用於增加細胞培養物的壽命和蛋白收率的改良方法和組合物的製作方法

2023-10-11 02:16:14

專利名稱：：用於增加細胞培養物的壽命和蛋白收率的改良方法和組合物的製作方法用於增加細胞培養物的壽命和蛋白收率的改良方法和組合物發明領域本發明的多個實施方案涉及增加細胞系的壽命和/或蛋白收率的方法和組合物。在具體的實施方案中，所述細胞系可為生產抗體或抗體片段的雜交瘤細胞系。在更具體的實施方案中，所述方法可包括用一種或多種基因(例如編碼E6、E7和/或Bcl-2或相關蛋白的基因)轉染細胞系。這些蛋白不限於其天然序列，而是可包括一個或多個置換的胺基酸，例如具有T69E、S70E和S87E點突變的Bcl-2。其它實施方案涉及能夠在無血清培養基中生長和生產蛋白的哺乳動物細胞系。可通過用表達異源蛋白的表達載體轉染這些細胞系而將這些細胞系用於蛋白生產方法，所述異源蛋白例如為抗體、雙特異性抗體、多價抗體或多特異性抗體或其片段。在優選實施方案中，所述細胞系可在無血清培養基中被轉染，由於避免了必須使轉染細胞系適應無血清生長和蛋白生產，因而提供了可觀的時間節省。發明背景多生物技術產品的基礎，包括由這些細胞將蛋白產物加工到支持介質中，由此支持介質分離這些產物，並進一步加工，然後臨床使用。培養物中生長的細胞隨時間變化的蛋白生產量取決於眾多因素，例如細胞密度、細胞周期、蛋白的細胞生物合成速率、用於支持細胞存活率和生長的培養基條件狀況以及培養物中的細胞壽命(即它們需要多長時間死於程序性細胞死亡或凋亡)。已開發了各種改善培養物中的細胞存活率和壽命的方法，以及通過例如控制營養、細胞密度、氧和二氧化碳含量、乳酸脫氫酶、pH、摩爾滲透壓濃度、分解代謝產物等增加所需蛋白的生產率的方法。例如，增加細胞密度可使該過程更高產，但也能降低培養物中的細胞壽命。因此，可能期望在達到最大密度時降低培養物中這些細胞的增殖速率，以便將細胞群儘可能長時間地保持在其最高產狀態。這導致增加或延長了處於其生產高峰的生物反應器周期，加工目標蛋白產物的時間段更長，並且這導致生物反應器周期收率的更高。已尋求許多不同的方法來增加生物反應器周期時間，例如調節支持細胞增殖的培養基、加入某些生長促進因子以及抑制細胞增殖而不影響蛋白合成。一個具體方法的目的就在於通過使用影響細胞周期靶的基因或反義寡核苷酸控制細胞周期來增加培養細胞的壽命，從而通過用阻止細胞周期發展和誘導所謂的假衰老狀態的載體來轉染、轉化或感染而將細胞誘導至假衰老階段，所述假衰老狀態阻斷進一步的細胞分裂，並擴大培養物中所述細胞的蛋白合成能力；換句話說，假衰老狀態可通過用表達細胞周期抑制劑的載體轉染細胞來誘導(Bucciarelli等，美國專利申請2002/0160450Al;WO02/16590A2)。後一種方法通過抑制細胞複製設法迫使細胞進入可具有延長的細胞培養物壽命(如Goldstein和Singal，ExpCellRes88，359-64,1974;Brenner等，Oncogene17:199-205，1998所述)並可抗凋亡(Chang等，ProcNatlAcadSciUSA97,4291-6，2000;Javeland等，Oncogene19,61-8，2000)的狀態。另一個方法涉及建立在用腺病毒El基因轉染後無限增殖的原代二倍體人細胞或其衍生物。新細胞系(其中一種是表達功能性Ad5EIA和EIB基因產物的PER.C6(ECACC保藏號96022940))可生產重組腺病毒以及設計用於基因治療和疫苗以及用於生產重組治療性蛋白(例如人生長因子和人抗體(Vogels等，WO02/40665A2))的其它病毒(例如流感病毒、單純皰滲病毒、輪狀病毒、麻滲病毒)。其它方法集中於應用胱天蛋白酶抑制劑來防止或延遲細胞凋亡。參見例如美國專利第6,586,206號。還有一些方法嘗試使用凋亡抑制劑如Bcl-2家族成員預防或延遲細胞凋亡。參見Arden等，BioprocessingJournal,3:23-28(2004)。這些方法已產生不可預知的結果。例如，在一項研究中，Bcl-2表達增加了細胞存活率，但並不增加蛋白產量。(參見Tey等，Biotechnol.Bioeng.68:31-43，2000)。另一個實例公開了Bcl-2蛋白的過表達延遲了CHO細胞凋亡，但Bcl-xL增加蛋白產量，而Bcl-2降低蛋白產量(參見WO03/083093)。又一個實例公開了使用Bcl-2蛋白表達來延長培養物中的Sp2/0-Ag14(ATCC#CRL-1581，後文稱為Sp2/0)細胞存活的實驗。但是，表達Bcl-2的克隆的細胞密度比其親本培養物的細胞密度低20-50%，這引起對其在生物醫藥工業中的實際應用的顧慮(參見WO03/040374;U.S.6,964,199)。因此，顯然，本領域需要高水平表達重組蛋白的改良宿主細胞，以及在宿主細胞中可靠地增加重組蛋白生產(尤其是抗體和抗體片段、多特異性抗體、片段和單鏈構建物、肽、酶、生長因子、激素、白介素、幹擾素和疫苗的生產)的方法。還需要預適應在無血清或血清耗竭培養基中生長的細胞系，這些細胞系可在無血清條件下用表達載體轉染並用於蛋白生產，在無血清生長和蛋白生產前無需經歷長適應期。發明概述因此，本發明的一個目標是通過將抑制衰老或促進細胞存活的物質(例如抗凋亡劑)導入細胞中提供改良的宿主細胞，增加細胞培養物的壽命和/或重組蛋白產量的方法。這類物質的使用優先增加培養物中用於生產所需重組蛋白的細胞的壽命和存活率，伴隨地增加培養物中這些細胞的生產率，由此增加所需蛋白的最佳收率。優選地，用於本發明方法的凋亡抑制劑包括但不限於Bcl-2及其家族成員。或者，可通過將下調胞內促凋亡蛋白(例如p53和Rb)水平的物質或上調胞內抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)的物質導入細胞中改善細胞克隆的壽命和重組蛋白收率。優選地，用於本發明方法的調節劑包括但不限於人乳頭瘤病毒16型(HPV-16)癌蛋白E6和E7、抗凋亡蛋白Bcl-2及其組合。另外，如本文所述的胱天蛋白酶抑制劑也可能有助於阻滯或減緩凋亡，由此增加細胞存活和增加培養物中所述細胞的重組蛋白產量。可在這些培養物中用於增強重組蛋白生產的其它類別的抗凋亡劑包括細胞因子I型超家族的某些成員，例如促紅細胞生成素(EPO)。EPO作為該類別的一種原型分子，是多種細胞類型(不僅僅是紅細胞)凋亡的主要調節物，因此例如在內皮細胞、心肌細胞、腎臟、皮膚和神經元的管狀上皮細胞中具有更通用的細胞保護功能[參考P.Ghezzi和M.Brines,CellDeathandDifferentiation11(增刊1)，s37-s44,2004年7月的綜述]。[OOIO]在多個實施方案中，已用一種或多種調節劑如HPV-16、E6、E7和/或Bcl-2轉染的細胞系可對在無血清培養基中生長進行預適應。這類經預適應的細胞系包括但不限於Sp/ESF細胞系(參見以下實施例)，它們能夠在無血清條件下用一種或多種表達載體進行進一步的轉化，由此允許在無血清條件下表達和生產蛋白，而無需適應無血清生長所需的大量時間。這種意想不到的結果使得可以在無血清或低血清條件下生產蛋白，提供了顯著的培養基成本節約。同時，在無血清條件下的轉染和蛋白生產節約了無血清適應所需的大量時間，而該時間在使用標準哺乳動物細胞系時是必需的，這些標準哺乳動物細胞系只有在富血清條件下才是可轉染的，需要額外的6-12個月來適應無血清蛋白生產。本發明還講授了摻入新的因素組合的細胞培養方法，所述因素包括但不限於轉染載體、篩選和選擇具有所需特性的細胞克隆、細胞培養基、生長條件、生物反應器配置和細胞類型，以建立其中細胞培養物的壽命被增加和/或變得最佳以及所需重組蛋白收率增加的細胞培養條件。這些細胞培養方法包括懸浮、灌注和補料-分批生產方法。參見Tey等，J.BiotechnoL79:147-159(2000);Zhang等，J.Chem.Technol.BiotechnoL79:171-181(2004);Zhou等，Biotechnol.Bioeng.55:783-792(1997)。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科技術語都具有其平常的和普通的含義。另外，本文提及的所有專利和其它參考文獻的內容都通過引用整體結合到本文中。附圖簡述圖1顯示了用環己醯亞胺處理(+CHX)或未處理(-CHX)的Sp2/0和Sp-E26細胞的目視圖象。圖2顯示了對CHX處理更有抗性的HPVE6/E7轉導細胞的篩選結果。篩選了總共55個克隆；在第一個實驗中，篩選31個克隆(上圖)；在第二個實驗中，篩選24個克隆(下圖)。將各個克隆的健康細胞分為兩等份。一份用CHX處理2小時，另一份不處理。然後通過MTT測定來檢測這兩種培養物中的存活細胞，對經處理的存活細胞群(CHX+)對未處理的存活細胞群(CHX_)的比率作圖。如上圖所示，CHX處理導致Sp2/0細胞的存活率下降30%,而Sp-E26細胞僅下降6%。所篩選的31個克隆中有7個(以*表示)表現得顯著好於Sp2/0(存活率下降<20%)，但不如Sp-E26。對於在第二個實驗中篩選的24個克隆(下圖)，CHX處理導致Sp2/0細胞的存活率下降約50%,Sp-E26存活率下降<20%。所篩選的24個克隆中有10個(以*或**表示)表現得顯著好於Sp2/0(<30%下降)，它們中的6個(以**表示)相當於或好於Sp-E26(95%存活率)以250,000個/ml的初始細胞密度接種在生物反應器中。每日通過錐蟲藍和顯微鏡計數細胞。圖7顯示了用Bcl-2(100)抗體(SantaCmzBiotech.)染色並用增強化學發光顯現來篩選克隆之Bcl-2-EEE表達的代表性免疫印跡。圖8顯示了使用GuavaExpress的流式細胞術結果的圖。固定細胞，並透化，然後用綴合了藻紅蛋白的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.)染色。對比幾個亞克隆。圖9顯示了使用GuavaExpress的流式細胞術結果的圖。固定細胞，並透化，然後用綴合了藻紅蛋白的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.)染色。將Sp2/0、Raji和Daudi細月包與Bel-2-EEE克隆進行對比。