蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的應用的製作方法

2023-10-30 17:39:28

本發明屬於植物基因工程
技術領域：
，涉及一種纖維素合酶基因的應用，特別涉及一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的應用。
背景技術：
：纖維素是細胞壁的主要組成成分之一，也是評價造紙原料性能優劣的一個重要指標。植物細胞壁主要纖維素、半纖維素、木質素三大成分組成，這三大組分是地球上最豐富的可再生資源，而纖維素是細胞壁的第一大組分，由均一的吡喃式D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成，其葡萄糖殘基約2000～25000個(PaulyM,KeegstraK(2010)Plantcellwallpolymersasprecursorsforbiofuels.CurrentOpinioninPlantBiology,95:305-312；PaulyM,KeegstraK(2008)Cell-wallcarbohydratesandtheirmodificationasaresourceforbiofuels.ThePlantJournal,54(4):559-568)。而這種β-1,4糖苷鏈由纖維素合酶催化合成。Richmond和Somerville在擬南芥中已發現了10個纖維素合酶的編碼基因(現命名為AtCESA)(RichmondTA,SomervilleCR.(2000)Thecellulosesynthasesuperfamily1.PlantPhysiology,124:496-498)。AtCESA1，AtCESA2，AtCESA3，AtCESA5，AtCESA6和AtCESA9與植物初生壁的生物合成有關(ArioliT,PengL,BetznerA,etal.(1998)MolecularanalysisofcellulosebiosynthesisinArabidopsis.Science,279:717-720；BurnJE,etal.FunctionalanalysisofthecellulosesynthasegenesCESA1,CESA2,andCESA3inarabidopsis.PlantPhysiology,129(2):797-807；PagantS,etal.(2002)KOBITO1encodesanovelplasmamembraneproteinnecessaryfornormalsynthesisofcelluloseduringcellexpansioninarabidopsis.ThePlantCellOnline,14(9):2001-2013)，次生壁纖維素合酶基因複合體由AtCESA4，AtCESA7和AtCESA8構成，這些基因的突變體都表現為坍塌的木質部(irregularxylem，irx)(TurnerSR,SomervilleCR.(1997)CollapsedxylemphenotypeofArabidopsisidentifiesmutantsdeficientincellulosedepositioninthesecondarycellwall.PlantCell,9:689-701；SzyjanowiczPMJ,MckinnonI,TaylorNG,etal.(2004)Theirregularxylem2mutantisanallele ofkorriganthataffectsthesecondarycellwallofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal,37(5):730-740)。擬南芥cesa4突變體和cesa8突變體次生細胞壁中的纖維素沉積出現嚴重缺陷導致植株出現坍塌的木質部細胞(TurnerSR,SomervilleCR(1997)CollapsedxylemphenotypeofArabidopsisidentifiesmutantsdeficientincellulosedepositioninthesecondarycellwall.PlantCell,9:689-701；TaylorNG,HowellsRM,HuttlyAK,etal.