李春如等於1999年在國內首次採集到該蟲草，並鑑定其無性型為長座被毛孢 (Hirsutella longissima)。目前對長座線蟲草保肝活性提取物及活性成分的研究尚未見 報導。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種長座線蟲草及其提取物在製備保肝藥物及保健品中的 應用，其質量可控，安全性高，藥效明確，而且長座線蟲草子實體可人工培養，資源豐富、價 廉，可製成多種劑型。
[0006] 本發明技術方案如下：
[0007] 本發明提供一種長座線蟲草提取物，其從麥角菌科線蟲草屬長座線蟲草 (Ophiocordyceps Iongissima(Kobayasi) Sung)中提取，其活性成分為甾醇、環肽、核苷、多 糖等。按重量比計，提取物中留醇含量在5 %?15 %，環肽含量在2 %?10 %，核苷含量在 2%?10%，多糖含量在5%?15%，海藻糖含量在0.5%?5%，麥芽糖含量在1%?5%， 胺基酸含量在5%?25%，其他成分含量在10%?80%。
[0008] 本發明還提供了長座線蟲草提取物的製備方法，包括以下步驟：
[0009] 將長座線蟲草子實體或菌絲體用乙醇水溶液提取，濃縮提取液得濃縮液。將濃縮 液進行乾燥得提取物，對提取物中留醇、環肽、核苷及多糖進行檢測，提取物中留醇含量在 5%?25%，環肽含量在2%?10%，核苷含量在2%?10%，多糖含量在5%?25%，海藻 糖含量在〇. 5 %?5 %，麥芽糖含量在1 %?5 %，胺基酸含量在5 %?25 %。其他成分含量 在 10%?80%。
[0010] 乙醇水溶液可以是純水溶液，即含乙醇〇%，也可以是高濃度的乙醇水溶液，如含 乙醇95%。
[0011] 提取次數可以是1?4次，為了節約藥材或者根據乙醇水溶液的量，也可以提取更 多次。
[0012] 乙醇水溶液的用量可以每次為藥材量的5?10倍，根據提取次數和實際情況，也 可以用量更少或者更多。
[0013] 提取方式可以是煎煮法、浸漬法、回流法，也可以附加其他工藝，如超聲、微波輔助 提取。
[0014] 提取溫度可以是室溫?100°C，根據提取方式和實際情況選擇。
[0015] 提取時間可以每次為1?6h，根據提取方式及提取溫度，也可以增加提取時間。
[0016] 將一次或多次提取得到的提取液進行濃縮得濃縮液，濃縮方式優選減壓濃縮成浸 骨，溫度可以是40?60°C。
[0017] 乾燥方式可以是冷凍乾燥、減壓乾燥或者噴霧乾燥。減壓乾燥或者噴霧乾燥溫度 可以是40?60°C。
[0018] 長座線蟲草全草及其提取物可以通過抑制自身免疫性損傷來發揮保肝作用。上述 提取物加入相應輔料可製成各種製劑，包括：膠囊劑、片劑、顆粒劑、口服液、丸劑、散劑、混 懸劑、滴丸、凍乾粉、緩釋劑、控釋劑、靶向製劑等。
[0019] 本發明具有如下優點：
[0020] (1)首次證實長座線蟲草及其提取物具有保肝效果及免疫抑制活性，並鑑定其提 取物主要活性成分為留醇、環肽、核苷和多糖。
[0021] (2)長座線蟲草與冬蟲夏草均屬於線蟲草屬真菌，由於野生冬蟲夏草資源有限且 價格高昂，該蟲草具有成為一種野生冬蟲夏草替代品的潛力。
[0022] (3)長座線蟲草全草及提取物能明顯降低ConA誘導免疫性肝損傷小鼠的血清中 轉氨酶ALT、AST含量，降低血清總膽紅素，升高血清白蛋白含量。病理形態學檢查發現用藥 組肝臟顏色暗紅，質地較光滑。鏡下觀察肝小葉結構趨於正常，炎性細胞浸潤減輕，細胞病 變程度減輕。同時，長座線蟲草提取物可以抑制ConA刺激活化的小鼠脾淋巴細胞增殖，且 隨著劑量的增加效果越明顯。