圖10顯示了665.B4.1Cl、Sp2/0、Raji、Daudi、Sp-EEE(87-29克隆)和Sp-EEE(7-16克隆)細胞裂解物的免疫印跡分析的結果。(A)用人Bcl-2特異性抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc)染色的印跡。(B)用識別小鼠和人Bcl-2的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc)染色的印跡。圖11顯示了與在補加10%胎牛血清的培養基中生長的Sp2/0細胞相比Sp-EEE克隆的生長曲線(A)和存活率(B)。圖12顯示了與在補加1%胎牛血清的培養基中生長的Sp2/0細胞相比Sp-EEE克隆的生長曲線(A)和存活率(B)。圖13顯示了與在無血清培養基中生長的Sp2/0細胞相比Sp-EEE克隆的生長曲線(A)和存活率(B)。圖14顯示了氨甲蝶呤對Sp-EEE(87-29克隆)細胞的殺傷曲線。圖15顯示了與在有或沒有1mg/mlzeocin的情況下生長的Sp-EEE克隆相比，使用GuavaExpress的流式細胞術結果圖。固定細胞，並透化，然後用綴合了藻紅蛋白的抗Bcl-2抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.)染色。圖16顯示了用於轉染Sp2/0細胞從而獲得665.2B9克隆的pdHL2載體的圖譜，其具有人源化抗體序列以及SV40啟動子和增強子序列。圖17顯示了摻入了Bcl-2基因的DNA質粒的圖語，用於轉染克隆665.2B9。圖18和圖19顯示了Bcl-2轉染克隆665.2B9糾、Bcl-2陰性克隆和未轉染對照的生長語。將健康細胞(〉95。/。存活率)以400,000個/ml的初始細胞密度接種在24-孔板中。每日使用GuavaViaCount試劑和PCA設備計數存活細胞和死細胞。圖20和圖21顯示了Bcl-2轉染克隆665.2B9弁4和Bcl-2陰性克隆於不同MTX濃度的生長譜。將健康細胞(〉95%存活率)以100,000個/ml的初始細胞密度接種在T-培養瓶中。每日使用GuavaViaCount試劑和PCA設備計數存活細胞密度和存活率。圖22顯示了克隆665.2B9#4於漸增的MTX濃度下表達的人Bcl-2水平和克隆#13表達的人Bcl-2水平，該水平通過蛋白質印跡分析來糹企測。圖23和圖24分別顯示了在有或沒有攙入L-穀氨醯胺和葡萄4t的情況下在0.6和1fJvlMTX中培養的克隆665.2B9#4和在0.3MTX中培養的Bel-2-陰性克隆#13的細胞存活率和存活細胞密度的分布型。將健康細胞(>95%存活率)以200,000個/ml的初始細胞密度接種在轉瓶中。在第2天和第4天(箭頭指示)，將含葡萄糖和L-穀氨醯胺的營養補充溶液加入"攙入"培養物中。每日使用GuavaViaCount試劑和PCA設備計數存活細胞和死細胞。圖25顯示了在5天培養當中已適應的Sp/EEE亞克隆在無血清培養基中的存活率。圖26圖示了在5天培養當中無血清Sp/EEE亞克隆的存活細胞密度。發明詳述本文使用的"a"或"an"可指一個或一個以上的項目。本文使用的術語"和"與"或"可用於指合取或析取。即，兩個術語都應被理解為等同於"和/或"，另有說明的除外。本文使用的術語"約，，指加或減10%。即，"約100"指介於90和110之間的數字。本文描述的抗體指全長(即天然的或通過正常免疫球蛋白基因片段重組過程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特異性結合)部分或類似物，如抗體片段。抗體片段是抗體的一部分，例如F(ab)2、F(ab，)2、Fab、Fv、sFv等。抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結合，與結構無關。術語"抗體片段"還包括任何合成的或遺傳工程的蛋白，其通過結合特定抗原形成複合物起類似於抗體的作用。例如，抗體片段包括由可變區組成的分離片段，例如由重鏈和輕鏈的可變區組成的"Fv"片段、其中輕鏈和重鏈可變區通過肽接頭連接的重組單鏈多肽分子("scFv蛋白")以及由模擬高變區的胺基酸殘基組成的最小識別單位(CDR)。本文使用的術語抗體融合蛋白指重組生產的抗原結合分子，其中兩個或多個具有相同或不同特異性的相同或不同scFv或抗體片段相連接。融合蛋白的價數表示融合蛋白對單個抗原或表位具有多少個結合臂或位點；即單價、二價、三價或多價。抗體融合蛋白的多價指其在結合抗原時可利用多種相互作用，因此增加與抗原結合的親合力。特異性表示抗體融合蛋白能夠結合多少種抗原或表位；即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義，天然抗體如IgG是二價的，因為其具有兩個結合臂，但是其是單特異性的，因為其結合一種表位。單特異性多價融合蛋白對一種表位具有不止一個結合位點，但僅結合一種這樣的表位，例如雙抗體具有兩個與同一抗原反應的結合位點。融合蛋白可包含單個抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性組合或多拷貝的相同抗體組分。融合蛋白可另外包含抗體或抗體片段和治療劑。適於這類融合蛋白的治療劑的實例包括免疫調節劑("抗體-免疫調節劑融合蛋白，，)和毒素("抗體-毒素融合蛋白")。一種優選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優選為重組RNA酶。細胞系本發明的各個實施方案涉及改良的組合物，包括宿主細胞系，並涉及在這些細胞系中增強重組蛋白生產的方法。業已建立了組成型表達一種或多種抗凋亡基因並可用編碼目標蛋白或肽的表達構建物轉染的細胞系，其中抗凋亡基因的表達延長了培養物中轉染細胞的存活，並提供了增強的目標蛋白或肽的收率。具體的實施方案涉及Sp2/0骨髓瘤細胞系的衍生物，該衍生物提供了稱為Sp-E26、Sp-EEE和Sp-ESF的新細胞系，它們在分批培養中顯示出增強的存活。Sp-E26組成型地表達HPV-16的E6和E7蛋白。Sp-EEE和Sp-ESF組成型地表達稱為Bcl-2-EEE的Bcl-2突變體。另外，重組蛋白的生產，尤其是重組抗體和抗體片段的生產，可在用目標重組蛋白的表達載體轉染Sp-E26、Sp-EEE或Sp-ESF時得以改善。E6/E7或Bcl-2-EEE蛋白延遲了宿主細胞中的凋亡誘導，允許宿主細胞中增強的重組蛋白生產。還可通過將一種或多種胱天蛋白酶抑制劑(例如胱天蛋白酶1和/或3抑制劑)(BinYang等，NephronExperimentalNephrology2004;96:e39-e51)和/或一種或多種細胞因子I型超家族成員(例如促紅細胞生成素(EPO))加入到細胞的生長培養基中來加強蛋白生產。泛胱天蛋白酶(pan-caspase)抑制劑在這方面特別有效。此外，Sp-EEE細胞系可預適應在無血清或低血清條件下生長和蛋白生產，產生無血清預適應細胞系，例如Sp-ESF。Sp-ESF和相似的細胞系可用一種或多種編碼目標蛋白(例如抗體、抗體片段、雙特異性抗體等)的表達載體轉染。將無血清條件用於轉染在可用於轉染和蛋白生產的哺乳動物細胞系中是獨一無二的，節省了適應無血清生長所需的大量時間。重組蛋白(例如抗體或抗體片段)的生產可通過共表達凋亡抑制劑(例如Bc1-2)在宿主細胞中被顯著增強。具體地說，蛋白生產在骨髓瘤細胞系如Sp2/0中被顯著增強，所述骨髓瘤細胞系用編碼抗體或抗體片段的表達載體穩定轉染，並用編碼凋亡抑制劑如Bcl-2的表達載體共轉染。增加的抗體生產還可由E6/E7基因轉染的宿主細胞獲得。還可通過將一種或多種胱天蛋白酶抑制劑加入細胞的生長培養基中來加強重組蛋白生產。泛胱天蛋白酶抑制劑在這方面特別有效。另夕卜，可通過將EPO或另一種抗凋亡細胞因子補加入細胞培養物的培養基中來增強重組蛋白生產。生理性或程序性細胞死亡稱為凋亡(Kerr等，BrJCancer.,26:239-257,1972),是正確的組織發育和維持所必需的，由在進化中一直保守的固有遺傳程序控制(Ellis等，AnnuRevCellBiol,7,663-698,1991)。因此，當細胞在人工環境如離體Oxv/vo)培養物中生長時，此遺傳天賦導致有限的壽命。因此，這些細胞培養物對用於藥物和工業的蛋白生產以及研究的可用性，取決於維持這些培養物在它們按照凋亡^l4'J死亡之前的延長壽命或周期。已發現了通過區分細胞周期與凋亡作用、獨立地作用於細胞增殖和細胞死亡事件的方法和物質。Bcl-2是一種眾所周知的凋亡胞內調節劑(Vaux等，Nature335,440-2,1988),為原癌基因，已發現其具有與其對細胞周期進入的抑制性影響在遺傳上不同的抗凋亡作用(Huang等，EMBOJ16,4628-38，1997)。Bcl-2的兩種同源物BcI-Xl和Bcl-w也延長細胞存活，但Bcl-2家族的其它成員如Bax和Bak是促凋亡的(Oltvai等，Cell74，609-19,1993;Chittenden等，Nature374,733-6,1995;Farrow等，Nature374，731-3，1995;Kiefer等，Nature374,736-9，1995)。其它抗凋亡基因包括Bd-6和Mcl-l。因此，Bcl-2及其家族的某些成員表現出抗凋亡的保護作用，它們可用於增加培養物中用於生產蛋白的某些宿主細胞壽命，由此提高所產生和分離的蛋白量的方法。抗凋亡Bcl-2家族成員(如Bcl-2、BCl-x。Bcl-w或這些蛋白的突變體)的過表達抑制凋亡，導致細胞密度增加和培養物存活更長。因此，抗凋亡Bcl-2家族基因的轉染通過幹擾細胞周期自身避免了延長細胞培養的必要性，其他人已提出了這一點(同前)。同樣，用Bcl-2基因轉染成纖維細胞導致Bcl-2在這些細胞中過表達，導致拮抗凋亡並增加這些細胞的壽命，伴隨著重組蛋白生產和分離的增加。還已經觀察到在去除細胞因子時，白介素-6(IL-6)-依賴性鼠骨髓瘤細胞死亡，似乎它們經歷了凋亡。還發現這些細胞中的IL-6-受體在延長凋亡方面可由Bcl-2或Bcl-xt調節(Schwarz等，CancerRes55:2262-5，1995)。已有報導，具有3點突變(T69E、S70E和S87E)的突變型Bcl-2表現出顯著高於野生型或單點突變體的抗凋亡活性(Deng等，PNAS(101)153-158,2004)。