檢測甲基轉移酶活性的方法和篩選甲基轉移酶活性調節物的方法

2023-10-11 14:15:44 4

專利名稱：檢測甲基轉移酶活性的方法和篩選甲基轉移酶活性調節物的方法
技術領域：
本發明涉及轉錄調節。
背景技術：
肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的癌症之一，而且它的發病率在日本以及美國正逐漸升高(Akriviadis EA等，BrJ Surg.1998 Oct；85(10)1319-31)。雖然最近的醫學進展已經在診斷方面取得很大進步，很多HCC患者仍然是在晚期才被診斷出，而且他們的疾病依然很難完全治癒。此外，肝硬變或慢性肝炎患者具有高HCC風險，它們可能形成多發肝腫瘤，或者甚至在完全除去原始腫瘤後形成新腫瘤。因此，開發高效化療藥物和預防策略是迫切關心的問題。
結腸直腸癌是發達國家中癌症致死的主要原因。具體地，在美國每年報導有超過130,000例新髮結腸直腸癌病例。結腸直腸癌佔所有癌症的大約15％。其中，有大約5％與遺傳性基因缺陷直接相關。許多患者在癌症開始前就被診斷患有癌前結腸或直腸息肉。雖然許多小結腸直腸息肉是良性的，一些類型會進展成為癌症。最廣泛使用的結腸直腸癌的篩選檢查是結腸鏡檢。該方法用於觀察可疑的生長物和/或獲取組織活檢物。通常，組織活檢物經過組織學檢查並且基於活檢細胞的顯微鏡下外觀進行診斷。但是，該方法的限制在於其結果是主觀的且不能用於癌前狀態的非常早期的檢測。敏感的、特異的且方便的用於檢測非常早期的結腸直腸癌或前-惡性病變的診斷系統是非常需要的，因為它可能最終消除所述疾病。

發明內容
本發明部分基於ZNFN3A1的甲基轉移酶活性的發現，ZNFN3A1是參與癌細胞增殖的一種多肽。此外，ZNFN3A1的甲基轉移酶活性在90-kD熱休克蛋白質(HSP90)存在時表達。
因此，本發明的特徵在於測定甲基轉移酶活性的方法，其通過使本發明的多肽與甲基轉移酶基質以及輔助因子在適於所述基質甲基化的條件下接觸，並檢測所述基質的甲基化水平來進行。本發明的多肽是ZNFN3A1多肽或其功能等同物。例如，本發明的多肽可包括胺基酸序列SEQ ID NO51。可選，本發明的多肽可包括胺基酸序列SEQ ID NO51，其中一或多個胺基酸被取代，缺失或插入，並且所述多肽具有多肽SEQ ID NO51的生物活性。多肽SEQ ID No51的生物活性包括例如促進細胞增殖和靶基因的轉錄活化。此外，所述多肽包括428個胺基酸的蛋白質，其由SEQ ID NO50或在例如低度到高度嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO50雜交的多核苷酸的開放讀框編碼並具有SEQ ID NO50的生物活性。低度嚴謹條件是例如42℃，2X SSC，0.1％SDS，或優選50℃，2X SSC，0.1％SDS。優選，使用高度嚴謹條件。高度嚴謹條件是例如在2X SSC，0.01％SDS中於室溫在20min間洗滌3次，然後在1x SSC，0.1％SDS中於37℃在20min間洗滌3次，並在1x SSC，0.1％SDS中於50℃在20 min間洗滌2次。然而，多種因素諸如溫度和鹽濃度可影響雜交的嚴謹度，並且本領域技術人員可適宜選擇所述因素以獲得所需的嚴謹度。可選，所述多肽進一步與90-kD熱休克蛋白接觸。甲基化定義為催化甲基基團轉移到另外的化合物，例如受體分子。甲基化通過諸如利用放射活性甲基供體的方法檢測。所述基質是任何能接受甲基基團的化合物諸如蛋白質，核酸(RNA或DNA)或小分子。例如，所述基質是組蛋白或含有甲基化區的組蛋白的片段。實際上，證實組蛋白H3賴氨酸4可被ZNFN3A1甲基化。因此，組蛋白H3，或其含有賴氨酸4的片段，可用作基質。輔助因子，例如甲基供體是任何可提供甲基基團的化合物。例如，所述輔助因子是S-腺苷-L-甲硫氨酸。適宜的甲基化條件包括例如本領域已知的鹼性緩衝液條件諸如Tris-HCl。
本發明還提供鑑定調節(例如增加或降低)甲基轉移酶活性的試劑的方法，所述方法通過在受試試劑存在的條件下，使本發明的多肽與甲基轉移酶基質以及輔助因子在適宜所述基質的甲基化的條件下進行接觸，並測定所述基質的甲基化水平。與正常對照甲基化水平相比甲基化水平的降低表示所述受試試劑是甲基轉移酶活性的抑制劑。抑制(例如降低)甲基轉移酶活性的化合物可用於治療、預防或緩解結腸直腸癌或肝細胞癌的症狀。例如，所述化合物抑制癌細胞的增殖。可選，與正常對照水平相比水平或活性的增加表示所述受試試劑是甲基轉移酶活性的增強物。正常對照水平是指不存在受試化合物的條件下檢測到的基質的甲基化水平。
本發明提供篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的方法，所述方法通過將多肽與熱休克蛋白90A(HSP90A)多肽在存在受試試劑的條件下接觸並檢測所述多肽與HSP90A之間的結合來進行。將所述多肽與HSP90A在存在受試化合物時的結合與不存在該受試化合物時的結合進行比較。選擇降低所述多肽與HSP90A的結合的受試化合物。所述多肽與HSP90A的結合定義為該多肽與bb之間的非共價結合。結合通過本領域已知的方法諸如酵母雙雜合子篩選系統測定。
本發明還包括用於緩解結腸直腸癌或肝細胞癌的症狀的組合物和方法，其通過使結腸直腸癌細胞或肝細胞癌細胞與如上述鑑定的化合物接觸來進行。例如，治療結腸直腸癌和/或肝細胞癌的方法通過給藥哺乳動物例如診斷為患有所述疾病狀態的人類患者含有藥物有效量的上述鑑定的化合物以及藥物載體的組合物來進行。
本發明還提供了利用甲基轉移酶多肽，基質、輔助因子以及HSP90A檢測化合物的甲基轉移酶活性的試劑盒。所述試劑以試劑盒的形式包裝在一起。所述試劑包裝在分離的容器中，例如本發明的甲基轉移酶多肽，基質，輔助因子，對照劑(陽性和/或陰性)，和/或可檢測標記。本發明另一實施方案是檢測受試化合物對甲基轉移酶活性的調節活性，和/或本發明的ZNFN3A1多肽與熱休克蛋白90A多肽(HSP90A)的結合的試劑盒。所述試劑盒包括ZNFN3A1多肽或其片段以及HSP90A多肽。在該實施方案的一些方面中，ZNFN3A1是多肽，優選重組多肽，包含具有天然ZNFN3A1的SET結構域的胺基酸序列。此外，本發明提供用於篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的試劑盒，所述試劑盒包含以下組分含有選自胺基酸序列SEQ ID NO51的連續胺基酸序列、並且胺基酸序列包含NHSCDPN(SEQ ID NO52)和/或GEELTICY(SEQ ID NO53)的多肽；以及S-腺苷-L-甲硫氨酸。實施所述測定法的說明(例如書面的、錄音帶，VCR，CD-ROM等)包含在該試劑盒內。該試劑盒的測定模式是本領域已知的轉移酶測定法或結合測定法。
除非另有說明，本文所用的所有技術以及科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員所理解的含義相同。儘管類似或等同於本文所述的那些的方法和材料可用於實施或檢測本發明，適宜的方法和材料在下文描述。所有公開出版物，專利申請，專利，以及本文所述的其他對比文件的全文都包含在本文作為參考。如有衝突，以本說明書，包括定義為準。此外，所述的材料、方法和實施例僅僅是示例性的並不意圖限制本發明。
附圖簡述

