Reg樣蛋白的製作方法

2023-10-11 06:28:44

專利名稱：Reg樣蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質，其存在、不存在和在生物樣品中的濃度，或表達水平可以用來指示腫瘤、癌症及相關病症的存在與否，以及相關的預測與診斷。
廣義的講，「標記」是指能用於將癌症與正常組織和其他疾病狀態區分開任何性質。這個標記的存在是分類的基礎。更具體而言，該術語表示易於分析的特定的分子。血清標記，正如該名稱所暗示的，是易於人血清中分析出的標記。典型的，它們是分泌蛋白或細胞受體，它們在腫瘤細胞中很豐富，遠遠超過它們在(或完全不存在)正常的細胞和組織中的數量。實例包括PSA、CEA和AFP。
作為更寬泛的考慮，腫瘤和癌症標記包括通過各種細胞產生的核酸及其他與核酸相關的物質來檢測癌症和腫瘤。(正如其它物質也與核酸相關一樣)。癌症一般認為是一種多突變疾病。因此，與一些較古老的癌症標記相比，在分子水平上檢測突變提供了更直接、更可靠的診斷前景。因此，宜將指示引起癌症或在癌症中出現的突變的核酸序列作為癌症標記。進行核酸處理的能力不損害血清標記的有用性。它們都可以在對病人的診斷、籌劃和治療監控中起到合適的作用。
編碼癌症相關抗原和結果的基因的發現，開啟了通過遺傳學的介入對抗癌細胞增殖的大門。通過準確且一致地應用癌症標記，將癌性組織從正常組織中區分出來，不僅具有診斷潛力而且用於治療和預後也是可取的。因此，人們仍在繼續尋找這樣的標記。
Reg蛋白，屬於C型凝集素超家族，是約20kD的分泌蛋白質，在胃腸道的正常和惡性組織中，腦垂體和再生神經元中可以發現。Reg的表達與細胞的增殖、轉移和分化相關(Chiba T等，2000，胃腸病學雜誌35增刊1252，Levine JL，2000，臨床研究8960，Otonkoski T等.，1994，糖尿病431164，Bemard-PerroneseFR，1999，組織化學細胞化學雜誌47863)。已知的reg基因簇在人染色體2p12上。
Reg蛋白質家族的第一個被定性的成員是reg 1α，它分離自鼠新生胰腺小島(Terazono等，1988)。接下來，克隆出了另外四個編碼人Reg蛋白的cDNA和相應的小鼠和大鼠正源蛋白的cDNA(Watanabe等.，1990；Lasserre等.，1992；Bartoli等.，1993；Raeloff等.，1997)。它們對上皮細胞和神經外胚層細胞的亞型有促進細胞分裂活性(Katsumata等，1995；Zenilman等.，1996；1997；1998；Livesey等.1997)。最近公開了一種大鼠的regl蛋白的生長信號轉導受體。該受體是由與人的多發性外生骨疣基因同源的基因編碼的。並發現該基因除了胰腺小島中表達外，在包括腎、肝、腸、腎上腺和腦垂體腺的多種組織中都可以表達(Kobayashi等.，2000)。
鑑別、分離和使用新的癌症、腫瘤標記在診斷，治療和癌症的預測上仍是很重要的。
本發明還包括一種核酸分子，該核酸分子是與編碼和SEQ ID NO 2至少有70％同一性的蛋白的核酸分子互補的核酸分子，一種具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列中至少15個連續鹼基的核酸分子，或一種能在嚴謹條件下與SEQ ID NO 1所示核酸序列分子雜交的核酸分子。
本發明的另一方面，提供了分離的RELP。
在本發明的另一個方面，檢測腫瘤或癌性存在的方法包括檢測有上面所述序列的多肽、蛋白或核酸分子的表達，和生物樣品中上述分子的存在或濃度與腫瘤或癌性的存在或不存在的相關性。
在本發明的另一個方面，提供了能與RELP或其功能等價物相結合的抗體。
在本發明的另一個方面，提供了能檢測上述多肽，蛋白或核酸分子的試劑盒。
附圖簡述

圖1編碼RELP的cDNA核酸序列(Seq.ID No.1)。
圖2RELP的胺基酸序列(Seq.ID No.2)。
圖3編碼RELP信號蛋白的cDNA核酸序列(Seq.ID No.3)圖3aRELP信號蛋白的胺基酸序列(Seq.ID No.4)。
圖4按比例繪製的RELP基因的簡要示意圖。
在此處，此處所用到的術語「核酸序列」，如上面所描述的，包括包含一個或更多修飾鹼基的DNAs或RNAs，即為了穩定性或其他原因其主鏈被修飾的DNAs或RNAs。而且，包含特殊鹼基，如次黃嘌呤核苷，或修飾鹼基，如三苯甲基化的鹼基，的DNAs或RNAs，僅舉兩例在此處所用術語核酸序列的含義範圍。為達到許多有用目的而對DNA和RNA進行的多種修飾是本領域共知的。在此所用術語核酸序列包含化學地、酶地或代謝地修飾的核酸序列，和病毒特徵的DNA和RNA的化學形式的核酸序列及特別是簡單和複合細胞。核酸序列包含短核酸序列，通常指寡核苷酸。