因此，多個實施方案涉及構建Bcl-2-EEE三重突變體的表達載體，然後使用該表達載體轉染Sp2/0細胞，以建立顯示出壽命和重組蛋白生產改善的Sp-EEE克隆和亞克隆。其它物質，例如致癌性病毒，也可以對抗凋亡，作為其激發細胞無限增殖化的一部分，並最終完成惡性轉化，例如高風險型HPV癌蛋白E6和E7(Finzer等，CancerLett188,15-24，2002)。例如，病毒E6蛋白有效阻斷對紫外線的表皮凋亡反應(Storey,TrendsMolMed8，417-21，2002)。還已經由間接的證據表明，人乳頭瘤病毒可在鱗狀細胞(但不是基底細胞)癌中引起凋亡減弱(Jackson等，BrJCancer87,319-23,2002)。但是，不是所有的乳頭瘤病毒癌蛋白都具有抗凋亡作用。例如，其它研究已報告了牛物種的乳頭瘤病毒E6蛋白使細胞對凋亡敏化(Liu等，Virology295，230-7，2002),這與表明HPV-16E7基因保護星型細胞抗某些刺激物誘導的凋亡的其它研究(Lee等，YonseiMedJ42，471-9，2001)相反。通過使用E6結合肽適體，獲得HPVE6癌蛋白在HPV陽性肺瘤細胞中具有抗凋亡活性的直接實驗證據(Butz等，ProcNatlAcadSciUSA97，6693-7，2000)。但是，其它HPV癌蛋白可具有相反的作用。E2蛋白在沒有其它HPV蛋白的情況下誘導凋亡(Webster等，JBiolChem275,87-94，2000)。已知E6和E7兩種蛋白的持續表達是子宮頸癌細胞的最佳增殖所需要的，這兩種病毒蛋白對細胞存活表現出截然不同的作用(DeFilippis等，JVirol77，1551-63，2003)。歸於HPV-16E6的主要胞內靶是p53。E6與p53和細胞遍在蛋白連接酶形成三重複合物E6AP，導致p53通過蛋白酶體途徑遍在蛋白化和降解以及p53失活。另一方面，HPV-16E7蛋白與肺瘤阻抑蛋白Rb相互作用並^f吏其去穩定化。而且，據報導，參與凋亡和細胞周期途徑的各種其它胞內蛋白的水平受E6和E7轉化調節，這些蛋白例如為Bcl-2、Bcl-xL、p73、MDM2、p21、細胞周期蛋白和cdc、cdk蛋白等。這些蛋白表達的改變將大大地影響細胞的生理特性。本發明人因此假設，以HPV-16E6和E7轉染培養物中的細胞應有效產生遺傳修飾型克隆，這些克隆抗衰老培養條件誘導的凋亡，並因此延長了細胞培養物的壽命。還假定將HPV-16癌蛋白E7或E6中的任一種單獨導入細胞中可能足以產生對衰老培養條件誘導的凋亡抗性改善的遺傳修飾型克隆。當細胞是生產重組蛋白的克隆時，生理特性的改善又會轉變為整體蛋白生產率提高。產生表達病毒性抗凋亡基因的新宿主細胞可產生組成型表達病毒性抗凋亡基因(例如HPV-16E6和E7蛋白)的宿主細胞，例如骨髓瘤宿主細胞。這些宿主細胞可用編碼目標重組蛋白的表達載體轉染，抗凋亡基因的共表達導致重組蛋白的產量顯著增加。宿主細胞基本上可為適於重組蛋白生產、可用病毒性抗凋亡基因穩定轉化的任意宿主細胞。對於許多重組蛋白來說，諸如CHO和COS細胞的宿主細胞是有利的，而對於其它蛋白如抗體來說，諸如骨髓瘤細胞和CHO細胞的宿主細胞是通常的選擇。有用的宿主細胞系的其它實例為VERO和HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、W138、BHK、C0S-7、293、HepG2、3T3、NSO、NS1、RIN和MDCK細胞系。使用的細胞系可得自商業來源，例如C0S-1(例如ATCCCRL1650)、C0S-7(例如ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCCCRL-IO)、P3X3Ag8.653(ATCCCRL-1580)、CHO(例如ATCCCRL1610)和BSC-1(例如ATCCCRL-26)細胞系。可通過導致基因組成型表達或誘導型表達的任意合適方法，即允許將基因穩定整合入宿主細胞染色體中並同時允許基因表達的任意方法，將病毒(例如E6/E78)和/或真核基因導入宿主細胞中。用目標基因穩定轉化宿主細胞的方法在本領域眾所周知。特別有利的方法是^f吏用編碼病毒性抗凋亡基因的逆轉錄病毒載體。適宜的載體包括LSXN載體(Miller等，Biotechniques7,980-90,1989)。但是，可使用本領域已知的任意替代方法，例如電穿孔或細胞融合。有利的是，用於轉染宿主細胞的載體含允許選擇含該載體的細胞的選擇標記。適宜的選擇標記，例如賦予所轉染細胞抗生素抗性的酶，在本領域眾所周知。在轉染後，將細胞保持在含該選擇劑如抗生素的培養基中，並根據所述標記的抗性進行篩選。可使用常規方法通過有限稀釋選擇和克隆細胞。可通過用誘導凋亡的物質如環己醯亞胺(CHX)4兆戰細胞來檢驗病毒抗凋亡基因增加細胞存活率的能力。不表達病毒性抗凋亡基因的細胞傾向於表現出顯著的凋亡發生，而表達所述基因的細胞表現出凋亡活性急劇降低。檢測凋亡的方法在本領域眾所周知，包括例如細胞表面FITC-膜聯蛋白V結合測定、DNA斷裂成梯測定和TUNEL測定。在選擇表達病毒抗凋亡基因的適宜細胞時，可用編碼選定的重組蛋白的表達載體轉染細胞。表達載體可為適於瞬時表達的載體，或者有利地可為含真核複製起點的游離型載體，或者可為允許表達盒穩定整合以及隨後基因擴增的可擴增載體。適宜的載體在本領域眾所周知，包括例如pdHL2載體，該載體特別適於生產抗體和抗體片段。在使用可擴增表達盒時，其有利地含選擇標記，該選擇標記與在逆轉錄病毒載體中使用的選擇標記不同，使得可以選擇轉染細胞。可再一次通過有限稀釋選擇適宜的轉染細胞並進行克隆。在選擇適宜的克隆時，可將細胞置於適宜的培養基中並培養，以生產期望的目標蛋白。所述培養基可包含血清，或優選地可為無血清的。另外，還可以通過將一種或多種胱天蛋白酶抑制劑(例如胱天蛋白酶1或3)加入培養基中來增加細胞壽命和蛋白產量。優選地，胱天蛋白酶抑制劑起抑制胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9和/或胱天蛋白酶12中的一種或多種的作用。有利地，使用透過細胞的胱天蛋白酶抑制劑，泛胱天蛋白酶抑制劑特別有利。適宜的抑制劑如Z-VAD-fmk和Ac-DEVD-cho(SEQIDNO:7)在本領域眾所周知。或者，可進一步轉染細胞系，以表達胱天蛋白酶抑制劑，例如Aven或XIAP，以通過影響凋亡增強其生長特性。就此而言，細胞因子I型超家族的某些成員，如EPO,也可以通過具有抗凋亡作用和細胞保護作用增加細胞存活。上述方法產生的細胞系可用於以基本任意的期望基因轉染。但是，技術人員將認識到，所建立的組成型表達預期蛋白(尤其是重組蛋白)的細胞系隨後可用編碼病毒抗凋亡基因或Bcl-2家族抗凋亡基因的適宜載體轉染。參見以下的實施例2。目標蛋白基本上可為能以可檢測量在宿主細胞中生產的任意蛋白。實例包括傳統的IgG型抗體、Fab'、Fab、F(ab')2或F(ab)2片段、scFv、雙抗體、IgG-scFv或Fab-scFv融合抗體、IgG-或Fab-肽毒素融合蛋白或疫苗[例如包括但不限於甲、乙或C型肝炎；HIV、流感病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭瘤病毒、皰疹病毒、漢坦病毒、伊波拉病毒、輪狀病毒、巨細胞病毒、利什曼原蟲RNA病毒、SARS、瘧疾、結核(分枝桿菌)、炭疽、天花、兔熱病和www.vaccines.org中歹'J出的其它疫苗，它們整體在此引入作為參考]。本文描述的宿主細胞特別適於在如實施例1和2中所述的骨髓瘤細胞系中高效生產抗體和抗體片段，以及生產重組生長因子(例如EPO、G-CSF、GM-CSF、EGF、VEGF、血小板生成素)、激素、白介素(例如IL-1至IL-31)、幹擾素(例^口a、卩、y禾口複合幹才尤素(consensusinterferon)和酶。這些方法可應用於眾多用於生產重組蛋白的細胞系，包括其它骨髓瘤細胞系，例如鼠NSO或大鼠YB2/0;表皮細胞系，例如CHO和HEK293;間充質細胞系，例如成纖維細胞系COS-l或COS-7;和神經元細胞，例如^L網膜細胞，以及神經膠質細胞和神經膠質瘤細胞。在表達凋亡抑制劑的細胞中的重組抗體表達先前的工作已描述了在生產嵌合抗體的重組CHO細胞中共表達Bcl-2(—種天然凋亡抑制劑)的作用。(參見Tey等，Biotechnol.Bioeng.68:31-43(2000))。儘管觀察到細胞培養物壽命增加，但與無Bcl-2表達的等同細胞相比，抗體生產並未增加。但是，本發明人已發現，當骨髓瘤細胞也表達Bcl-2時，該細胞的重組抗體產量顯著增力口。有利地，用編碼抗體或抗體片段的表達盒穩定轉染骨髓瘤細胞系。適宜的表達盒包含一個或多個控制抗體重鏈和輕鏈(就scFv而言為單鏈)表達的啟動子連同如上所述的選擇標記。特別有用的載體是含選擇標記基因的pdHL2，其含有效連接(operativelylinked)至編碼選擇標記酶的DNA序列的啟動子；具有有效連接至編碼目標蛋白的DNA序列的啟動子的轉錄單元；和在選擇標記基因和轉錄單元之間的增強子元件，與沒有該第一個增強子的情況下選擇標記基因和第一個轉錄單元這二者的轉錄相比，該增強子元件刺激選擇標記基因和第一個轉錄單元這二者的轉錄。該載體還包含封閉元件，其由處於第一個增強子和選^^標記基因之間的啟動子組成，該元件潛在地可用於選擇性削弱選擇標記基因的轉錄刺激。可將Vh和Vt序列連接入pdHL2中，pdHL2是含人輕鏈恆定區、重鏈恆定區和可擴增dhfr基因的序列(這些序列每個均由單獨的啟動子控制)的可擴增載體。參見Leung等，TumorTargeting2:184,(1996)和Losman等，Cancer80:2660-2667，(1997)。該載體可通過例如電穿孔轉染入細胞中。可通過將0.1pM或適宜濃度的氨甲蝶呤(MTX)加入到培養基中進行選擇。擴增可用一直到3^M或更高的漸增濃度的MTX以分步方式進行。因此，可使用本領域眾所周知的方法獲得並表徵用表達盒穩定轉染並組成型表達目標抗體的細胞。另參見以下的實施例4。在選擇和克隆後，則可用編碼抗凋亡基因如Bcl-2的表達載體轉染表達抗體的細胞系。例如，使用適宜的方法，例如電穿孔，將含融合至SV40啟動子的Bcl-2基因的載體pZeoSV(Invitrogen，Carlsbad,Calif.)