圖1A圖示了甲基轉移酶的SET結構域中的保守序列。
圖1B是SDS-PAGE凝膠的照片，顯示野生型ZNFN3A1和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)之間的相互作用。相等量的野生型或突變ZNFN3A1(箭頭)與[3H]-標記的SAM一起保溫(上圖)。SAM-結合的ZNFN3A1(箭頭)通過螢光圖檢出(下圖)。
圖1C是存在或不存在重組HSP90A時，ZNFN3A1的SET結構域的體外HMTase測定法的照片。SET7作為對照。
圖2A是體外組蛋白H3-K4甲基轉移酶測定法的照片。組蛋白H3與野生型或突變ZNFN3A1或SET7在SAM和HSP90A存在的條件下一同保溫。
圖2B是顯示通過將具體的肽加入二甲基化的H3-K4來抑制H3-K4的二甲基化的照片。
圖2C是體外組蛋白H3-K9甲基轉移酶測定法的照片。SUV39H1作為陽性對照。
圖3A是SDS-PAGE凝膠的照片，顯示通過CBB-染色檢測免疫沉澱的和重組ZNFN3A1蛋白。泳道1.蛋白標記1，泳道2.蛋白標記2，泳道3.免疫沉澱的Flag標記的ZNFN3A1，泳道4.重組ZNFN3A1蛋白，泳道5.白蛋白(1μg)，泳道6.白蛋白(2μg)，泳道7.白蛋白(5μg)。
圖3B是照片，顯示免疫沉澱的Flag-ZNFN3A1和重組ZNFN3A1蛋白的體外組蛋白H3 HMTase活性。
圖3C是照片，通過免疫沉澱的Flag-ZNFN3A1或重組ZNFN3A1蛋白顯示二甲基化的(上圖)和三甲基化的(下圖)組蛋白H3-K4。
圖3D是柱圖，顯示SAHH對ZNFN3A1的HMTase活性的影響。
圖4A是柱圖，顯示HEK293細胞中ZNFN3A1的致癌活性的影響。存活細胞的數目通過Cell Counting Kit-8在轉染後第14天測定。*，通過Fisher’s制約付最小有義差測定(Fisher’s protected least-significant test)確定為顯著差異(p＜0.05)。
圖4B是柱圖，顯示HCT116細胞中ZNFN3A1的致腫瘤活性的影響。存活細胞的數目通過Cell Counting Kit-8在轉染後第14天測定。*，通過Fisher’s制約付最小有義差測定確定為顯著差異(p＜0.05)。
圖5A是柱圖，顯示質粒轉染後14天通過Cell Counting Kit-8測定的結腸癌細胞系的細胞存活力。細胞利用用於HCT116的含有0.5μg/μl G418的McCoy’s培養基，用於SW948的含有1.0μg/μl G418的L-15培養基進行選擇。*，通過Fisher’s制約付最小有義差測定確定為顯著差異(p＜0.05)。
圖5B是柱圖，顯示質粒轉染後14天通過Cell Counting Kit-8測定的肝癌細胞系的細胞存活力。細胞利用用於HepG2的含有1.0μg/μl G418的DMEM，用於Huh7和Alexander的含有0.8μg/μl G418的DMEM進行選擇。*，通過Fisher’s制約付最小有義差測定確定為顯著差異(p＜0.05)。
圖6A是照片，顯示HEK293細胞中ZNFN3A1的內源性表達。Aa在用pcDNA(模擬)或pc-DNA-ZNFN3A1轉染的細胞中的時間依賴性表達通過western印跡分析檢測。
圖6B是照片，顯示候選下遊基因應答於內源性ZNFN3A1的表達。半定量RT-PCR分析利用來自用pcDNA-ZNFN3A1或模擬轉染的HEK293細胞的RNA進行。
圖7A圖示了Nkx2.8的5』-側翼區中推定的ZNFN3A1-結合序列。ZNFN3A1對Nkx2.8的HSP90A-依賴性反式活化通過其與推定的結合序列的相互作用表達。
圖7B是照片，顯示通過ChIP測定法鑑定Nkx2.8啟動子區中的ZNFN3A1-結合元件。
圖7C是柱圖，顯示重組GST-ZNFN3A1和含有ZNFN3A1-結合元件(ZBE)的雙鏈DNA探針之間的體外結合測定的結果。
圖7D是柱圖，顯示HCC細胞中，在存在或不存在ZNFN3A1-siRNA的條件下含有Nkx2.8的野生型或突變ZNFN3A1-結合元件(ZBE)的轉錄測定。
圖7E是凝膠照片，顯示HEK293細胞中Nkx2.8應答於野生型(泳道2或3)或突變(泳道4或5)ZNFN3A1的外源性表達。加入HSP90A-特異性抑制物，geldanamycin，減小野生型ZNFN3A1(泳道3)導致的Nkx2.8表達的加強。
圖7F是柱圖，顯示基因組中含有整合的Nkx2.8啟動子螢光素酶基因的HEK293-Nkx2.8Luc細胞中野生型或突變ZNFN3A1對螢光素酶活性的影響。
圖8A是照片，顯示肝癌細胞中內源ZNFN3A1和Nkx2.8的ChIP-4區之間的相互作用。
圖8B是照片，顯示HEK293細胞中，存在ZNFN3A1時二甲基化的組蛋白H3賴氨酸4(H3-K4)和ChIP-4之間的相互作用。
發明詳述本發明部分基於新的組蛋白甲基轉移酶ZNFN3A1的發現，其參與癌細胞的增殖。Aa的組蛋白甲基轉移酶活性在存在90-kD熱休克蛋白(HSP90A)時表達，因此HSP90A在組蛋白甲基轉移酶活性中起作用。
ZNFN3A1表達在結腸直腸癌以及肝細胞癌(HCC)中與非癌性肝和結腸直腸組織相比明顯升高(WO 03/27143)。ZNFN3A1 cDNA由含有SEQ.ID.NO.50所示的1284個核苷酸的開放讀框的1622個核苷酸組成。該開放讀框編碼具有鋅指基序以及SET結構域的428個胺基酸的蛋白質，如SEQ.ID.NO.51所示。Aa蛋白質的亞細胞定位在細胞周期進展的過程中改變並隨培養的細胞的密度而改變。當細胞處於中到晚S期或在低密度的條件中培養時Aa蛋白質在細胞核中聚集。但是，當細胞在細胞周期的其它階段或在高密度條件下生長時，ZNFN3A1蛋白質定位在細胞質以及細胞核中。
ZNFN3A1含有兩個保守的胺基酸序列「NHSCXXN」(SEQ ID NO54)和「GEELXXXY」(SEQ ID NO55)限定的SET結構域。(圖1A)編碼具有SET結構域的蛋白質的基因根據它們SET結構域的同源性分成四個家族，即SUV39，SET1，SET2和RIZ家族。Aa的SET結構域不含有任何在這些亞家族中保守的前-SET，後-SET，AWS，SANT或C2H2結構域，因此ZNFN3A1可構成SET結構域蛋白質的新的亞家族種類。
ZNFN3A1與RNA螺旋酶KIAA0054直接結合，與RNA聚合酶II形成複合體，其通過所述複合體與EGFR基因的5』側翼區中的元件「(C)CCCTCC(T)」的直接結合活化包括表皮生長因子受體(EGFR)的下遊基因的轉錄。此外，ZNFN3A1顯示與RNA螺旋酶(HELZ)以及90-kD熱休克蛋白(HSP90A)結合。
NIH3T3細胞中ZNFN3A1的外源表達導致增加的細胞生長。反之，利用反義S寡核苷酸抑制其表達導致肝癌細胞的明顯生長抑制。此外，證實了ZNFN3A1的siRNA也可抑制肝細胞瘤細胞以及結腸直腸腺癌細胞的增殖(WO2004/76623)。這些發現表明ZNFN3A1賦予癌細胞致癌活性，這通過用具有RNA螺旋酶和RNA聚合酶II的複合體對包括EGFR的靶基因進行轉錄活化來實現，並且抑制所述複合體的活性是治療結腸直腸癌和肝細胞癌的策略。其它SET結構域蛋白的調節解除已經顯示與人腫瘤有關。例如在人白血病中，觀察到SET1家族的果蠅trithorax基因的人同源物MLL(10，11)的頻繁轉位。儘管不清楚MLL功能的喪失或獲得是否導致癌發生，MLL通過與Hox啟動子序列的直接結合經由SET結構域(12)的甲基化酶活性介導的H3-賴氨酸-4-特異性甲基化來活化Hox基因的轉錄。MLL2和EZH2，是SET1家族的兩個成員，其在胰腺癌、膠質細胞瘤或激素抵抗性轉移性前列腺癌中擴增(13-15)。
本發明因此提供了篩選調節ZNFN3A1甲基轉移酶活性的化合物的方法。所述方法通過使ZNFN3A1多肽或其具有甲基轉移酶活性的功能等同物與一或多種候選化合物接觸，並測定接觸的ZNFN3A1或其功能等同物的甲基轉移酶活性來進行。調節ZNFN3A1或其功能等同物的甲基轉移酶活性的化合物由此得以鑑定。
本發明中，術語「功能等同物」的意思是受試蛋白質具有與ZNFN3A1相同或基本相同的甲基轉移酶活性。具體地，所述蛋白質催化組蛋白H3或包含賴氨酸4的組蛋白H3片段的甲基化。受試蛋白是否具有靶活性可通過本發明確定。即，甲基轉移酶活性可通過使多肽與基質(例如組蛋白H3或其包含賴氨酸4的片段)以及輔助因子(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸)在適宜所述基質甲基化的條件下接觸並檢測所述基質的甲基化水平來確定。
製備與給定蛋白在功能上等同的蛋白質的方法是本領域技術人員已知的並包括將突變引入所述蛋白的已知方法。例如，本領域技術人員可製備與人ZNFN3A1蛋白功能上等同的蛋白質，所述製備可通過經由定點誘變將適宜突變引入人ZNFN3A1蛋白質的胺基酸序列來進行(Hashimoto-Gotoh，T.et al.(1995)，Gene 152，271-275；Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)，MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)，Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W，and Fritz HJ.(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)，Methods Enzymol.85，2763-2766)。胺基酸突變也可天然存在。本發明所用的蛋白質包括具有這樣的人ZNFN3A1蛋白的胺基酸序列的那些蛋白質，其中一或多種胺基酸被突變，條件是產生的突變蛋白質與人ZNFN3A1蛋白在功能上等同。所述突變體中待突變的胺基酸的數目通常為10個以下，優選6個以下，更優選3個以下。SET結構域「NHSCXXN」(SEQ ID NO54)和「GEELXXXY「(SEQ ID NO55)可在突變蛋白的胺基酸序列中保守以保持甲基轉移酶活性(「X」表示任何胺基酸)。
突變的或修飾的蛋白質，其胺基酸序列通過具體胺基酸序列的一或多個胺基酸殘基的缺失，添加和/或取代進行修飾的蛋白質，已知可保持原來的生物活性(Mark，D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J. Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
待突變的胺基酸殘基優選突變成不同的胺基酸，其中胺基酸側鏈的性質是保守的(已知為保守胺基酸取代的過程)。胺基酸側鏈的性質的實例是疏水胺基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，親水胺基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，並且所述側鏈具有以下共同的功能基團或性質脂肪族側鏈(G，A，V，L，I，P)；含有羥基的側鏈(S，T，Y)；含有硫原子的側鏈(C，M)；含有羧酸和氨基化合物的側鏈(D，N，E，Q)；含有鹼基的側鏈(R，K，H)；以及含有芳香基團的側鏈(H，F，Y，W)。括號內的字母是胺基酸的單字母代碼。
