含有自由羥基(oh)或伯胺或仲胺官能團的化合物的磺化方法
2023-10-30 09:08:22
專利名稱：含有自由羥基(oh)或伯胺或仲胺官能團的化合物的磺化方法
技術領域：
本發明涉及一種在非降解的條件下可重現地製備磺化化合物的方法，所述方法適用於製備對分子構成有嚴格要求的化合物，例如在治療藥劑中。
本發明的方法可用於所有包含自由羥基(OH)或任選取代的伯胺或仲胺的單體、低聚和聚合化合物。本發明更具體地涉及一種用於對聚合物進行官能化的O和N磺化方法。
在現有技術中報導的磺化化合物的製備方法中，通常在O或N磺化期間會引起聚合物鏈的斷裂，並由此形成潛在的有毒反應殘基。本發明的方法的目的是通過在特定條件下控制磺酸根基團的加入來精確地避免這種缺點，從而不會改變最初聚合物(例如低聚糖)的結構完整性。
具有抗凝性能的官能化聚合物在現有技術中是已知，並且它們是通過在葡聚糖(D)鏈上取代有羧甲基(CM)、甲基-苄基醯胺(B)和磺化甲基-苄基醯胺(S)基團獲得的一系列衍生物，縮寫為CMDBS。這些聚合物的製備方法具體描述在法國專利公布2 461 724以及美國專利公布4,740,594中。這兩個專利都未提供最終聚合物結構的精確分析，並且這兩種方法都不能提供證據證明最終產物是均一的。這兩個專利中所述的磺化反應的實驗條件促使碸與糖苷殘基的自由OH基結合，並且所給的分析不能清楚地證實磺化苄胺基團的存在。
CMDBS家族的其它成員(「肝素結合生長因子」，HBGF)，在美國專利公布5,693,625中被描述為結瘢劑。在其它的文獻中還描述了HBFGPP的激發肌肉組織(法國專利2 718 024)、神經組織(法國專利2718 026)和消化道組織(法國專利2 718 023)中的損害的修復和再生的性能及其消炎性能(法國專利2 718 025)。這些專利建立了一系列篩選可生物相容的聚合物的功能標準，其中包括如下四種功能特性-保護肝素結合生長因子(HBGF)(如成纖維細胞生長因子，如FGF12)或者轉化因子(如抗蛋白水解降解的TGF-β)，以及在細胞培養時在一系列試驗中強化其生物活性。
-呈現低於10國際單位/mg的抗凝活性。
-在生理條件下抑制白細胞彈性蛋白酶的活性。
-在生理條件下抑制纖維蛋白溶酶的活性。
法國專利申請98 09309報導了一類呈現HBGFPP性能的聚合物(命名為「再生劑」，RGTA)的結構，並且描述了其製備方法和性能。這些RGTA呈現抗纖維變性效果，特別是能夠改善皮膚傷痕癒合的質量；呈現抗氧化劑效果，特別是用於治療自由基的有害影響(電離輻射之後或者在局部缺血引起的氧化應激期間)；以及呈現調節組織內環境穩定性特別是骨質內環境穩定性的性能。這些性能是對前述HBGFPP特性的補充。
法國專利98 09309中所述的聚合物如下式所示AaXxYy(I)其中A是單體；X代表RCOOR′基團；Y代表A上結合的O-或N-磺化基團並且並且對應於下式之一ROSO3R′或RNSO3R′；這些R基團是任選支化和/或不飽和並且可以含有一個或多個芳環的脂族烴鏈，所述芳環不包括不包括苄胺和磺化苄胺基團；R′代表氫原子或陽離子；a代表單體的數量；x代表A單體被X基團取代的水平或程度；y代表A單體被Y基團取代的水平或程度。
在法國專利98 09309中所述的聚合物中，我們可以引證葡聚糖衍生物如CMDS。CMDS型的聚合物也被描述為抗凝劑(Maiga等人，Carbohydrate Polymers，1997，32，89-93)。
在現有技術的所有這些實例中，所述的這些合成方法都不符合再現性標準，難以確保獲得保持分子完整性和沒有汙染物的產物。事實上，儘管在現有技術中描述了很多羧基取代的方法，並且採用這些方法可以控制取代以確保足夠的再現性，但是磺化方法的控制較為困難。