轉染入細胞中，必要時可進行選擇和基因擴增。或者，適宜的宿主細胞可用凋亡抑制劑如突變型Bcl-2基因轉染，然後適應在無血清培養基中生長，之後優選在無血清培養基中用編碼期望的目標蛋白的表達載體進一步轉染。可如上使用所獲細胞系進行抗體生產，並與不表達凋亡抑制劑的細胞中的生產相比較。以下給出了闡述本發明的代表性實例。實施例l描述了將HPV-16E6/E7摻入Sp2/0細胞中產生改良的細胞克隆Sp-E26，其顯示出凋亡降低/延遲的特徵。實施例2描述了一種通過單獨地過表達HPV-16E7元件改良宿主細胞系的方法。實施例3描述了使用Sp-E26作為宿主開發生產重組抗體的轉染體。實施例4描述了對共表達E6/E7元件的產抗體細胞系觀察到的增強的單克隆抗體生產。實施例5描述了改良型Sp2/0細胞系(稱為Sp-EEE)的產生和表徵，該細胞系組成型表達具有3個點突變的突變型Bcl-2(Bcl-2-EEE)，導致壽命提升。實施例6描述了表達Bcl-2的產抗體細胞系的改良生長特性。實施例7描述了對實施例6的Bcl-2表達細胞系觀察到的增強的單克隆抗體生產。實施例8描述了通過在細胞中導入Bcl-2表達改良生產低水平重組蛋白的細胞克隆的方法。實施例9描述了通過在細胞中導入Bcl-2表達改良Sp-E26的方法。實施例10描述了使用Sp-EEE作為宿主開發生產重組抗體的轉染體。實施例11描述了使用補料-分批反應器模式和補料流程優化得率。實施例12描述了能夠在無血清培養基中生長以及轉染的Sp-EEE亞克隆的產生。儘管本文利用以一種或多種編碼本領域已知的抑制劑的基因轉染的細胞系闡述了優選實施方案，但技術人員會認識到，在替代性實施方案中，可在要求保護的方法和組合物的範圍內，在這些基因的編碼和/或非編碼序列中實施各種置換、缺失或插入，只要所編碼蛋白表現出與天然蛋白相同的生理功能(抗凋亡)。在某些實施方案中，所編碼蛋白可表現出與天然(野生型)蛋白80%或以上的序列同一性，更優選85%或以上、更優選90%或以上、更優選95%或以上、更優選98%或以上、更優選99%或以上、最優選99.5%或以上的序列同一性。抗體多種實施方案可涉及由目標轉染細胞系表達的抗體和/或抗體片段。術語"抗體"在本文用於指具有抗原結合區的任意抗體樣分子，並包括抗體片革殳，例如Fab'、Fab、F(ab，)2、單結構域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。製備和使用各種基於抗體的構建物和片段的技術在本領域眾所周知。製備和表徵抗體的方法在本領域也是眾所周知的(參見例^口HarloweandLane,1988，爿加^0<^'^:爿丄a6orafto/jA/"wwa/,ColdSpringHarborLaboratory),所使用的抗體還可以由各種各樣的已知來源經商業渠道獲得。例如，各種各樣的分泌抗體的骨髓瘤細胞系可得自美國典型培養物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)。抗各種疾病靶標(包括但不限於腫瘤相關抗原)的大量抗體已保藏於ATCC，可用於要求保護的方法和組合物。(參見例如美國專利第7,060,802、7,056,509、7,049,060、7,045,132、7,041,803、7,041,802、7,041,293、7,038,018、7，037，498、7,012,133、7,001,598、6,998,468、6，994，976、6,994，852、6,989,241、6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、6,949,244、6,946,129、6，943，020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、8，783，758、6，770，450、6,767,711、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,15、6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,652,852、6,635,482、6,630,144、6,610,833、6，610，294、6,605,441、6,605，279、6,596,852、6,592,868、6，576,745、6，572;856、6，566，076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206、6,441,143、6,432,404、6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,274、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、6,340,459號,每個專利有關分泌抗體的雜交瘤細胞系和所述抗體或其片段的相關靶抗原的ATCC保藏號的內容均在此引入作為參考)。這些僅僅是示例性的，多種其它分泌抗體的雜交瘤是本領域已知的。技術人員會認識到，通過簡單檢索ATCC、PubMed和/或USPTO資料庫中抗選定疾病相關目標靶的抗體，可獲得抗幾乎任意疾病相關抗原的分泌抗體的雜交瘤。可使用本領域眾所周知的標準技術，將所克隆抗體的抗原結合域擴增、切下、連接到表達載體中、轉化入已適應的表達載體中以及用於蛋白生產。所要求保護的方法和/或組合物的某些實施方案可涉及抗體片段。生產抗體片段的示例性方法公開於美國專利第4,036,945號；美國專利第4,331,647號；Nisonoff等，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89:230;Porter,1959，Biochem.J.,73:119;Edelman等，1967，METHODSINENZYMOLOGY,422頁(AcademicPress)以及Coligan等(編輯)，1991，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,CJohnWiley&Sons)。還可以使用其它形成抗體片段的方法，例如分離重鏈以形成單價重鏈片段、進一步切割片段或其它酶解、化學或遺傳技術，只要所述片段結合完整抗體所識別的抗原即可。例如，Fv片段包含結合的Vh和Vt鏈。該結合可為非共價的，如在Inbar等，1972,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659中所述。或者，可變鏈可通過分子間二石危4建連接，或通過化學物質如戊二醛交聯。參見Sandhu,1992，Crit.Rev.Biotech"12:437。優選地，Fv片段包含通過肽接頭連接的Vh和Vt鏈。這些單鏈抗原結合蛋白(sFv)通過構建結構基因而製備，所述結構基因含編碼Vh和Vi結構域的DNA序列，所述Vh和VJ吉構域通過寡核苷酸接頭序列連接。將結構基因插入表達載體中，隨後將表達載體導入宿主細胞中。重組宿主細胞合成其中連接肽橋接兩個V結構域的多肽單鏈。用於生產sFv的方法在本領域眾所周知。參見Whitlow等，1991,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:97;Bird等，1988,Science,242:423;美國專利第4,946,778號;Pack等,1993，Bio/Technology，11:1271,和Sandhu,1992，Crit.Rev.Biotech.，12:437。另一種形式的抗體片段是編碼單個互補決定區(CDR)的肽。CDR肽("最小識別單位，，)可通過構建編碼目標抗體CDR的基因獲得。這些基因例如通過使用聚合,反應由產抗體的細胞的RNA合成可變區而製備。參見Larrick等，1991，Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106;Ritter等(編輯)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION,166-179頁(CambridgeUniversityPress);Birch等，(編輯)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,137-185頁(Wiley-Liss,Inc.)。在分泌抗體的雜交瘤細胞系可公開獲得時，可獲得編碼抗原結合特異性的CDR序列，將其摻入到嵌合或人源化抗體中，並使用。嵌合^傳^7乂源化拔傳嵌合抗體是一種重組蛋白，其中人抗體的可變區已被例如小鼠抗體的可變區(包括小鼠抗體的互補決定區(CDR))替代。嵌合抗體在施用給受試者時表現出降低的免疫原性和增加的穩定性。構建嵌合抗體的方法在本領域眾所周知(例如Leung等，1994,Hybridoma13:469)。可通過將小鼠CDR由小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變鏈轉移到人抗體的對應可變區中，使嵌合單克隆抗體人源化。嵌合單克隆抗體中的小鼠構架區(FR)也用人FR序列替代。為保留人源化單克隆抗體的穩定性和抗原特異性，一個或多個人FR殘基可用小鼠的對應殘基替代。人源化單克隆抗體可用於受試者的治療性治療。還可通過選定的CDR序列修飾增加人源化抗體對耙的親合性(WO0029584Al)。生產人源化單克隆抗體的技術在本領域眾所周知。(參見例如Jones等，1986，Nature,321:522;Riechmann等，Nature,1988,332:323;Verhoeyen等，1988，Science,239:1534;Carter等，1992,Pro"Nat'lAcad.Sci.USA,89:4285;Sandhu,Crit.Rev.Biotech"1992，12:437;Tempest等，1991,Biotechnology9:266;Singer等，J.Immunol.,1993,150:2844)。其它實施方案可涉及非人靈長類抗體。用於在狒狒中產生治療上有用的抗體的通用技術可見於例如Goldenberg等，WO91/11465(1991)以及Losman等，Int.J.Cancer46:310(1990)。