一種分析測定食品中多種內分泌幹擾物的方法
2023-10-30 11:10:42 2
專利名稱：一種分析測定食品中多種內分泌幹擾物的方法
技術領域：
本發明屬於食品檢驗領域，涉及食品內內分泌幹擾物的分析測定方法，具體涉及一種分析測定奶粉和液態奶中多種內分泌幹擾物的方法。尤其是採用固相萃取-超高效液相色譜串聯四極杆飛行時間質譜分析方法同時分析奶粉和液態奶中26種4類內分泌幹擾物的方法。
背景技術：
研究顯示，內分泌幹擾物能夠幹擾內分泌系統，給動物或者人造成有害影響的往往是自然的或者與人類活動相關的化合物。據文獻報導，暴露於內分泌幹擾物與性早熟，前列腺癌，子宮癌和乳腺癌等激素相關疾病的發生有關。食品是人們暴露於內分泌幹擾物的重要途徑。牛奶和奶製品作為日常生活中重要的食品之一，其安全受到人們的強烈關注。然而，據調查，奶牛的現代養殖為了提高牛奶產量，需要使奶牛不斷的受孕，儘可能延長產奶期，同時縮短乾涸期，這種養殖方式導致了大部分牛奶來自於懷孕中奶牛，因此有可能使牛奶中的內性激素(孕激素、雄激素和雌激素、)的含量增加。有報導，牛奶的消費量與卵巢癌、乳腺癌和前列腺有關，同時已在牛奶或者奶製品中檢測出孕酮、雄烯二酮、雌酮和雌二醇等內源性激素。烷基酚類(如辛基酚和壬基酚)和雙酚A是常用的工業原料，主要用於烷基酚聚氧乙烯醚，環氧樹脂和聚碳酸酯的生產，最終製成產品，如嬰兒奶瓶等。該些產品在反覆使用或者加熱等因素的作用下，可直接或者降解後釋放出烷基酚單體和雙酚A進入到食品中。有研究在牛奶，奶粉和嬰兒配方食品中已經檢測出壬基酚和雙酚A等酚類。為保障牛奶及其奶製品的安全，評價人群通過食品暴露於內分泌幹擾物的程度，探討內分泌幹擾物與疾病的關係，建立牛奶和奶製品中多種內分泌幹擾物的有效分析方法是第一步。目前，食品中內分泌幹擾物的分析方法主要為氣相色譜質譜聯用法和液相色譜三重四極杆質譜聯用法。由於氣相色譜質譜聯用法在分析內分泌幹擾物時需要衍生化，而且靈敏度低於液相色譜三重四極杆質譜聯用法，所以前者在食品內分泌幹擾物分析中的地位，正在逐步被後者取代。液相色譜三重四極杆質譜聯法在分析孕激素和雄激素時，一般在離子源為陽離子模式下分析，採用的流動相為甲醇和水，可以加甲酸或者不加；而在雌激素和酚類(烷基酚和雙酚A)分析時，一般在離子源為陰離子模式下分析，採用的流動相為乙腈和水，可以加氨水或者不加。然而，在研究中需要同時分析孕激素、雄激素、雌激素和酚類時，是將它們分為2組，即孕激素、雄激素與雌激素和酚類，按上述分析方法分2次測定，既耗時又費溶劑。三重四極杆在定量分析時，通常採用多反應監測模式用以獲得較高的靈敏度，然而在此模式下檢測離子以外的用於結構解釋的碎片離子信息被丟棄；而在離子全掃描模式下，又損失較大的靈敏度。四極杆飛行時間質譜儀可以較高靈敏度獲得全部碎片離子的精確分子量，克服了三重四極杆不能兼顧結構解釋和靈敏度的困境。因此在定量分析中，四極杆飛行時間質譜儀也逐漸受到關注。然而，在食品內分泌幹擾物分析中，由於內分泌幹擾物的含量常常極低(ng/kg或者pg/kg級)，此濃度水平與四極杆飛行時間質譜儀的檢出限接近，四極杆飛行時間質譜儀難以準確分析食品中內分泌幹擾物。因此，有關領域需要尋求及建立一次色譜進樣實現上述4類內分泌幹擾物同時準確分析測定的方法。尤其是改善四極杆飛行時間質譜儀靈敏度，以使其能適應食品中內分泌幹擾物的準確分析。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，提供一種食品內內分泌幹擾物的分析測定方法，具體涉及一種分析測定奶粉和液態奶中多種內分泌幹擾物的方法。尤其是採用固相萃取-超高效液相色譜串聯四極杆飛行時間質譜分析方法同時分析奶粉和液態奶中26種4類內分泌幹擾物的方法。本發明方法能彌補現有技術中不能實現一次色譜進樣同時分析所述述4類內分泌幹擾物的缺陷，同時能提高四極杆飛行時間質譜儀的靈敏度，實現食品中內分泌幹擾物四極杆飛行時間質譜儀的準確分析。本發明所述的奶粉和液態奶中26種4類內分泌幹擾物包括下述10種雌激素包括雌三醇、雌二醇、α-雌二醇、馬烯雌留酮、17 α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；7種孕激素包括孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔諾酮、21 α -羥孕酮、17 α -羥孕酮和甲基炔諾酮；3種酚類包括雙酚A、4-tert- 丁基酚和4-tert-辛基酚；6種雄性激素包括睪酮、雄烯二酮、康力龍、甲睪酮、群勃龍和諾龍。