(2002)InteractionsamongthreedistinctCesAproteinsessentialforcellulosesynthesis.100(3):1450-1455)。目前，CESA的功能推測主要來自於基因表達、UDP-G結合實驗(PearJR,KawagoeY,SchreckengostWE,etal.(1996)HigherplantscontainhomologsofthebacterialcelAgenesencodingthecatalyticsubunitofcellulosesynthase.ProcNatlAcadSciUSA,93(22):12637-12642)、突變分析(FagardM,DesnosT,DesprezT,etal.(2000)PROCUSTE1encodesacellulosesynthaserequiredfornormalcellelongationspecificallyinrootsanddark-grownhypocotylsofArabidopsis.ThePlantCell,12(12):2409-2424)及基因沉默實驗(Burtonetal，2000)。蓮(Nelumbonucifera)屬睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬(Nelumbo)多年生水生宿根草本植物。蓮葉柄中含有大量的纖維素，從中間折斷可拉出大量細長而有韌性的蓮纖維。蓮纖維的性能非常特殊，Pan等報導，兩段掰開的葉柄之間的纖維絲能被拉長至少十釐米而不斷開，每根纖維絲由二十根左右的細纖維絲組成，平行並以螺旋形式的分布在蓮葉柄的導管分子中(PanY,HanG,MaoZ(2011)TheanatomyoflotusfibersfoundinpetiolesofNelumbonucifera.AquaticBotany,95:167-171)。蓮纖維絲的成分中纖維素、半纖維素、木質素的含量分別是41.4±0.29％，25.87±0.64％，19.56±0.32％(PanY,HanG,MaoZ(2011)StructuralcharacteristicsandphysicalpropertiesoflotusfibersobtainedfromNelumbonuciferapetioles.CarbohydPolym,85:188-195)。克隆出蓮的纖維素合酶基因，並利用轉基因技術研究其功能表達，將有利於深入研究蓮纖維絲及纖維素的合成機理，進而有目的地利用蓮纖維素合酶基因去改善一些林木樹種用於增加其纖維素含量，提高可利用性。蓮以及蓮纖維絲的藥學應用、化學性能和物理結構均被研究並報導過，也有蓮基因水平的研究，蓮的基因組於2013年公布(RayM,RobertV,YanlingL,etal.(2013)Genomeofthelong-livingsacredlotus(NelumbonuciferaGaertn.).GenomeBiology,14(5):R41)，這為蓮相關基因的克隆與功能研究提供了便利。技術實現要素：為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在於提供一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的應用。鑑於蓮的葉柄中含有大量纖維絲且葉柄內部、外部纖維素含量不一致的現象，為從基因表達程度方面入手進行深入研究其纖維素合成，將蓮葉柄內、外和葉片三個部位做轉錄組測序，進而研究其纖維素合酶基因的表達。本發明的主要目的是將轉錄組中發現的一段在葉柄部位表達量比較高的纖維素合酶基因的表達情況。根據轉錄組測序得到的序列設計引物以蓮葉柄總cDNA為模板將此基因克隆出來並進行測序，對測序結果行BLAST，發現其與擬南芥的AtCESA4基因序列相似度最高，因此我們將之命名為NnuCESA4。然後從ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)訂購到擬南芥cesa4突變體(Salk_029940c)，並通過轉基因技術將蓮中的NnuCESA4基因轉入到相應的擬南芥突變體中檢測其功能互補情況，推斷該基因的功能表達情況，以便後續可有目的性的將該基因轉入到一些林木樹種用於增加其纖維素含量，提高可利用性。