將一或多個胺基酸殘基添加到人ZNFN3A1蛋白的胺基酸序列(SEQ IDNO51)所得的蛋白質實例是含有人ZNFN3A1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人ZNFN3A1蛋白和其它肽或蛋白的融合物，並且用於本發明。融合蛋白可通過本領域技術人員已知的技術製備，諸如通過將編碼本發明的人ZNFN3A1蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA相連，使得框架匹配，將融合DNA插入表達載體並在宿主中表達所述載體。對於與本發明的蛋白融合的肽或蛋白質沒有限制。
能夠作為與本發明蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG(Hopp，T.P.等，Biotechnology(1988)6，1204-1210)、含6個His(組氨酸)殘基的6xHis、10xHis、流感病毒凝激素(HA)、人類c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-標記、HSV-標記、E-標記、SV40 T抗原片段、lck標記、α-微管蛋白片段、B-標記、C蛋白片段等。可以與本發明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(穀胱甘肽-S-轉移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結合蛋白)等等。
融合蛋白可通過使商業可得的、編碼上述融合肽或蛋白的DNA與編碼本發明的蛋白相融合併表達製備的融合DNA來製備。
本領域已知的另一種分離功能等同蛋白的方法是例如，利用雜交技術的方法(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold SpringHarbor Lab.Press，1989)。本領域技術人員可輕易分離與完整或部分ZNFN3A1 DNA序列具有高度同源性的DNA(例如，SEQ ID NO50)，以及從分離的DNA中分離人ZNFN3A1蛋白的功能等同蛋白。用於本發明的蛋白包括與編碼人ZNFN3A1蛋白的完整或部分DNA序列雜交的DNA編碼的那些，以及與人ZNFN3A1蛋白在功能上等同的那些。這些蛋白質包括與源自人或小鼠的蛋白質相應的哺乳動物同源物(例如猴，大鼠，兔和牛基因編碼的蛋白質)。對於從動物分離與編碼人ZNFN3A1蛋白高度同源的cDNA而言，具體優選使用來自骨骼肌、睪丸，HCC或結腸直腸腫瘤的組織。
用於分離編碼與人ZNFN3A1蛋白在功能上等同的蛋白質的DNA的雜交條件可由本領域技術人員常規選擇。例如，雜交可通過利用「Rapid-hybbuffer」(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃預雜交30min以上，加入標記的探針，以及在68℃加熱1小時以上來進行。例如可在低度嚴謹條件下進行以下洗滌步驟。低度嚴謹條件例如，42℃，2X SSC，0.1％SDS，或優選50℃，2X SSC，0.1％SDS。更優選，使用高度嚴謹條件。高度嚴謹條件例如在2XSSC，0.01％SDS中於室溫在20min間洗滌3次，然後在1x SSC，0.1％SDS中於37℃在20min間洗滌三次，並在1x SSC，0.1％SDS中於50℃在20min間洗滌兩次。然而，多種因素諸如溫度和鹽濃度可影響雜交嚴謹度並且本領域技術人員可選擇適宜因素以達到需要的嚴謹度。
也可使用基因擴增法替代雜交，例如聚合酶鏈反應(PCR)法，其可用於利用基於編碼人ZNFN3A1蛋白(SEQ ID NO51)的DNA(SEQ ID NO50)的序列信息合成的引物，分離編碼與人ZNFN3A1蛋白功能等同的蛋白的DNA。
由通過上述雜交技術或基因擴增技術分離的DNA編碼的人ZNFN3A1蛋白的功能等同蛋白質通常與人ZNFN3A1蛋白的胺基酸序列高度同源。「高度同源性」(也稱為「高度同一性」)通常指兩種最佳比對的序列(多肽或多核苷酸序列)之間的同一性程度。通常，高度同源性或同一性指40％以上，優選60％以上，更優選80％以上，更優選85％，90％，95％，98％，99％，以上的同源性。兩種多肽或多核苷酸序列之間的同源性或同一性程度可通過「Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730」中的算法確定。
本發明所用的蛋白質的胺基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的存在或不存在或形式可不同，根據用於產生它的細胞或宿主或採用的純化方法而定。但是，只要其與人ZNFN3A1蛋白(SEQ ID NO51)在功能上等同，就可用於本發明。
通過本領域熟練技術人員公知的方法，本發明蛋白可以作為重組蛋白或天然蛋白製備。重組蛋白可通過將編碼本發明蛋白的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.50的DNA)插入到合適的表達載體中，將載體引入到合適的宿主細胞中，獲取提取物，並通過使提取物經層析，例如，離子交換層析、反相層析、凝膠過濾或利用固定了針對本發明蛋白的抗體的柱子的親和層析，或通過不止一個前述柱子的結合來製備和純化蛋白。
並且當本發明蛋白作為與穀胱甘肽-S-轉移酶蛋白的融合蛋白、或者作為增加了多個組氨酸的重組蛋白在宿主細胞(例如，動物細胞和大腸桿菌(E.coli)內表達時，表達的重組蛋白可利用穀胱甘肽柱或鎳柱純化。
在純化融合蛋白後，還有可能根據需要用凝血酶或因子-Xa通過切割除去目的蛋白之外的區域。
天然蛋白可通過本領域技術人員已知的方法，例如，通過使親和柱(該柱結合有下文所述的與ZNFN3A1蛋白結合的抗體)，與表達本發明蛋白的組織或細胞的提取物接觸來分離。抗體可以是多克隆抗體或者單克隆抗體。
本發明中，ZNFN3A1蛋白的甲基轉移酶活性可通過本領域已知的方法測定。例如，ZNFN3A1和基質可與標記的甲基供體在適宜的測定條件下保溫。組蛋白H3，組蛋白H3肽，以及S-腺苷-[甲基-14C]-L-甲硫氨酸，或S-腺苷-[甲基-3H]-L-甲硫氨酸優選可分別用作基質和甲基供體。放射性標記向組蛋白或組蛋白肽的轉移可通過例如SDS-PAGE電泳和螢光照相法來檢測。可選，反應後，可通過過濾將組蛋白或組蛋白肽從甲基供體中分離，保留在濾紙上的放射性標記的量可通過閃爍計數法定量。其它可與甲基供體連接的適宜標記諸如發色性和螢光標記，以及檢測這些標記向組蛋白和組蛋白肽的轉移的方法是本領域已知的。
可選，ZNFN3A1的甲基轉移酶活性可利用未標記的甲基供體(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸)以及選擇性識別甲基化的組蛋白或組蛋白肽的試劑進行測定。例如，在能將基質甲基化的條件下保溫ZNFN3A1、待甲基化的基質以及甲基供體之後，可通過免疫學方法檢測甲基化的基質。利用識別甲基化的基質的抗體的免疫技術可用於檢測。例如，抗甲基化的組蛋白的抗體可購得(abcam Ltd.)。利用識別甲基化的組蛋白的抗體的ELISA或免疫印跡可用於本發明。
除了利用抗體，甲基化的組蛋白可利用以高親合力選擇性結合甲基化的組蛋白的試劑檢測。所述試劑是本領域已知的並可通過本領域已知的篩選測定法確定。示例性結合試劑是異染色質蛋白HP1，當其在賴氨酸4甲基化時結合組蛋白H3(H3-K4)。HP1，或其結合片段可被標記，並可檢出與甲基化的H3-K4結合的HP1或片段。可選，HP1或片段無需被標記，並可利用抗HP1抗體在ELISA測定法中檢出。
本發明中，可採用促進基質甲基化的試劑。例如，Flag標記的ZNFN3A1的H3甲基轉移酶活性在存在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)時明顯高於不存在SAHH的情況(圖3d)。因此，SAHH或其功能等同物是促進甲基化的優選試劑。所述試劑促進基質甲基化，由此可高度敏感地測定甲基轉移酶活性。ZNFN3A1可與基質以及輔助因子在所述促進劑存在的條件下接觸。
各種低通量和高通量酶測定法模式是本領域已知的，並可用於檢測或測定ZNFN3A1的甲基轉移酶活性。對於高通量測定法，組蛋白和組蛋白肽基質可方便地固定於固體支持物上，諸如多孔板，玻片或晶片。反應後，甲基化的產物可通過上述方法在固相支持物上檢出。可選，甲基轉移酶反應可在溶液中發生，然後組蛋白或組蛋白肽可固定在固相支持物上，並檢出甲基化的產物。為了有利於所述測定，該固相支持物可用鏈黴抗生物素包被而組蛋白可用生物素標記，或固相支持物可用抗組蛋白抗體包被。本領域技術人員可根據所需的篩選通量容量確定適宜的測定模式。
ZNFN3A1或其功能等同物需要熱休克蛋白90A(HSP90A)來表達甲基轉移酶活性。因此，幹擾ZNFN3A1或其功能等同物與HSP90A的結合的化合物可用於調節甲基轉移酶活性。可通過以下方法篩選這樣的化合物。因此，本發明還提供篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使選自下組的多肽與熱休克蛋白90A多肽(HSP90A)在存在受試化合物的條件下接觸i.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽；ii.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽，其中一或多個胺基酸被取代，缺失或插入，並且所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；iii.包含與SEQ ID NO51具有至少大約80％同源性的胺基酸序列的多肽；和vi.在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO50組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；b.檢測所述多肽與HSP90A之間的結合；c.比較存在所述受試化合物與不存在所述受試化合物的條件下，所述多肽與HSP90A的結合，和d.選擇降低所述多肽和HSP90A之間的結合的受試化合物。
本發明中，多肽與HSP90A的結合可通過本領域技術人員已知的任何適宜方法檢測。例如，所述多肽或HSP90A中的一種可結合於固相支持物，另一種可用檢測用標記物質標記。標記物質諸如放射性同位素(例如，3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(例如，鹼性磷酸酶，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶)，螢光物質(例如，異硫氰酸螢光素(FITC)，羅丹明)，和生物素/抗生物素蛋白，可用於標記本發明方法的多肽或HSP90A。用於檢測標記物質的方法也是已知的。
本發明還包括本發明蛋白的部分肽的用途。部分肽具有特異於ZNFN3A1蛋白的胺基酸序列，其由至少約400個胺基酸，通常少於約200，並通常少於約100個胺基酸，並且至少約7個胺基酸。優選約8個胺基酸以上，更優選約9個胺基酸以上組成。所述部分肽可用於例如篩選結合ZNFN3A1蛋白質的化合物，篩選ZNFN3A1與其輔助因子諸如SAM之間結合的抑制物。含有SET結構域的部分肽優選用於這些篩選。
用於本發明的部分肽可通過遺傳改造，通過肽合成的已知方法，或通過利用適宜的肽酶消化本發明的蛋白來製備。對於肽合成，可使用例如固相合成或液相合成。
SET結構域突變的ZNFN3A1突變體顯示細胞增殖的抑制性效應(圖4或5)。因此，ZNFN3A1的部分肽優選包括SET結構域「NHSCXXN」(SEQ IDNO54)和/.和或「GEELXXXY」(SEQ ID NO55)。