在此處，RELP的「功能衍生物」指擁有和RELP的生物活大體類似的生物活性(功能的或結構的)的化合物。術語「功能衍生物」包括RELP的「片段」、「變體」、「退化變體」、「類似物」、「同系物」或「化學衍生物」。一個分子和RELP是「大體類似的」，即或二者有大體類似的結構或兩者具有類似的生物活性。
本說明書中描述新鑑定的蛋白，「RELP」(Reg樣蛋白)。已克隆、分離了編碼此蛋白的核酸(包括，例如，cDNA)，並應用於癌症診斷。提出了基因結構和染色體定位，描述了其表達的組織分布。此外，製備了與該蛋白相結合的抗體並設計了其應用方法。還克隆了RELP的鼠的同系物並進行了鑑定。
除非特別指出，此說明書中描述的所有核酸序列都為5′-3′方向。
圖1表示用於產生RELP的cDNA核酸序列(Seq.ID No.1)。此RELP的cDNA編碼158個胺基酸的蛋白，該蛋白帶有推定為22個胺基酸的信號肽(圖3)，RELP的分子量約為18kd，算出的等電點是9.128。RELP的氨基端高度疏水、包括一段具有22個胺基酸的可切割信號序列。人的Reg蛋白之間具有51-87％同一性、55-87％相似性；RELP與它們具有32-37％同一性、42-47％相似性。
RELP的一級結構和C-型凝集素亞組蛋白超家族的一級結構相似，其包括一個單獨的磷水化合物識別結構域(CRD)。與CRD-相關且包含在分子內二硫鍵內的四個保守和兩個可選擇的半胱氨酸在RELP中都是保守的。殘基50-53代表推定的氮-糖基化位點。RELP的二級結構和人Reg 1α二級結構類似，這些蛋白的球形摺疊可能相關。RELP的胺基酸序列如圖2(Seq.ID No.2)所示。
RELP基因位於1號染色體12-13.1區，跨距約17500鹼基對。它包含7個外顯子。圖4按比例描繪出的RELP基因的示意圖，並示出所測定的外顯子之間的距離。每個外顯子的位置用羅馬數字表示。
RELP在正常組織中的表達RELP信息在小腸上皮細胞亞群高表達。該細胞亞群代表腸神經內分泌細胞(用嗜鉻粒蛋白共定位以證明)。RELP mRNA也見於胃、結腸的不同部位，其定位於上皮細胞腺管底部、胰腺、前列腺、睪丸。
RELP在患病組織中的表達RELP在發源於不同器官，例如卵巢、胃、結腸、乳房和胰腺，的粘蛋白腫瘤中異常大量表達。RELP mRNA的表達量在粘蛋白卵巢腫瘤中非常的高。卵巢、胃、結腸、乳房的粘蛋白腫瘤的上皮細胞顯示高的、統一的蛋白表達水平。管內的粘蛋白胰腺腫瘤也表達RELP。這些腫瘤作為最近鑑定的胰腺病症實體出現，所述胰腺病症預先有復發的胰腺炎趨向。它們可能傾向於惡化。
用受驗者的生物樣品來確定癌細胞是否在受驗者中存在。適宜的生物樣品的例子包括血和活組織材料。診斷的方法之一是使樣品細胞中的RNA在嚴謹條件下暴露在能和RELP基因轉錄物或其中的片段的標記探針雜交。當然雜交條件根據生物樣品的性質、癌症種類、探針製備方法、組織製備方法等的不同而改變以期獲得最適宜的敏感性和特異性。
將樣品和探針接觸後，下一步是確定探針是否和樣品中mRNA的核酸序列雜交，從中推斷出RELP基因的表達，其高水平表達有助於癌症的診斷。
另一診斷方法是將樣品和與針對抗原肽(即RELP)的抗體相接觸。這些抗體在開發非常特殊的測定——檢測RELP抗原中有用，且這些實驗允許以多種形式應用。優選的是這些抗體是標記的單克隆抗體。RELP是分泌分子，在體液，例如血清、血漿、囊腫液、胰腺液和尿，中檢測RELP抗原可用來探測或跟蹤監測表達RELP的癌症。典型的，蛋白在患病組織(如上所述)中表達水平是在正常組織中的100-1000倍。在本發明的血清分析中可檢測到相應於正常組織200-1000％的血清水平。最典型的是，發現結腸癌病人血清化驗結果250％倍於正常RELP水平。同樣的，分析mRNA表達水平的分子診斷結果顯示出表達水平是正常組織的150-1000％即指示疾病。
純化的生物活性的RELP可能有幾種不同的物理結構。RELP可能以全長的新生多肽或未加工的多肽、或部分加工的多肽、或加工過的多肽的結合體形式存在。全長新生的RELP多肽可經特殊的蛋白水解切割進行翻譯後修飾，形成全長新生多肽片段。一個片段或自然相關片段可能有和RELP相關的全部生物活性，但各RELP片段和自然相關RELP多肽片段的RELP活性程度可能不同。