本發明通過構建過表達載體及通過轉基因技術來研究其功能表達，確定該基因具有纖維素合酶功能並促進植物次生細胞壁的纖維素合成。本發明的目的通過下述技術方案實現：本發明提供一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4在促進纖維素合成中的應用。本發明提供一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4在促進次生細胞壁中纖維素合成中的應用。所述的蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的胺基酸序列如SEQIDNO:1所示。所述的蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。上述應用的具體過程如下：1.基因的獲得根據轉錄組數據，得到了15個蓮的CESA基因序列，對這15個CESA基因進行了RT-qPCR，發現其中一條序列表達量特別高並且在葉柄內外部位表達量遠遠高於葉片，根據轉錄組測序結果設計引物以蓮葉柄總cDNA為模板將此基因克隆出來並進行測序，對測序結果行BLAST，發現本序列與擬南芥的AtCESA4序列相似度最高，因此我們猜測其與次生細胞壁纖維素的合成密切相關，並將該基因命名為NnuCESA4，進而搜索已公布的蓮基因組序列，發現本基因序列與NNU_10513序列相同。所述的引物序列如下：NnuCESA4-F：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAC CGGCCTAATCGCCG-3′；NnuCESA4-R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGCACTCCACTCCACATTGC-3′。2.載體的構建將擴增的NnuCESA4的cDNA構建至過表達載體pEarlyGate100中組成雙元表達載體，得到過表達重組質粒；該載體攜帶花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，並具有除草劑抗性，可供轉基因植物的篩選。3.轉化農桿菌將上述得到的過表達重組質粒採用凍融法轉化至根癌農桿菌GV3101中，選取陽性菌並保存，準備轉染擬南芥。4.轉化擬南芥cesa4：由於擬南芥cesa4純合突變體植株矮小，果莢畸形，幾乎不結種子，故選用無表型的cesa4雜合突變體進行轉基因並收取種子以備下一代陽性植株篩選，將上述得到的含有目的基因的陽性農桿菌以浸染法轉化45天盛花期的cesa4雜合突變體植株，果莢成熟後收集種子，用除草劑抗性篩選轉基因陽性植株，並通過基因鑑定選取基因背景為cesa4純合突變體的陽性植株，即為轉基因植株。以擬南芥cesa4純合突變體作為陰性對照。5.轉基因植株表型觀察擬南芥cesa4純合突變體植株矮小，蓮座葉窄短呈深綠色，果莢畸形短小，幾乎無種子，纖維素含量較低，並具有嚴重坍塌的木質部結構。通過轉蓮基因NnuCESA4入擬南芥cesa4純合突變體，對相同條件下種植的生長6到7周的轉基因植株、野生型植株及cesa4純合突變體植株的主莖高度、蓮座葉大小及果莢狀態進行比較觀察並記錄。轉基因植株長出了少量比野生型短小但能正常結種子的果莢，蓮座葉長度比cesa4純合突變體增長了92％，並且莖稈高度也增長了47％。為了觀察木質部變化，對轉基因植株的主莖橫切片進行甲苯胺藍染色，在光學顯微鏡下觀察，cesa4純合突變體原本坍塌比較嚴重的木質部細胞在蓮NnuCESA4基因的轉入後得到了部分恢復。用硝酸乙醇法測定擬南芥主莖的纖維素含量，測定結果證明轉基因植株的纖維素含量比cesa4純合突變體增長了1.16倍，但尚未恢復至野生型程度。結果表明：通過進化樹分析和轉基因技術及互補植株表型分析確定蓮基因NnuCESA4具有纖維素合酶功能，能參與次生細胞壁中纖維素的合成。本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果：(1)本發明擴增得到蓮基因NnuCESA4，並得到了含有蓮基因NnuCESA4的過表達載體。(2)本發明得到了蓮基因NnuCESA4轉擬南芥cesa4純合突變體的陽性轉基因植株。