乂戎糸使用組合方法或用人免疫球蛋白基因座轉化的轉基因動物生產全人抗體的方法是本領域已知的(例如Mancini等，2004,TVewM/cra&.o/.27:315-28;Conrad和Scheller，2005，Ow^.if/g/z77zrawg/7戸fSc匿".8:117-26;Brekke禾口Loset,2003,C群.O—.屍/zawaco/.3:544-50;這些文獻每個均在此引入作為參考)。預期這些全人抗體表現出甚至比嵌合抗體或人源化抗體更少的副作用，並如基本內源的人抗體一樣在體內起作用。在某些實施方案中，要求保護的方法和步驟可使用通過這些技術產生的人抗體。在一個替代方法中，可使用噬菌體展示技術產生人抗體(例如Dantas-Barbosa等，2005,Mo/,4:126-40,該文獻在此引入作為參考)。人抗體可由正常人或表現出特定病症如癌症的人產生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病個體構建人抗體的優勢在於，循環抗體庫可偏向於抗疾病相關抗原的抗體。在該方法的一個非限制性實例中，Dantas-Barbosa等(2005)由骨肉瘤患者構建了人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫。一般來說，由循環血淋巴細胞獲得總RNA(同前)。由p、y和K鏈抗體庫克隆重組Fab，並插入到噬菌體展示文庫中(同前)。將RNA轉變為cDNA,並使用針對重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特異性引物製備FabcDNA文庫(Marks等，1991,JMo/.艦222:581-97，該文獻在此引入作為參考)。按照Andris-Widhopf等(2000，載於P/zageD&;7/a;;Z^60rato7M10—4。評價了12個隨機選擇的克隆的Pmax，發現介於13-170mg/L之間，平均值為50mg/L。可通過用MTX進行基因擴增進一步增強這些克隆的生產率。該實施例表明，使用Sp-E26作為開發生產重組蛋白的細胞克隆的宿主優於其親代Sp2/0細胞。實施例4.通過穩定表達HPV16E6和E7基因改良產抗體的細胞系607-3u-8細胞最初通過轉染由Sp2/0產生，以產生人源化單克隆抗體。通過基因擴增(用MTX)開發了該克隆，並經亞克隆，以將最大(抗體)生產率增強高達150mg/L，其在去掉(weanedoff)培養基中的血清補加物後降低至約100mg/L。為獲得在無血清條件下的更高抗體生產率，將HPV-16的E6/E7基因導入607-3u-8中，並如下評價E6/E7對抗體生產率的作用。用含HPV-16E6和E7基因表達盒的LXSN逆轉錄病毒載體以10:1的MOI轉導保持在補加10%FBS和3|iiMMTX的HSFM中的607-3u-8細胞。在復甦24小時後，在G418(400|iig/ml)中達10天選擇穩定轉染的細胞。通過有限稀釋(0.5個細胞/孔)將G418-抗性細胞在96孔細胞培養板中亞克隆。獲得稱為607E1C12的存活克隆以進行評價。還選擇了未用E6/E7轉染的607-3u-8的兩個亞克隆，稱為607-3u-8-7G7和607-3u-8-2D10。測定這3個克隆的Pmax，沒有顯著差異(表1)。這些結果提示，將E6/E7基因導入細胞中不改變細胞產抗體的能力。接著，使607E1C12、607-3u-8-7G7和607-3u-8-2D10適應在無血清培養基中生長，並測定這些克隆的生產率。所有細胞在無血清培養基中都生長良好。克隆607E1C12的最終抗體生產率保持在150mg/L，而兩個無E6/E7的克隆顯著下降少。另外，607E1C12在冷凍(用於冷凍保存)和融解循環後的生產率穩定(表1)。表ltableseeoriginaldocumentpage32a通過由終末培養物上清液進行IgG蛋白純化而測定。"~b括號中的數字指示樣本量。e細胞已被冷凍用於冷凍保存。實施例5.組成型表達突變Bcl-2的遺傳改良型Sp2/0細胞系的產生和表徵證據表明,具有3個點突變(T69E、S70E和S87E)的突變體Bcl-2表現出顯著高於野生型或單點突變體的抗凋亡活性(Deng等，PNAS101:153-158,2004)。因此，構建用於該三重突變體(稱為Bcl-2-EEE)的表達載體，並用於轉染Sp2/0細胞，以便增加存活率和生產率，尤其是在生物反應器中。分離克隆，並評價其Bel-2-EEE表達水平、生長和凋亡特性。Bcl-2-EEE的核酸序列如SEQIDNO.3所示；Bcl-2-EEE蛋白的對應胺基酸序列如SEQIDNO.4所示。基於人Bcl-2的胺基酸殘基64-101的編碼序列設計116bp的合成DNA雙鏈體。殘基69、70和87的密碼子全部改變為穀氨酸的密碼子(E)。完整序列格外地富含GC,具有眾多聚G和聚C串(polyCmn)。對幾個密碼子進行保守改變，以打破G和C串，降低整體GC含量。合成了兩種80-聚體寡核苦酸，它們組合在一起覆蓋116bp的序列，在它們的3'末端具有22bp的重疊(參見SEQIDNO.5和6)。使所述寡核苦酸退火，通過用Taq聚合酶進行引物延伸產生雙鏈DNA。使用PCR引物Bcl-2-EEEPCRLeft(TATATGGACCCGGTCGCCAGAGAAG;SEQIDNO:10)和Bcl-2-EEEPCRRight(TTAATCGCCGGCCTGGCGGAGGGTC;SEQIDNO:ll)擴增雙鏈體。然後將126bp的擴增體克隆入pGemTPCR克隆載體中。用Tthl和NgoMI限制性內切核酸酶消化Bcl-2-EEE-pGemT構建物，凝膠分離105bp的片段，並與經Tthl和NgoMI消化的hBcl-2-pucl9載體(ATCC79804)連接，產生hBcl-2(EEE)-puc19。證實了該構建物的序列。用EcoRI由hBcl-2(EEE)-puc19切下948bp的插入片,殳，並與經EcoRI消化並用鹼性磷酸酶處理的pZeoSV2+載體連接。獲得的構建物為hBcl-2(EEE)-pZeoSV2+。然後按照用於Sp2/0細胞的標準方法，用60嗎hBcl-2(EEE)-pZeoSV2+通過電穿孔轉染Sp2/0細胞(5.6x106)。將細胞鋪板入6塊96孔板中，在無選擇壓力的情況下溫育48小時。2天後，向培養基加入訓jig/mlzeocin。將40個孔的細胞擴增至24孔板，通過採用抗hBcl-2和抗(3肌動蛋白的蛋白質印跡來分析。40個當中除5個以外全部顯示出中至高水平的Bcl-2-EEE表達。圖7顯示了4個凝膠之一的結果。先前用野生型Bcl-2轉染的來源於Sp2/0的hMN14細胞系(克隆664.B4)用作陽性對照(+)。如Deng等所證實，Bcl-2-EEE在SDS-PAGE中的遷移稍微慢於野生型Bcl-2。選擇3個強陽性孔(#7、#25和#87)，用於進一步評價和亞克隆。有限稀釋鋪板導致每塊96孔板少於20個陽性孔，表明各個孔中的細胞實際上被克隆的可能性非常高(>99%)。起初，使用抗hBcl-2-PE通過GuavaExpress分析來自3個原始孔的23個亞克隆(圖8)。結果證實，原始孔含混合的細胞克隆。釘孔產生的克隆具有最強的信號，#25孔具有最低的信號。擴增克隆7-12、7-16、87-2和87-10用於進一步的分析。隨後，類似地分析某些初始較慢生長的亞克隆，一個克隆87-29產生的信號比任意其它克隆高20%,擴增該克隆用於進一步的分析。將兩個高表達SP-EEE克隆(87-29和7-16)與未轉染的Sp2/0、Raji和Daudi細胞相對比(圖9)。Sp-EEE克隆表達約為Raji和Daudi細胞的20倍高，已知Raji和Daudi細胞均以估計正常的細胞水平表達Bcl-2。Sp2/0細胞為陰性。這一點由抗Bcl-2免疫印跡進一步得到證實(圖10)。即便用高蛋白負載(50K細胞)和長曝光X-射線膠片以人Bcl-2特異性抗體在Sp2/0細胞中也未檢測到Bcl-2。用識別小鼠、大鼠和人Bcl-2的抗Bcl-2單克隆抗體(C-2，SantaCruzBiotech)進行免疫印跡分析，由未轉染的Sp2/0細胞未檢測到任何Bcl-2，即便用高蛋白負載(100K細胞)和長曝光時間也是如此(圖IOB)。即便在Sp2/0細胞中有任何Bcl-2表達，其表達水平也比克隆87-29中的Bcl-2-EEE低超過2個數量級。[OIOO]比較5個Sp-EEE亞克隆和Sp2/0細胞的生長曲線。3個Sp-EEE亞克隆表現出超越Sp2/0細胞的明顯優勢。這3個克隆(7-12、7-16和87-29)還表達最高水平的Bcl-2隱EEE。由於7-12和7-16來自同一原始孔，並具有幾乎相同的特性(Bcl-2-EEE水平和生長曲線)，所以它們可能源於同一初始克隆。最好的兩個SP-EEE亞克隆7-16和87-29用於進一步的評價。將克隆接種在補加10%、1%或0。/。血清(未斷血清(withoutweaning))的培養基中，監測細胞密度和存活率。在10。/。血清中，87-29生長至高密度，與Sp2/0細胞相比存活增加超過4天(圖11)。在1%血清中，所有細胞都生長至在10%血清中所獲密度的約35-40%，Bcl-2-EEE轉染體具有相似的超越Sp2/0的存活優勢(圖12)。當直接轉移入無血清培養基中時，Sp2/0細胞僅生長至600K細胞/ml，而87-29細胞生長至2倍高的密度(圖13)。在每個血清濃度，87-29細胞都比Sp2/0細胞多存活4-6天。測定87-29的氨甲蝶呤(MTX)敏感性(圖14)。數據提示，0.04pM的最低MTX濃度足以進行MTX抗性克隆的初始選擇。因此，用於Sp2/0細胞的相同選擇和擴增方案可用於SP-EEE細胞。Bcl-2是一種促存活/抗凋亡蛋白。已有幾個小組證明，失去柔性環結構域(FLD)的Bcl-2缺失突變體具有增強的抑制凋亡的能力(Figueroa等,2001,BiotechnologyandBioengineering,73，211-222;Chang等，1997,EMBOJ.,16，968-977)。更近一些，已表明在Bcl-2的FLD中模擬磷酸化的1-3個S/T殘基向穀氨酸的突變，顯著增強其抗凋亡能力(Deng等2004,PNAS，101,153-158)。