因為編碼特定胺基酸的不同密碼子有大量冗餘，本發明也包括那些包含最終翻譯為同一種胺基酸的不同密碼子的DNA序列。為這一特定目的，關係一個或更多替換密碼子的序列將被定義為退化種類。沒有實質改變表達蛋白的最終天然性質的突變體，無論DNA序列的突變體或翻譯的蛋白的突變體，都包含在本發明範圍內。例如，脂肪族胺基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的替代物；羥基胺基酸絲氨酸、蘇氨酸之間的互換；酸性胺基酸天冬氨酸、穀氨酸之間的互換；醯胺基胺基酸天冬醯胺、谷醯胺的替代物；鹼性胺基酸賴氨酸、精氨酸之間的互換；芳香族胺基酸苯丙氨酸、酪氨酸間的交換，可以不引起多肽功能上的變化。這些替換眾所周知的並已在例如《基因分子生物學》，第四版，Bengamin Cummings Pub.Co.，Waston等人著中有所描述。
眾所周知，可以通過改變編碼某個肽的DNA序列使其以編碼和原來肽具有不同性質的肽。改變DNA序列的方法包括定點突變、嵌合替代、基因融合，但不僅限於此。定點突變用於改變一個或更多DNA殘基，可能導致沉默突變，保守突變或不保守突變。嵌合基因是用類似或不同的基因的結構域替換RELP基因中的相似結構域來製備的。類似的，向RELP基因添加結構域，如便於確定和分離基因的親和標記以製備融合基因。可以用代替RELP基因結構域的方式製備融合基因，例如通過去掉跨膜區域或加上改變通常運輸途徑的靶序列或加上新的翻譯後修飾序列的方法生成蛋白的可溶形式。改變性質的例子包括改變酶對底物或配體的受體的親和力，但不僅限於此。核酸序列或多肽序列所有這些改變在本發明中都預期為有用變異體，只要其保持和在本發明中描述的核酸序列或多肽序列的最初用途一致的功能。
如本領域所公知的，同一性或相似性是通過對比序列而確定的在兩個或多個多肽序列或核酸序列之間的關係。在本領域，同一性是指在多肽或核苷酸序列之間序列相關性的程度，根據具體情況，通過在成串的這樣的序列之間相配而確定。同一性和相似性是容易計算的(計算分子生物學，Lesk，A.M.，編，牛津大學出版社，紐約，1998；生物計算信息和基因組工程Smith，D.W.，編，科學出版社，紐約，1993；序列數據的計算機分析，Part L，Griffin，A.M.，和Griffin，h.g.，編.，Humana出版社，新澤西，1994；分子生物學中的序列分析，von Heinje，G.，科學出版社，1987；引物序列分析，Gribskov，M和Devereux，J.，編，M Stockton出版社，紐約，1991)。有很多測定兩個核苷酸序列或多肽序列同一性或相似性的方法，兩個術語對本領域技術人員而言都是公知的(分子生物學中的序列分析，von Heinje，G.，科學出版社，1987；引物序列分析，Gribskov，M和Devereux，J.，編，M Stockton出版社，紐約1991；Carillo，H.，和Lipman，D.，(1998)SIAM應用數學雜誌，48，1073.，在兩個序列之間確定同一性或相似性通常使用的方法並不局限於Carillo，H.，和Lipman，D.，(1998)SIAM應用數學雜誌，48，1073.中所披露的。確定同一性的優先的方法是設計給出受測試的兩個序列之間最大相配。確定同一性和相似性的方法可以由電腦程式生成。優選的確定兩序列同一性和相似性的電腦程式包括但不限於GCG程序包(Devereux，J.，等.，(1984)核酸研究12(1)，387)，BLASTP，BLAST和FASTA(Atschul，S.F.等.，(1990)分子生物學雜誌215，403)。
多肽經常包括作為天然胺基酸的20種普通胺基酸以外的胺基酸。一些胺基酸，包含末端胺基酸可在給定的多肽中被修飾，也可在天然過程，例如加工過程和翻譯後修飾，也可以通過本領域公知的化學修飾技術進行。實際上，多肽上出現的天然的普通的修飾的數量是大的難以詳盡，但在基礎文獻中已有描述，在專題論文中和大部頭研究著作中更加詳細，這對本領域普通技術人員來講是公知的。在這些已知的修飾之中，可能出現在多肽中的是，乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素類共價連接或核苷酸衍生物，與脂類或脂類衍生物共價連接，與磷脂酸肌醇共價相連、交聯、環化、二硫鍵結合結構、脫甲基化、共價交連結構、胱胺酸結構、焦穀氨酸結構、達夫反應、γ-羧基化、葡基胺化、GPI錨定結構、羥基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、蛋白水解過程、磷酸化、異戊烯基化、外消旋、氫烯基化、硫酸化、tRNA介導的附加胺基酸的胺醯化蛋白質，和隨機化。這些修飾對本領域技術人員來講是共知的，在科學著作參見蛋白-結構和分子組成，第二版Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Commpany，紐約(1993)中有詳細的描述。