[0023] (4)本發明還提供了長座線蟲草提取物的檢測方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1是ConA誘導的肝損傷小鼠肝組織形態學改變圖（HEX200)。

【具體實施方式】
[0025] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0026] 實施例1 :長座線蟲草提取物的製備
[0027] 將長座線蟲草（安徽農業大學李春如教授提供並鑑定）子實體於粉碎機上粉碎， 稱取I. 3kg粉末，用5倍藥材質量的95%乙醇浸泡過夜，60°C熱提取4次，每次4小時，趁 熱過濾。合併濾液，減壓回收乙醇得提取物浸膏，45°C真空乾燥得長座線蟲草提取物189g。 按重量比計，各組分如下，留醇含量在12. 3%，環肽含量在3. 6%，核苷含量在2. 5%，多糖 含量在5. 6%，甘露醇（佔12.9% )、海藻糖（佔0.5% )、葡萄糖（佔3.6% )、麥芽糖（佔 1% )、胺基酸（佔10% )，其他成分含量在48%。
[0028] 實施例2 :長座線蟲草提取物的製備
[0029] 將長座線蟲草（安徽農業大學李春如教授提供並鑑定）子實體於粉碎機上粉碎， 稱取I. 3kg粉末，用10倍藥材質量的水浸泡過夜，60°C熱提取4次，每次4小時，趁熱過濾。 合併濾液，減壓濃縮得提取物浸膏，45°C真空乾燥得長座線蟲草提取物260g。按重量比計， 各組分如下，留醇含量在5 %，環肽含量在2 %，核苷含量在4%，多糖含量在15 %，甘露醇 (佔25% )、海藻糖（佔2% )、葡萄糖（佔12% )、麥芽糖（佔4% )、胺基酸（佔21% )，其 他成分含量在10%。
[0030] 實施例3 :長座線蟲草提取物的製備
[0031] 將長座線蟲草（安徽農業大學李春如教授提供並鑑定）子實體於粉碎機上粉碎， 稱取I. 3kg粉末，用8倍藥材質量的60%乙醇浸泡過夜，回流提取3次，每次3小時，趁熱過 濾，合併濾液，減壓回收乙醇得提取物浸膏，45°C真空乾燥得長座線蟲草提取物310g。按重 量比計，各組分如下，留醇含量在17%，環肽含量在6%，核苷含量在7%，多糖含量在12%, 甘露醇（佔15% )、海藻糖（佔1% )、葡萄糖（佔8% )、麥芽糖（佔3% )、胺基酸（佔 14% )，其他成分含量在17%。
[0032] 實施例4 :長座線蟲草提取物各組分的測定方法
[0033] 4. 1甾醇含量測定（比色法）
[0034] 精密稱定乾燥的麥角甾醇對照品約10mg，加無水乙醇溶解並定容至10ml，即得對 照品溶液；稱取長座線蟲草提取物35mg，無水乙醇溶解並定容至50ml，即得長座線蟲草提 取物供試品溶液。
[0035] 另外，分別精密移取0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. Oml對照品溶液，置IOml具塞刻度 試管中，分別加入無水乙醇使體積為5ml，再沿管壁緩慢地向各試管中加入5ml磷硫鐵顯 色劑，搖勻，室溫下冷卻30ml即得對照品或供試品的顯色溶液，以無水乙醇同法作空白。 530nm測定吸光度，繪製標準曲線。精密吸取供試品溶液5ml，加入5ml顯色劑，同法測定吸 光度，通過標準曲線計算含量。以對照品濃度為橫坐標，相應的吸光度值為縱坐標，繪製出 的標準曲線。
[0036] 含量測定結果表明實施例1提取物中甾醇含量為12. 3%，實施例2提取物中甾醇 含量約為5.0%，實施例3提取物中甾醇含量約為21.0%。
[0037] 4. 2環肽含量測定（比色法）
[0038] 準確稱取0. 2g酪氨酸，用蒸饋水溶解並定容至1000ml，配成0. 2mg/ml的對照品溶 液，於〇°C下保存備用；