本發明採用下述技術方案分析測定食品中多種內分泌幹擾物:用水充分溶解樣品，加入與水混溶的有機溶劑超聲提取待測物後，加入鈉鹽，使有機溶劑與水相分離，實現液液萃取；取定量有含有待測物的機溶劑，經C18填料的固相萃取淨化，丹醯氯衍生(使雌激素和酚類的離子化方式從陰離子模式轉變為陰離子模式)後，超高效液相色譜串聯四極杆飛行時間質譜儀分析。具體而言，本發明的分析測定食品中多種內分泌幹擾物的方法，其特徵在於，其包括步驟:I)樣品前處理:取一定量樣品用水充分溶解後，加入有機溶劑超聲提取待測物(如果為液態奶側直接加入有機溶劑超聲提取待測物)，加入鈉鹽，通過離心使水相與有機相分離；取含有待測物的有機溶劑提取液，用微氮氣流吹至近幹後，純水復溶後，過C18填料固相萃取小柱，用乙腈水溶液洗脫待測物後；向洗脫液中加入鈉鹽，通過離心使乙腈與水相分離；取乙腈提取液，用微氮氣流吹至近幹後，用丹醯氯衍生在60°C反應一定時間得待測物，冷卻至室溫後，直接進樣分析；本發明所述待測物為雄激素、孕激素和丹醯化雌激素和酚類的溶液；尤其包括10種雌激素:雌三醇、雌二醇、α-雌二醇、馬烯雌留酮、17 α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；7種孕激素:孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔諾酮、21α-羥孕酮、17α-羥孕酮和甲基炔諾酮；3種酚類:雙酚A、4-tert-丁基酚和4-tert-辛基酚；6種雄性激素:睪酮、雄烯二酮、康力龍、甲睪酮、群勃龍和諾龍。本發明中，加入的鈉鹽為氯化鈉或者硫酸鈉，優選加入氯化鈉；本發明中，所說的有機溶劑選自乙腈或者丙酮，其中優選乙腈；本發明中，所說的固相萃取乙腈洗脫溶液濃度為I ;50_80，其中優選1: 60 ;
本發明中，所說的衍生化溫度為60-80°C，其中優選60°C ；本發明中，所說的衍生化時間為10-30分鐘，其中優選10分鐘；2)超高效液相色譜串聯四極杆飛行時間質譜儀測定色譜柱採用C18柱，流動相為IOMm的甲酸銨水溶液和乙腈溶液，離子源採用陽離子模式；其中，色譜條件:色譜柱:C18(柱長:100mm柱內徑:2.1mm填料粒徑:1.7μ m);流動相:10mM的乙酸銨的甲醇和水；流速:0.3mL/min ;梯度洗脫；色譜柱溫度:40°C ;進樣量為:10 μ L ；質譜條件:電噴霧離子源(陽離子模式);霧化氣:氮氣；碰撞氣:氬氣；毛細管電壓:3.0kV ;去溶劑氣溫度:400°C ;去溶劑氣流量:600L/h ;源溫度:120°C ;採樣錐電壓:40V ；錐孔氣流量:40L/h。3)計算濃度:採用基質匹配內標法，以峰面積計算樣品中26種內分泌幹擾物的含量。本發明方法的優點在於:1，實現一次色譜進樣同時分析4類內分泌幹擾物，2，同時能提高四極杆飛行時間質譜儀的靈敏度，實現食品中內分泌幹擾物四極杆飛行時間質譜儀的準確分析。為了便於理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的分析測定食品中多種內分泌幹擾物的方法進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的範圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的範圍內。
圖1為雌激素母離子提取色譜圖。圖2為雄激素和酚類母離子提取色譜圖。圖3為孕激素母離子提取色譜圖。