本發明的範圍包括與編碼具有此處所述胺基酸序列的多肽的全長核酸序列具有70％同一性核酸序列和互補於該核酸序列的核酸序列。可供選擇的，優選的是包含至少有80％同一性部分的核酸序列，更優選是包含至少有90％同一性的部分核酸序列，在這些優選的核酸分子當中，至少有95％同一性的是特別優選的。進一步的，有至少97％同一性的是比至少有95％同一性更優選的，在這當中，至少有98％同一性的和至少有99％同一性的是特別優選的，至少有99％同一性是最優選的。在優選實施例中，能與所述核酸序列雜交的核酸序列編碼與帶有RELP胺基酸序列特性的多肽具有基本相同的生物功能或活性的多肽。除此之外，在這個方面的優選實施例是編碼與具有SEQ ID NO 1的DNA編碼的成熟多肽相同的生物學功能和活性的多肽的核苷酸序列，本發明進一步涉及能夠雜交於上述核苷酸的核苷酸序列，在這點上，本發明特別涉及能在嚴謹條件下能與上述核苷酸雜交的核苷酸序列，在這裡，術語「嚴謹條件」指只有在序列間有至少95％或97％同一性時才出現雜交。
本發明的核酸序列可以用作RNA，cDNA和基因組DNA的探針來分離編碼這裡所公開的RELP的全長cDNA和基因組克隆，及用來分離與它們有很高序列相似性的其它基因的全長cDNA和基因組克隆。這種探針通常包含至少15個鹼基，優選的該探針有至少30個鹼基甚至至少50個鹼基，更優選的是探針有30個鹼基，甚至在50個鹼基或更少。例如，本發明的基因的編碼區可以使用已知的DNA序列合成寡聚核苷酸探針進行篩選而獲得。一個互補於本發明給出的基因的標記的寡聚核苷酸，可用來篩選cDNA庫、基因組DNA庫或mRNA庫以確定探針與文庫中的那些成員雜交。
本發明的多肽包括SEQ ID NO 2的(特別是成熟的多肽)多肽，也包括和SEQ ID NO 2的多肽具有至少70％同一性的多肽，優選和SEQ ID NO 2的多肽具有至少80％同一性的多肽，更優選是和SEQ ID NO 2的多肽具有至少90％相似性(更好是至少90％同一性)的多肽。更優選是和SEQ ID NO 2的多肽具有至少95％相似性(更好是至少97％同一性)的多肽，也包括該多肽的一部分，這部分多肽通常包括至少30個胺基酸，優選的包括至少50個胺基酸。本發明的多肽片段的代表性的例子包括，例如，SEQ ID NO 2的截短多肽或它的變體或衍生物，除了包含氨基端的一系列的殘基(是指連續的區域，部分)缺失、或包含羧基端的一系列殘基缺失，或在兩截短突變體中，兩個包含系列殘基的缺失，一個包含了氨基端，一個包含了羧基端以外。本發明在這一方面還優選具有SEQ ID NO 2描述的多肽序列的結構或功能屬性的片段。
臨床鑑定RELP的試劑盒可以用這些和相似的抗體輕易製備。這樣的試劑盒可以包括直接鑑別RELP的抗體，適當的指示劑(例如酶、標記物等)，和(選擇性的)其它在這種試劑盒中有用的試劑，比如稀釋緩衝液，穩定劑和其它在這種分析中用到的典型物質。這試劑盒可以用來從體液中檢測RELP，來篩選和追蹤表達RELP的癌症，來篩選在組織樣品中存在的RELP蛋白。
Seq.ID No.6CYGYFRKLRNWSDAELECQSYGNGASeq.ID No.7WIDGAMYLYRSWSGKSMGGNKHCSeq.ID No.8CAEMSSNNNFLTWSSNESeq.ID No.9CAEMSSNNNFLTWSSNECNKRQHFLCKYRSeq.ID No.10CEYISGYQRSQPIWIGLHDPQKRQQWQSeq.ID No.11CQSYGNGAHLASILSLKEASTLA實施例3雙螢光免疫染色正常的十二指腸黏膜組織在用針對RELP的多克隆抗體(1∶30；25μg/ml)和嗜鉻粒蛋白A的單克隆抗體(1∶5000；0.2μg/ml，CA)雙染色丁二胺異硫氰酸鹽連接的豬抗兔免疫球蛋白(DAKO)和異硫氰酸螢光素(FITC)連接的羊抗鼠免疫球蛋白(ICN/Cappel)進行雙染色。對照組中，用正常的兔子和小鼠血清中的IgG片段取代主要抗體。
RELP與嗜鉻粒蛋白A的共定位顯示十二指腸的RELP表達細胞屬於神經內分泌類。
少數的RELP陽性細胞在胃黏膜和外分泌胰腺中發現，正常的克隆，RELP定位於腺管底部的上皮細胞。強的RELP mRNA信號被在從十二指腸黏膜中所選細胞的細胞質中觀察到，在而大多數上皮是陰性的來自卵巢，胃、結腸、乳房的粘蛋白癌中也在上皮細胞中檢測到了RELP的mRNA。RELP特異性mRNA造影術證實了RELP蛋白在這些細胞中表達。實施例5免疫組織化學親和純化的針對RELP的C末端的多克隆抗體被用於組織化學法檢測和RELP定位。4個從Helsinki大學病理學系檔案庫中獲得的福馬林固定和石蠟包埋正常和癌症組織中得到的μm級的切片被安裝在3-氨丙基-三乙氧基-矽烷(APES，Sigma，St.Louis，MO，U。S.A)矽化的載玻片上，再在通過一系列濃度梯度的酒精和進行脫蠟和再水合，再用甲醇過氧化物(含有0.5％氫過氧化物的甲醇)在室溫處理30分鐘，以固定內源過氧化物酶活性。在微波箱處理兩次每次5分鐘(650W)以恢復抗原。Elite ABC試劑盒(Vectastain，Vector Laboratories，Burlingame，CA，U.S.A)被用來做免疫過氧化酶染色。RELP抗體在理想的稀釋度為1∶2000時使用。生物素化的第二抗體和過氧化物酶標記的抗生物素蛋白-生物素複合物在載玻片上溫育30分鐘，用PBS(pH7.2)稀釋，所有的培育是在室溫條件下在潮溼箱中進行的。在不同的染色步驟之間，載玻片用PBS清洗三次。過氧化物酶染色，用3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)溶液(0.2mg/ml溶於含有0.03％氫過氧化物的0.05M乙酸鹽緩衝液中)在室溫下進行15分鐘後可見。最後載玻片被用Mayer蘇木精輕輕的復染色，並用水性固封劑(Aquamount，BDH)固封。在對照實驗中，主要抗體被用從正常兔子血清中的IgG的片段所替換或者主要抗體被RELP肽預吸附。這種染色指示了在十二指腸部分上皮細胞中，在胃黏膜部分上皮細胞中，在外分泌胰腺管部分細胞中，在結腸腺管底部細胞中，在乳房導管部分上皮細胞中，在來自卵巢，胃、結腸、乳房，良性和惡性粘蛋白性起源的上皮細胞中RELP蛋白的存在胰腺的其基質完全是陰性的。惡性腫瘤上皮細胞的大量的一致的RELP蛋白表達進一步支持了RELP作為腫瘤標記的用途。作為一個分泌蛋白，RELP可以從血清或血漿中測定。進一步，抗RELP的抗體可以在檢測樣品組織和細胞學標本中獨立的腫瘤細胞中有用。實施例6基因的結構和核苷酸序列RELP的cDNA包括1517個核苷酸，蛋白質編碼區由476bp的核苷酸組成，編碼具有158個胺基酸的蛋白質。5』和3』非翻譯區分別包含440和601個核苷酸。第一個蛋氨酸(nt441-443)前是Kozaks』共有序列翻譯起始位點。(kozak序列AAG在起始蛋氨酸前)。一個聚腺嘌呤化的信號(AATAAA)位於終止密碼子下遊510bp，該蛋白質的基因結構是在公眾庫的基因組資料上推斷出來的。基因組鹼基數據的隨機排序的片段側翼末端的遺失的鹼基對可以通過對物理基因組RELP序列的測序獲得。
一個包含基因組RELP序列的人基因組PAC克隆已經從基因組系統公司(St.Louis，Missouri)獲得。用含約120kb基因組插入物的質粒PAC轉化細菌細胞NS3516。質粒DNA用EndoFree Plasmid MaxiKit(Qiagen，Germany)分離。基因組序列用側翼為丟失序列RELP特異性引物進行PCR擴增。
使用的引物如下
CAGCTGTGCTCCTGGATGGT Seq.ID No.12TGGTCGGTACTTGCACAGGA Seq.ID No.13CTCCTATTGCTGAGCTGCCT Seq.ID No.14ATTCGTTGCTGCTCCAAGTT Seq.ID No.15TTCCAGAAGCATGCGGCTG Seq.ID No.16ACAGGAAGTGTTGGCGCTT Seq.ID No.17ATGGCTTCCAGAAGCATGC Seq.ID No.18CTATGGTCGGTACTTGCACA Seq.ID No.19CTTGCTCTATGGTCGGTACT Seq.ID No.20ACTGGGACCACTGGAGACACT Seq.ID No.21GAGACACTGAAGAAGGCAG Seq.ID No.22AGACCCAGCTGTTTCATAGG Seq.ID No.23AATGGAGAGAGGGCAGAAGG Seq.ID No.24TGATATCATCATGAGACCCAGCT Seq.ID No.25AGACAGTCATCCATTTGCCCA Seq.ID No.26TGGGCAAATGGATGACTGTCT Seq.ID No.27CTCTAGAATCCAACAAAACTC Seq.ID No.28TGCCAGACCAGGATCTGTACA Seq.ID No.29ATCCATATCGGCTGGCTTC Seq.ID