鉀氫泵蛋白及其編碼基因和它們的應用的製作方法

2023-10-11 12:23:24

專利名稱：鉀氫泵蛋白及其編碼基因和它們的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鉀氫泵蛋白，還涉及鉀氫泵蛋白的編碼基因，以及含有鉀氫泵基因的重組載體和細胞，以及鉀氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細胞在培育具有耐鹼性轉基因生物中的應用。
背景技術：
鉀氫泵(K+/H+antiporter)是細胞中負責K+/H+交換的一種跨膜運輸蛋白，廣泛存在於細菌、人和高等植物的質膜及許多真核生物細胞器的膜中。質膜H+-ATPase用水解ATP的能量把H+從細胞質中泵出細胞，產生跨質膜的H+電化學勢梯度，提供能量，驅動質膜上的鉀氫泵蛋白，使H+順其電化學勢進入細胞，同時K+逆其電化學勢排出細胞。鉀離子能夠通過維持細胞的滲透壓，作 為胞內酶的激活劑PH的調節劑以及刺激胞內積累相容性溶質的第二信使來保證細胞的正常生理活動。鉀氫泵蛋白通過K+外排來保持細胞內的低K+水平和PH值的穩定，是生物細胞耐受鹽鹼的關鍵因子，另外它在細胞器的發生及離子均衡過程中，還執行體積和滲透調節的功能，是保持細胞離子均衡的關鍵因子。與鈉氫泵相比，目前關於鉀氫泵的發現和研究報導還比較少。

發明內容
本發明的發明人基於對鉀氫泵的分子生物學研究，意外地發現從嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)中得到了一種鉀氫泵蛋白及其編碼基因，另一方面還提供了含有鉀氫泵基因的重組載體和細胞，以及鉀氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細胞在培育具有耐鹼性轉基因生物中的應用。本發明提供了一種鉀氫泵蛋白，其中，該鉀氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的胺基酸序列，或者該鉀氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加後仍具有鉀氫泵蛋白活性的胺基酸序列。本發明還提供了一種鉀氫泵基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的胺基酸序列的核苷酸序列。另外，本發明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發明提供的鉀氫泵基因。本發明還提供了一種轉基因細胞，其中，該轉基因細胞含有本發明提供的鉀氫泵基因。本發明還提供了得到的鉀氫泵蛋白及其編碼基因、含有該基因的重組載體及轉基因細胞在培育具有耐鹼性轉基因生物中的應用。鉀氫泵蛋白在耐鹽鹼植物培育等方面具有重要的應用潛力。通過克隆得到鉀氫泵基因，並通過轉基因的操作將微生物來源的鉀氫泵基因導入到植物細胞中，獲得耐鹽鹼性提聞的轉基因植株成為可能。


圖1 顯示了重組載體 pUC18-BpOF4-cha 導入的大腸桿菌 K12 (pUC18-BpOF4_cha)的耐鹼性的測定結果，其中，將重組載體pUC18-BpOF4-cha導入的大腸桿菌K12 (pUC18-BpOF4-cha)分別接種到 pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS,HEPES 和TRICINE, 5N NaOH調節)的LB液體培養基中(100 μ g/ml氨苄青黴素)，培養12小時後測定0D_，以導入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。圖2顯示了鉀氫泵缺失的大腸桿菌K12 ( Λ cha)以及導入重組載體pUC18-BpOF4-cha的K12 (Acha) (pUC18-BpOF4_cha)耐鹼性的測定結果，其中，將導入重組載體pUC18-BpOF4_cha的K12 (Acha) (pUC18-BpOF4_cha)和鉀氫泵缺失的大腸桿菌K12 ( Δ cha)分別接種到 pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS、HEPES 和 TRICINE,5N NaOH調節)的LB液體培養基中，培養12小時後測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。