所述磺化方法是在非常低的pH值下進行的，它不能保持聚合物鏈的完整性，特別是當該鏈由天然糖構成時。而且，這些磺化條件導致脫羧作用，這是非常難控制的。
因此，現有技術中的許多研究描述了對Aa型多糖進行硫酸化的方法。因此，例如，葡聚糖硫酸酯(或O-磺酸酯)(DS)、羧甲基葡聚糖硫酸酯(CM-D-S)(或O-磺酸酯)和其它硫酸化(或O-磺化)低聚糖(如木聚糖或澱粉)是通過美國專利4,814,437中所述類型的方法硫酸化(或O-磺化)的。在這些方法中，許多專家提出了使用強酸作為磺化劑磺化多糖方法。例如，美國專利4,740,594和4,755,379、和法國專利2 772 382描述了用二氯甲烷(CH2Cl2)作為溶劑用氯磺酸處理來製備CM-D-S和DM-D-B-S型的分子。在較早的研究中對這種方法已經做了廣泛的描述，這是由於氯磺酸被用於用吡啶作為鹼性溶劑的DS合成方法(Ricketts，Biochem J，51，210-133，1952)。在有甲醯胺的情況下硫酸和磺酸也用於在低溫下製備DS，如美國專利3,498,972和3,141,014所述。已知這些強酸反應條件會使得產物部分降解，即使在有鹼性溶劑的情況下或者低溫下。在為聚合物產物的情況下它們導致大分子鏈的明顯斷裂，並且使得待磺化的分子中所含的某些官能團部分水解。就這些強酸性條件而言已提出了許多改進，其中包括使用更好的緩衝介質或低酸性介質。因此，與使用已經提出的硫酸和磺酸相比，使用三氧化硫(SO3)絡合物作為磺化劑降低了磺化反應的苛刻度(Archives of Biochemistry and Biophysics，95，36-41，1961；Tetrahedron Letters，29，7，803-806，1988；J.Chem.Soc.Perkin trans.1,157,1995)。SO3胺型的許多絡合物已能商購獲得，例如SO3-ME3N(三甲胺)、SO3-Et3N(三乙胺)、SO3-吡啶和SO3-哌啶。這些試劑用於例如DMF、甲醯胺和DMSO等溶劑的無水介質中。儘管這些方法已用於製備硫酸化多糖，特別是用於硫酸化帶有酯、醚或醯胺官能團的葡聚糖衍生物，但是它們由於引起如下問題而存在嚴重缺陷-這些聚合物的大分子鏈隨機斷裂，儘管比磺酸磺化的斷裂比例低；-上述聚合物上已有的官能團部分水解；和-通過形成胺產生汙染製品的副產物，活體接種實驗顯示這些副產物有毒(Brain Res，16，208-2，473-478，1981)。
為了儘可能去除這些毒性剩餘物，已對這些技術進行了更進一步的改進，並且針對吡啶提出了美國專利4,814,437中所述的方法。事實上，該方法中所用的SO3-胺與大多數多糖的還原端的醛基反應，尤其在葡聚糖中，並且由此形成的鍵是共價的，因此非常牢固。
通過使用例如SO3-DMF和SO3-FA的SO3-胺型絡合物克服了使用SO3-胺絡合物的缺陷。例如，通過使用甲醯胺作為溶劑，使用SO3與甲醯胺的絡合物(SO3-FA)對葡聚糖進行O-磺化製得DS鹽，更具體地說是鈉鹽，如美國專利4,855,416中所述用。該方法包括原位形成SO3-FA絡合物，然後將其與葡聚糖反應。SO3-FA絡合物的強反應性導致反應介質的強酸性，儘管使用惰性環境(N2)和無水溶劑。這也導致了大分子鏈的降解。
另一種廣泛使用的非活化絡合物是SO3-DMF。事實上在法國專利2 772 382中提出了CM-D-S和CM-D-B-S型的硫酸化多糖的合成。然而，SO3-DMF絡合物，與SO3-FA絡合物類似，使得反應介質為強酸性，這樣也導致了大分子鏈的斷裂和不穩定的水解基團水解，導致對合成和最終產物失去控制。因此在製備高分子量多陰離子聚合物(不希望以隨機、非控制的方式斷裂)的情況下，這種方法沒有其它方法好。