No.30CACTATGAAGAGAAGCCCCT Seq.ID No.31AAACACAACTGCTGCAGCGT Seq.ID No.32GAAGCCAGCCGATATGGAT Seq.ID No.33TAGAGCTAGAAGCCACTACT Seq.ID No.34TCCTGTGCAAGTACCGACCA Seq.ID No.35CAGTAGTGGCTTCTAGCTCT Seq.ID No.36TCCTGGGCACTATGAAGAG Seq.ID No.37GGTAGCAATATTGTAGAATCC Seq.ID No.38GTTTGTAGCACACTCCTGAT Seq.ID No.39TATGGCTGCAGTCTGCGGT Seq.ID No.40ACTAGAGTGGTCATGGGAAC Seq.ID No.41GATTCCAGTTTGCAAGGTAC Seq.ID No.42TACTGCTACTGCTGGGGAAT Seq.ID No.43擴增的DNA片段亞克隆進TA載體，relp基因片段的核苷酸序列通過源自載性和relp特異的引物進行測序而獲得。比較基因組RELP的DNA和RELP的cDNA序列，發現轉錄區分成了被6個內含子分割成的7個外顯子，所有的外顯子-內含子連接點遵循著GT-AG的規則。外顯子1，2，3，4，5，6，7的長度分別是172，174，161，98，137，106和669bp(圖4)。可以肯定，由於不同的剪接外顯子2並不在所有的轉錄子中出現。第一個外顯子的開始是從使用AG規則的基因組序列和剪切供體受體位點一致序列位置來推斷的。外顯子1-3編碼5』非翻譯區的440nt(或266nt在丟失外顯子2的剪切變異區)，外顯子7編碼3』非翻譯區的601nt。
relp基因的啟動子序列通過Genomatix啟動子分析程序進行分析。一個Ap-1結合位點和一個cAMP應答元件被分別定位在轉錄起始位點上遊的15和44鹼基對。實施例7螢光原位雜交為了確定relp基因的染色體定位，進行了螢光原位雜交實驗。一個包含RELP基因的人基因組PAC克隆用做探針來確定RELP在人染色體中位置。PAC質粒使用生物秦16-dUTP以缺口轉移法標記。載有核分裂間期和中期核的載玻片用0.01N HCl在37℃預處理10分鐘後在含有(20mg/ml)胃蛋白酶的0.01N HCl在37℃處理5分鐘。在剃度酒精溶液中脫水後，將載玻片在64℃，在70％的甲醯氨/2×SSC溶液中變性，在37℃條件下雜交過夜。在雜交後，載玻片用2×SSC在45℃清洗1×5分鐘，0.1×SSC在45℃清洗2×5分鐘，在4×SSC/0.2％TWENN中室溫清洗1×5分鐘，在5％BSA/4×SSC溶液中，37℃封閉三十分鐘，在4×SSC/0.2％Tween中在45℃處理5分鐘，雜交的探針用抗生物素蛋白偶合物FITC進行檢測，用生物素-抗生物素蛋白抗體進行信號放大。在4×SSC/0.2％Tween中在45℃清洗3×5分鐘後，載玻片用DAPI進行反染色，固封在抗褪色溶液中。
雜交僅在染色體1的p12-13.1帶上顯示出信號。
實施例8斑點印跡雜交和Northern雜交分析使用了多組織表達(MTE)陣列和多組織Northern雜交II和III(Clontech，)進行了斑點印跡雜交和Northern雜交分析，32P標記的RELP全長cDNA用作探針，用多引物DNA標記試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)進行探針標記，放射自顯影使用柯達Biomax MS膠片，時間1-3天。印跡雜交分析顯示胃腸道組織、前列腺組織、睪丸組織中有RELP的mRNA。Northern雜交分析證明在十二指腸、胃、睪丸和前列腺中有1.5Kb轉錄體的高表達。值得注意的是，它也在空腸、迴腸、ILOCECUM、闌尾、下行結腸和胰腺有表達。在甲狀腺，脊柱索、腎上腺，骨髓、脾臟、胸腺、卵巢和白血球中沒有發現RELP表達。
上面描述的是正常組織的RELP分布。
在依上述描述在身體內所鑑定的癌症中，RELP異位的表達，意思就是它在根本就不應該表達它的細胞中表達。它的表達不適當，是由於分化水平的退化，因此，在整個有機體中RELP的出現超出了正常的水平體內產生過多的RELP(在血漿中檢測)，這表示在一個已知可以演化RELP陽性腫瘤的器官中存在癌症。實施例9反轉錄聚合酶鏈反應用RT-PCR試劑盒(Finnzymes，Espoo，Finland)通過連續的RT-PCR進行RELP的mRNA的反轉錄和PCR擴增。通過一次RT-PCR反應，100ng的poly(A)RNA被反轉錄為cDNA。使用的引物如下正義CAGCTGTGCTCCTGGATGGT，Seq.ID No.12CTCCTATTGCTGAGCTGCCT Seq.ID No.14反義TGGTCGGTACTTGCACAGGA，Seq.ID No.44ATTCGTTGCTGCTCCAAGTT Seq.ID No.45反轉錄反應在48℃進行30分鐘。在PCR擴增前，樣品先在95℃變性4分鐘。循環參數如下(30x)在95℃變性30s，在60℃退火1分鐘，在72℃延伸1分鐘，最後在72℃延伸5分鐘。