[0039] 稱取2. Og諱三酮，0. 02g抗壞血酸，用無水乙醇溶解並定容至IOOml棕色試劑瓶， 低溫保存。稱取I. Og碘酸鉀溶於蒸餾水中並稀釋至300ml，再加入200mL 95%乙醇溶液， 混勻備用。
[0040] 精密稱取lOOmg，置於燒瓶中，加入95%的乙醇50ml，90°C水浴回流3次，每次3h 合併提取液減壓濃縮。用等體積的醋酸乙酯萃取3次，合併萃取液減壓濃縮。向濃縮液中 加入I. 2mol/L的鹽酸6ml，90°C水浴加熱2h，然後轉移到IOml量瓶中，用蒸餾水定容至刻 度。醇提取物乙酸乙酯相加入茚三酮顯色劑後反應呈陰性，說明用該法處理的供試品不會 受到樣品中所含胺基酸、蛋白質的影響。
[0041] 配製系列對照品溶液，以不加對照品為空白對照，與茚三酮顯色後，於576nm處測 吸光度，繪製標準曲線。
[0042] 含量測定結果表明實施例1提取物中環肽含量為3. 6% (用酪氨酸表示），實施例 2提取物中環肽含量約為2. 0% (用酪氨酸表示），實施例3提取物中環肽含量約為7. 0% (用酪氨酸表示）。
[0043] 4. 3多糖含量測定（比色法）
[0044] 精密稱取IOmg長座線蟲草提取物乾燥品，蒸餾水溶解並定容至10ml，此為長座線 蟲草提取物供試品溶液。
[0045] 另外，精確稱取乾燥的標準品葡萄糖5. 18mg，置於50ml容量瓶中，蒸餾水定容至 刻度，此為葡萄糖標準溶液；分別取0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 40ml葡萄糖標準溶液於 具塞試管中，加蒸餾水使體積為2ml再加苯酚試液Iml，搖勻，迅速滴加濃硫酸5ml搖勻後放 置5min沸水浴加熱15min，取出冷卻至室溫，以蒸饋水2ml加苯酚和硫酸做對照，於490nm 測吸光度，繪製標曲。取供試品溶液lml，加蒸餾水使體積為2ml，同法測定吸光度，通過標 準曲線計算含量。
[0046] 測定結果顯示，實施例1提取物中多糖含量約為5. 6%，實施例2提取物中多糖含 量約為9.0%，實施例3提取物中多糖含量約為22.0%。
[0047] 4. 4核苷含量測定（HPLC法）
[0048] TSKgel 0DS-100V 色譜柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m);流動相 A 為 0· Olmol/L 的 KH2PO4 水溶液，B為甲醇，檢測波長260nm，柱溫20°C，流速lml/min進樣量20 μ 1，梯度洗脫，0? 12min，B 0%?2% ;12 ?23min，B 2%?5% ;23 ?35min，B 5%?20% ;35 ?45min，B 20% ;45 ?55min，B 20%?0% ;55 ?60min，B 0%。
[0049] 分別精密稱取腺嘌呤I. 95mg，鳥嘌呤I. 99mg，次黃嘌呤2. 19mg，尿嘧啶2. Olmg，胞 嘧啶I. 97mg，胸腺嘧啶I. 96mg，腺苷2. 02mg，鳥苷2. 06mg，胞苷2. 00mg，尿苷2. 06mg，β -胸 苷2. 04mg，肌苷2. 15mg，和蟲草素2. 09mg，置IOml容量瓶中，分別用0· 01mol/L的KH2PO4定 容至刻度（鳥嘌呤除外），鳥嘌呤用〇. lmol/L的HCl定容至刻度，製得濃度為0. 2mg/ml的 對照品溶液。分別精密吸取13種對照品溶液lml，充分混勻，即得混合對照品溶液。
[0050] 精密稱取IOOmg長座線蟲草提取物乾燥品，蒸餾水溶解並定容至50ml，吸取Iml稀 釋至IOml，0. 45 μ m微孔濾膜過濾，取續濾液即得供長座線蟲草提取物試品溶液。