因此希望改進法國專利97 15702中所述的製備CMDBS和CMDS的合成方法。根據法國專利97 15702，這種改進一方面能夠製得分子量更均一的葡聚糖衍生物，另一方面能夠控制取代比例，由此確保這些結構更均一和更加確定。然而，同現有技術類似，法國專利97 15702中所述的方法是基於使用SO3-胺(DMF、吡啶或三乙胺)來磺化多糖，並且在所給的實例中僅使用了SO3-吡啶。而且這種方法導致形成剩餘痕量的對人有毒的吡啶，並且難以看出其能避免形成多糖鏈片段。
更具體地，本發明的目的是提供新的通用磺化方法，使用該方法能夠高度精確地控制含有羥基官能團或者伯胺或仲胺官能團的化合物上的磺化基團取代條件。
該目的是通過一種對含有一個或多個自由羥基官能團和/或一個或多個取代或未取代的伯胺或仲胺官能團的化合物的磺化方法來實現的，其特徵在於它包括在有捕酸劑的情況下用SO3-DMF絡合物來處理所述化合物。
術語「捕酸劑」是指能夠選擇性地與溶液中的自由質子反應的物質或這些物質的混合物。向反應介質中加入這種捕酸劑之後，質子被這些捕酸劑捕獲並且不再參與pH值的降低，因為它們不再具有反應性。
所述捕酸劑例如選自沸點低於100℃的鏈烯烴或鏈炔烴或這二者的混合物。
所述捕酸劑有益地是丁烯如2-甲基-2-丁烯(2M2B)、2-甲基-丙烯、2-甲基-戊烯、或其異構體或它們的混合物。
本發明的方法的特別之處在於其能夠避免使用過低的pH值，並因此避免了處理過的化合物的斷裂。而且本發明還具有不加入難以除去或者難以完全除去的有毒物質的益處。
更具體地，本發明的方法包括以下步驟a)在無水溶劑或共溶劑如二甲基甲醯胺(DMF)或由甲醯胺和二甲基甲醯胺組成的共溶劑中將待磺化的化合物溶解或者製成一均勻溶液；b)室溫(20-22℃)下加入摩爾過量的可混溶於共溶劑中的捕酸劑，例如2-甲基-2-丁烯；c)在攪拌下快速加入SO3-DMF絡合物；d)在低於30℃的控制溫度下將前面步驟中獲得的混合物攪拌1-2小時；e)將所述混合物逐步加入到一鹼性溶液，例如2％的碳酸氫鈉(NaHCO3)或另一鹼的溶液中使反應停止，同時監控pH值，使其從不低於4，以便獲得磺化化合物的鹽。
本發明的方法有益地包括將步驟(e)中所得的磺化化合物純化，例如通過相對水經超濾膜以1000道爾頓的截止閾值切向超濾(所述水滿足人體注射用水的質量要求)。
步驟(a)中所用的溶劑優選不是二甲亞碸(DMSO)，這是由於在本發明的框架內進行的研究證實非常難從所述磺化多糖製品中除去該溶劑，因此對其在藥品中的使用構成障礙。
當待磺化的化合物不易溶於無水溶劑或共溶劑中時，本方法的一個特定實施方式包括將所述化合物質子化以便促進其溶解。本文中我們例如通過將待磺化的化合物通過陽離子交換柱來處理該化合物，所述化合物是取代有一個或多個羧酸根合基團的糖聚合物，例如葡聚糖，其質子化導致形成-COOH基團。
因此磺化條件得到很好的控制，避免了最初取代有羧基的聚合物的脫羧。因此，優選如下的磺化條件將待磺化的化合物溶解於無水溶劑中(參見實施例II.1)。加入摩爾過量的捕酸劑(例如鏈烯烴2M2B)。加入磺化劑(SO3)如絡合物SO3-DMF，並且該反應在低於捕酸劑的蒸發溫度的溫度下進行。通過加入鹼性溶液如NaHCO3使反應停止。
本發明的方法可用於單體、低聚物和聚合物。更具體地，它適合諸如前述的HBGFPP或RGTA等的聚合物，尤其是得自葡聚糖的化合物和蘋果酸的共聚物。因此本發明特別適用於下式的聚合物AaXxYy(I)其中其中A是單體；X代表RCOOR′基團；Y代表相連於A上的O-或N-磺化基團並且對應於下式之一ROSO3R′或RNSO3R′；這些R基團是任選支化和/或不飽和並且可以含有一個或多個芳環的脂族烴鏈，所述芳環不包括苄胺和磺化苄胺基團；R′代表氫原子或陽離子；a代表單體的數量；x代表A單體被X基團取代的水平或程度；y代表A單體被Y基團取代的水平或程度。