擴增產物通過瓊脂糖電泳分析，並根據製造商的說明亞克隆到TA克隆系統(Invitrogen，San Diego)中。克隆的PCR產物的核苷酸序列用Thermo測序試劑盒(Amersham，Buckingshire，UK)和ALF快速序列分析儀(Pharmacia，Uppsala，Sweden)進行測序。這些步驟證實了RELP在十二指腸、結腸、胃和胰腺中存在RELP轉錄物，排除了本應在Northem印跡和斑點印跡實驗中應已檢測到的代表其他與RELP同源的reg蛋白的RNA的可能性。
通過免疫測定RELP的量證明了抗體劑量反應曲線在加入100ng到100μg/ml的抗體時是線性的。對於血清分析，當樣品先被10-倍稀釋後再分析時，範圍是從1ng到1000ng/ml。
實施例2描述的抗體的固相製備是使用CNBr-活性瓊脂糖(Pharmacia)製備的。微滴定板(Nunc Iimmunoplates；Grand Island Biological Co.，Grand Island，N.Y.)用含有抗體(200μl/孔)的pH9.6的50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液在4℃包被18小時，然後移去抗體溶液，結合在塑料板上的殘餘的蛋白質結合位點通過加入200μl分析緩衝液(包含1％兔血清和1％牛白蛋白的PBS)封閉。在室溫培養1小時後，包被的微滴定板立即被用於進一步的分析。
進一步的分析，200μl樣品用分析緩衝液稀釋，在37℃下處理1-5小時。在用反應緩衝液衝洗3遍後，200μl與辣根過氧化物酶(Sigma，Type VI)共價結合的抗體被用於每個加樣孔，在37℃下反應1.5小時。將結合物稀釋到每含10％(v/v)鼠血清的PBS中5μg免疫球蛋白。其後依上述步驟清洗，200μl底物/加樣孔，在室溫下反應0.5小時，底物溶液包含0.4mg/ml的o-苯二胺和0.003％氫過氧化物pH5.0的檸檬酸鹽緩衝液，加入50μl2N硫酸終止反應，使用酶分析平板儀(Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，Pa.)在488nm處測定吸光率。
結合酶聯的百分比通過公式計算(B-B0)(B1-B0)(100)其中，B＝樣品吸光率，B1＝最大吸光率，B0＝空白吸光率。每個分析進行三次，使用標準消化物，用反應緩衝液26倍稀釋的血清樣品。通過在固相替代多種抗體試劑檢驗免疫特異性，所述的抗體試劑包括CEA的抗體和非免疫兔血清。在所述固相抗體中，只有根據實施例2準備的抗體以高濃度與抗原結合。
檢測了正常對照供試體，良性的和惡性的前列腺疾病人和有卵巢癌、胃癌、結腸癌和乳房癌的病人的血清RELP水平。
從健康的人獲得的血清顯示RELP/ml平均值為90ng/ml。只有5％的樣品表達150ng/ml或更高的血清抗原。這個值被選做血清水平上升的截止點。
從患有良性結腸疾病的病人獲得的血清顯示RELP為160ng/ml(表4)的一個平均值。200ng/ml或更高的血清抗原的發生率只有5％。有結腸癌的病人(確診)顯示一個RELP平均值在160ng/ml以上循環水平的寬的範圍。
依上述描述的癌症患者的血清也作了評估。
所估計的RELP水平的一致性達90％。患癌症的群體中血清平均值明顯高於對照。(約高250％)。
根據有限的手術後結腸癌主要定位的病人，RELP的存在明顯減小，這數據表明血清中RELP水平與腫瘤有一定的關係。從而使這種測定對於病人的監控方面具有應用價值。
