糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫測定法的製作方法
2023-10-11 13:52:49 3
專利名稱：糞便樣品中幽門螺桿菌的免疫測定法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的方法。
幽門螺桿菌是一種在人的胃腸道上部發現的細菌，已經發現它與胃十二指腸疾病如消化性潰瘍、胃炎和其它疾病有關。按來源把該細菌分在彎曲桿菌屬，然後根據有關它的超微結構和脂肪酸組分方面更詳細的資料再分在螺桿菌屬。
許多不同的技術，如侵入性診斷技術和非侵入性診斷技術已用於測定幽門螺桿菌。侵入性診斷技術包括胃活組織的檢查和培養物。非侵入性診斷技術包括脲呼吸試驗，其中用飲料的方式給患者用C-13或C-14標記的脲，並用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)中的抗原測定血清中的幽門螺桿菌的抗體。在Aleonohammad的美國專利5,262,156和Blaser的歐洲專利申請0 329 570中能夠發現後一種技術的例子。
目前已經鑑別出了好幾種主要的抗原並用於測定幽門螺桿菌抗體的免疫測定法中。但是，這些測定法在血清學診斷方面不具有特異性和敏感性。Newell，D.G.，等，Serodian.Immunother.Infer.Dis，.31-6(1989)。這些免疫測定法的一個問題是交叉反應性。對幽門螺桿菌中的主要抗原，尤其是分子量為60Da的假鞭毛蛋白的研究表明這些抗原中的一些對幽門螺桿菌不是特異的並且也在其它細菌如空腸彎曲桿菌和結腸彎曲桿菌中發現。在設計對幽門螺桿菌的免疫測定法中遇到的第二個問題是菌株的變異。在不同的幽門螺桿菌菌株中已經發現在抗原方面有許多差異。這些問題排除了用單一抗原設計一種測定法。它們也排除了使用單克隆抗體。人們已經嘗試改良對幽門螺桿菌抗體免疫測定法的特異性和選擇性的一種途徑是使用來自不同幽門螺桿菌菌株抗原的混合物，該混合物是用特定的抗原片段富集的。測定血清中幽門螺桿菌抗體的一種酶聯免疫吸附試驗在商業上能夠從Meridian Diagnostics得到。這種測定法使用了一種細菌全細胞溶解產物作抗原。
使用一種用抗原測定幽門螺桿菌抗體存在的ELISA有一些缺點。具體是，在治療感染後人血清中的抗體效價在較長時期內(一些情況是6個多月)仍保持較高。所以，用這種ELISA的陽性試驗並不意味著患者目前被感染和需要治療幽門螺桿菌的感染。當遇到陽性ELISA時，治療醫生通常要求作胃活組織檢查來確認在開始抗生素治療前存在該細菌。所以，以抗原為主的ELISA不能消除對侵入性診斷技術步驟的需求。相反，如果能夠設計一種免疫測定法測定幽門螺桿菌抗原替代抗體，由於在患者治療期間一般測定不到抗原，所以能夠顯著性地減少對胃活組織檢查確認感染的需求。這樣，就對測定幽門螺桿菌抗原的ELISA有一種需求，更具體地說，對直接從糞便樣品中測定幽門螺桿菌的ELISA有一種需求。
儘管人們已知測定糞便樣品中微生物如Campylobacter difficile和腺病毒的ELISA，但是，在對幽門螺桿菌呈陽性的患者的胃活組織檢查的研究中，該細菌一般不能被培養和從糞便樣品中分離出來。這一點和交叉反應性和菌株變異的問題使得可能設計一種對幽門螺桿菌特異並對從糞便樣品中直接可靠地測定幽門螺桿菌抗原足夠敏感的ELISA更值得懷疑。
發明概述本發明提供了一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的方法，它包括(a)把懷疑含有幽門螺桿菌的一種糞便樣品懸浮於樣品稀釋液中；(b)把該稀釋液中的糞便樣品與幽門螺桿菌抗原的第一種多克隆抗體接觸以形成該抗體和抗原的複合體；(c)把該樣品和該複合體進行分離；(d)把該複合體暴露於該抗原的第二種多克隆抗體並把該抗體的一部分與該複合體反應，把所述的第一種和第二種抗體之一結合在一種固體載體上，其它用一種檢測劑進行標記；和(e)測定標記的抗體量並依次測定該糞便樣品中幽門螺桿菌抗原的存在。
