可直接檢測基因的免衝洗pcr擴增管的製作方法

2023-10-30 13:31:27

專利名稱：可直接檢測基因的免衝洗pcr擴增管的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於基因擴增和直接檢測的PCR擴增管(PCR擴增管是本領域技術人員熟知的技術名詞)，尤其是指一種可直接檢測擴增產物的免衝洗PCR擴增管。
二、技術背景目前，在分子生物學研究和醫學臨床診斷過程中，聚合酶鏈式反應(PCR)技術是不可缺少的。PCR通常是在一個封閉的管腔內進行，它可以將被檢測的靶基因放大數萬至數百萬倍。但是，基因擴增之後，一般需要用電泳等方法對擴增產物進行檢測。由於PCR方法靈敏度極高，其擴增產物在檢測過程中不可避免的會進入空氣中。當進行下一次試驗時，這些飄浮在空中的產物將可能又被擴增出來，這就是PCR檢測容易獲得所謂「假陽性」的原因。為此，國際上一些生物技術公司發展了封閉式的基因擴增和檢測技術。如螢光定量PCR技術。但是，該技術需要有十分複雜的動態光學檢測裝置，檢測儀器十分複雜，在我國很難推廣。同時，該技術每次試驗只能檢測一個基因的信息，不能滿足生物資訊時代人們需要對大量基因信息的檢測的要求。
基因晶片技術為人們同時檢測大量基因信息提供了工具。基因晶片把許多不同的核酸探針(單鏈寡核苷酸)固定於玻片上。把樣品中基因的擴增產物標記螢光，並與晶片上的核酸探針進行雜交，通過螢光掃描儀進行檢測。雖然基因晶片獲得的信息量大，但是目前大部分基因晶片主要用於細胞的mRNA表達檢測等實驗室研究應用。在重要病原微生物檢測方面，至今沒有成熟的應用實例和過硬的產品問世。就其主要原因在於樣品的處理、擴增標記、雜交、檢測等操作過程都是分開來單獨進行的，由此導致現有技術存在著操作繁瑣、複雜的缺陷，並因此而增加了汙染的機會，降低了所得結果的可靠性。儘管目前已將基因擴增技術與晶片檢測方法合為一體，但其特點是整個基因擴增過程在一個微反應池中進行，因而，需要對器件的同一部位反覆地升溫降溫，這將無法對結果進行動態跟蹤和實時定量分析。為此，國內外一些研究者提出把基因晶片與微流體技術相結合，來實現所有操作過程的一體化。申請人對此也進行了研究，並已提出了基因擴增微陣列探針循環檢測型生物晶片等。然而，由於這種晶片製備困難，並需要研製專門的反應器與之配套，故其成本很高。同時，基因晶片要求靶基因的擴增產物標記螢光，通過螢光信號來檢測核酸探針的雜交狀態。這就要求在樣品處理過程中要摻入螢光，這不僅提高了樣品處理的成本，增加了難度和不確定因素。而且，在這個過程中因標記效率問題，影響檢測的可靠性。同時，由於整個操作過程的的複雜性提高，如樣品處理過程的條件控制和雜交後非特異探針的反覆清洗等，不利於集成化檢測。因此，發展可以對被檢測的基因序列進行非標記檢測的低成本的生物晶片技術是實現生物晶片在醫學和生命科學等領域中大量實際應用的關鍵之一。
三、技術內容技術問題本發明提供一種能使基因擴增、雜交及檢測一體化操作方法的操作得以簡便、靶基因擴增時無需摻入螢光、成本得以降低且可使所得結果的可靠性得以提高的可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管。
技術方案本發明即一種可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用於PCR的反應管1內固定有分子信標2。
有益效果①由於本發明將分子信標設置於反應管內反應管自身能夠構成一個相對封閉的空間，使基因擴增、雜交及檢測一體化的操作方法可以按如下步驟在上述相對封閉的空間內完成A)將製備好的待擴增基因提取物、擴增液(包括相應的引物和酶等)加入反應管本體中，把蓋帽緊扣在反應管上；B)把封閉好的反應管放置於相應的基因擴增儀中進行擴增；基因擴增儀可以使用各種流行的儀器，也可以是通過改進的專用的擴增雜交和檢測一體化儀器；C)將管內擴增後的溶液流倒固定的分子信標區域，與管內表面上的分子信標進行作用，控制一定的溫度使其進行特異性的雜交；D)通過光學檢測方法，讀出反應管上分子信標的螢光信號，從而獲得基因的雜交信息。而這種方法正是由於有了本發明，才能通過一些簡單的操作，實現基因擴增、雜交、檢測操作的連續，而且無需在靶基因的擴增過程中加入螢光基團等標記物，避免在PCR擴增後打開擴增管，以清洗非特異性雜交的靶基因，以及加入雜交液等操作，不僅簡化了操作步驟，更重要的是完全避免了PCR擴增產物的檢測假陽性並使該方法可以採用現有的設備或是對現有設備稍加改進後的設備，降低了成本。