本發明篩選用於治療或預防HCC或結腸直腸癌的化合物的方法的另一實施方案中，所述方法利用ZNFN3A1與其輔助因子諸如SAM的結合能力。在結合S-腺苷-L-甲硫氨酸的SET結構域中具有突變的蛋白質抑制癌細胞增殖。這些發現提示ZNFN3A1通過其與分子諸如S-腺苷-L-甲硫氨酸的結合發揮細胞增殖功能。因此，抑制ZNFN3A1與其輔助因子之間的結合導致細胞增殖的抑制，抑制所述結合的化合物可作為用於治療或預防HCC或結腸直腸癌的藥物。
所述篩選方法包括以下步驟a.在受試化合物存在的條件下，使包含選自胺基酸序列SEQ ID NO51的連續胺基酸序列、並且其中胺基酸序列包含NHSCDPN(SEQ ID NO52)和/或GEELTICY(SEQ ID NO53)的多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸接觸；b.檢測所述多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的結合；c.比較存在所述受試化合物與不存在所述受試化合物的條件下，所述多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸的結合，和d.選擇降低所述多肽和S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的結合的受試化合物。
用於篩選的多肽可為重組多肽或天然多肽，或可為部分肽，只要其保持與S-腺苷-L-甲硫氨酸結合的能力即可。用於篩選的多肽可為例如純化的多肽，可溶性蛋白，與載體結合的形式，或與其它多肽融合的融合蛋白。
可以使用任何受試樣品，例如，細胞提取物、細胞培養上清、發酵微生物的產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗製蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物以及天然化合物。
用於本發明所述測定法中的受試化合物也可為特異性結合ZNFN3A1或缺乏甲基轉移酶活性的抗部分ZNFN3A1肽的抗體。例如，可檢測抗體(例如單克隆抗體)阻斷ZNFN3A1與其基質S-腺苷-L-甲硫氨酸或HSP90A之間的結合的能力。類似地可檢測部分ZNFN3A1肽抑制ZNFN3A1與其基質S-腺苷-L-甲硫氨酸或HSP90A結合的能力，其可用作ZNFN3A1活性的抑制物。所述抗體和部分肽因此可用作ZNFN3A1活性的抑制物。
作為篩選抑制ZNFN3A1與S-腺苷-L-甲硫氨酸的結合的化合物的方法，許多本領域已知的方法可用。所述篩選可作為體外測定系統進行，例如在細胞系統中。更具體地，首先，所述多肽，或S-腺苷-L-甲硫氨酸結合於支持物，並且加入其它成分以及受試樣品。然後，保溫混合物，洗滌，檢測和/或測定其它結合於支持物的成分。
可用於結合蛋白的支持物的實例包括不溶性多糖，諸如瓊脂糖，纖維素，和葡聚糖；以及合成樹脂，諸如聚丙烯醯胺，聚苯乙烯以及矽；優選使用由上述物質製備的可購得的珠子以及板(例如多孔板，生物傳感器晶片等)。使用珠子時，它們可被填入柱子。
多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸與支持物的結合可根據常規方法進行，諸如化學鍵合，以及物理吸附。可選，多肽可通過特異性識別它的抗體而與支持物結合。此外，多肽與支持物的結合也可通過抗生物素蛋白和生物素的結合來進行。
多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的結合在緩衝液中進行，例如但不限於磷酸鹽緩衝液和Tris緩衝液，只要所述緩衝液不抑制蛋白之間的結合即可。
本發明中，利用表面胞質團共振現象的生物傳感器可用作檢測或定量所述多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的結合的裝置。當使用所述生物傳感器時，多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的相互作用可作為表面胞質團共振信號實時觀察到，而這利用僅僅極少量的多肽且無需標記(例如，BIAcore，Pharmacia)。因此，可利用生物傳感器諸如BIAcore來評估多肽以及多肽和S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的結合。
可選，多肽或多肽和S-腺苷-L-甲硫氨酸可被標記，並且所述標記可用於檢測或測定結合的多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸。具體地，預標記多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸之一之後，標記的成分與另一成分在受試化合物存在的條件下接觸，洗滌後根據標記檢測或測定結合的成分。
標記物質諸如放射性同位素(例如，3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)，酶(例如，鹼性磷酸酶，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶)，螢光物質(例如，異硫氰酸螢光素(FITC)，羅丹明)，和生物素/抗生物素蛋白，可用於標記本發明方法的多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸。當多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸用放射性同位素標記時，可通過液體閃爍法進行檢測或測定。可選，用酶標記的多肽或S-腺苷-L-甲硫氨酸可通過加入酶的基質以利用光度計檢測基質的酶促改變諸如顏色的產生來檢測或測定。此外，如果螢光物質用作標記，結合的成分可利用螢光光度計檢測或測定。
此外，多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸的結合也可利用多肽的抗體檢測或測定。例如，使固定在支持物上的S-腺苷-L-甲硫氨酸與受試化合物以及多肽接觸之後，保溫所述混合物並洗滌，並可利用抗所述多肽的抗體進行檢測或測定。
如果在本發明的篩選中使用抗體，所述抗體優選利用上述標記物質之一進行標記，並基於標記物質進行檢測或測定。此外，本發明的篩選中與蛋白結合的抗體可利用蛋白G或蛋白A柱進行檢測或測定。
通過篩選分離的化合物是抑制ZNFN3A1甲基轉移酶的藥物的候選物，並可用於治療或預防HCC或結腸直腸癌。
此外，其中的部分結構抑制ZNFN3A1的甲基轉移酶活性的化合物通過添加，缺失和/或取代來轉化，並也包含在可通過本發明的篩選方法獲得的化合物中。
如上所述，抑制ZNFN3A1的甲基轉移酶活性的化合物可為缺乏甲基轉移酶活性的部分ZNFN3A1肽或可為抗ZNFN3A1的抗體。本文術語「抗體」指這樣的免疫球蛋白分子，其具有僅與用於合成所述抗體的抗原或與其緊密相關的抗原相互作用(即，結合)的具體結構。此外，抗體可為抗體片段或修飾的抗體，只要其結合ZNFN3A1基因編碼的蛋白即可。例如，抗體片段可為Fab，F(ab』)2，Fv，或單鏈Fv(scFv)，其中H和L鏈的Fv片段通過適宜的接頭連接(Huston J.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883(1988))。更具體地，抗體片段可通過利用酶處理抗體產生，所述酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。可選可構建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體並在適宜宿主細胞中進行表達(見例如，Co M.S.et al.J.Immunol.1522968-2976(1994)；Better M.and Horwitz A.H.Methods Enzymol.178476-496(1989)；Pluckthun A.and Skerra A.Methods Enzymol.178497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux J.et al.Methods Enzymol.121663-669(1986)；Bird R.E.andWalker B.W.Trends Biotechnol.9132-137(1991))。
可通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)偶聯來修飾抗體。本發明提供所述修飾的抗體。所述修飾的抗體可通過對抗體的化學修飾獲得。所述修飾方法是本領域常規的。可選，抗體可包括具有源自非人抗體的可變區以及源自人抗體的恆定區的嵌合抗體，或包括源自非人抗體的互補決定區(CDR)，源自人抗體的框架區(FR)以及恆定區的人源化抗體。所述抗體可通過利用已知技術製備。人源化可通過利用相應的人抗體序列取代嚙齒類的CDR或CDR序列來進行(見例如，Verhoeyen et al.，Science 2391534-1536(1988))。因此，所述人源化抗體可為嵌合抗體，其中基本上少於完整人可變結構域被非人物種的相應序列取代。
包含人可變區以及人框架和恆定區的完整人抗體也可使用。所述抗體可利用本領域已知的各種技術製備。例如，體外方法涉及使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(e.g.，Hoogenboom Winter，J.Mol.Biol.227381(1991)，類似地，人抗體可通過將人免疫球蛋白位點引入轉基因動物來製備，例如其中內源性免疫球蛋白基因被部分或完全失活的小鼠。該方法的描述見於例如美國專利6,150,584，5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
當由本發明的方法分離的化合物作為藥物給藥人類或其它哺乳動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、小雞、貓、綿羊、豬、牛、猴子、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)時，分離的化合物可以直接給藥，或者可以利用已知的藥物製備方法配製成劑型。例如，根據需要，藥物可以作為糖衣片劑、膠囊、藥酒和微膠囊口服，或者用水或其它任何藥學上可接受的液體配製成用於注射的無菌溶液或懸液形式，非口服給予。例如，化合物可以與藥學上可接受的載體或介質，具體地，無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、調味劑、賦形劑、媒介物、保存劑、粘附劑等，以藥物實施通常所接受的單位劑量的形式進行混合。這些藥劑中活性成分的含量在指定範圍內可獲得適當的劑量。
能夠混合到片劑和膠囊中的添加劑的例子有，粘附劑例如明膠、玉米澱粉、黃芪膠和阿拉伯膠；賦形劑例如微晶纖維素；膨脹劑例如玉米澱粉、明膠和海藻酸；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精；調味劑例如薄荷油、Gaultheria adenothrix油和櫻桃。當單位劑量形式為膠囊時，上述成分中還可以包括液體載體，例如油。用於注射的無菌組合物可以利用媒介物例如用於注射的蒸餾水，按照常規的藥物實施進行配製。