三重突變體(T69E、S70E和S87E)提供了最顯著的存活增強。在此，使用相似的Bcl-2三重突變構建物(Bcl-2-EEE)穩定轉染Sp2/0細胞。所有前述實驗都表明，Bcl-2-EEE的表達降低了Sp2/0細胞中的凋亡速率。該作用很大程度上是劑量依賴性的，因為具有較高表達水平的克隆比那些具有較低水平的克隆存活得更長。與未轉染的Sp2/0細胞相比,最好的克隆87-29生長至高15-20%的細胞密度，並多存活4-6天。克隆(87-29)中的Bcl-2-EEE水平是Daudi或Raji細胞中的正常水平的約20倍。在未轉染的Sp2/0細胞中未檢測到Bcl-2表達。如在實施例6中所述，用表達野生型Bcl-2用的相似構建物轉染表達hMN-14的Sp2/0細胞，並分離出具有優良生長特性和增強的生產率的克隆。當用MTX進一步擴增該克隆(664.B4)時，Bcl-2水平顯著增加。最後，對擴增的(3MTX)細胞系進行亞克隆，1個克隆(664.B4.1C1)的Bcl-2水平是664.B4的2倍。該特定亞克隆具有優越的生產率和生長特性。87-29中的Bcl-2-EEE水平是所擴增的664.B4.1C1中的Bcl-2水平的約2倍。87-29細胞具有的生長速率與Sp2/0細胞的生長速率相當，可明顯地再繼續生長1天，所達到的最大密度比Sp2/0高15-20%。對表達E6/E7的Sp-E26細胞系觀察到相似的特性。表達Bcl-2-EEE的87-29克隆提供了比親代Sp2/0細胞多4-6天的存活，優於Sp-E26克隆，Sp-E26克隆僅多存活1天。由87-29克隆代表的Sp-EEE細胞系可用作抗凋亡宿主，用於在用含重組蛋白基因的適宜載體轉染時表達該重組蛋白。為了使該細胞系可用，必須在轉染和擴增後以及在延長的培養當中保持其Bcl-2-EEE表達和存活優勢。穩定轉染的Bcl-2-EEE基因不大可能會在隨後的轉染當中失去，因此存活特性應不會減小。MTX擴增甚至有可能通過增加Bcl-2蛋白表達改善生產克隆的存活。實際上，用野生型Bcl-2轉染的hMN-14664.B4細胞系就是這種情況。在擴增和亞克隆後，Bcl-2水平增加幾倍，細胞存活顯著改善。最終的Sp/EEE克隆(#87-29)具有與親代Sp2/0細胞相當的生長速率。但是，與Sp2/0相比，Sp/EEE87-29細胞再繼續生長1天，達到高15-20%的最大密度,表現出多4-6天的存活。此外，Sp/EEE細胞系與Sp2/0細胞相比相當程度地更耐受血清除盡。實施例6.通過穩定表達人Bcl-2基因改善穩定期分批培養物中產抗體細胞的存活#染順贏絲_/^細胞克隆665.2B9最初通過轉染由Sp2/0產生，以生產人源化單克隆抗-CEA抗體(Qu等，未公開的結果)。使用稱為hMN14pdHL2的載體轉染Sp2/0細胞，獲得細胞克隆665.2B9。pdHL2載體首先由Gillies等描述，具有可擴增的鼠dhfr基因，該基因使得可以通過氨曱蝶呤處理進行隨後的選擇和擴增(Gillies等，J.Immunol.Methods125:191(1989))。一般來說，pdHL2載體提供了IgG重鏈和輕鏈基因這二者的表達，所述IgG重鏈和輕鏈基因獨立地受控於兩個金屬硫蛋白啟動子和IgH增強子。hMN14pdHL2載體的圖譜示於圖16。SEQIDNO.1顯示了所述載體的序列；SEQIDNO.2顯示了定義為增強子序列的72bp序列；啟動子序列對應於hMN14pdHL2的核苷酸2908-2979。Sp2/0細胞一^L可通過用線性化pdHL2載體(如在本實例中使用的hMN14pdHL2載體)電穿孔轉染。轉染後48小時可通過將細胞與含0.05-0.1|iMMTX的培養基溫育進行選擇。通過逐步增加MTX濃度至5)LiM實現所插入抗體序列的擴增。用逐步增加至0.3|LiM的MTX對克隆進行基因擴增，此時抗體的最大生產率(Pmax)增加至約100mg/L。為改善細胞生長特性，用含人Bcl-2基因的質粒表達載體(圖17)通過電穿孔轉染665.2B9細胞。使用EcoRI位點由購自ATCC的pB4質粒(pB4，目錄號#79804)切下Bcl-2基因，並使用相同的限制酶插入哺乳動物表達載體pZeoSV(+)的MCS中。因為zeocin抗性基因是所述載體的一部分，所以將轉染的細胞置於含50-300嗎/mLzeocin的培養基中。由含300mg/mlzeocin的培養基中選擇穩定克隆，並通過以0.5個細胞/100|uL/孔的密度鋪板在96孔板中於無zeocin的培養基中亞克隆。此後使用無zeocin的培養基。通過在顯微鏡下目視檢查證實各孔中克隆的形成情況。擴增僅具有1個細胞簇的孔中的細胞。每塊96孔板都產生約30個克隆，由這些克隆隨機選擇約14個克隆用於進一步的研究。通過每日細胞計數以及採用ViaCount試劑和GuavaPCA進行存活率檢查評價這些克隆的生長特徵。由在24孔板中評價的14個克隆(圖18、19)鑑別出1個顯示出改善的生長特徵(較高的細胞密度和延長的細胞存活)的Bcl-2-轉染克隆，稱為665.2B9糾(或克隆弁4)。相比於親代665.2B9克隆，克隆#4生長至更高細胞密度(約1.7倍)，在T-培養瓶中多存活4-6天(圖20、21)，並且由於生長更好，根據ELISA滴定和A蛋白柱純化的測定，克隆#4的P皿增加至約170mg/L。為i正實665.2B9#4的改良生長特性因Bcl-2的轉染而產生，使用GuavaExpress試劑和GuavaPCA設備檢測人Bcl-2蛋白的胞內水平。簡單地講，將置於1.5ml離心管中的4><105個細胞以1500rpm離心5分鐘，用lxPBS清洗3次。小心地吸出上清液。向細胞沉澱加入SantaCruzBiotechnology(SCB),Inc.的固定溶液(10x，60pL)(目錄號弁sc-3622)達15分鐘，在水上溫育。於4。C用4xlmLPBS去除固定溶液，每次離心如所述進行。在渦旋的同時於-20。C滴加透化緩衝液(0.5mL)(SCB目錄號弁sc-3623)，接著在冰上進行15分鐘的溫育。然後離心細胞，並用0.5mLFCM清洗緩沖液(SCB目錄號弁sc-3624)清洗2次。將最終的細胞沉澱重懸浮在100FCM清洗緩沖液中，並用10pL綴合至PE的抗Bcl-2小鼠單克隆抗體(得自SCB)染色Bcl-2胞內蛋白。於室溫在黑暗中進行1小時的溫育。之後用0.5mLFCM清洗緩沖液進行兩次清洗。用0.4mLFCM清洗緩沖液重懸浮最終的細胞沉澱，並用GuavaPC分析細胞。將各個克隆的平均螢光強度值(MFI)與採用綴合PE的非特異性同種型小鼠IgGl染色的對照比較。結果歸納於表2，證實與親代細胞系相比克隆665.2B9#4表達更高水平的Bcl-2蛋白。顯示出與親代665.2B9相似的生長譜的zeocin抗性克隆(#13)對Bcl-2染色是陰性的，證實Bcl-2表達是生長改良所必需的。表2tableseeoriginaldocumentpage38[Q114]採用GuavaExpress分析，發現用MTX擴增克隆665.2B9糾，對應於Bcl-2水平的螢光染色強度升高，提示Bcl-2與dhfr基因共擴增。為比較所擴增細胞的胞內Bcl-2水平，使用抗人Bcl-2抗體對克隆665.2B9#4(Bcl-2陽性)和克隆#13(Bcl-2陰性)的細胞裂解物進行蛋白質印跡分析。密度計評價表明，在1.0^MMTX中生長的克隆665.2B9糾的Bcl-2信號是0.6MTX中的細胞的2倍。克隆#13的裂解物未表現出存在Bcl-2蛋白(圖22)。實施例7.在分批培養條件下克隆665.2B9#4的改良的抗體生產通過監測接近終末期的細胞培養物中的營養物消耗，發現葡萄糖和L-穀氨醯胺是首先被消耗的組分。進行實驗，以確定補加這些限制性營養物是否會改善最終的抗體收率。啟動兩類培養攙入補料分批培養一其中這些限制性組分在它們消耗時補加；和未補料分批培養一無營養物補加。測試在含0.6和1pMMTX的培養基中生長的Bcl-2-陽性克隆665.2B9#4和在0.3pMMTX中生長的Bcl-2-陰性克隆#13。圖23和24顯示了兩種培養類型中的細胞存活率和細胞密度的情況，直至它們達到終末期。蛋白收率以mg/L表示，如在表3中所示。該實驗的結果提示，對於所有培養物來說，營養物攙入均將所生產抗體的總收率提升至約2倍。表3tableseeoriginaldocumentpage39通過A蛋白柱純化測定。兩次純化的平均值。實施例8.將Bcl-2基因導入生產低水平重組蛋白的細胞系中細胞克隆482.2C4A最初通過轉染由Sp2/0產生，以生產IgG(抗-CEA)和兩個scFv(抗-DTPA)形式的雙特異性抗體(Leung等，J.Nuc.Med.41:270P,2000;Hayes等，Proc.Am.Asso.Cancer.Res.43:969,2002),它們每個都共價連接至IgG重鏈的C-末端。對該克隆進行基因擴增，得到約20mg/L的最終生產率。為改善生長特性和最終改善抗體生產率，如實施例6所述用含人Bcl-2基因的質粒表達載體通過電穿孔轉染482.2C4A細胞。3周後在含750嗎/mlZeocin的培養基中選擇轉染體。用25pg/mlCHX處理Zeocin-抗性細月包5小時，以去除凋亡敏感細胞。用新鮮培養基清洗經處理的細胞兩次，以去除CHX，並重懸浮在新鮮生長培養基中。在復甦24小時後，將存活的細胞通過有限稀釋在96孔細胞培養板中克隆(0.5個細胞/孔)。克隆在2周內出現在孔中，根據其抗體生產情況、對CHX誘導的凋亡的抗性以及生長譜進行篩選。選擇那些在所有方面都表現得比親代482.2C4A好的克隆，並進一步表徵。與親代482.2C4A細胞相比，預期最好的表現者在逆境條件下生長時更強壯，抗衰老培養條件誘導的凋亡，具有更高的最大抗體生產率(約150%或更好)。實施例9.將Bcl-2基因導入Sp-E26中進一步改善細胞生長特性如在實施例5中所述用含人Bcl-2-EEE基因的質粒表達載體通過電穿孔轉染Sp-E26細胞。3周後在含500嗎/mlZeocin的培養基中選擇轉染體。用25pg/mlCHX處理Zeocin抗性細胞5小時，以去除凋亡敏感細胞。用新鮮培養基清洗經處理的細胞兩次，以去除CHX,並懸浮在新鮮培養基中。在復甦24小時後，通過有限稀釋將存活細胞在96孔細胞培養板中克隆(0.5個細胞/孔)。克隆在2周內出現在孔中，根據其對CHX誘導的凋亡的抗性以及生長譜進行篩選。