具體實施例方式實施例1測定奶粉中26種內分泌幹擾物I，儀器和試劑:ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters)，SYNAPT G2高解析度飛行時間質譜儀(美國Waters)，2200T超聲波清洗器(上海安譜)，TGL-10B高速臺式離心機(上海安亭)，KD200氮氣吹掃儀(杭州奧盛)；12位固相萃取儀(德國CNW) ;C18固相萃取柱(上海迪馬，500mg，3mL) ；LC-MS 級乙腈(美國 Fisher)，LC-MS 級純水(美國 Fisher)，LC-MS 級乙酸乙酯(美國Fisher)，優級純氯化鈉(上海國藥集團)。標準品:10種雌激素、7種孕激素和3種酚類均購於美國Sigma，6種雄激素購於德國Dr.Ehrenstorfer ;標準品純度均大於97.8 %。標準儲備溶液的配置:分別稱取標準品10.0mg於IOmL棕色容量瓶中，用甲乙腈定容之刻度，搖勻得到1.0mg/mL的標準溶液，於-20°C保存。混合標準工作溶液的配置:用乙腈/水(10/90，V/V)稀釋標準儲備液(1.0mg/mL) IOOO倍得到lug/mL的混合標準溶液，然後逐級稀釋得到所需的不同濃度的標準工作溶液。2，分析方法2.1樣品前處理稱取混勻的奶粉樣品4.0g,置於50mL具塞塑料離心管中，加入IOmL純水，充分混勻，超聲波提取IOmin後,加入20mL乙腈,振搖2min,再次超聲波提取IOmin,然後加入3g氯化鈉，振搖2min,離心IOmin (7000rpm),取IOmL上清液於5.0mL離心管中；加入3mL正己烷，振搖Imin後，靜置5min，去除上層正己烷，重複操作I次，下層乙腈提取液用微氮氣流吹至近幹(約剩餘100 μ L),剩餘物用2mL純水復溶後,待淨化；預先依次用6mL乙腈和5%乙腈水溶液活化平衡C18固相萃取小柱後，將上述2mL待淨化液全部上柱，再用10mL60%乙腈水溶液洗脫待測物；上樣和洗脫的流速控制在3mL/min ；向洗脫液中加入1.5g氯化鈉，振搖混勻靜置分層後，取3mL上層乙腈，用氮氣流吹至近幹，剩餘物用於丹醯氯衍生；向上述剩餘物中加入100 μ L碳酸鈉緩衝溶液(pH = 10.0)和100 μ L丹醯氯丙酮溶液(lmg/mL)，漩渦混勻，60°C水浴條件下，反應20min，冷卻至室溫後，直接進樣分析。2.2色譜條件和質譜條件Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100mmX2.1mm，1.8μ m);流動相:0.1% 甲酸的水溶液(A)和0.1 %甲酸的乙腈溶液(B);梯度洗脫程序=O-1min內保持10% B，l-3min內10% B線性升至50% B，3-1 Imin內50% B線性升至80% B，ll_18min內80% B線性升至 95% B, 18-21min 內 95% B 線性升至 100% B，21-21.5min 內 100% B 線性降至 10% B,21.5-24min內保持10% B ;流速:0.3mL/min ;柱溫:40°C;樣品室溫度:5°C;進樣量=IOyL0ESI陽離子模式；毛細管電壓3.0Kv ;錐孔電壓:40Kv ;提取錐電壓:4ν ;離子源溫度:120°C ;脫溶劑氣(氮氣)溫度:40(TC ;錐孔氣流量:40L/h ;脫溶劑氣流量:600L/h ;碰撞氣:氬氣；MS模式採集參數:質量範圍:100-800Da，掃描時間:0.2s。2.3標準曲線和檢出限用經檢測26種內分泌幹擾物含量均低於檢出限的空白奶粉作為基質樣品，按所述樣品前處理方法得到經C18固相萃取淨化後的乙腈樣品處理液。將標準曲線的6個濃度水平製備在6份完全相同的3mL該處理液中，之後的衍生、分析與樣品的操作一致。6個濃度水平分別為0.5、1.0,2.0,5.0、20和100ng/mL。各濃度水平內標濃度均為5.0ng/mL。標準曲線的繪製是基於在MS模式下提取窗口為0.02Da的母離子的提取色譜圖峰面積。以各待測物的母離子色譜峰面積與內標母離子色譜峰面積之比乘以內標的質量濃度(Y)為縱坐標，各待測物的質量濃度(X)為橫坐標繪製內標法校準曲線。以3倍信噪比(S/N)對應的樣品中待測物濃度作為檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)對應的樣品中待測物濃度作為定量限(LOQ)，獲得各待測物的檢出限和定量限。結果顯示(如表I所示)，相關係數均大於0.995，定量限和檢出限分別為0.007-0.2 μ g/kg和0.002-0.05 μ g/kg。表I 26種內分泌幹擾物的線性方程、相關係數、檢出限和定量限
權利要求
1.一種分析測定食品中多種內分泌幹擾物的方法，其特徵在於，該方法中，採用水溶解樣品，加入與水混溶的有機溶劑超聲提取待測物後，加入鈉鹽，使有機溶劑與水相分離，實現液液萃取；取定量有含有待測物的機溶劑，經C18填料的固相萃取淨化，丹醯氯衍生後，用超高效液相色譜串聯四極杆飛行時間質譜儀分析測定食品中多種內分泌幹擾物。