序列表110奧索臨床診斷有限公司(Ortho-Clinical Diagnostics，Inc)120REG樣蛋白130CDS-23316045170atentIn version 3.02101211477212DNA213人4001atggcttcca gaagcatgcg gctgctccta ttgctgagct gcctggccaa aacaggagtc 60ctgggtgata tcatcatgag acccagctgt gctcctggat ggttttacca caagtccaat120tgctatggtt acttcaggaa gctgaggaac tggtctgatg ccgagctcga gtgtcagtct180tacggaaacg gagcccacct ggcatctatc ctgagtttaa aggaagccag caccatagca240gagtacataa gtggctatca gagaagccag ccgatatgga ttggcctgca cgacccacag300aagaggcagc agtggcagtg gattgatggg gccatgtatc tgtacagatc ctggtctggc360aagtccatgg gtgggaacaa gcactgtgct gagatgagct ccaataacaa ctttttaact420tggagcagca acgaatgcaa caagcgccaa cacttcctgt gcaagtaccg accatag 4772102211158212PRT213人4002Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu Ala1 5 10 15Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro20 25 30Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu35 40 45Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser Tyr Gly Asn Gly50 55 60Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr Ile Ala65 70 75 80Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln Pro Ile Trp Ile Gly Leu85 90 95His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met
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權利要求
1.一種檢測腫瘤存在的方法，包括檢測下列各項的存在或數量a、編碼一種蛋白的核酸分子，所述蛋白與包含SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽有至少70％的同一性；b、一種與(a)項中的核酸序列互補的核酸分子；c、一種包含(a)或(b)項所述的核酸序列中至少15個連續鹼基的核酸分子；和d、一種在嚴謹條件下能和(a)項所述核酸序列雜交的核酸分子和將上述的存在或數量與腫瘤的存在相關聯。
2.一種檢測腫瘤存在的方法，包括在生物樣品中檢測RELP的濃度。
3.權利要求1所述的方法，進一步包括將所述分子的存在或數量與所述腫瘤的存在與否相關聯的步驟。
4.一種鑑定RELP存在的試劑盒，包括a、可與RELP蛋白發生免疫反應的抗體，和b、檢測所述抗體存在的試劑。
5.權利要求4所述的試劑盒，進一步包括用於鑑定癌症存在、鑑定癌症的性質或監控癌症的治療過程的使用說明。
6.用作鑑定癌症存在、鑑定癌症的性質或監控癌症的治療過程的試劑盒所述的試劑盒包括a、與編碼RELP蛋白的核酸分子中的一部分互補的核酸分子試劑，所述的核酸分子試劑包含編碼RELP的核酸序列中至少15個的連續的鹼基；和b、一種包含所述核酸分子試劑的容器。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其中，所述的核酸試劑分子選自SEQ IDNO12-43。
全文摘要
本發明公開了一種檢測腫瘤存在的方法，包括檢測下列各項的存在或數量a.編碼一種蛋白的核酸分子，所述蛋白與包含SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽有至少70％的同一性；b.一種與(a)項中的核酸序列互補的核酸分子；c.一種包含(a)或(b)項所述的核酸序列中至少15個連續鹼基的核酸分子；和d.一種在嚴謹條件下能和(a)項所述核酸序列雜交的核酸分子；和將上述的存在或數量與腫瘤的存在相關聯。本發明還提供了一種檢測REG樣蛋白存在的試劑盒。
文檔編號C12P21/08GK1409114SQ02119230
公開日2003年4月9日 申請日期2002年3月16日 優先權日2001年3月16日
發明者M·黑斯卡拉 申請人:奧索臨床診斷有限公司