具體實施例方式以下本發明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。本發明提供了一種鉀氫泵蛋白，其中，該鉀氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的胺基酸序列，或者該鉀氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加後仍具有鉀氫泵蛋白活性的胺基酸序列。優選地，所述鉀氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。相應地，本發明還提供了一種鉀氫泵基因，其中，該基因具有SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的胺基酸序列的核苷酸序列。優選地，所述基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本發明提供的鉀氫泵基因是從嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmusOF4)中克隆得到的。此外，本發明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發明提供的鉀氫泵基因。在本發明中，所述「載體」可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質粒，粘粒,曬菌體及反轉錄病毒等。本發明優選大腸桿菌pUC18質粒。本發明還提供了一種轉基因細胞，其中，該轉基因細胞含有本發明提供的鉀氫泵基因。所述轉基因細胞為原核細胞或真核細胞，優選可以是大腸桿菌、枯草桿菌或菸草BY2細胞，最優選大腸桿菌。此外，本發明還提供了本發明提供的鉀氫泵蛋白及其編碼基因、及含有鉀氫泵基因的重組載體和轉基因細胞在培育具有耐鹼性轉基因生物中的應用。所述生物為植物或微生物。實施例1編碼鉀氫泵的核苷酸序列的克隆(1)嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)總DNA的提取和純化取嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)的新鮮溼菌體20克，懸於10毫升50毫摩爾/升Tris緩衝液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩爾/升乙二胺四乙酸(EDTA) (pH 8.0)，混勻後於37°C放置20分鐘，然後加入2毫升10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，55°C放置5分鐘，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取最後一次抽提的上清溶液，加入2倍體積乙醇，沉澱DNA。將沉澱回收的DNA先後用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌後，將所得DNA溶於0.5毫升TE緩衝液(pH 8.0,10毫摩爾/升Tris，I毫摩爾/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase) 3微升，37°C保溫I小時，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍體積乙醇，沉澱回收DNA，先後用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌後，真空乾燥DNA沉澱，用去離子水溶解，得總DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度計測定結果為 A26tl/A28tl = 1.818，A260/A230 = 2.052。(2)鉀氫泵基因的克隆分析嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)的基因組信息後，設計鉀氫泵基因的上下遊引物，其中上遊引物為5 』 -TATGACCATGATTACATGTTAAGTTCTATCAA-3，，下遊引物為5 』 -CAG GTCGACTCTAGACTATAAGCTTTGTTCTTC-3 』。通過高保真的核酸聚合酶Pyrobest (Takara),以上述提取的嗜喊芽抱桿菌(Bacillus pseudofirmus 0F4)基因組為模板擴增出鉀氫泵基因的全長。通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因的大小，並將PCR產物送至諾賽基因公司測序，最後得到1485bp的如SED ID NO:1所示的核苷酸序列。實施例2編碼鉀氫泵的基因功能驗證(I)重組克隆載體pUC18-BpOF4_cha的構建利用Cycle-pure Kit純化上述得到的PCR產物。利用Fast clone Kit將純化的PCR產物和pUC18連接，將構建好的 重組載體pUC18-BpOF4-cha通過化學轉化法導入到大腸桿菌K12BW25113中。通過含有100 μ g/ml氨苄青黴素的LB平板的篩選以及PCR驗證得到含有重組載體pUC18-BpOF4-cha插入的陽性克隆大腸桿菌K12 (pUC18-BpOF4_cha)，經測序證實pUC18-BpOF4-cha插入的擴增序列與鉀氫泵的核苷酸序列完全一致。(2)大腸桿菌K12BW25113鉀氫泵缺失體的構建通過設計含有待敲除基因的上下遊同源臂的DNA片段的引物擴增打靶基因，利用大腸桿菌入噬菌體具有和宿主不同的λ Red重組系統將目的基因快速準確的敲除。通過敲除大腸桿菌K12BW2511的鉀氫泵基因，得到大腸桿菌K12BW25113鉀氫泵基因(Acha)缺失的突變體E.coli K12 ( Δ cha)，鉀氫泵基因被卡那黴素基因取代。