2.按權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的多種內分泌幹擾物為奶粉和液態奶中26種4類內分泌幹擾物，包括雌三醇、β-雌二醇、α-雌二醇、馬烯雌留酮、17 α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔諾酮、21 α -羥孕酮、17 α -羥孕酮和甲基炔諾酮；雙酚A、4_tert_ 丁基酚和4-tert-辛基酚；睪酮、雄烯二酮、康力龍、甲睪酮、群勃龍和諾龍。
3.按權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的方法其包括步驟: 1)樣品前處理: 取樣品用水充分溶解後，加入有機溶劑超聲提取待測物，加入鈉鹽，離心使水相與有機相分離；取含有待測物的有機溶劑提取液，用微氮氣流吹至近幹後，純水復溶，過C18填料固相萃取小柱，用乙腈水溶液洗脫待測物；向洗脫液中加入鈉鹽，離心使乙腈與水相分離；取乙腈提取液，用微氮氣流吹至近幹，用丹醯氯衍生在60°C反應得待測物，冷卻至室溫後，直接進樣分析； 2)超高效液相色譜串聯四極杆飛行時間質譜儀測定: 色譜柱採用C18柱，流動相為IOMm的甲酸銨水溶液和乙腈溶液，離子源採用陽離子模式； 其中，色譜條件:色譜柱:C18 ;柱長:100mm ;柱內徑:2.1mm ;填料粒徑:1.7 μ m ;流動相:10mM的乙酸銨的甲醇和水；流速:0.3mL/min ;梯度洗脫；色譜柱溫度:40°C ;進樣量為:10μ L ； 質譜條件:電噴霧離子源採用陽離子模式；霧化氣:氮氣；碰撞氣:氬氣；毛細管電壓:3.0kV ;去溶劑氣溫度:40(TC ;去溶劑氣流量:600L/h ;源溫度:120°C ;採樣錐電壓:40V ;錐孔氣流量:40L/h。
3)計算濃度: 採用基質匹配內標法，以峰面積計算樣品中26種內分泌幹擾物的含量。
4.按權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於，所述的有機溶劑選自乙腈或者丙酮。
5.按權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於，所述的鈉鹽選自氯化鈉或者硫酸鈉。
6.按權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於，所述的鈉鹽選自氯化鈉。
7.按權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於，所述的固相萃取乙腈洗脫液濃度為I: 50-80。
8.按權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的固相萃取乙腈洗脫液濃度為1: 60。
9.按權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於所述的衍生化溫度為60-80°C。
10.按權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於，所述的衍生化時間為10-30分鐘。
全文摘要
本發明屬於食品檢驗領域，涉及食品內內分泌幹擾物的分析測定方法，具體涉及一種分析測定奶粉和液態奶中多種內分泌幹擾物的方法。本發明採用水溶解樣品，加入與水混溶的有機溶劑超聲提取待測物後，加入鈉鹽，使有機溶劑與水相分離，實現液液萃取；取定量有含有待測物的機溶劑，經C18填料的固相萃取淨化，丹醯氯衍生後，用超高效液相色譜串聯四極杆飛行時間質譜儀同時分析測定食品中26種4類內分泌幹擾物。本發明方法能彌補現有技術中不能實現一次色譜進樣同時分析食品中多種內分泌幹擾物的缺陷，同時能提高四極杆飛行時間質譜儀的靈敏度，實現食品中內分泌幹擾物四極杆飛行時間質譜儀的準確分析。
文檔編號G01N30/06GK103185762SQ20111045881
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者王和興, 周穎, 姜慶五 申請人:復旦大學