選擇那些在所有方面都表現得比親代Sp-E26以及Sp-EEE好的克隆，並進一步表徵。與親代Sp-E26和Sp/EEE細胞相比，預期含HPV-16E6/E7和Bcl-2-EEE的最佳表現者在逆境條件下生長時更強壯，抗衰老培養條件誘導的凋亡；因此，其是用於重組蛋白生產的較好宿主細胞。實施例10.Sp-EEE細胞系的改善的重組蛋白生產在開發用於生產重組蛋白的存活增強的細胞系時，有兩條途徑可以採納。如在實施例6中所述，一個方法已完成得相當成功，該方法包括用促凋亡基因如Bcl-2穩定轉染已有的生產細胞系。但是，該方法需要額外的轉染、選擇和克隆步驟，由此將細胞系開發過程延長至少兩個月和可能長得多的時間。此外，篩選"最佳，，克隆是相當複雜的，因為需要為每個克隆確定許多參數，包括生長/存活、Bcl-2表達水平和生產率。因此，僅可評價少量克隆。具有最高生產率的克隆很有可能不具有優良的存活率，反之亦然。本文使用的一種替代的策略是開發具有優良的生長和存活特性的親代細胞系，該細胞系隨後用生產目標蛋白用的表達載體轉染。相比於Sp2/0細胞，Sp-EEE細胞再繼續生長1天，達到的最大密度高15-20%，在培養物中多存活4-6天。細胞在隨後用生產重組蛋白用的基因轉染時保持其增強的生長和存活特性，所述重組蛋白例如為IgG、抗體片段和融合蛋白、生長因子(例如G-CSF、GM-CFS、EPO、EGF、VEGF)、細胞因子(例如白介素家族成員(IL-1-IL-31)或幹擾素家族成員(例如a、(3或y幹擾素))、寡核苷酸、肽、激素、酶或疫苗(例如曱、乙或C型肝炎，以及上述的其它疫苗)。使用含一種或多種重組蛋白(例如IgG)表達盒的DNA載體(例如pdHL2)通過標準方法如電穿孔轉染Sp-EEE細胞。將轉染體鋪板在96孔板中，通過既有技術如ELISA或Biacore分析克隆的蛋白生產情況。在幾個月內使生產性克隆經受培養基中增加濃度的MTX，以擴增基因拷貝數。因為表達Bcl-2-EEE的克隆與在Bcl-2陰性Sp2/0細胞中產生的克隆相比生長至約高20%的細胞密度，並多存活至少4天，所以前者在標準培養瓶或轉瓶培養中將多產生至少20%的重組蛋白。在懸浮、灌注或補料-分批生物反應器培養物中實現甚至更大的增加。實施例11.在生物反應器中Bcl-2轉染克隆665,B4.1C1的改善的抗體生產將實施例6的665.2B9#4和親代克隆665.2B9兩者在無血清培養基中斷血清。通過在T-培養瓶中連續傳代培養幾個月使細胞適應含3(_iMMTX的雜交瘤無血清培養基(HSFM)(ImmunomedicsPN10070)的定製配製物。經適應的細胞由T-培養瓶放大至轉瓶，用於建庫。使用由45%條件培養基(在指數生長期的培養物離心後作為上清液收集的培養基)、10%DMSO和45%HSFM組成的無FBS的冷凍保護溶液，在各l-mL的小瓶中為每個細胞系建立具有lxl(f個活細胞的主細胞庫(MCB)。MCB細胞系分別稱為665.2B9.1E4(無Bcl-2基因)和6M.B4.1C1(有BclJ基因)。在分批培養條件下比較這兩個克隆的生長特性和抗體產量。使用以上由MCN擴增的細胞在3-L實驗室規;漠的生物反應器中進行實驗。3-L生物反應器系統是按比例縮小的2500-LcGMP生物反應器系統的模型。因此，評價結果將支持這些細胞系用於大規模商品化生產的適合性。使用與在建立MCB中所用相同的生長HSFM(ImmunomedicsPN10070)維持細胞系，並製備接種物。在3-L補料-分批生物反應器工藝中使用基礎HSFM(—種基於生長HSFM具有定製改良的定製配製物(ImmunomedicsPN10194))。兩種培養基均含胰島素和轉鐵蛋白作為僅有的微量蛋白。將額外的0.1。/。PluronicF68摻入到配製物中，以保護細胞免遭攪拌和通氣引起的剪切。該培養基還含3jiMMTX。連續補料溶液和脈衝補料溶液的具體特性示於以下的表4和5:表4tableseeoriginaldocumentpage43表5tableseeoriginaldocumentpage43在具有2L工作體積的3LBellco旋動瓶(spinner-flask)生物反應器系統(Bellcoglasses,Vineland,N丄)中進行補料-分批實驗。監測生物反應器的溫度、pH和溶解氧(DO)，並通過單迴路控制器控制。通過加熱毯將反應器溫度控制於37°C。通過加入C02或6%Na2C03將培養物pH控制於7.3。通過圓柱形燒結噴頭以10ml/分鐘進行通氣。通過將02間歇噴入培養基中將DO控制在40。/。空氣飽和度以上。在整個培養過程中使用50約60rpm的恆定攪拌速率。融解MCB的冷凍小瓶，並在T-培養瓶中復甦約1-2周。然後將細胞由T-培養瓶擴增至轉瓶，然後接種入生物反應器中。細胞在5%C02氣氛中於37。C培養，並在整個擴增過程中保持在指數生長期。在接種前，經泵將1.2L基礎HSFM無菌轉移入生物反應器中。以空氣飽和培養基，以校準溶解氧(DO)探頭。另取培養基樣品，以校準pH探頭。一校準好pH探頭和DO探頭，就將兩個控制器設定於AUTO模式。一旦系統達到pH(7.3)和溫度(37。C)設定點，就將計算量的接種物由轉瓶經泵轉移入生物反應器中。接種後的存活細胞密度(VCD)約為2xlS個存活細胞/ml。補料策略如下。在培養過程中，將濃縮的營養物溶液補料入生物反應器中，給細胞提供必需的和非過量的營養物。濃縮的營養物溶液經連續補料和脈衝補料遞送至培養基。使用蠕動泵(Watson-Marlow101U/R)將連續補料溶液經泵連續轉移入反應器中。脈沖補料溶液一天一次脈衝補料入培養物中。開發了兩種補料-分批補料策略，並應用於兩種細胞系。工藝#1在培養過程中不補料重組胰島素。工藝#2基於工藝#1設計，具有改良的亞油酸和脂質補料策略和額外的胰島素補料。下表歸納了用於兩種細胞系的兩種工藝的補料。tableseeoriginaldocumentpage45表7用於細胞系665.2B9.1E4的工藝#2連續補料連續補料速率(ml/天)天數預期的存活細胞葡萄糖和ImmuC2ImmuC5密度(糹田胞/mL)穀氨醯胺第2天0.40.7E66000第3天上午1.0~1.7E60600第3天下午1.01~2.5E60900第4天上午2.51~3.5E60900第4天下午2.51~4.5E601500第5天上午4.51~6.5E60090第5天下午4.517.5E600120第6天7.51~12E600120第7天如果〈13E600120如果〉13.1E600150第8天如果〈10E60090如果為10.1~13E600120如果〉13.1E600150脈衝補料脈衝補料(mL)天數TCSoyPlusLA/CD脂質TECImmuBME/胰島素(120g/L)(1.5mg/ml)(500X)溶液VitaminEDTA(4mg/ml)480048246442200005665ui^tt,1456700第第第第第第表8tableseeoriginaldocumentpage47表9tableseeoriginaldocumentpage48在培養過程中，定時取生物反應器樣品進行離線分析。在用0.4%錐蟲藍染料染色後，使用血細胞計數器通過顯微鏡計數檢測活細胞密度(VCD)和細胞存活率。使用NovaBioprofile200檢測葡萄糖、乳糖、穀氨醯胺和氨濃度。使用A蛋白親和層析柱(AppliedBiosystems,P/N2-1001-00)通過HPLC測定抗體濃度。通過將所產生的累積抗體除以培養物中總存活細胞的時間積分計算單位抗體生產率一-i,其中fKCDFi^通過下述梯形法則逼近2藉助於工藝#1，665.2B9.1E4細胞生長，在第6天時獲得lxl7個存活細胞/ml的最大VCD和86。/。的存活率。在6天後，VCD和V。/。快速下降，在第8天收集培養物。工藝#2幫助培養物達到1.2x107個存活細胞/ml的更高VCD,並維持多1天。與665.2B9.1E4細胞相比，665.B4.1C1細胞在兩種工藝中均表現出好得多的生長。在工藝#1中，其VCD在第7天時達到2xl07個存活細胞/ml和97%存活率。培養物在其開始衰敗前還將此VCD和V。/。多保持2天。在第11天收集培養物。在工藝#2中，665.B4.1C1細月包顯示出與工藝#1相似的生長譜。更具體地il,細胞達到2.3x107個存活細胞/ml的最高VCD,存活率稍微緩慢地下降，在第11天進行收集。此觀察結果與665.2B9.1E4細胞系稍微不同，665,2B9,1E4細胞系在工藝#2中表現出生長優勢。比較兩種細胞系在工藝#1和#2中的抗體收率。665.2B9.1E4細胞在工藝#1中的最終收率是0.42g/L，在工藝#2中的最終收率是0.55g/L。相比之下，665.B4.1C1細胞在兩種工藝中都得到更高的最終收率1.5g/L。計算每日的單位抗體生產率(基於每個細胞)，對於兩種工藝，在整個培養過程中665.2B9.1E4細胞都具有約15pg/細胞/天的平均每日Q[MAb]。在工藝#2中以最高VCD再生長1天產生更高的最終抗體濃度。665.B4.1C1細胞在兩種工藝中都顯示出相似的每日單位抗體生產率分布型，工藝#1獲得稍高一些的生產率。每日Q[M,保持在約20-25pg/細胞/天之間，直至第9天。此後，生產率下降。與665.2B9.1E4細胞系的15pg/細胞/天相比，665.B4.1C1細胞系表現出約25pg/細胞/天的更高單位抗體生產率。組合其較好的生長，與665.2B9.1E4細胞系達到的0.55g/L相比，665.B4.1C1細胞系使最終抗體收率增至3倍，達1.5g/L。這些結果證實了將Bcl-2基因摻入宿主細胞系中的利益在模擬重組蛋白(在本實例中為臨床應用的抗體)的大規模商品化製備的生物反應器中增強其在無血清培養基中的生長和抗體收率。實施例12.Sp/ESF無血清預適應細胞系的開發以下概述了用於細胞轉化和蛋白生產的標準方法。將Sp2/0細胞或Sp2/0衍生細胞系保持在10%FBS中，通過用含目標基因的表達載體經電穿孔轉染。在將轉染細胞系保持在補加10。/。FBS的培養基中的同時，嘗試通過逐步增加培養基中的氨曱蝶呤(MTX)來擴增表達。該擴增方法似乎僅偶爾起作用，通常採用具有較低初始生產率的細胞系，一般需要4-8個月。一完成MTX擴增，就在3-6個月的時間段內使克隆逐漸適應在無血清培養基中生長，這通常導致生產率損失達50%。