(3)重組載體pUC18-BpOF4_cha導入的大腸桿菌K12(pUC18-Bp0F4_cha)的耐鹼性的測定將重組載體pUC18-BpOF4_cha導入的大腸桿菌K12 (pUC18-BpOF4_cha)分別接種到 pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS、HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調節)的 LB液體培養基中(100 μ g/ml氨苄青黴素)，培養12小時後測定0D_，以導入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結果如圖1所示。(4)鉀氫泵缺失的大腸桿菌K12 ( Δ cha)以及導入重組載體pUC18-BpOF4_cha的K12 ( Δ cha) (pUC18-BpOF4_cha)耐喊性的測定將導入重組載體pUC18-BpOF4_cha 的 K12 ( Δ cha) (pUC18-BpOF4_cha)和鉀氫泵缺失的大腸桿菌K12 ( Δ cha)分別接種到pH為8.0、8.5、9.0和9.5 (含有50mM的CAPS,HEPES和TRICINE，5N NaOH調節)的LB液體培養基中，培養12小時後測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結果如圖2所示。從圖1中可以看出，導入重組載體？此18-8 0 4-(*&的大腸桿菌1(12在？!1為8.0、8.5,9.0和9.5的LB液體培養基中(100 μ g/ml氨苄青黴素)，12小時後測定OD6tltl明顯高於導入PUC18空載體的大腸桿菌K12，這也證明了鉀氫泵基因(BpOF4-cha)的導入能夠提高大腸桿菌K12的耐鹼性。從圖2中可以看出，導入重組載體pUC18-BpOF4_cha的大腸桿菌K12(Acha)在pH
8.0，8.5，9.0 和 9.5 (含有 50mM CAPS, HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調節)的 LB 液體培養基中，12小時後測定0D_明顯高於導入大腸桿菌鉀氫泵的缺失體K12，這也證明了鉀氫泵基因(BpOF4_cha)的導入能夠提高大腸桿菌K12 ( Λ cha)的耐鹼性。綜上所述，本申請提供的鉀氫泵基因在耐鹽鹼生物的培育等方面具有重要的應用潛力。通過克隆得到鉀氫泵基因，並通過轉基因的操作將微生物來源的鉀氫泵導入到植物細胞中，獲得耐鹽鹼性提高的 轉基因植株成為可能。
權利要求
1.一種鍾氧慄蛋白，其特徵在於，該鐘氧慄蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者該鉀氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加後仍具有鉀氫泵蛋白活性的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的鉀氫泵蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No:2所示的胺基酸序列。
3.一種鉀氫泵基因，其特徵在於，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No:1所示的核苷酸序列。
5.一種重組載體，其特徵在於，該重組載體含有權利要求3所述的基因。
6.一種轉基因細胞，其特徵在於，該轉基因細胞含有權利要求3所述的基因。
7.根據權利要求6所述的轉基因細胞，其中，所述轉基因細胞為原核細胞或真核細胞。
8.權利要求1所述的鉀氫泵蛋白、權利要求3所述的基因、權利要求5所述的重組載體、權利要求6所述的轉基因細胞在培育具有耐鹼性轉基因生物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其中 ，所述生物為植物或微生物。
全文摘要
本發明涉及一種鉀氫泵蛋白，其中，該鉀氫泵蛋白具有SEQ ID No2所示的胺基酸序列，或者該鉀氫泵蛋白具有將SEQ ID No2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加後仍具有鉀氫泵蛋白活性的胺基酸序列。此外，還涉及鉀氫泵蛋白的編碼基因，其中，該基因具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No2所示的胺基酸序列的核苷酸序列。還涉及含有鉀氫泵基因的重組載體和細胞，以及鉀氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細胞在培育具有耐鹼性轉基因生物中的應用。
文檔編號C12N15/63GK103087163SQ20111033795
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月31日 優先權日2011年10月31日
發明者馬延和, 翟磊, 薛燕芬 申請人:中國科學院微生物研究所