生理鹽水、葡萄糖以及其它等滲液體包括助劑，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉，可以用作為注射水溶液。這些可以與合適的增溶劑聯合使用，例如醇類，特別是乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，例如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可用作油質液體，可以與苯甲酸苄酯或苯甲醇聯合用作增溶劑，還可與緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液和乙酸鈉緩衝液；鎮痛劑，例如鹽酸普魯卡因；穩定劑，例如苯甲醇、酚；以及抗氧化劑一起配製。製備的注射劑可以填充到合適的安瓿中。
可以利用本領域熟練技術人員所公知的方法向患者給藥本發明的藥物化合物，例如作為動脈注射、靜脈注射、經皮注射，並且還可以作為鼻內、經支氣管、肌內或口服給藥。給藥的劑量和方法根據患者的體重和年齡以及給藥方法而變化；不過，本領域熟練技術人員能夠常規選擇它們。如果所述化合物由DNA編碼，可將該DNA插入到基因治療載體中，並給藥載體進行治療。給藥的劑量和方法根據患者的體重、年齡和症狀變化，但是本領域熟練技術人員能夠適當地選擇它們。
舉例來說，當向標準成年人(體重60kg)口服給藥時，雖然就症狀而言存在某些差異，但與本發明蛋白結合併調節其活性的化合物的劑量為約0.1mg-100mg每天，優選約0.1mg-50mg每天，更優選約1.0mg-20mg每天。
當以注射形式向標準成年人(體重60kg)腸胃外給藥時，雖然就患者、靶器官、症狀和給藥方法而言存在某些差異，但可以很方便地經靜脈內注射約0.01mg-約30mg每天，優選約0.1mg-約20mg每天，更優選約0.1mg-約10mg每天的劑量。在其它動物的情況下，可以按60kg體重的標準換算給藥量。
本發明還提供了治療受試者中的HCC或結腸直腸癌的方法。給藥可為對可能患(或易患)或患有與ZNFN3A1的甲基轉移酶活性異常相關疾病的受試者預防性或治療性給藥。所述方法包括降低HCC或結腸直腸癌細胞中ZNFN3A1的功能。功能可通過給藥通過本發明的篩選方法獲得的化合物來抑制。
另一方面，本發明包括藥物或治療組合物，其含有本發明所述的一或多種治療化合物。可選，本發明還提供本文所述的一或多種治療性化合物在製備用於治療和/或預防HCC或結腸直腸癌的藥物或治療組合物中的用途。藥物配製劑可包括適於口服，經結腸、經鼻、經局部(包括經頰或舌下)、經陰道或經胃腸外(包括經肌內、皮下和靜脈內)給藥的那些，以及通過吸入或吹入給藥的那些。在適宜的情況下，配製劑可方便地存在離散的劑量單位中並可通過製藥領域已知的任何方法製備。所有所述藥學方法都包括按需要將活性化合物與液體載體和/或細微切割的固體載體接觸，然後如果需要將產物成型成所需配製劑的步驟。
適於口服給藥的藥物配製劑可方便地作為離散的單位，諸如膠囊，扁囊或片劑存在，每種都含有預定量的活性成分；作為粉末或顆粒；或作為溶液，懸液或作為乳液。活性成分也可作為藥糖丸或糊劑，並可為純的形式，即不含載體。用於口服給藥的片劑和膠囊可含有常規賦形劑諸如粘合劑，填充劑、潤滑劑、崩解劑或溼潤劑。片劑可通過壓縮或模製製備，其中可選含有一或多種配方成分。壓縮的片劑可通過在適宜的機器中將活性成分壓縮成自由流動的形式諸如粉末或顆粒，可選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑性，表面活性或分散劑混合。模製的片劑可通過在適宜的機器中模製利用惰性液體稀釋劑溼潤的粉末化合物的混合物來製備。所述片劑可根據本領域已知的方法包被。口服液體製備物可以為例如含水或油性混懸液，溶液，乳液，糖漿或酏劑，或可作為幹的產物在使用前利用水或其他適宜載體溶解。所述液體製備物可含有常規添加劑諸如混懸劑，乳化劑，非水性載體(其可包含食用油)，或防腐劑。片劑可選配製成以緩慢或以受控的方式釋放其中的活性成分的形式。
胃腸外給藥的配製劑包括含水和不含水的無菌注射溶液，其中含有抗氧化劑、緩衝劑，抑菌劑和使得配製劑與目的受試者的血液等張的溶質；以及含水和不含水的無菌混懸液，其可包含混懸劑以及增稠劑。所述配製劑可存在單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，並可儲存在冷凍-乾燥的(凍幹的)條件下，僅僅需要在使用前即刻添加無菌液體載體，例如鹽水，注射用水。可選，所述配製劑可用於連續輸注。即配即用的注射溶液和懸液可由以前描述的無菌粉末，顆粒以及片劑製備。
直腸給藥的配製劑可作為栓劑製備，其中的載體為常用載體諸如可可脂或聚乙二醇。局部口內給藥的配製劑，例如經頰或經舌下給藥的配製劑包括糖錠，其中在加香的基質諸如蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠中含有活性成分，所述配製劑還包括錠劑，其中在基質諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中含有活性成分。對於鼻內給藥，本發明獲得的化合物可用作液體噴霧劑或可分散的粉末或滴劑的形式。滴劑可與含水或非含水基質配製在一起，也包括一或多種分散劑，助溶劑或混懸劑。液體噴霧可常規自壓縮的包裝遞送。
對於通過吸入給藥，化合物可方便地自吹入器、霧化器、加壓的包裝或其他用於遞送氣溶膠噴霧的方便裝置遞送。加壓的包裝可包括適宜的推進劑諸如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他適宜氣體。對於加壓的氣溶膠，劑量單位可通過提供閥來遞送計量的量來確定。
可選，對於通過吸入或吹入給藥，所述化合物可為乾粉組合物，例如該化合物與適宜粉末基質諸如乳糖和澱粉的混合粉末。所述粉末組合物可以單位劑量的形式存在於例如膠囊、藥筒、凝膠或發泡的包裝中，通過吸入器或吹入器可給藥所述組合物。
需要時，可採用上述適於持續釋放活性成分的配製劑。所述藥物組合物也可含有其他活性成分諸如抗微生物劑，免疫抑制劑或防腐劑。
應理解除了上述具體的成分，本發明的配製劑也可包括本領域對於目的配製劑類型常用的其他試劑，例如適於口服給藥的那些可包括加香劑。
優選的單位劑量配製劑是含有有效劑量的活性成分的那些，如下所述，或其適宜的部分。
對於每種前述的情形，所述組合物可以約0.1-約250mg/kg每天的劑量口服或經注射給藥。成人的劑量範圍通常為約5mg-約17.5g/天，優選約5mg-約10g/天，更優選約100mg-約3g/天。片劑或其他以離散單位提供的單位劑量形式可方便地包含在所述劑量有效的量或作為其複數形式，例如含有約5mg-約500mg，通常約100mg-約500mg的單位。
所述藥物組合物優選口服或通過注射(經靜脈內或皮下)給藥，給藥受試者的精確的量由主治醫師決定。但是，所用的量有賴於多種因素，包括受試者的年齡和性別，被治療的確切的疾病，以及其嚴重性。給藥途徑還有賴於疾病及其嚴重性。
實施例1一般方法體外組蛋白甲基轉移酶(HMTase)測定法293T細胞用表達Flag標記的ZNFN3A1(pFLAG-CMV-ZNFN3A1)、SET7蛋白或模擬的質粒轉染，利用抗Flag抗體通過免疫沉澱純化標記的蛋白。體外HMTase測定法根據方案(1)稍加改動進行。簡言之，免疫沉澱的蛋白與作為基質25μg游離組蛋白(H3，H2B，H2A和H4的混合物；Roche)，作為甲基供體的2.5μCi S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸，在40μl甲基化酶活性緩衝液混合物(50mM Tris-HCl pH 8.5，20mM KCl，10mM MgCl2，10mM β-巰基乙醇，250mM蔗糖)中在37 ℃保溫60min。為測定組蛋白H3甲基轉移酶活性，將免疫沉澱的蛋白質與1μg重組組蛋白H3(Upstate)基質和2μCiS-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸(SAM)(Amersham Biosciences)甲基供體在20μl甲基化酶活性緩衝液混合物(50mM Tris-HCl pH 8.5，100mM NaCl，10mM DTT)中、30℃保溫1小時。蛋白質通過18％SDS-PAGE分離並通過考馬斯染色和螢光照相法顯示。
體外組蛋白H3甲基轉移酶(HMTase)測定法H3-K4特異性甲基轉移酶活性通過對與存在20μM未標記的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和2μgHSP90A的條件下與免疫沉澱物在30℃保溫1hr的重組Xenopus H3蛋白(UBI)進行western印記分析來檢測，其中利用抗單甲基化的(Abcam；ab8895)，二-甲基化的(Abcam；ab7766)，三-甲基化的(Abcam；ab8580)H3-K4，總H3(Abcam；ab1791)，和三-甲基化的H3-K9(UBI；07523)的抗體進行。用表達Flag標記的野生型ZNFN3A1，突變ZNFN3A1，SET7/9，SUV39H1，或模擬的質粒轉染的細胞的裂解物利用抗Flag抗體(Sigma)免疫沉澱。利用對於二-甲基化的H3-K4(Abcam；ab7768，ARTK-Me2-QTAR-GGC)和二-甲基化的 H3-K9(Abcam；ab1772，QTARK-Me2-ST-GGC)的肽進行競爭實驗。重組ZNFN3A1在具有表達GST-融合的ZNFN3A1的質粒的大腸桿菌細胞或具有表達HA標記的ZNFN3A1的質粒的Sf9細胞中表達。H3-甲基轉移酶活性也在存在或不存在0.04USAHH(Sigma)時利用純化自Sf9細胞的免疫沉澱的ZNFN3A1蛋白或重組ZNFN3A1分析。
集落形成測定野生型ZNFN3A1和突變ZNFN3A1(ΔEEL和ΔNHSC)的整個編碼序列被克隆入p3xFLAG-CMV-10(SIGMA)的適宜克隆位點。被設計為表達野生型ZNFN3A1(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1)或突變ZNFN3A1(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL，p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔNHSC)的有義鏈的質粒，或對照質粒(p3xFLAG-CMV-10)利用FuGENE6試劑根據提供商(Roche)的建議轉染入HEK293，結腸直腸癌細胞或肝癌細胞。轉染的細胞保持在補充有最佳濃度的遺傳黴素的培養基中。細胞存活力利用CellCounting Kit-8根據生產商的方案(DOJINDO)進行測定。
通過cDNA微陣列鑑定下遊基因不表達ZNFN3A1的HEK293細胞利用pcDNA-ZNFN3A1或模擬載體轉染。轉染後18小時提取RNA，用Cy3或Cy5染料標記，並共雜交到含有前述的13,824個基因的內部cDNA微陣列載片上(2，3)。數據標準化之後，進一步分析信號高於截留值的基因。
染色質免疫沉澱(ChIP)測定法HEK293，HepG2和Huh7細胞利用pFLAG-CMV-ZNFN3A1轉染然後在1％甲醛中固定。利用ChIP測定試劑盒根據生產商(Promega)的說明對固定的染色質樣品進行免疫沉澱。來自HEK293細胞的DNA利用抗Flag抗體和抗二甲基化的組蛋白H3抗體沉澱，來自HepG2和Huh7細胞的DNA利用抗-ZNFN3A1沉澱。用於ChIP測定法的引物組顯示於表1。
表1用於ChIP測定法的引物 SEQ ID No；