因為Sp/EEE細胞系表現出增強的生長和存活特性以及對血清除盡的優良耐受，所以決定研究開發預適應在無血清培養基中生長的Sp/EEE細胞系和使用該細胞系進行轉染、克隆和擴增的可行性。以下描述了Sp/ESF(Sp/EEE無血清)細胞系的開發。通過用C-AD2-Fab-h679-pdHL2表達載體轉染，證實了生產克隆蛋白如抗體或片段的可行性。這>在無羞，培#差尹_^長和亞乂^在2個月的時間段內使Sp/EEE細胞適應在無血清培養基(SFM)中生長。在嘗試確定於無FBS的SFM中轉染是否可行時，將已適應無血清的Sp/EEE細胞以有限稀釋鋪板，以確定它們是否能由低密度復甦。將細胞以5個細胞/孔的濃度鋪板在96孔板的第一行中，並順著板以2倍稀釋。由有限稀釋產生總共7個克隆。這些結果表明，細胞在轉染必需的條件下可存活。使用這7個亞克隆中的4個進行生長曲線實驗，以選擇具有最有利的生長特性的克隆。將這4個克隆(#1、3、4和5)以及親代克隆以3xlS個細胞/ml的密度分傳到T25培養瓶的6ml培養基中。監測細胞存活率(圖25)和密度(圖26),直至達到0存活率。在所述亞克隆中，#3比任意其它亞克隆或親代細胞系都多存活24小時。另外，亞克隆#3和#1達到比其它克隆高的最大細胞密度(3.2-3.3xle個/mL，圖26)。這提示亞克隆#3可能更適於經歷成功的轉染。因此，給予亞克隆約新名稱Sp/ESF,用於隨後的轉染。^M7WZ^脊襲&/，勿應基於以上數據，按照用於Sp2/0細胞的標準方法，用30嗎的h679-AD2-pdHL2通過電穿孔轉染Sp/ESF細胞(亞克隆#3)。在48小時後，用0.1|iMMTX選擇細胞。作為對照，還在相同條件下用h679-AD2-pdHL2通過電穿孔轉染在10%FBS中的Sp/EEE細胞對照。在10天後，準備平板，以便使用BSA-IMP-260包被的平板經ELISA進行篩選。對於兩個轉染，400個孔中約130個含陽性克隆。將來自具有40個最高OD讀數的孔的陽性Sp/ESF細胞轉移至24-孔板，並將MTX增加至0.2pMMTX。在24-孔板中的細胞達到終末期後，通過使用HSG傳感晶片的BIACORE分析進行進一步的篩選。所篩選的克隆中有4個克隆的生產率〉50mg/L。最高生產克隆(h679-AD2-SF弁T6)的初始生產率為82mg/L。這些初始生產率結果非常類似於由先前使用在10%FBS中的Sp/EEE細胞的該構建物轉染獲得的那些結果。放大選擇h679-AD2-SF#T6克隆用於MTX放大(amplification)。在2周後，將MTX濃度由0.2pM增加至0.4^M。在增加僅2倍MTX後就已經可以觀察到一些生產率的放大。表100.1nMMTX82mg/L0.2|uMMTX93mg/L0.4nMMTX103mg/L結論以上給出的Sp/ESF的數據表明，轉染、通過有限稀釋克隆和MTX力欠大全部可在無血清條件下在不足1個月內完成。這由h679-Fab-AD2-pdHL2表達載體的轉染得到證實，產生非常高的初始生產率82mg/L,其可在兩周內擴大至103mg/L。預期較長時間的MTX接觸可進一步放大。最佳克隆(T6)的初始生產率為82mg/L，超過了來自在10%FBS中進行的親代Sp/EEE細胞系最初轉染的最佳克隆h679-AD2-pdHL2(5D8)的初始生產率，後者的初始生產率為約50mg/L。還業已用EPO-DDD2-pdHL2轉染Sp/ESF細胞，用於生產促紅細胞生成素。表11比較了Sp/ESF的關鍵參數和現有PER.C6細胞系(Jones等,載於Biotechnol.Prog.2003,19:163-168)的那些參數，如表11所示，Sp/ESP在許多類別當中都優於PER,C6。表lltableseeoriginaldocumentpage53按照本文公開內容，可製備和執行本文公開並要求保護的所有組合物和/或方法和或裝置，而無需過度不當實驗。儘管已就優選實施方案描述了本發明的組合物和方法，但對本領域技術人員顯而易見的是，可對所述組合物和/或方法和/或裝置以及在本文描述的步驟或步驟次序中應用各種變化，而不偏離本發明的概念、精神和範圍。更具體地說，顯然，化學和生理均相關的某些物質可替代本文描述的物質，而且會達到相同或相似的結果。對本領域技術人員都是顯而易見的所有這些相似的替代和修改，被認為屬於由隨附權利要求定義的本發明的精神、範圍和概念。權利要求1.哺乳動物細胞系，所述細胞系已用凋亡抑制劑轉染，並適應在無血清培養基中生長，所述細胞系可在無血清條件下用一種或多種表達載體轉染。2.權利要求1的細胞系，其中所述凋亡抑制劑包含編碼具有T69E、S70E和S87E突變的Bcl-2的基因。3.權利要求1的細胞系，其中所述表達載體編碼抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、多價抗體或其片段。4.權利要求1的細胞系，其中所述用凋亡抑制劑轉染的細胞系表現出的生長所達到的密度，等於或大於未轉染細胞系表現出的密度。5.權利要求4的細胞系，其中所述用凋亡抑制劑轉染的細胞系表現出的生長所達到的密度，比未轉染細胞系表現出的密度大至少10%。6.權利要求4的細胞系，其中所述用凋亡抑制劑轉染的細胞系表現出的生長所達到的密度，比未轉染細胞系表現出的密度大至少20%。7.權利要求1的細胞系，其中用凋亡抑制劑轉染的細胞系的蛋白產量大於親本細胞系的蛋白產量。8.權利要求7的細胞系，其中用凋亡抑制劑轉染的細胞系的蛋白產量是用親本細胞系觀察到的蛋白產量的2倍。9.權利要求1的細胞系，所述細胞系進一步用一種或多種表達載體轉染。10.權利要求9的細胞系，其中所述一種或多種表達載體是染色體整合型的。11.權利要求1的細胞系，其中所述細胞系是選自Sp2/0、Sp2/0衍生物、NSO或YB2/0的骨髓瘤細胞系。12.權利要求1的細胞系，其中所述細胞系選自CHO、HEK293、COS-l、COS-7、HepG2、BHK21、P3X3Ag8.653和BSC-1。13.權利要求1的細胞系，其中所述凋亡抑制劑選自E6、E7、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-EEE、Bhrfl、KS-Bcl-2、E1B-19K、Bcl-6和Mcl-l。14.一種蛋白，所述蛋白由權利要求9的細胞系生產。15.權利要求14的蛋白，其中所述蛋白是抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、多價抗體或其片段。16.權利要求14的蛋白，其中所述蛋白是生長因子、激素、白介素、幹擾素或酶。17.權利要求16的蛋白，其中所述蛋白選自EPO、G-CSF、GM-CSF、EGF、VEGF、血小板生成素、IL-1至IL-31、幹擾素-a、幹擾素-(3和幹擾素-Y。18.蛋白生產方法，所述方法包括a)獲得用凋亡抑制劑轉染的細胞系，所述細胞系適應在無血清培養基中生長；b)在無血清條件下用一種或多種表達載體轉染所述細胞系；和c)通過在無血清培養基中培養所述細胞系，由所述一種或多種表達載體生產一種或多種蛋白。19.權利要求18的方法，其中所述凋亡抑制劑包含編碼具有T69E、S70E和S87E突變的Bcl-2的基因。20.權利要求18的方法，其中所述表達載體編碼抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、多價抗體或其片段。21.權利要求18的方法，其中所述用凋亡抑制劑轉染的細胞系表現出的生長所達到的密度，等於或大於未轉染細胞系表現出的密度。22.權利要求21的方法，其中所述用凋亡抑制劑轉染的細胞系表現出的生長所達到的密度，比未轉染細胞系表現出的密度大至少10%。23.權利要求22的方法，其中所述用凋亡抑制劑轉染的細胞系表現出的生長所達到的密度，比未轉染細胞系表現出的密度大至少20%。24.權利要求18的方法，其中用凋亡抑制劑轉染的細胞系的蛋白產量大於親本細胞系的蛋白產量。25.權利要求18的方法，其中所述細胞系是骨髓瘤細胞系。26.權利要求25的方法，其中所述骨髓瘤細胞系是Sp2/0或其衍生物、鼠NSO或大鼠YB2/0細胞系。27.權利要求18的方法，其中所述細胞系選自CHO、HEK293、COS-l、COS畫7、HepG2、BHK21、P3X3Ag8.653和BSC-1。28.權利要求18的方法，其中所述凋亡抑制劑選自E6、E7、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-EEE、Bhrfl、KS-Bcl畫2、E1B-19K、Bcl-6和Mcl-l。29.權利要求18的方法，所述方法還包括在含至少一種胱天蛋白酶抑制劑的培養基中培養所述細胞系。30.權利要求29的方法，其中所述胱天蛋白酶抑制劑選自胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-12和泛胱天蛋白酶抑制劑。31.權利要求18的方法，所述方法還包括在含促紅細胞生成素的培養基中培養所述細胞系。32.權利要求30的方法，其中所述胱天蛋白酶抑制劑選自Z陽VAD-fmk、Ac-DEVD-cho(SEQIDNO:7)、Aven和XIAP。33.權利要求18的方法，所述方法導致細胞培養物的壽命增加至少4天。34.權利要求18的方法，所述方法導致細胞培養物的壽命增加至少6天。全文摘要公開了用於增加細胞培養物的壽命並允許增加蛋白產量的組合物和方法，所述蛋白優選為重組蛋白，例如為抗體、肽、酶、生長因子、白介素、幹擾素、激素和疫苗。用凋亡抑制性基因或載體(例如三重突變型Bcl-2基因)轉染的細胞可在培養物中存活更長時間，導致蛋白生物合成的狀態延長和收率擴大。這類轉染的細胞表現出的最大細胞密度等於或超過親代細胞系達到的最大密度。還可使轉染的細胞預適應在無血清培養基中的生長，大大降低了在無血清培養基中獲得蛋白生產所需要的時間。在某些方法中，經預適應的細胞可在無血清條件下轉化後用於蛋白生產。該方法優選涉及真核細胞，更優選涉及哺乳動物細胞。文檔編號C12N5/00GK101273121SQ200680035226公開日2008年9月24日申請日期2006年7月14日優先權日2005年7月25日發明者C·H·張,D·M·戈登伯格,E·A·羅西,J·-D·楊,Z·屈,黛安·諾德斯特龍申請人:免疫醫療公司