[0051] 將混合對照品溶液用流動相逐級稀釋成1，2, 4,8,16, 20,40,100倍濃度的混合對 照品溶液，分別進樣20 μ 1，以對照品濃度（μ g/ml)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪製標準曲 線；供試品溶液以相同色譜條件下進樣20 μ 1，以13種核苷和鹼基的峰面積計算含量。
[0052] HPLC測定結果顯示，13種核苷和鹼基出峰順序為胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌 呤、鳥嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、β_胸苷、腺苷和蟲草素，通過保留時間來 確定樣品中化合物種類，以13種核苷和鹼基作為外標，計算結果顯示，實施例1提取物中核 苷含量約為2. 5%，實施例2提取物中核苷含量約為4. 0%。
[0053] 4. 5甘露醇含量測定（比色法）
[0054] 精確稱取待測樣品各IOOmg分別置於IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。 100°C水浴2h，過濾，用蒸餾水洗滌殘渣；將濾液和洗液合併，並定容至200ml，備用。
[0055] 精密稱取乾燥至恆重的甘露醇標準品50mg，加蒸饋水50ml，配製成lmg/L的甘露 醇溶液。然後分別稀釋配製成質量濃度為1〇、20、30、40、5〇 μ8/πι1的甘露醇標準品溶液。
[0056] 精密量取待測樣品溶液100 μ 1，加入IOml刻度試管中，加 Iml高碘酸鉀溶液，混 勻，室溫放置lOmin，加入2ml 0. 1% L-鼠李糖溶液以除去過多的高碘酸鉀，混合後加4ml 新配製的Nash試劑，於53°C水浴加熱15min使其顯色；每個樣品三個重複。之後迅速冷卻 至室溫，用全波長酶標儀在412nm處，測定吸光度。以蒸餾水代替樣品溶液，用同樣的方法 操作作為對照，測定其吸光度。
[0057] 測定結果顯示，實施例1提取物中甘露醇含量約為12. 9%，實施例2提取物中甘露 醇含量為25.0%。
[0058] 4. 6葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的含量測定（HPLC法）
[0059] 色譜條件為：Inertsil NH2柱（4. 6mmX250mm)，流動相為：乙腈：水=3:1，流速 lml/min，柱溫40°C,示差折光檢測器檢測,進樣量10μ 1。
[0060] 分別精確稱取烘乾至恆重的葡萄糖、麥芽糖、海藻糖標準品各50mg，置於IOmL容 量瓶中，加超純水定容作儲備液。將儲備液稀釋至不同濃度，進樣分析，根據峰面積和三種 糖含量繪製標準曲線。
[0061] 分別精密稱取樣品lOOmg，加入蒸餾水100ml，沸水浴提取2h後定容到100ml，分 別取Iml溶液於12000r/min條件下離心lOmin，取上清液，再以0. 22μπι濾膜過濾，進樣檢 測。
[0062] 計算結果顯示，實施例1提取物中葡萄糖、麥芽糖、海藻糖含量分別為3. 6%、1%、 0. 5%，實施例2提取物中葡萄糖、麥芽糖、海藻糖含量分別為12. 0%、4%、2%。
[0063] 4. 7胺基酸含量的測定
[0064] 精密稱取2mg待測樣品置安瓿瓶中，各加2ml 6mol/L鹽酸，熔封，IKTC水解24h， 真空乾燥。加2mL 0. 02mol/L鹽酸，用0. 22 μ m微孔濾膜過濾，備用。利用L-8900型氨基 酸分析儀分析，進樣量20 μ 1。
[0065] 測定結果顯示，實施例1提取物中胺基酸含量約為10%，實施例2提取物中胺基酸 含量約為21%。
[0066] 4· 8其他組分