螢光素酶測定法.
Nkx2.8啟動子的片段通過PCR利用以下引物組擴增5』-AGCGGGCCTGGTACCAAATTTGTG-3』(SEQ ID NO；46)和5』-CCGGGATGC標記CGCATTTACAGC-3』(SEQ ID NO；47)，並將產物克隆入pGL3鹼性載體(pGL3-Nkx2.8-wtZBE)。利用QuickChange定點誘變試劑盒、根據提供商的推薦(Stratagene)，將突變報導質粒(pGL3-Nkx2.8-mutZBE)通過取代pGL3-Nkx2.8-wtZBE中的ZNFN3A1-結合序列(CCCTCCT被取代為CCGACCT以及GAGGGG被取代為GTCGGG)來製備。利用Dual-Luciferase Reporter Assay System(雙-螢光素酶報導測定系統)根據生產商的指示(Promega)進行螢光素酶測定。
HEK293-Nkx2.8Luc細胞的建立利用FuGENE6試劑、根據提供商(Roche)的建議，HEK293-Nkx2.8Luc細胞的適宜轉化體通過將pGL3-Nkx2.8-wtZBE和pcDNA(+)3.1質粒(10∶1)轉染入HEK293細胞來建立。轉染的細胞保持載補充有0.9μg/μl遺傳黴素的培養基中，轉染後2周選出單個集落。
細胞系人胚胎腎293(HEK293)和人宮頸癌(HeLa)細胞獲自IWAKI。人肝細胞瘤細胞系HepG2，人宮頸癌細胞系HeLa，和人結腸癌細胞系HCT116獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。另一種人肝細胞瘤細胞系Huh7獲自Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)，而SNU423和SNU475獲自韓國細胞系文庫(Korea cell-line bank)。所有細胞系在適宜培養基中以單層生長。
RT-PCR標準RT-PCR在20μl PCR緩衝液(TAKARA)中進行，並在94℃擴增4min以變性，然後以94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s在Gene Amp PCRsystem 9700(Perkin-Elmer)中進行30個循環。用於RT-PCR試驗的引物序列顯示於表2。
表2 用於RT-PCR的引物SEQ ID No；