本發明的方法可用於製備聚合物，尤其是式(I)所示的聚合物，其中在單體單元之間或者單體單元與其取代基之間(例如式(I)的聚合物中的A-A或A-X鍵)存在由在酸性介質中不穩定的官能團(尤其是酯、醯胺、醚、縮醛(糖苷)官能團或其它基團)形成的鍵。
本發明的方法因此尤其適用於製備硫酸化糖單體或低聚物，例如某些肝素片段，或者適用於製備RGTA類的聚合物，尤其是當A是糖苷單體時，例如在為葡聚糖-基聚合物或所有其它多糖化合物的情況下。
下面針對實施本發明方法，通過實施例並參照附圖，對本發明的其它優點和特徵作更詳細的解釋，其中
-
圖1顯示了具有末端醛基的CMDS分子。就值x和y不是0的CMDS而言，有三種Z單元a)醛或半縮醛，b)羧甲基糖苷和c)磺酸酯基糖苷。
-圖2代表取代的葡聚糖的末端單元的醛官能團和半縮醛之間的轉化平衡。端基異構位置的取代單元不參與該平衡。
-圖3代表具有表3中所述結構特徵的CMDS型分子的色譜圖。
-圖4顯示了相同產物PA 07在不同凝膠過濾柱上獲得的色譜圖。
-圖5顯示了CMDS的結構。
這些實施例還包括將本發明的方法與現有技術的方法進行比較，尤其是對於得自葡聚糖的聚合物(如CMDS或CMDBS)的磺化。通過比較發現法國專利FR 97 15702和FR 99 07636中提出的方案不能很好地保持葡聚糖聚合物分子的完整性，因為它們產生可以通過簡單方法檢測和定量的片段，並且會使接枝在大分子鏈上的基團發生水解。
I-磺化的評價I.1-羧基和磺化基團的測定方法為了能夠對不同的磺化方法進行比較，我們測定了單位葡萄糖中羧基(x)和磺化基團(y)的取代度(ds)。葡聚糖是葡萄糖聚合物，它在每個葡萄單元上有3個反應性OH基團。因此理論最大值是3。通過滴定分析法和根據現有技術中描述的常規方法的元素分析進行定量測定。
滴定分析測定結合元素分析能夠確定羧甲基醚(x)和磺酸根合(y)基團的總取代比例(x和y)。
I.2-取代基團的位置的測定為了確定接枝於糖苷單元上的基團的位置，我們在本領域專家已知的標準條件下使用NMR(質子核磁共振)分析法(J.Biol.Chem.275，38，29383-29390，2000)。我們使用Bruker 200-MHz核磁共振儀。
I.3-聚-糖苷鏈的片段的測定方法為了確定磺化基團加成反應之前和之後的聚合物鏈的完整性，測定溶液中的產物中的醛。
如圖1所示，由於僅在聚合物的還原末端具有醛基，因此通過測定醛能夠確定產物的還原末端。由此測得待磺化的產物上的醛基的數量。在此該數值等於每克產物1微摩爾醛。如果在反應期間不發生斷裂的話，該值在所有情況下都保持低於或等於最初產物的值。
事實上，磺化反應之後測定的醛值低於加入磺化基團之前測定的值(對0.5mmol/g的CMDS而言為1.0μmol/g)。對x＝0.5且y＝1.25的CMDS產物通常發現的自由醛值接近0.4微摩爾醛/克產物。相反，如果該數值超過最初值(1.0)，那麼必定形成了斷裂。
由於每一鏈斷裂產生一個新的可測定的反應醛，因此這種方法能夠測定片段的形成。
I.4-分子量的測定方法和製品表觀均勻性的研究方法分子量的測定是通過高效空間排阻色譜法於0.1M NaNO3中在KB-804和KB-805過濾凝膠(Shodex Japon)串聯柱上以0.7ml/min進行的。在柱出口使用Dawn光散射微型檢測器和RID 10型折射計測定產物(J.Biol.Chem.275，38，29383-29390，2000)。製品的均勻性是由分子量的分布曲線和峰寬度的量度(在半高)以及通過測定曲線的對稱性來反映的。
二級HPLC-凝膠過濾工藝可以根據分子量分布得出分子均一性。圖3中顯示了所得的高斯分布。
色譜條件是柱TSKgelG4000PWX(TOSOHAAS)，30℃下，7.8mm ID×30cm；流動相NaCl0.3M；流速0.7ml/min；測定IR0.06。
對於採用所述工藝使用SO3-胺絡合物合成的產物而言，發現製品的均勻性隨所用的色譜系統而變化。
當通過Shodex柱分離產物時，峰不對稱，但是當使用二級色譜分離系統時，相應於相同產物的峰顯示是對稱的，如圖4所示。這說明這些製品以及現有技術的製品中分子量分散的均勻性與所用分離系統有關。
II-使用本發明方法的羧甲基葡聚糖的O-磺化的實例以及與現有技術的比較下面實施例中描述了通過使用諸如氯磺酸的試劑、或者使用SO3-胺絡合物、使用SO3-DMF絡合物、和在有捕酸劑2-甲基-2-丁烯的情況下使用SO3-DMF絡合物(SO3-DMF/2M2B)(本發明方案)來進行不同的O-磺化反應。
為了進行對比，選用羧甲基葡聚糖作為最初聚合物。
II.1-在有捕酸劑的情況下與絡合物SO3-DMF/2-甲基-2-丁烯的反應在500-ml燒瓶中，將5g酸式羧甲基葡聚糖(CMDH+)(24.27mmol)溶解在40ml的甲醯胺中，然後在攪拌下加入40ml的2-甲基-2-丁烯(25當量)。加入7.90g的SO3-DMF(5當量/單位葡聚糖)。在30℃、攪拌下將反應進行2小時。
通過將反應介質慢慢倒入200ml 2％的NaHCO3中使反應停止。其pH必需接近7。如果不是這種情況，加入蘇打或HCl將該溶液中和。在任何情況下溶液的pH值必需不低於5，以避免產物降解。
在減壓下通過旋轉蒸發去除過量的水、DMF和2M2B之後，產物經過切向超濾來純化，然後冷凍乾燥。獲得6g磺化產物白色粉末。
下表1顯示了對CMDH+(x＝0.52)的O-磺化的再現性，其中每單位葡萄糖用5當量SO3-DMF和25當量2M2B。測定由相同CMD製得的產物的平均偏差(MD)百分比。
B肝病毒核酸的log轉換相對於基線的離散曲線見圖3。每個劑量方案在第29天時的平均log轉換值的配對比較結果見表9。配對比較的差異未經任何多重調整，顯著差異水平為5％。
表9.第29天時B肝病毒核酸值距基線的平均log轉換值(置信區間95％)
注不包含0的置信區間(見括號內)表明兩個處理在5％的水中所述的產物)MW＝67500+/-7500。
所得結果證實在有2M2B的情況下，所得磺化比例是反應的化學計量比的函數。而且，反應條件不影響前面接枝於CMD上的羧乙基醚基的水平。
II.2-通過質子的NMR分析確定分子使用包括滴定分析定量測定、元素分析、還原糖定量分析和HPLC/凝膠上過濾結合MALLS測定並補充1H NMR光譜的分析技術分析合成的產物。
1H NMR光譜法為我們提供了不同基團在最初葡聚糖的糖苷單元的C-2、C-3和C-4三個反應性羥基上的取代位置以及取代速率之比。下表3顯示了在實例CM-D-S型葡聚糖中通過NMR分析得出的X和Y在A上的取代位置。
表3基團的位置和以ds計的取代度
d.s各基團在每個葡萄糖單元(A)上的取代度。X＝CM；CH2COONa；Y＝SO3Na。
OH表示沒有與單體A反應的OH基數。
d.s.是由沒有被取代的剩餘羥基計算得到的(每個葡萄糖A單體中自由OH的最初值是3；(n＝3))。
C3+C4在位置C-3和C-4的總取代，以X、Y和自由OH基計算，為總d.s.與C-2位測定的d.s.之差。
III-與現有技術相比III.1-使用氯磺酸的O-磺化。與ClSO3H反應將5g羧甲基葡聚糖(24.27mmol，1當量/葡萄糖單元)加入到162ml二氯甲烷中。獲得一不均勻混合物。將該混合物劇烈攪拌以獲得產物在二氯甲烷中的均勻懸液。