[0067] 未鑑定的組分統稱為其他組分。
[0068] 實施例5 :長座線蟲草抗ConA誘導的免疫性肝損傷活性測試 [0069] ICR小鼠，SPF級，體重18?22g，安徽醫科大學實驗動物中心提供。
[0070] 將80隻小鼠隨機分為8組，每組10隻，分別為正常組、模型組、陽性對照組（地 塞米松20mg/kg)，給藥組為長座線蟲草提取物組（實施例1製得，按給藥劑量分為100、 50、25mg/kg的高、中、低三組）、長座線蟲草提取物組（實施例2製得，100mg/kg)及全草組 (400mg/kg)，所用藥物均以0. 3%羧甲基纖維素鈉生理鹽水溶解或混懸。各組老鼠每天按 0. ImVlOg分別灌胃給予相應藥物，空白組和模型組分別給予等體積的0.3%羧甲基纖維 素鈉生理鹽水,連續給小鼠灌胃l〇d。
[0071] 末次給藥後8h，正常組小鼠尾靜脈注射PBS溶液0. 3ml，其他各組注射0. 3ml刀豆 蛋白A ConA(20mg/kg)，尾靜脈注射造模。造模後禁食不禁飲12h，稱重，自小鼠後眼眶靜脈 叢採血，3000r/min離心IOmin製備血清，做血清相關生化指標檢測。頸椎脫曰處死小鼠，解 剖摘取肝臟，用預冷的生理鹽水製成10%肝勻漿，離心取上清液置於4°C保存備用。另切取 每組肝相同部位組織塊5 X 5 X 2mm，置於10 %福馬林中固定24h後做病理學檢測。
[0072] 表1長座線蟲草對肝損傷小鼠肝脾指數、血清中ALT、AST的影響％，[ ±s，η = 8)
[0073]

【權利要求】
1. 長座線蟲草在製備保肝藥物和保健品中的應用。
2. 長座線蟲草提取物在製備保肝藥物和保健品中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述長座線蟲草提取物從麥角菌科線蟲 草屬長座線蟲草中提取，提取物含有按重量比計的如下組分，留醇5%?25%，環肽2%? 10%，核苷2%?10%，多糖5%?25%。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述長座線蟲草提取物還含有按重量比計 的甘露醇5%?25%，海藻糖0? 5%?5%，麥芽糖1 %?5%，胺基酸5%?25%。
5. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述長座線蟲草提取物按如下方法製備， 將長座線蟲草子實體或菌絲體用乙醇水溶液提取，濃縮，乾燥，製得提取物。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述長座線蟲草提取物按如下方法製備， 用長座線蟲草子實體或菌絲體質量5-10倍量的0-95%乙醇，室溫-100°C提取1-4次，每次 1-6小時，趁熱過濾，合併濾液，減壓回收乙醇得提取物浸膏，乾燥，製得提取物；其中提取 方式選自煎煮法、浸漬法、回流法、超聲提取、微波提取；乾燥方式選自冷凍乾燥、減壓乾燥 或者噴霧乾燥。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述長座線蟲草提取物按如下方法製備， 將長座線蟲草子實體粉碎，用5倍藥材質量的95%乙醇，60°C熱提取4次，每次4小時，趁熱 過濾，合併濾液，減壓回收乙醇得提取物浸膏。
8. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述長座線蟲草提取物按如下方法製備， 將長座線蟲草子實體粉碎，用10倍藥材質量的水提取，60°C熱提取4次，每次4小時，趁熱 過濾，合併濾液，減壓濃縮得提取物浸膏，45°C真空乾燥得長座線蟲草提取物。