ZNFN3A1突變形式的Western印跡分析用表達Flag標記的ZNFN3A1的野生型和各種突變形式的質粒轉染的細胞利用ZNFN3A1抗體和抗-Flag抗體進行免疫印跡。表達ZNFN3A1的突變形式的質粒被克隆入p3xFLAG-CMV-10載體，其中利用表3所示的引物組擴增PCR產物。
SEQ ID表3 用於構建突變型ZNFN3A1的引物 No；

實施例2測定ZNFN3A1的甲基轉移酶活性製備含有ZNFN3A1的野生型SET結構域的蛋白質以及缺乏兩個區域之一的兩種形式的突變蛋白，通過暴露於UV照射將等量的每種蛋白與[3H]-標記的SAM交聯。如圖1b所示，野生型SET結構域能與[3H]-標記的SAM反應而沒有突變體可與之反應，表明SET結構域可與甲基供體的反應。野生型SET和對照重組SET蛋白與[3H]-標記的SAM以及作為基質的組蛋白混合物進一步保溫，在SDS-PAGE上分離標記的蛋白之後進行測定。如所預期的那樣，通過對照SET7檢測到對應[3H]-標記的組蛋白H3蛋白的強帶(圖1c，泳道3)。當基質與ZNFN3A1的野生型SET一同保溫時，檢測到對應標記的組蛋白H3的弱帶，利用模擬進行觀察時沒有發現這條帶(圖1c，泳道1和2)。
由於酵母雙雜交子篩選將HSP90A鑑定為ZNFN3A1的相互反應蛋白，假設HSP90A可支持SET的蛋白摺疊。為了檢測該假設，將SAM和組蛋白與野生型SET以及重組HSP90A蛋白一同保溫，導致對組蛋白H3的甲基轉移酶活性增加(圖1c，泳道4和5)。這些數據證實ZNFN3A1通過修飾染色質結構以及相關的RNA聚合酶II活性調節下遊基因的表達。
實施例3ZNFN3A1的組蛋白H3甲基轉移酶活性由於含有SET結構域的蛋白在組蛋白組蛋白H3賴氨酸4(H3-K4)或賴氨酸9(H3-K9)的甲基化中起重要作用，我們研究了ZNFN3A1是否具有使H3-K4或H3-K9甲基化的能力。我們將重組組蛋白H3在存在SAM和HSP90A的條件下與野生型和突變ZNFN3A1和SET7在體外一同保溫。與以前的報導一致(26)，SET增強H3-K4的單和二甲基化，但不誘導其三甲基化(圖2a，泳道2)。另一方面，野生型ZNFN3A1不導致單甲基化。但是，其可導致H3-K4的二和三甲基化(圖2a，泳道3)。甲基化可通過加入二甲基化的H3-K4肽完全抑制，但不受加入二甲基化的H3-K9肽的影響(圖2b)。利用H3-K9的試驗表明H3-K9既不被野生型也不被突變ZNFN3A1甲基化(圖2c)，提示ZNFN3A1具有H3-K4-特異性甲基轉移酶活性。
實施例4重組ZNFN3A1.的組蛋白H3-K4甲基轉移酶活性此外，野生型和突變ZNFN3A1的整個編碼區被克隆進pGEX6P-1載體的適宜克隆位點中，並在DH10B細胞中表達。重組GST-ZNFN3A1融合蛋白利用Sepharose 4B珠(Amersham)純化，並利用Precision蛋白酶(Amersham)根據供應商的方案(圖3a，泳道4)進一步分離重組ZNFN3A1。重組ZNFN3A1在體外也顯示對組蛋白H3的HMTase活性(圖3b)。利用抗二甲基化的和抗三甲基化的H3-K4抗體進行的Western印跡分析證實重組ZNFN3A1誘導組蛋白H3-K4的二-甲基化和三-甲基化(圖3c，分別示於上圖和下圖)。由於S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)水解從SAM催化獲得的SAH並抑制甲基化和增強甲基轉移酶活性(4)，我們研究了SAHH是否影響ZNFN3A1的組蛋白H3甲基轉移酶活性。Flag-標記的ZNFN3A1的H3甲基轉移酶活性在存在SAHH時明顯高於缺乏SAHH的情況(圖3d)。
實施例5ZNFN3A1的HMTase活性與癌細胞增殖之間的關係為了分析HMTase活性對細胞生長的影響，我們通過轉染表達ZNFN3A1的野生型(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1)或HMTase-無活性突變形式(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL，p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔNHSC)的質粒或對照質粒(p3xFLAG-CMV)來進行集落形成試驗。在不表達內源ZNFN3A1的HEK293中，野生型ZNFN3A1的轉導產生的集落明顯多於對照或突變ZNFN3A1，其反映了ZNFN3A1的致癌活性(圖4a)。一致地，在HCT116結腸癌細胞中利用p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1轉染與對照相比增加了集落的數目(圖4b)。另一方面，利用p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL轉染導致與p3xFLAG-CMV相比HCT116細胞的生長降低，提示突變ZNFN3A1可影響內源ZNFN3A1的功能。此外，我們還研究了突變形式的質粒在各種結腸直腸癌細胞系以及肝癌細胞系中的生長抑制作用(圖5)。結果顯示，無HMTase活性的ZNFN3A1(p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔEEL，p3xFLAG-CMV-ZNFN3A1-ΔNHSC)的轉導與對照相比明顯降低癌細胞的生長，提示ZNFN3A1的HMTase活性與結腸癌和肝癌細胞的增殖有關。
實施例6鑑定受ZNFN3A1調控的基因為了鑑定受ZNFN3A1調節的下遊基因，將pcDNA-ZNFN3A1轉染入通過RT-PCR顯示為具有不可檢測的ZNFN3A1表達水平的HEK293細胞，並利用含有13,824個基因的cDNA微陣列監測基因表達中的改變。早在12小時的免疫印跡分析顯示ZNFN3A1的時間依賴型誘導(圖6a)，因此轉染後18小時從利用pcDNA-ZNFN3A1轉染的細胞以及pcDNA-模擬轉染的細胞提取RNA。表達圖譜分析鑑定了具有改變的表達的81種基因，其中包括與模擬轉染的細胞相比在pcDNA-ZNFN3A1轉染的細胞中上調超過3倍的62種基因，以及下調超過3倍的19種基因(表5)。在62種上調的基因中，發現癌基因的組諸如Myc，Crk，JunD，Maf和Wnt10B，參與細胞周期調節的基因(cyclin G1，Cdk2和Topoisomerase II)，以及同源框基因(Nkx2.5，Nkx2.8and LIM homeobox protein 2)通過導入ZNFN3A1上調。與細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E相關地，cdk2在S期進展中起重要作用(5，6)，並且細胞周期蛋白E/cdk2複合體的擴增顯示與多種腫瘤包括CRC和HCC的腫瘤進展有關(7，8)。已知同源框基因是發育中形態改變以及腫瘤生成的重要因素(9)。因此ZNFN3A1的表達升高通過這些下遊基因的活化在人癌形成中起重要作用。
選擇11種上調的基因，其中包括Nkx2.8，C/EBPδ，Nkx2.5，Wnt10B，PIK3CB，NEURL，PSMD9，ECEL1，CRKL，APS，和Seb4D，利用獲自ZNFN3A1和模擬轉染的細胞的RNA進行RT-PCR。用於半定量RT-PCR的引物組顯示於表2。
預期地，結果支持了這些基因的表達通過ZNFN3A1得以增強(圖6b)。在Nkx2.8的轉錄起始位點上遊的1.5kb區中搜索推定的ZNFN3A1結合序列。鑑定了兩種序列(圖7a)。隨後利用pFLAG-ZNFN3A1轉染的細胞以及抗FlagM2抗體的染色質免疫沉澱(ChIP)測定法證實了含有這些序列的一段基因組片段(ChIP-4)與ZNFN3A1結合，其他不具有ZNFN3A1結合序列的片段(ChIP-1，-2，和-3)不與ZNFN3A1結合(圖7b)。ChIP-4片段含有兩個推定的結合序列(CCCTCCT和GAGGGG)，它們位於5』側翼區的-510 bp到-467 bp中(圖7a)。製備含有該ZNFN3A1結合元件(ZBE)的雙鏈寡核苷酸探針，進行體外結合測定，利用重組GST，GST-ZNFN3A1，和GST-wtTcf4作為對照(圖7c)。用於體外結合測定法的探針顯示於表4。
表4 用於體內結合測定法的寡核苷酸SEQ ID NO；