分子信標與普通的核酸探針(單鏈核酸探針)不同。分子信標是由螢光基團、螢光淬滅基團、和雙鏈核酸的莖杆區、單鏈環形核酸區等4部分組成的。其中，單鏈環形核酸區為分子信標與被檢測的靶基因雜交識別的區域。當分子信標與靶基因結合後，雙鏈核酸的莖稈被打開，從而使螢光集團和螢光淬滅基團之間的距離改變，引起分子信標的螢光發光性質的改變。而普通的核酸的DNA單鏈探針是通過與被標記有螢光分子的靶基因雜交，實現檢測的。分子信標一般直接在溶液中檢測靶基因，但這只能檢測一種靶基因。本發明用固定化的分子信標法檢測靶基因，不僅可以同時對多個基因進行檢測，而且可以無需對靶基因摻入螢光等特殊的操作處理，也無需對雜交後晶片上的非特異性吸附進行清洗，以降低螢光背景。木發明就是把分子信標直接固定於PCR擴增管內，在PRC擴增管內實現基因擴增和雜交檢測一體化。分子信標內的螢光基團和螢光猝滅基團，在雜交檢測時，用於與分子信標雜交的核酸片斷不需要進行螢光標記，雜交後，核酸片斷與分子信標結合，使分子信標內部具有的螢光基團和螢光猝滅基團在空間分開，其螢光基團的信號可以被檢測，同時，沒有進行雜交的分子信標具有的螢光基團和螢光猝滅基團在空間上保持微小距離，螢光信號不能被檢測到，所以不需要進行衝洗，減少了操作步驟，降低了檢測的難度。綜上，本發明能使基因擴增、雜交及檢測一體化操作方法的操作得以簡便、成本得以降低且可使所得結果的可靠性得以提高，並可實現免衝洗。
②由於本發明能使操作方法進行多遍擴增、雜交及檢測，故本發明能夠使該方法實現動態跟蹤檢測並獲得定量結果。
③本發明採用「將分子信標通過化學活性基團連接在透明窗口上」的連接，具有結合牢固，不容易脫離，可多次反覆使用的優點，同時需要的檢測樣品少，分子探針的密度高。
④本發明「把分子信標固定於高分子凝膠介質中，再固定在透明窗口上」的技術措施提高了固定分子信標的密度，增強了雜交信號，使所得結果的可靠性得以進一步提高。
⑤本發明「把透明窗口分割成若干區域，分別在不同的區域上組裝具有不同或相同鹼基排列方式的核酸序列分子信標」的方法，可以在一次PCR試驗中對數個甚至數萬個基因片斷進行雜交檢測，可進行高通量的檢測。
四

圖1是本發明的結構示意圖。
圖2是本發明分子信標的直接化學連接關係圖。
圖3是本發明實施例的局部結構示意圖。
圖4是本發明實施例的局部結構示意圖。
五、具體實施方案實施例1 一種可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用於PCR的反應管1內固定有分子信標2，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口3，分子信標2固定透明窗口3內側，分子信標2通過化學活性基團R連接在透明窗口3上，本實施例可以採取如下具體連接方式將分子信標連接固定在透明窗口上1.在聚苯乙烯等透明塑料窗口、玻璃等表面上通過等離子體激活、紫外輻射激活、和化學激活等方法，在透明窗口表面上連接化學活性基團，如氨基、醛基、氰基、巰基等，再利用上述化學活性基團與分子信標上的化學基團反應，把分子信標連接到透明窗口上。
2.對透明塑料窗口、玻璃表面的修飾方法有很多種，如戊二醛修飾法、聚賴氨酸修飾法、巰基修飾法、多糖修飾法、BSA-NHS修飾法、水凝膠修飾法等，透明玻璃窗口的化學處理放入由1/3過氧化氫(30％)和2/3硫酸(18M)組成的溶液中，浸泡1小時(21)。再用去離子蒸餾水衝洗3遍；放入去離子蒸餾水煮沸10分鐘；在氬氣流下乾燥，於乾燥處保存備用。
氨基矽烷化處理將預處理後的基片浸入含有1％3-aminopropyltriethoxysilane(氨基矽烷)的95％丙酮/水的溶液10分鐘，取出後，用丙酮和去離子水衝洗乾淨，在120℃下乾燥45分鐘後，置於乾燥處保存。將矽烷化後的玻片放入含3％～4％戊二醛的PBS溶液中，室溫浸泡2小時，取出，洗淨，用氮氣吹乾，置於4℃保存備用。
BSA-NHS修飾製備將已經矽烷化的透明塑料窗口、玻片放入含有1.76g N-N′-disuccinimidyl carbonate，1.2 ml N-N′-diisopropylethylamine，和68.8ml N-N′-dimethylformamide(DMF)的溶液A中，室溫反應3小時後取出，浸入含1％BSA的PBS溶液室溫放置12小時，然後取出放入溶液A中，室溫繼續反應3小時，取出，洗淨吹乾備用。