9. 根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述藥物和保健品的劑型選自膠囊劑、 片劑、顆粒劑、口服液、丸劑、散劑、混懸劑、滴丸、凍乾粉、緩釋劑、控釋劑、靶向製劑。
10. 長座線蟲草提取物的檢測方法：包括①留醇含量測定；②環肽含量測定；③多糖含 量測定；④核苷含量測定；⑤甘露醇含量測定；⑥麥芽糖、海藻糖的含量測定；⑦胺基酸含 量的測定。
11. 根據權利要求10所述的檢測方法，其特徵在於包括①比色法測定甾醇含量；②比 色法測定環肽含量；③比色法測定多糖含量；④HPLC法核苷含量測定；⑤甘露醇含量測定； ⑥麥芽糖、海藻糖的含量測定；⑦胺基酸含量的測定。
12. 根據權利要求11所述的檢測方法，其特徵在於包括 ①甾醇含量測定 精密稱定乾燥的麥角甾醇對照品約l〇mg，加無水乙醇溶解並定容至10ml，即得對照品 溶液；稱取長座線蟲草提取物35mg，無水乙醇溶解並定容至50ml，即得長座線蟲草提取物 供試品溶液； 另外，分別精密移取〇. l、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0ml對照品溶液，置10ml具塞刻度試管 中，分別加入無水乙醇使體積為5ml，再沿管壁緩慢地向各試管中加入5ml磷硫鐵顯色劑， 搖勻，室溫下冷卻30ml即得對照品或供試品的顯色溶液，以無水乙醇同法作空白；530nm測 定吸光度，繪製標準曲線；精密吸取供試品溶液5ml，加入5ml顯色劑，同法測定吸光度，通 過標準曲線計算含量；以對照品濃度為橫坐標，相應的吸光度值為縱坐標，繪製出的標準曲 線. ② 環肽含量測定 準確稱取0. 2g酪氨酸，用蒸饋水溶解並定容至1000ml，配成0. 2mg/ml的對照品溶液， 於0°C下保存備用；稱取2. 0g茚三酮，0. 02g抗壞血酸，用無水乙醇溶解並定容至100ml棕 色試劑瓶，低溫保存；稱取1. 〇g碘酸鉀溶於蒸餾水中並稀釋至300ml，再加入200mL 95% 乙醇溶液，混勻備用；精密稱取l〇〇mg，置於燒瓶中，加入95%的乙醇50ml，90°C水浴回流3 次，每次3h合併提取液減壓濃縮；用等體積的醋酸乙酯萃取3次，合併萃取液減壓濃縮；向 濃縮液中加入1. 2mol/L的鹽酸6ml，90°C水浴加熱2h，然後轉移到10ml量瓶中，用蒸餾水 定容至刻度； 配製系列對照品溶液，以不加對照品為空白對照，與茚三酮顯色後，於576nm處測吸光 度，繪製標準曲線； ③ 多糖含量測定 精密稱取l〇mg長座線蟲草提取物乾燥品，蒸餾水溶解並定容至10ml，此為長座線蟲草 提取物供試品溶液； 另外，精確稱取乾燥的標準品葡萄糖5. 18mg，置於50ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度， 此為葡萄糖標準溶液；分別取〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 40ml葡萄糖標準溶液於具塞 試管中，加蒸饋水使體積為2ml再加苯酚試液lml，搖勻，迅速滴加濃硫酸5ml搖勻後放置 5min沸水浴加熱15min，取出冷卻至室溫，以蒸饋水2ml加苯酚和硫酸做對照，於490nm測 吸光度，繪製標曲；取供試品溶液lml，加蒸餾水使體積為2ml，同法測定吸光度，通過標準 曲線計算含量； ④ 核苷含量測定 TSKgel 0DS-100V 色譜柱（4.6_X250mm，5iim);流動相 A 為 0.01mol/L 的腿#04水溶 液，B為甲醇，檢測波長260nm，柱溫20°C，流速lml/min進樣量20 ill，梯度洗脫，0?12min， B 0%?2% ;12 ?23min，B 2%?5% ;23 ?35min，B 5%?20% ;35 ?45min，B 20% ; 45 ?55min，B 20%?0% ;55 ?60min，B 0% ; 分別精密稱取腺嘌呤1. 