將1.5mL氯磺酸(24.27mmol，1當量/葡萄糖單元)緩慢加入到該混合物中。將該反應介質持續攪拌2小時。反應期間形成棕色的產物聚集體。將該混合物過濾(在4號多孔玻璃漏鬥上)並且回收的產物用100ml二氯甲烷洗滌2次，用100ml二氯甲烷/二噁烷(1∶1)混合物洗滌3次，並用100ml二噁烷洗滌最後一次。將所得產物溶解在200ml蒸餾水中並通過加入2M的蘇打使溶液的pH上升至9.5，然後加入0.05mol/l的HCl使溶液的pH為7。
將溶液過濾，濃縮並經500ml甲醇沉澱。然後在烘箱中將最終沉澱物乾燥，之後純化。
按照本方案進行3個獨立的操作一個是在室溫下用1當量的氯磺酸。
一個是在室溫下用2當量的氯磺酸。
一個是在4℃下用2當量的氯磺酸。
III.2-與SO3-胺和醯胺絡合物的反應使用以SO3為基礎的不同絡合物SO3-吡啶、SO3-三甲胺、SO3-三乙胺和SO3-DMF(二甲基甲醯胺)實施上面概括的方案。
下表4顯示了通過使用SO3的不同絡合物進行CMD的O-磺化(d.s.C＝0.56)獲得的產物的結構和生理特性。
在500ml燒瓶中，將5g的羧甲基葡聚糖(24.27mmol，1當量/葡萄糖單元)溶解在50ml的甲醯胺中。為了加速該羧甲基葡聚糖的溶解，將反應介質的溫度升高至50℃。一旦產物溶解之後，使溶液回到室溫。為了進行每一反應，在50ml的甲醯胺中單獨地製備下表4所示的含有每一絡合物的溶液，並在攪拌下加入羧甲基葡聚糖。反應在室溫下進行2小時。
加入2升4℃下的蒸餾水使反應停止。進行混合併通過加入2M的NaOH溶液使介質的pH升至7.5-8。
在減壓下旋轉蒸發除去過量水之後，通過切向超濾將產物純化，然後冷凍乾燥。獲得6g白色粉末形式的硫酸化產物。
按照該方案進行4個獨立的操作一個是室溫下用2當量的SO3-吡啶絡合物；一個是在室溫下用2當量的SO3-三甲胺絡合物；一個是在室溫下用2當量的SO3-三乙胺絡合物；一個是在室溫下用2當量的SO3-DMF絡合物。
另外，嚴格按照法國專利FR 97 15702的實施例5中所述的方法進行反應(表4第8行)，其中通過形成三甲基銨鹽來溶解CMD。將SO3-吡啶絡合物以0.4倍的自由OH基的量(相當於2當量的絡合物/葡萄糖單元)溶解在DMSO中並加入到聚合物溶液中。該反應在二甲基甲醯胺中於室溫下進行。
表4顯示了按照不同方法合成不同的CMDS型聚合物的結構特徵。本發明的方法相應於表4的第10和11項，並且所用條件描述於表4
n.d.＝未檢出*本試驗的最初產物是在CM中以1殘基/葡萄糖單元的量取代的。
DCS型的不同產物是由單批次的羧基化葡聚糖(表4，第1項)以x＝0.56的羧酸根合的取代度進行合成的。在純化之後，產物通過不同結構分析技術表徵。
滴定分析結果顯示，使用氯磺酸和SO3-醯胺或胺絡合物的O-磺化反應導致接枝羧基的醚鍵斷開(dsC或x)和大分子鏈的降解(分子量和還原糖的定量測定)。該斷開隨著加入試劑的當量數的增加而更加顯著。降低反應介質的溫度可以抑制該降解。
應注意的是，使用絡合物SO3-Et3N(表4，第6項)製得的產物是磺化最充分的產物，而且也是脫羧作用最嚴重的產物。這種趨勢由其它產物得到證實。
該表的最後兩項(第10和11項)使用起捕酸劑作用的2M2B以限制接枝的羧酸根合基團的醚鍵和大分子鏈的降解和主鏈的降解。
應注意的是，在有2M2B的情況下，磺化之後獲得的產物的dsC與前體的dsC相同。這與試劑的加入量無關。事實上，用2.5倍以上的絡合物SO3-DMF(第11項)，我們獲得更高dsS，但是畢竟dsC沒有改變。由此證實了使用2M2B的方案的效果。
然而就目前已知的O-磺化技術而言，存在脫羧作用和大分子鏈的降解，在有2M2B的情況下的O-磺化技術使其能夠解決接枝在葡聚糖上的羧酸根合基團損失的問題。