瓊脂糖修飾處理瓊脂糖加雙蒸水配製成1％的瓊脂糖水溶液，完全混合煮沸3分鐘。在每一片已經矽烷化的透明塑料窗口上都傾倒2ml的瓊脂糖水溶液，待凝固後於37℃下過夜乾燥，室溫乾燥條件下保存。使用前用20mM的NaIO4水溶液活化，再用雙蒸水洗淨即可。
巰基修飾處理配製含巰基矽烷1％的甲苯溶液，將要處理的透明塑料窗口放入溶液中，室溫下過夜。取出玻片，用三氯甲烷、丙酮等有機溶劑清洗，吹乾。
聚賴氨酸修飾處理將清洗乾淨的透明塑料窗口放入含3％聚賴氨酸的PBS溶液中浸泡2小時，洗淨，吹乾，於4℃保存。
實施例2 一種可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用於PCR的反應管1內固定有若干分子信標2，分別用於檢測非典型性肺炎相關的冠狀病毒的特定基因片斷和甲型、乙型流感病毒的特定基因片斷，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口3，分子信標2固定透明窗口3內側，本實施例把透明窗口分割成若干區域，分別在不同的區域上組裝具有不同或相同鹼基排列方式的核酸序列分子信標，本實施例還可以把分子信標2固定於高分子凝膠介質4(如聚丙烯醯胺、瓊脂糖、聚乙烯醇等)中，再固定在透明窗口3上。檢測樣品經病毒裂解處理後，放入免衝洗PCR擴增管中，同時加入反轉錄PCR(RT-PCT)試劑和冠狀病毒和甲型、乙型流感病毒的擴增引物，封閉擴增管後，進行PCR反應裝置上進行擴增反應。擴增完成後，將擴增產物引入窗口區；若在檢測樣品中存在有被檢測的病毒，則在相應的分子信標固定區域將可檢測到螢光信號。
實施例3 一種可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋11和管體12組成，在用於PCR的反應管1內固定有若干分子信標2，分別用於檢測非典型性肺炎相關的冠狀病毒的特定基因片斷和甲型、乙型流感病毒的特定基因片斷，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口3，分子信標2固定透明窗口3內側，在本實施例中，在透明窗口3上設有透明的高分子凝膠層(如聚丙烯醯胺、瓊脂糖、聚乙烯醇等)，再把分子信標2固定於高分子凝膠介質層上。
權利要求
1.一種可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管(1)由管蓋(11)和管體(12)組成，其特徵在於在用於PCR的反應管(1)內固定有分子信標(2)。
2.根據權利要求1所述的可直接檢測基因的免衝洗PCR反應管，其特徵在於在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口(3)，分子信標(2)固定透明窗口(3)內側。
3.根據權利要求1或2所述的可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，其特徵在於分子信標(2)通過化學活性基團(R)連接在透明窗口(3)上。
4.根據權利要求1或2所述的所述的可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，其特徵在於把分子信標(2)固定於高分子凝膠介質(4)中，再固定在透明窗口(3)上。
5.根據權利要求1或2所述的所述的可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，其特徵在於在透明窗口(3)上設有透明的高分子凝膠層，再把分子信標(2)固定於高分子凝膠介質層上。
6.根據權利要求2所述的所述的可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，其特徵在於把透明窗口分割成若干區域，分別在不同的區域上組裝具有不同或相同鹼基排列方式的核酸序列分子信標。
全文摘要
本發明公開了一種可直接檢測基因的免衝洗PCR擴增管，包括反應管且該反應管由管蓋和管體組成，在用於PCR的反應管內固定有分子信標，在PCR反應管內固定分子信標的區域上有透明窗口，分子信標固定透明窗口內側。本發明將分子信標引入技術方案後，能使基因擴增、雜交及檢測一體化操作方法的操作得以簡便、靶基因擴增時無需摻入螢光、成本得以降低且可使所得結果的可靠性得以提高。
文檔編號C12P19/34GK1448500SQ0311338
公開日2003年10月15日 申請日期2003年5月1日 優先權日2003年5月1日
發明者陸祖宏, 劉全俊, 王宏 申請人:東南大學