95mg，鳥嘌呤1. 99mg，次黃嘌呤2. 19mg，尿嘧啶2. Olmg，胞嘧啶 1. 97mg，胸腺嘧啶 1. 96mg，腺苷 2. 02mg，鳥苷 2. 06mg，胞苷 2. 00mg，尿苷 2. 06mg，0 -胸苷 2. 04mg，肌苷2. 15mg，和蟲草素2. 09mg，置10ml容量瓶中，分別用0? 01mol/L的KH2P04定容 至刻度（鳥嘌呤除外），鳥嘌呤用〇. lmol/L的HC1定容至刻度，製得濃度為0. 2mg/ml的對 照品溶液；分別精密吸取13種對照品溶液lml，充分混勻，即得混合對照品溶液；精密稱取 100mg長座線蟲草提取物乾燥品，蒸饋水溶解並定容至50ml，吸取lml稀釋至10ml，0. 45 y m 微孔濾膜過濾，取續濾液即得供長座線蟲草提取物試品溶液； 將混合對照品溶液用流動相逐級稀釋成1，2,4,8,16, 20,40,100倍濃度的混合對照品 溶液，分別進樣20 yl，以對照品濃度g/ml)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪製標準曲線； 供試品溶液以相同色譜條件下進樣20 yl，以13種核苷和鹼基的峰面積計算含量； ⑤ 甘露醇含量測定 精確稱取待測樣品各l〇〇mg分別置於100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度；100°C水 浴2h，過濾，用蒸餾水洗滌殘渣；將濾液和洗液合併，並定容至200ml，備用； 精密稱取乾燥至恆重的甘露醇標準品50mg，加蒸饋水50ml，配製成lmg/L的甘露醇溶 液；然後分別稀釋配製成質量濃度為l〇、20、30、40、50ii g/ml的甘露醇標準品溶液； 精密量取待測樣品溶液100 y 1，加入l〇ml刻度試管中，加 lml高碘酸鉀溶液，混勻，室 溫放置lOmin，加入2ml 0. 1% L-鼠李糖溶液以除去過多的高碘酸鉀，混合後加4ml新配製 的Nash試劑，於53°C水浴加熱15min使其顯色；每個樣品三個重複；之後迅速冷卻至室溫， 用全波長酶標儀在412nm處，測定吸光度；以蒸餾水代替樣品溶液，用同樣的方法操作作為 對照，測定其吸光度； ⑥ 麥芽糖、海藻糖的含量測定 色譜條件為：Inertsil NH2柱（4. 6_X 250mm)，流動相為：乙腈：水=3:1，流速lml/ min，柱溫40°C，示差折光檢測器檢測，進樣量10 yl ;分別精確稱取烘乾至恆重的麥芽糖、 海藻糖標準品各50mg，置於10mL容量瓶中，加超純水定容作儲備液；將儲備液稀釋至不同 濃度，進樣分析，根據峰面積和三種糖含量繪製標準曲線； 分別精密稱取樣品l〇〇mg，加入蒸餾水100ml，沸水浴提取2h後定容到100ml，分別取 lml溶液於12000r/min條件下離心lOmin，取上清液，再以0. 22iim濾膜過濾，進樣檢測； ⑦ 胺基酸含量的測定 精密稱取2mg待測樣品置安瓿瓶中，各加2ml 6mol/L鹽酸，熔封，110°C水解24h，真空 乾燥；加2mL 0. 02mol/L鹽酸，用0. 22 ii m微孔濾膜過濾,備用；利用L-8900型胺基酸分析 儀分析，進樣量20 yl。
【文檔編號】G01N21/31GK104352531SQ201410527605
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】程文明, 李春如, 李俊, 王佳佳, 張勳, 吳昆
申請人:安徽醫科大學