體內活性以及體內毒性的測定是在成年大鼠的後爪趾長伸肌的肌肉再生模型上進行的，在破碎之後按照Gautron J.、Kedzia C.、Husmann I.和Barritault D的「葡聚糖衍生物對成年大鼠骨骼肌再生的促進作用」，C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de la Vie(1995)，318671-676中所述的試驗條件來進行。該再生是通過在組織學部分通過測定再生肌肉纖維的量來定量的。通過纖維形成的減少(與注入生理血清的對照相比)以及通過分析再生的外觀並揭示再生的異常區或者形成異常區或者形成炎症區顯示肌肉組織退化來測定其毒性。
IV-本發明方法在其它類型的聚合物合成中的推廣應用表5顯示了使用本發明的方法對式AaXxYy所示的各種聚合物的合成以及所述聚合物的分析特性，其中A是糖，並且a大於1。
表權利要求
1.具有一個或多個自由羥基官能團和/或一個或多個取代或未取代的伯胺或仲胺官能團的化合物的磺化方法，其特徵在於該方法包括在有捕酸劑的情況下用絡合物SO3-DMF來處理所述化合物。
2.如權利要求1的方法，其特徵在於所述捕酸劑選自沸點低於100℃的鏈烯烴、鏈炔烴以及它們的混合物。
3.如權利要求1或2的方法，其特徵在於所述捕酸劑選自2-甲基-2-丁烯(2M2B)、2-甲基-丙烯、2-甲基-戊烯、以及它們的異構體和它們的混合物。
4.如權利要求1-3任一項的方法，其特徵在於它包括以下步驟a)在無水溶劑或共溶劑如二甲基甲醯胺(DMF)或由甲醯胺和二甲基甲醯胺組成的共溶劑中將待磺化的化合物溶解或者製成一均勻溶液；b)室溫(20-22℃)下加入摩爾過量的可混溶於所述共溶劑中的捕酸劑，例如2-甲基-2-丁烯；c)在攪拌下快速加入SO3-DMF絡合物；d)在低於30℃的控制溫度下將前面步驟中獲得的混合物攪拌1-2小時；e)將所述混合物逐步加入到一鹼性溶液，例如2％的碳酸氫鈉(NaHCO3)或另一鹼的溶液中使反應停止，同時監控pH值，使其從不低於4，以便獲得磺化化合物的鹽。
5.如權利要求4的方法，其特徵在於它包括將步驟(e)中所得的磺化化合物純化。
6.如權利要求4或5的方法，其特徵在於它包括在步驟(a)之前將所述化合物質子化以便促進其在步驟(a)中的溶解。
7.如前面權利要求中任一項的方法，其特徵在於所述待磺化的化合物選自單體、低聚物和聚合物。
8.如權利要求7的方法，其特徵在於所述待磺化的化合物是下式的聚合物AaXxYy (I)其中A是單體；X代表RCOOR′基團；Y代表相連於A上的O-或N-磺化基團並且對應於下式之一ROSO3R′或RNSO3R′；這些R基團是任選支化和/或不飽和並且可以含有一個或多個芳環的脂族烴鏈，所述芳環不包括苄胺和磺化苄胺基團；R′代表氫原子或陽離子；a代表單體的數量；x代表A單體被X基團取代的水平或程度；y代表A單體被Y基團取代的水平或程度。
9.如權利要求7或8的方法，其特徵在於所述聚合物是葡聚糖的衍生物或者蘋果酸的共聚物。
10.如權利要求7-9任一的方法，其特徵在於所述聚合物的單體單元之間或者單體單元與其取代基之間存在由在酸性介質中不穩定的官能團形成的鍵，尤其是酯、醯胺、醚和縮醛官能團。
全文摘要
本發明涉及一種具有一個或多個自由羥基官能團和/或一個或多個取代或未取代的伯胺或仲胺官能團的化合物的磺化方法。本發明的特徵在於它包括用SO
文檔編號C07C303/00GK1617889SQ02827691
公開日2005年5月18日 申請日期2002年11月28日 優先權日2001年11月29日
發明者埃馬紐埃爾·珀蒂, 達爾西·加西亞－帕皮, 韋羅妮克·巴爾比耶－沙斯費耶 申請人:器官組織再生修復替換－Otr3公司