(3)本發明通過轉基因植株、純合突變體植株與野生型植株對比，發現該基因能部分互補擬南芥cesa4純合突變體的表型，具有纖維素合酶的功能，促進纖維素的合成，並確定該基因參與植物次生細胞壁中纖維素的合成。附圖說明圖1是轉錄組測序中15個NnuCESA基因在不同部位的表達量；其中，T1，T2，T3分別是葉片、葉柄外部和葉柄內部。圖2是15個NnuCESA基因的在不同部位的RT-qPCR結果；其中，T1，T2，T3分別是葉片、葉柄外部和葉柄內部。圖3是表達載體構建示意圖。圖4是cesa4純合突變體、轉基因植株和野生型植株表型對比圖；其中，圖A中從左至右分別為cesa4純合突變體，轉基因植株和野生型植株；圖B中從下至上三排分別為cesa4純合突變體，轉基因植株和野生型植株的蓮座葉片；圖C中從下至上三排分別為cesa4純合突變體，轉基因植株和野生型植株的果莢。圖5是cesa4純合突變體、轉基因植株和野生型植株莖部橫切切片對比圖。其中，A，B，C分別為cesa4純合突變體，轉基因植株和野生型植株的莖部橫切面甲苯胺藍染色圖，箭頭所指的部位為木質部細胞。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件或按照製造廠商所建議的實驗條件。實施例1：蓮NnuCESA4基因序列的獲得先將蓮花葉柄內、外和葉片三個部位做轉錄組測序得到各基因片段在不同 部位的表達量，找出15個CESA基因片段的表達量(結果見圖1)，並做RT-qPCR驗證(結果見圖2)，各基因在不同部位的相對表達量結果與轉錄組測序的結果趨勢基本一致，其中一段CESA基因序列表達量特別高並且在莖稈內部和外部的表達量均高於葉片部位，根據轉錄組測序結果設計引物以葉柄總cDNA為模板將此基因克隆出來並進行測序，對測序結果行BLAST,發現該基因與擬南芥中參與次生細胞壁纖維素合成的基因AtCESA4相似度極高，因此我們推測該基因應該參與次生細胞壁中纖維素的合成，並將其命名為NnuCESA4,通過序列比對發現，本基因序列與蓮基因組網站(http://lotus-db.wbgcas.cn/)中的基因NNU_10513序列相同。實施例2：蓮葉柄的總RNA的提取用RNA提取試劑盒(OMEGA)分別提取蓮葉柄的總RNA。詳細步驟參考試劑盒說明書。實施例3：蓮總cDNA的獲得以蓮葉柄總RNA為模板採用OMEGA反轉錄試劑盒得蓮總cDNA，詳細步驟按照試劑盒使用說明書操作。實施例4：目的片段的擴增以蓮基因NnuCESA4的mRNA為模板設計兩端引物，並在引物兩端加上用於構建載體的Gateway接頭引物。上下遊引物分別為：NnuCESA4-F：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGACCGGCCTAATCGCCG-3′；NnuCESA4-R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGCACTCCACTCCACATTGC-3′；以蓮葉柄總cDNA為模板，在退火溫度為52℃及延伸溫度為72℃的程序下進行PCR擴增，擴增產物經電泳鑑定後純化並保存。實施例5：載體構建連接採用Gateway雙元載體構建方法，將實施例4中獲得的擴增產物與載體質粒pDONR207(購買於ABRC，http://abrc.osu.edu/)進行BP重組反應，重組產物轉化DH5α感受態細胞(市售)並得到陽性菌，擴大培養並提取質粒後進行 質粒測序鑑定。將測序正確的重組質粒與pEarlyGate100(購買於ABRC，http://abrc.osu.edu/)(該載體攜帶花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，並具有除草劑抗性，可供轉基因植物的篩選)進行LR重組反應，重組產物轉化大腸桿菌DH5α並得到陽性菌，擴大培養後提取質粒並測序，將測序正確的重組質粒保存備用。表達載體構建示意圖如圖3所示。測序結果如SEQIDNO:2所示，與基因NnuCESA4(基因ID為NNU_10513)中序列相同。實施例6：轉化根癌農桿菌GV31011.將根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態細胞(市售)冰上融化，加入1至5μL(<300μg)實施例5中的重組質粒，輕彈混勻，冰浴15min。2.將上述混合物轉移至液氮中急凍5min，再37℃熱激5min，迅速轉移至冰上5min。