結果表明含有野生型Tcf4-結合基序(wtTBM)的寡核苷酸探針與GST-wtTcf4結合而不與GST或GST-ZNFN3A1蛋白結合。類似地，儘管ZBE不與GST結合，其能與GST-ZNFN3A1蛋白結合。此外，確定所述相互作用通過加入冷競爭性DNA抑制，提示GST-ZNFN3A1和ZBE之間的特異性相互作用。
表5 受ZNFN3A1上調和下調的基因

上調的基因癌基因

細胞周期

信號轉導


粘附

受體

形態

轉錄


分泌的

各種酶

其它


下調的基因細胞周期

轉錄

分泌性

各種酶


其它

實施例7ZNFN3A1調節Nkx2.8的轉錄活性為了檢測ZBE是否導致Nkx2.8在癌細胞中的反式活化，製備報導質粒，其包括克隆的螢光素酶基因上遊區的野生型ZBE(pGL3-Nkx2.8-wtZBE)的Nkx2.8的-791到+109，以及包括突變ZBE的(pGL3-Nkx2.8-mutZBE)的報導質粒。這些報導質粒被轉染入HepG2或SNU475細胞，並且在存在或不存在ZNFN3A1的siRNA的條件下測定其螢光素酶活性(圖7d)。突變報導質粒顯示與野生型質粒相比在細胞中的活性明顯降低，表明ZBE導致Nkx2.8在細胞中的反式活化。明顯地，與表達ZNFN3A1的siRNA的質粒共轉染(psiU6BX-ZNFN3A1-12通過將以下雙鏈寡核苷酸克隆入psiU6BX載體的Bbsl位點製備；正向5′-CACCAACATCTACCAGCTGAAGGTGTTCAAGAGACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3′(SEQ ID NO；48)，反向5′-AAAAAACATCTACCAGCTGAAGGTGTCTCTTGAACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3′(SEQ ID NO；49)(WO2004/76623))降低野生型報導質粒與模擬(psiU6BX-Mock)相比的螢光素酶活性，但不影響突變質粒的活性。
這些數據表明ZNFN3A1通過與ZBE反應直接調節Nkx2.8的轉錄活性。
實施例8Nkx2.8與ZNFN3A1的HSP90A依賴性HMTase活性相關為了測定ZNFN3A1的HMTase活性是否與Nkx2.8的表達相關，以及HSP90A是否參與其調節，用表達野生型或無HMTase活性的突變ZNFN3A1的質粒(ZNFN3A1-ΔEEL和ZNFN3A1-ΔNHSC)轉染，利用分離自轉染的細胞的RNA進行半定量RT-PCR(圖7e)。如預期那樣，儘管野生型質粒促進Nkx2.8的表達，兩種類型的突變質粒都不能誘導表達。此外，添加HSP90A的特異性抑制物格爾德黴素(geldanamycin)抑制野生型ZNFN3A1導致的表達增強(圖7e泳道3)，這於HSP90A在體外增強HMTase活性的發現一致(圖1c)。建立了在基因組中整合了Nkx2.8和螢光素酶基因(pGL3-Nkx2.8-wtZBE)的HEK293-Nkx2.8Luc細胞。利用表達野生型ZNFN3A1的質粒進行轉染以劑量依賴方式增加螢光素酶活性，但是加入2μM格爾德黴素或與無HMTase活性的突變不增加所述活性(圖7f)。總而言之，這些結果表明Nkx2.8的表達與ZNFN3A1的HSP90A依賴型HMTase活性相關。
實施例9Nkx2.8啟動子中的ChaIP-4區與ZNFN3A1的結合我們利用大量表達ZNFN3A1的HepG2或Huh7肝癌細胞的提取物利用抗ZNFN3A1抗體進行另外的ChIP測定，其支持了內源性ZNFN3A1蛋白與ChIP-4區之間的作用(圖8a)。利用抗二甲基化的H3-K4抗體進行進一步ChIP測定顯示用野生型ZNFN3A1轉染的HEK293細胞中二甲基化的H3-K4與ChIP-4區之間的結合(圖8b)。
工業實用性本發明顯示ZNFN3A1具有甲基轉移酶活性，並且抑制所述活性導致對癌細胞的細胞增殖的抑制。因此，抑制甲基轉移酶活性或ZNFN3A1與其輔助因子的結合的試劑阻止其活性，可作為抗癌藥劑用於治療，具體可作為用於治療HCC或結腸直腸癌的抗癌藥劑。
已經報導ZNFN3A1的表達在HCC或結腸直腸癌中上調。因此，本發明檢測ZNFN3A1的甲基轉移酶活性的方法也可用於鑑定這些癌症。具體地，與正常細胞相比顯示較高的甲基轉移酶活性的細胞可被鑑定為癌症細胞。
此外，調節ZNFN3A1的甲基轉移酶活性的調節物也可用於鑑定癌症。例如，所述調節物可用於證實受試細胞中檢出的甲基轉移酶活性是否源自ZNFN3A1。具體地，當甲基轉移酶活性受到調節物的改變(抑制或增強)時，所述活性被判斷為不是假陽性。
本文引用的所有專利，專利申請以及公開出版物都全文包含在此作為參考。此外，雖然本發明已經參考具體實施方案進行了詳細描述，對於本領域技術人員而言，顯而易見可進行各種改變和修飾而不偏離本發明的精神和範圍。
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223用於體外結合測定法的人工合成的引物序列40034gggcccctct aagattcagg atgacaagtt tcaggagggc gtaa 442103521115212DNA213人工的220
223用於體外結合測定法的人工合成的引物序列40035ccctttgatc ttacc 1521036
21115212DNA213人工的220
223用於體外結合測定法的人工合成的引物序列40036ggtaagatca aaggg 152103721115212DNA213人工的220
223用於體外結合測定法的人工合成的引物序列40037ccctttggcc ttacc 152103821115212DNA213人工的220
223用於體外結合測定法的人工合成的引物序列40038ggtaaggcca aaggg 152103921129212DNA213人工的220
223用於構建突變型ZNFN3A1的人工合成的引物序列40039cggaattctg gcgtcgtctg cgaccgctg 292104021132212DNA213人工的220
223用於構建突變型ZNFN3A1的人工合成的引物序列40040ggggtacctt aggatgctct gatgttggcg tc 322104121132212DNA213人工的220
223用於構建突變型ZNFN3A1的人工合成的引物序列40041cggaattcag actccgttcg acttcttggc ag 322104221133212DNA213人工的220
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2104321133212DNA213人工的220
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213人工的220
223用於通過PCR擴增Nkx2.8啟動子的片段的人工合成的引物序列40046agcgggcctg gtaccaaatt tgtg 242104721124212DNA213人工的220
223用於通過PCR擴增Nkx2.8啟動子的片段的人工合成的引物序列40047ccgggatgct agcgcattta cagc 242104821155212DNA213人工的220
223用於表達ZNFN3A1的siRNA的質粒的人工合成的寡核苷酸序列40048caccaacatc taccagctga aggtgttcaa gagacacctt cagctggtag atgtt 552104921155212DNA213人工的220
223用於表達ZNFN3A1的siRNA的質粒的人工合成的寡核苷酸序列40049aaaaaacatc taccagctga aggtgtctct tgaacacctt cagctggtag atgtt 55
210502111622212DNA213人(Homo sapiens)220
221CDS222(96)..(1382)40050gtgcgcgcag ggcgcaggcg cgcgggtccc ggcagcccgt gagacgcccg ctgctggacg 60cgggtagccg tctgaggtgc cggagctgcg ggagg atg gag ccg ctg aag gtg 113Met Glu Pro Leu Lys Val1 5gaa aag ttc gca acc gcc aac agg gga aac ggg ctg cgc gcc gtg acc 161Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn Gly Leu Arg Ala Val Thr10 15 20ccg ctg cgc ccc gga gag cta ctc ttc cgc tcg gat ccc ttg gcg tac 209Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg Ser Asp Pro Leu Ala Tyr25 30 35acg gtg tgc aag ggg agt cgt ggc gtc gtc tgc gac cgc tgc ctt ctc 257Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val Cys Asp Arg Cys Leu Leu40 45 50ggg aag gaa aag ctg atg cga tgc tct cag tgc cgc gtc gcc aaa tac 305Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln Cys Arg Val Ala Lys Tyr55 60 65 70tgt agt gct aag tgt cag aaa aaa gct tgg cca gac cac aag cgg gaa 353Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp Pro Asp His Lys Arg Glu75 80 85tgc aaa tgc ctt aaa agc tgc aaa ccc aga tat cct cca gac tcc gtt 401Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg Tyr Pro Pro Asp Ser Val90 95 100cga ctt ctt ggc aga gtt gtc ttc aaa ctt atg gat gga gca cct tca 449Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu Met Asp Gly Ala Pro Ser
105 110 115gaa tca gag aag ctt tac tca ttt tat gat ctg gag tca aat att aac 497Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp Leu Glu Ser Asn Ile Asn120 125 130aaa ctg act gaa gat aag aaa gag ggc ctc agg caa ctc gta atg aca 545Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu Arg Gln Leu Val Met Thr135 140 145 150ttt caa cat ttc atg aga gaa gaa ata cag gat gcc tct cag ctg cca 593Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln Asp Ala Ser Gln Leu Pro155 160 165cct gcc ttt gac ctt ttt gaa gcc ttt gca aaa gtg atc tgc aac tct 641Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala Lys Val Ile Cys Asn Ser170 175 180ttc acc atc tgt aat gcg gag atg cag gaa gtt ggt gtt ggc cta tat 689Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu Val Gly Val Gly Leu Tyr185 190 195ccc agt atc tct ttg ctc aat cac agc tgt gac ccc aac tgt tcg att 737Pro Ser lle Ser Leu Leu Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Cys Ser Ile200 205 210gtg ttc aat ggg ccc cac ctc tta ctg cga gca gtc cga gac atc gag 785Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg Ala Val Arg Asp Ile Glu215 220 225 230gtg gga gag gag ctc acc atc tgc tac ctg gat atg ctg atg acc agt 833Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu Asp Met Leu Met Thr Ser235 240 245gag gag cgc cgg aag cag ctg agg gac cag tac tgc ttt gaa tgt gac 881Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln Tyr Cys Phe Glu Cys Asp250 255 260tgt ttc cgt tgc caa acc cag gac aag gat gct gat atg cta act ggt 929Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp Ala Asp Met Leu Thr Gly265 270 275gat gag caa gta tgg aag gaa gtt caa gaa tcc ctg aaa aaa att gaa 977Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu Ser Leu Lys Lys Ile Glu
280 285 290gaa ctg aag gca cac tgg aag tgg gag cag gtt ctg gcc atg tgc cag 1025Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln Val Leu Ala Met Cys Gln295 300 305 310gcg atc ata agc agc aat tct gaa cgg ctt ccc gat atc aac atc tac 1073Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu Pro Asp Ile Asn Ile Tyr315 320 325cag ctg aag gtg ctc gac tgc gcc atg gat gcc tgc atc aac ctc ggc 1121Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp Ala Cys Ile Asn Leu Gly330 335 340ctg ttg gag gaa gcc ttg ttc tat ggt act cgg acc atg gag cca tac 1169Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr Arg Thr Met Glu Pro Tyr345 350 355agg att ttt ttc cca gga agc cat ccc gtc aga ggg gtt caa gtg atg 1217Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val Arg Gly Val Gln Val Met360 365 370aaa gtt ggc aaa ctg cag cta cat caa ggc atg ttt ccc caa gca atg 1265Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly Met Phe Pro Gln Ala Met375 380 385 390aag aat ctg aga ctg gct ttt gat att atg aga gtg aca cat ggc aga 1313Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met Arg Val Thr His Gly Arg395 400 405gaa cac agc ctg att gaa gat ttg att cta ctt tta gaa gaa tgc gac 1361Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu Leu Glu Glu Cys Asp410 415 420gcc aac atc aga gca tcc taa gggaacgcag tcagagggaa atacggcgtg1412Ala Asn Ile Arg Ala Ser425tgtctttgtt gaatgcctta ttgaggtcac acactctatg ctttgttagc tgtgtgaacc 1472tctcttattg gaaattctgt tccgtgtttg tgtaggtaaa taaaggcaga catggtttgc 1532aaaccacaag aatcattagt tgtagagaag cacgattata ataaattcaa aacatttggt 1592
tgaggatgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 162221051211428212PRT213人(Homo sapiens)40051Met Glu Pro Leu Lys Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn1 5 10 15Gly Leu Arg Ala Val Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg20 25 30Ser Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val35 40 45Cys Asp Arg Cys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln50 55 60Cys Arg Val Ala Lys Tyr Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp65 70 75 80Pro Asp His Lys Arg Glu Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg85 90 95Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu100 105 110Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp115 120 125Leu Glu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu130 135 140
Arg Gln Leu Val Met Thr Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu lle Gln145 150 155 160Asp Ala Ser Gln Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala165 170 175Lys Val Ile Cys Asn Ser Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu180 185 190Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys195 200 205Asp Pro Asn Cys Ser Ile Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg210 215 220Ala Val Arg Asp Ile Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu225 230 235 240Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln245 250 255Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp260 265 270Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu275 280 285Ser Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln290 295 300Val Leu Ala Met Cys Gln Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu305 310 315 320
Pro Asp Ile Asn Ile Tyr Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp325 330 335Ala Cys Ile Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr340 345 350Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val355 360 365Arg Gly Val Gln Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly370 375 380Met Phe Pro Gln Ala Met Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met385 390 395 400Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu lle Glu Asp Leu Ile Leu405 410 415Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn Ile Arg Ala Ser420 425210522117212PRT213人(Homo sapiens)40052Asn His Ser Cys Asp Pro Asn1 5210532118212PRT
213人(Homo sapiens)40053Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr1 5210542117212PRT213人(Homo sapiens)220
221MISC FEATURE222(5)..(6)223「Xaa」表示任何胺基酸40054Asn His Ser Cys Xaa Xaa Asn1 5210552118212PRT213人(Homo sapiens)220
221MISC FEATURE222(5)..(7)223「Xaa」表示任何胺基酸40055Gly Glu Glu Leu Xaa Xaa Xaa Tyr1 權利要求
1.多肽的甲基轉移酶活性的測定方法，所述方法包括以下步驟a.使選自下組的多肽與待甲基化的基質以及輔助因子在能使所述基質甲基化的條件下接觸i.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽(ZNFN3A1)；ii.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽，其中一或多個胺基酸被取代，缺失或插入，並且所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；iii.包含與SEQ ID NO51具有至少大約80％同源性的胺基酸序列的多肽；和iv.在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO50組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；b.檢測所述基質的甲基化水平；和c.通過使步驟(b)的甲基化水平與甲基轉移酶活性相關來測定甲基轉移酶活性。
2.權利要求1的方法，其中所述基質是組蛋白或其包含至少甲基化區的片段。
3.權利要求1的方法，其中所述甲基化區是組蛋白H3賴氨酸4。
4.權利要求1的方法，其中所述輔助因子是S-腺苷-L-甲硫氨酸。
5.權利要求1的方法，其中所述能使基質甲基化的條件是在熱休克蛋白90A(HSP90A)存在的條件下提供的。
6.權利要求1的方法，其中所述多肽與基質以及輔助因子的接觸是在甲基化增強劑存在的條件下進行的。
7.權利要求6的方法，其中所述甲基化增強劑是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。
8.鑑定甲基轉移酶活性的調節劑的方法，所述方法包括以下步驟a.在存在受試化合物的條件下，使選自下組的多肽與待甲基化的基質以及輔助因子在能使所述基質甲基化的條件下接觸i.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽；ii.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽，其中一或多個胺基酸被取代，缺失或插入，並且所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；iii.包含與SEQ ID NO51具有至少大約80％同源性的胺基酸序列的多肽；和vi.在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO50組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；b.檢測所述基質的甲基化水平；和c.將所述甲基化水平與對照水平相比較其中與對照水平相比甲基化水平的升高或降低表明所述受試化合物調節甲基轉移酶活性。
9.檢測受試化合物對甲基轉移酶活性的調節活性的試劑盒，所述試劑盒包含以下組分a.選自下組的多肽i.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽；ii.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽，其中一或多個胺基酸被取代，缺失或插入，並且所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；iii.包含與SEQ ID NO51具有至少大約80％同源性的胺基酸序列的多肽；和vi.在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO50組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；b.能被(a)的多肽甲基化的基質，c.所述基質甲基化的輔助因子，和d.HSP90A。
10.權利要求9的試劑盒，其中所述基質是組蛋白或其包含至少甲基化區的片段。
11.權利要求9的試劑盒，其中所述試劑盒還包括以下要素e.S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。
12篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a.通過權利要求7的方法，鑑定具有甲基轉移酶活性的調節活性的化合物，和b.選擇與對照水平相比降低基質甲基化水平的化合物。
13.篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使選自下組的多肽與熱休克蛋白90A多肽(HSP90A)在存在受試化合物的條件下接觸i.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽；ii.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽，其中一或多個胺基酸被取代，缺失或插入，並且所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；iii.包含與SEQ ID NO51具有至少大約80％同源性的胺基酸序列的多肽；和vi.在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO50組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；b.檢測所述多肽與HSP90A之間的結合；c.比較存在所述受試化合物與不存在所述受試化合物的條件下，所述多肽與HSP90A的結合，和d.選擇降低所述多肽和HSP90A之間的結合的受試化合物。
14.篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的試劑盒，所述試劑盒包含以下組分a.選自下組的多肽i.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽；ii.包含胺基酸序列SEQ ID NO51的多肽，其中一或多個胺基酸被取代，缺失或插入，並且所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；iii.包含與SEQ ID NO51具有至少大約80％同源性的胺基酸序列的多肽；和vi.在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO50組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中所述多肽具有與胺基酸序列SEQ ID NO51組成的多肽等同的生物活性；和d.HSP90A。
15.篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a.在受試化合物存在的條件下，使包含選自胺基酸序列SEQ ID NO51的連續胺基酸序列、並且胺基酸序列包含NHSCDPN(SEQ ID NO52)和/或GEELTICY(SEQ ID NO53)的多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸接觸；b.檢測所述多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的結合；c.比較存在所述受試化合物與不存在所述受試化合物的條件下，所述多肽與S-腺苷-L-甲硫氨酸的結合d.選擇降低所述多肽和S-腺苷-L-甲硫氨酸之間的結合的受試化合物。
16.篩選用於治療結腸直腸癌或肝細胞癌的化合物的試劑盒，所述試劑盒包含以下組分a.包含選自胺基酸序列SEQ ID NO51的連續胺基酸序列、並且胺基酸序列含有NHSCDPN(SEQ ID NO52)和/或GEELTICY(SEQ ID NO53)的多肽；和b.S-腺苷-L-甲硫氨酸。
17.用於緩解結腸直腸癌或肝細胞癌的症狀的組合物，包括藥物有效量的降低ZNFN3A1-介導的甲基化的化合物以及可藥用的載體。
18.緩解結腸直腸癌或肝細胞癌的症狀的方法，包括使結腸直腸癌細胞或肝細胞癌細胞與藥物有效量的降低ZNFN3A1-介導的甲基化的化合物接觸。
19.緩解結腸直腸癌或肝細胞癌的症狀的方法，包括使結腸直腸癌細胞與肝細胞癌細胞與藥物有效量的降低ZNFN3A1和HSP90A之間相互作用的化合物接觸。
20.緩解結腸直腸癌或肝細胞癌的症狀的方法，包括使結腸直腸癌細胞與肝細胞癌細胞與藥物有效量的降低ZNFN3A1和S-腺苷-L-甲硫氨酸之間相互作用的化合物接觸。
全文摘要
本發明特徵在於測定多肽的甲基轉移酶活性的方法，以及篩選甲基轉移酶活性調節物的方法。本發明還提供用於利用所述調節物預防或治療結腸直腸癌或肝細胞癌的方法或藥物組合物。
文檔編號G01N33/574GK1954082SQ200580009630
公開日2007年4月25日 申請日期2005年1月21日 優先權日2004年1月23日
發明者中村佑輔, 古川洋一 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司