在本發明的優選實施方案中，把第一種抗體結合在了一種載體上並用一種酶標記第二種抗體。也提供了三步三明治的測定法。
該免疫測定法將以試劑盒的形式提供，其中試劑盒包括塗有抗體孔的板，樣品稀釋液，標記的抗體，如酶-抗體結合物，洗滌緩衝液和在ELISA時，一種底物溶液。
詳細描述本發明的免疫測定法使用了幽門螺桿菌的多克隆抗體。這些抗體能夠從致敏動物的血清中獲得。把抗原注射到產生抗體的樣品一般是哺乳動物並優選兔子、山羊或牛來完成致敏作用。一般給一個起始量的注射，接著依次是增強劑量的注射使反應達到最大。理想的注射方法是以多倍劑量形式給白色紐西蘭兔子。所注射的抗原量必須足以能夠引出可測定的足夠量的抗體。用試驗出血法和間接螢光測定法可證實抗體的產生。
現在已經發現ATCC菌株43504的幽門螺桿菌特別適用於產生多克隆抗體。如上所述，已經在幽門螺桿菌中觀察到了大量菌株的變異。在不同地理區域以及飲食群中也觀察到了有機體的差異。儘管如此，已經發現用菌株43504的細胞致敏得到的抗體用於測定地理區域和飲食群的有機體。如果必要的話，例如，如果發現ELISA在測定特定人群中的有機體無效的話，可把來自一種以上的幽門螺桿菌菌株細胞用於產生抗體。
在已知免疫測量方法中所用的相同標記物能夠用於標記本發明所用的多克隆抗體。在這些標記物中可以提到如美國專利3,940,475所述的用於螢光測定法測定的螢光標記物，如美國專利3,654,090所述的酶標記物和放射性同位素如碘-125。最常用的酶標記物之一是辣根過氧化酶(HRP)和鹼性磷酸酶。下列實施例3詳細描述了用HRP標記的抗體。
用於從被試驗的糞便樣品中提取抗原物質的方法所用的未標記的多克隆抗體能夠固定在任何一種免疫測定法中常用的支持物上。在這些支持物中可使用的是濾紙、塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯或其它適當的試管。把抗體結合在這類物質上的技術是本領域普通技術人員所熟知的。
為了製備用於該測定法的糞便樣品，把樣品分散在以蛋白質為主的樣品稀釋液中。把該稀釋液配製好並將其緩衝使其交叉反應性最小。作為樣品稀釋液的例子，能夠提到的是胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、馬血清、酪蛋白、白蛋白、明膠和牛血清白蛋白(BSA)。現已發現一份糞便樣品和四份稀釋液的稀釋液是可用的。除了使用蛋白質為主的附加劑外，加入清潔劑和增加或降低pH值或稀釋緩衝劑的離子強度也能減少交叉反應度。例如，許多樣品稀釋液以0.05％到2％之間範圍濃度含有TritonX-100和/或Tween 20。加0-2.9％ NaCl可改變緩衝體系的離子強度。這些變化通過降低形成中的弱的或非特異性反應來導致較好的特異性。
在用於測定法中的抗體溶液和洗滌液的配製中也能體現交叉反應度。該抗體能夠在緩衝液中結合上述提到的一種蛋白脲而被提供。通過加入鹽和表面活性劑來控制交叉反應度能夠配製和緩衝該測定法中所用的洗滌液。降低交叉反應度的優選洗滌液是磷酸鹽緩衝溶液。
通過下列非限定性的實施例更詳細地說明抗原的配製、多克隆抗體的生產和ELISA。
實施例1幽門螺桿菌抗原的製備在用5％去纖維蛋白的羊血補加的胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)上劃線分離幽門螺桿菌(ATCC菌株43504)。在37℃微需氧量的環境下把平皿溫育6-7天。用克隆形態學、脲酶、過氧化氫酶氧化酶反應和革蘭氏染液評估所得到的細菌生長。把可接受的生長傳代培養到四個有羊血的瓊脂平皿上並在37℃微需氧量的環境下生長3-4天。
用5ml的0.85％NaCl浸沒每個平皿並用一臺平皿塗布器收集細菌生長。在2-8℃下以10,000xg把細菌離心分離15分鐘。把各個粒狀沉澱再懸浮於3ml的0.85％NaCl中並匯集在一個離心容器中。在2-8℃下以10,000xg把細菌懸浮液離心分離15分鐘。如上把粒狀沉澱再懸浮和離心。把最後的粒狀沉澱再懸浮於初始總體積的3％的20mM磷酸鹽緩衝液中。把該細菌細胞轉入一個冰凍的容器中並在不產生泡沫的最大設置下超聲處理5次各3分鐘，在兩次循環之間靜置30秒。在2-8℃下以57,000xg把超聲處理的細菌細胞離心分離15分鐘。收集細菌上清液並除去粒狀沉澱。
實施例2兔多克隆的生產用等份的弗氏完全佐劑(總免疫原是1.0ml)等份稀釋實施例1中所得到的細菌上清液使得每毫升含1×108個細胞。把該溶液完全混合併將該溶液0.2-0.5ml肌內注射到右後腿，把該溶液0.1-0.25ml皮下注射到背部8到10個部位。一個月後用弗氏完全佐劑連續注射，注射部位限定在背部皮下。
三個月後取試驗血液。在第三次注射後一周從耳中央靜脈取血。在2-8℃把該血液溫育過夜。第二天在室溫下以5,000xg把該血離心分離15分鐘。收集上清液並去掉粒狀沉澱。用間接螢光測定法(IFA)測試該上清液。把10μl幽門螺桿菌懸浮液放在玻片上並加熱固定進行IFA。用3％牛血清白蛋白(BSA)封閉該玻片5分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液(PBS)和0.5％Tween 20(PBS/Tween洗液)衝洗。加入50μl用含有疊氮鈉的磷酸緩衝鹽水(PBSA)稀釋為1∶10的試驗血和作為對照的正常兔血清並在潮溼環境下溫育30分鐘。用PBS/Tween洗液衝洗後，用PBSA把偶聯到FITC(異硫氰酸螢光素)的山羊抗兔稀釋為1∶10並每孔中加入50ul。在黑暗潮溼的環境下把玻片溫育30分鐘。再衝洗玻片。加入螢光測定封固劑和蓋玻片並用一臺螢光顯微鏡觀察。然後把證實血清螢光稠度讀數在4+的兔放出一定量的血。
除了從各只兔子中取50ml外，得到與試驗血相似的血量。將作為試驗血的該血溫育並離心。
測定血清總體積並加入等量的磷酸緩衝鹽水(PBS)。進行40％硫酸銨沉澱反應除去不需要的蛋白質並在2-8℃溫育24小時。把該混合物轉入一隻離心試管並在室溫下以10,000xg離心分離30分鐘。把粒狀沉澱再懸浮於PBS中使其大約是原始容量的三分之一。在2-8℃用總上清液容量200倍的pH6.5的0.0175M的磷酸鉀透析該懸浮液。透析後，在室溫下以10,000xg把懸浮液離心分離20分鐘。收集上清液並除去粒狀沉澱。
在室溫下用pH6.5的0.0175M磷酸鉀平衡DEAE(二乙氨乙基纖維素)柱。把該上清液放在柱上並收集流出物的餾分。測定蛋白濃度(OD280)併集中大於0.200的全部餾分。用ELISA測定所集中的抗體。
實施例3辣根過氧化酶的偶聯偶聯使用了10mg的DEAE純化的兔抗幽門螺桿菌的抗體。通過濃縮方法或加入pH9.6的10mM的碳酸氫鈉的方法使抗體的最終體積為2.5ml。用pH9.6的10mM的碳酸氫鈉平衡PD-10柱(Pharmcia)。向柱上加入該抗體並取九種餾分各1.0ml。測定各餾分的蛋白濃度(OD280E.O.＝1.4)併集中讀數在0.200以上的餾分。
用pH4.3的1mM三水醋酸鈉平衡分離用PD-10柱。對每1mg抗體來說所用的辣根過氧化酶(HRP)的最小量是1.172mgHRP。稱量1-1/2倍的最小計算量HRP並加入1.0ml的去離子水。進行蛋白濃縮(OD403E.O.＝2.275)並用去離子水把HRP稀釋到10mg/ml。以每4mgHRP的0.2ml濃度加入0.1M的間過碘酸鈉。在室溫輕微搖動下使該反應進行20分鐘。以每ml的HRP用4mg的量加入50ul的2M乙二醇來終止反應。用pH4.3的1mM的三水醋酸鈉把HRP通過PD-10柱洗脫。
偶合率為1mg抗體比1.172mgHRP。用10mM碳酸氫鈉調節該抗體的pH為9.6和用1mM的三水醋酸鈉調節HRP的pH為4.3。在專用燒瓶中合併這兩部分並用0.2M的碳酸氫鈉調節pH使其從9.6到9.6。避光保護，在室溫85-95rpm的旋轉器上把該混合物溫育兩小時。兩小時後，向每8mg抗體中加入0.1ml的4mg/ml的硼氫化鈉。把新混合物在4℃的旋轉器上溫育兩小時。使該偶聯物通過用PBS平衡的PD-10柱並收集含有該偶聯物的餾分。匯集該餾分並濃縮到大約1.0ml。把該濃縮物放在流速為10ml/小時的用PBS平衡的Sephracryl S-200柱上。收集2.0ml餾分並對抗體和HRP進行蛋白濃縮。匯集在OD280和OD403處具有相同峰的餾分並濃縮到大約1.0mg/ml。
下列實施例4說明一種稱作「向前」測定法，其中把結合在支持物上的抗體首先與被測試的樣品接觸通過形成一種抗體/抗原複合體並把該複合體與一種已知量的標記抗體接觸的方法來從樣品中提取抗原。但是，本領域普通技術人員也能想到用稱作「同時」或「反向」測定法進行免疫測定。同時測定法包括同時把結合到固體支持物上的抗體和標記的抗體加到被測試的樣品中的單一溫育步驟。完成溫育後，衝洗固體支持物除去殘餘樣品和未複合標記的抗體。然後測定與固體支持物相連的標記抗體的存在。反向測定法包括先把標記的抗體溶液加到糞便樣品中，接著加入結合在支持物上的未標記的抗體的步驟。溫育一秒鐘後，用常規的洗液衝洗該支持物使其不含殘餘的樣品和未反應的標記抗體。
實施例4ELISA試驗用PBS連續稀釋抗體在20ug/ml和2.5ug/ml之間。把0.100ml等份的各稀釋液加到Immunlon-II試紙(Dynatech)，覆蓋並在室溫下溫育過夜。用PBS/Tween洗液把平皿衝洗一次。在室溫下用1％BSA/PBS將其封閉1小時。再用PBS/Tween洗液衝洗一次。用0.1％BSA/PBS把幾個陽性和陰性樣品稀釋到1∶5。把各樣品(0.100ml)加入試紙的孔中，覆蓋並在室溫下溫育1小時。用Meriflor C/G洗液把平皿衝洗5次。把上述得到的偶聯到辣根過氧化酶的兔抗幽門螺桿菌稀釋到10ug/ml並向各孔加入0.100ml。遮蓋平皿並在室溫下溫育1小時。再用PBS/Tween洗液衝洗五次，然後在室溫下用0.100ml三甲基苯塞啶(trimethylbensidine)(TMB)溶液展開10分鐘。用0.050ml 2NH2SO4終止並在兩分鐘後讀數。選擇能夠產生最大信號和最低背景的稀釋液作理想的稀釋液。
通過把標記抗體的測定值與從含有已知量的抗原的校準樣品所得到的測定值比較來進行定量測定。下列表1顯示了當通過該測定法進行每個含有預定量數目有機體的四種樣品測定時所得到的光密度。
表1有機體的數目每ml OD450/6303×1072.5471.9×1070.6624.6×1060.1821.1×1060.038經過該測定法操作六種臨床樣品的結果顯示在表2中。
樣品OD450/630結果1 0.301 陽性2 0.713 陽性3 0.284 陽性4 0.005 陰性5 0.033 陰性
6 0.008 陰性按照本發明稱作三明治的測定法也能夠用於測定糞便樣品中的幽門螺桿菌。現有技術中已知三步測定法並且該基本方法能夠用於測定糞便樣品中的幽門螺桿菌。三步測定法一般是這樣進行的把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便樣品分散到一種最小交叉反應度的樣品稀釋液中並把稀釋的樣品加入到一種已經從第一種產生抗體的動物中得到的幽門螺桿菌的固相抗體中。把該樣品溫育形成抗體-抗原複合物。衝洗固相支持物上的過量樣品後，把一種從第二種產生抗體動物中所得到的並作為初級抗體的已知幽門螺桿菌抗體加入該抗體-抗原複合物中並溫育來形成一種抗體-抗原-抗體複合物。在形成該複合物並除去未反應的抗體後，把該複合物與一種作為二級抗體的已知抗體反應，其中的二級抗體是一種產生二級抗體種類如抗-(兔、牛或山羊)的免疫球蛋白。用常規方法(一般用酶)標記二級抗體並與抗體-抗原-抗體複合物溫育來形成三抗體複合物或三明治。在除去未反應的二級抗體後，用常規方法測定抗原。在使用酶標記中，把一種底物加入該抗原和三種抗體的複合物中並控制底物與連接酶的反應來測定存在於樣品中的抗原量。在這種作為基礎測定法的三明治測定法中，如果必要的話，配製或緩衝洗液和抗體溶液來控制交叉反應度。
經過詳細描述本發明和通過參考優選實施方案，在不超出下列權利要求中所限定的範圍內可能的改良和變化對本領域普通技術人員都將是顯而易見的。
權利要求
1.一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的方法，它包括(a)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便樣品懸浮於一種樣品稀釋液中；(b)把該稀釋液中的糞便樣品與幽門螺桿菌抗原的第一種多克隆抗體接觸以形成該抗體和抗原的複合體；(c)把該樣品和該複合體進行分離；(d)把該複合體暴露於該抗原的第二種多克隆抗體並把該抗體的一部分與該複合體反應，把所述的第一種和第二種抗體之一結合在一種固體載體上，其它用一種檢測劑進行標記；和(e)測定標記的抗體量並依次測定該糞便樣品中幽門螺桿菌抗原的存在。
2.根據權利要求1的方法，其中把第一種抗體結合在一種固體載體上，用一種檢測劑標記第二種抗體。
3.根據權利要求1的方法，其中用一種檢測劑標記第一種抗體，把第二種抗體結合在一種固體載體上。
4.根據權利要求1的方法，其中的樣品稀釋液是一種以蛋白質為主的稀釋液。
5.根據權利要求1的方法，其中的多克隆抗體是通過用幽門螺桿菌細胞把一種產生抗體的哺乳動物致敏得到的。
6.根據權利要求4的方法，其中的樣品稀釋液含有選自於由胎牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、馬血清、酪蛋白、白蛋白、明膠和牛血清白蛋白組成的一種蛋白。
7.根據權利要求1的方法，其中把該複合體暴露給第二種抗體之後，用一種能夠降低交叉反應度的緩衝液或能夠改善該測定法特異性的其它緩衝液洗滌該複合體。
8.根據權利要求5的方法，其中的細胞是來自多種幽門螺桿菌菌株的細胞。
9.根據權利要求3的方法，其中的檢測劑選自於鹼性磷酸酶和β-半乳糖苷酶辣根過氧化酶。
10.根據權利要求7的方法，其中的洗滌用磷酸鹽緩衝液。
11.根據權利要求5的方法，其中的細胞是來自ATCC菌株43504的細胞。
12.一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的方法，它包括(a)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便樣品懸浮於樣品稀釋液中；(b)把該稀釋液中的糞便樣品與幽門螺桿菌抗原的第一種多克隆抗體接觸以形成該抗體和抗原的複合體；(c)把該樣品和該複合體進行分離；(d)測定標記的抗體量並反過來測定該糞便樣品中幽門螺桿菌抗原的存在。
13.一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的方法，它包括(a)把懷疑含有幽門螺桿菌的糞便樣品懸浮於樣品稀釋液中；(b)把該稀釋液中的糞便樣品與產生第一種抗體的樣品所產生的幽門螺桿菌抗原的第一種多克隆抗體接觸以形成該抗體和抗原的複合體；(c)把該樣品和該複合體進行分離；(d)把步驟(b)中形成的抗體-抗原複合體與從產生第二種抗體的樣品中獲得的幽門螺桿菌抗原的初級多克隆抗體接觸以產生一種抗體-抗原-抗體複合體；(e)除去這種初級抗體，使其不存在於步驟(d)的複合體中；(f)把步驟(d)中形成的抗體-抗原-抗體複合體與二級抗體接觸，所述的二級抗體是產生第二種抗體的樣品的一種抗體，由此，該二級抗體與抗體-抗原-抗體複合體形成了複合體；和(e)測定該糞便樣品中幽門螺桿菌抗原的存在。
14.一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的試劑盒，它包括已結合有幽門螺桿菌的多克隆抗體的多孔板，以蛋白質為主的樣品稀釋液，幽門螺桿菌的酶多克隆抗體的偶聯物，洗滌緩衝液和底物溶液。
全文摘要
一種測定糞便樣品中幽門螺桿菌的方法，它包括(a)把懷凝含有幽門螺桿菌的糞便樣品懸浮於樣品的稀釋液中；(b)把該稀釋液中的糞便樣品與幽門螺桿菌抗原的第一種多克隆抗體接觸以形成該抗體和抗原的複合體；(c)把該樣品和該複合體進行分離；(d)把該複合體暴露於該抗原的第二種多克隆抗體並把該抗體的一部分與該複合體反應，把所述的第一種和第二種抗體之一結合在一種固體載體上，其它用檢測劑進行標記；和(e)測定標記的抗體量並依次測定該糞便樣品中幽門螺桿菌抗原的存在。
文檔編號G01N33/569GK1165299SQ9710311
公開日1997年11月19日 申請日期1997年3月12日 優先權日1996年5月9日
發明者C·V·拉卡, C·S·A·伊, K·J·科扎克 申請人:默裡迪恩診斷公司