3.加入800μL無抗性的LB液體培養基，28℃，200rpm搖4h。4.5000rpm，離心1min，棄700μL上清，其餘重懸，取200μL塗布於LB固體培養基(Rif+：50μg/mL，Gen+：15μg/mL)，28℃倒置培養2天。5.選取陽性菌落並小搖保菌。實施例7：農桿菌轉染擬南芥1.選用抽苔十天後的擬南芥(Arabidopsisthaliana)cesa4雜合突變體植株，保持較高溼度，準備轉化。2.在LB培養基中分別復甦上述帶有重組質粒的根癌農桿菌，28℃，220rpm小遙24h。3.5000rpm離心15min收集菌體。同時配製1L重懸液(5％(w/v)Sucrose，0.02～0.05％Silwet-77)。4.棄上清，殘留菌液用5％(w/v)蔗糖重懸清洗，8000rpm，離心10min收集菌體，此步驟可再復一次。5.用重懸液重懸菌體至OD600位0.8，重懸液轉移至15cm培養皿中。6.將待轉化擬南芥的花序侵入重懸液中1min。7.將已轉化植株倒置平放，22℃，相對溼度60～70％暗培養一天後，轉為正常培養，一個月後收取轉化種子。實施例8：篩選轉基因陽性植株將實施例7中得到的種子播種，萌芽10天左右噴施除草劑，得到存活植株後通過DNA鑑定確定目的基因是否轉入及植株基因型背景，做好標記，轉基因後的cesa4純合突變體可結少量種子，待果莢成熟後單株收種並保存。實施例9：擬南芥觀察表型選取生長6～7周的野生型、cesa4純合突變體及轉基因植株來觀察對比植株表型變化，每種類型的植株選取十株以上並用標尺來測量其莖稈高度、蓮座葉長度，觀察並拍照記錄果莢大小。結果如圖4和表1所示，結果表明，cesa4純合突變體的畸形果莢較多，幾乎無種子；轉基因植株長出了少量比野生型短小但能正常結種子的果莢，蓮座葉長度比cesa4純合突變體增長了92％，並且莖稈高度也增長了47％。表1野生型植株、純合突變體和轉基因植株纖維素含量比較結果野生型cesa4純合突變體轉基因植株莖稈纖維素含量(μg/mg)300±8.97A78.625±2.33C169.8±5.16B蓮座葉長度(cm)4.41±0.13A1.13±0.13C2.17±0.09B莖稈高度(cm)33.4±2.37A10.01±1.48C14.73±1.24B註：數值代表平均值+標準差(n＝4)，不同的字母代表顯著性差異(P<0.05；T檢驗)。實施例10：擬南芥主莖纖維素含量比較纖維素提取採用硝酸乙醇法。具體步驟為：先將收集的擬南芥主莖粉碎，烘乾後經苯醇抽提，稱取2g經苯醇抽提的試樣，把試樣置於250mL潔淨乾燥的錐形瓶中，加入25mL硝酸乙醇混合液，裝上回流裝置，放在沸水浴上加熱1h。在加熱過程中，應隨時搖蕩錐形瓶，以防止試樣跳動。煮沸1h後，移去冷凝管，將錐形瓶自水浴上取下，靜置片刻。待殘渣沉積瓶底後，用傾瀉法濾經已恆重的1G2玻璃濾器，儘量不使試樣流出。用真空泵將濾器中的濾液吸乾，再用玻璃棒將流入濾器的殘渣移入錐形瓶中重複施行上述步驟數次，直至纖維變白為止。最後將錐形瓶內容物全部移入濾器，用10mL硝酸乙醇混合液洗滌殘渣，再用熱水洗滌，至洗滌液遇甲基橙不呈酸性反應為止。最後用乙醇洗滌兩次，吸乾洗液，將濾器移入烘箱，於105±2℃烘乾至恆重。纖維素含量計算：纖維素含量＝(m1-m2)/m0(1-w)×100％，式中m1為絕幹纖維素與玻璃濾器的質量，m2為絕幹空玻璃濾器質量，m0為風乾試樣的質量，w為試樣的含水量。纖維素含量的結果見表1。從表1中可知，測 定結果證明轉基因植株的纖維素含量比cesa4純合突變體增長了1.16倍，但尚未恢復至野生型程度。實施例11：擬南芥莖段橫切片的製作與觀察分別選取生長6～7周的野生型、cesa4純合突變體及轉基因植株主莖，在土壤表層以上3cm取1cm莖段，用3％(w/v)的瓊脂糖包埋莖段，在LeicaVT1000S震動切片機上切片，厚度40μm，甲苯氨藍染色1～2min，置於載玻片上於光學顯微鏡下觀察比較並拍照。結果如圖5所示，A，B，C分別為cesa4純合突變體，轉基因植株和野生型植株的莖部橫切面甲苯胺藍染色圖，箭頭所指的部位為木質部細胞，圖A中的木質部細胞坍塌變形比較嚴重，圖B中的木質部細胞已得到部分恢復，但尚有部分畸形塌陷的細胞存在，未完全恢復至野生型。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp