Dna前處理緩衝液及菌體dna、核酸dna的製備方法

2023-10-30 11:00:02

專利名稱：Dna前處理緩衝液及菌體dna、核酸dna的製備方法
技術領域：
本發明涉及環境微生物樣本直接用於PCR反應的DNA前處理緩衝液及菌體DNA、核酸DNA的製備方法。
背景技術：
目前，用於環境樣本中汙水、汙泥等DNA的製備的方法多數為人工配置藥品，採用溶菌酶、反覆凍融結合CTAB或十二烷基磺酸鈉SDS法提取樣本中微生物的DNA，或用試劑盒製備，費用較高而且DNA提取效果不好，多為彌散的條帶，或者得率低；對於含有特殊的化學物質如油田汙水更加不容易提取，需要的時間較長，最後的效果不一定好。重要的是當環境樣本用於微生物分子生態學和特定菌種的定量檢測研究時，DNA的損失率較大，對於數量少的微生物根本無法提取，這樣的DNA用於微生物分子生態學的研究就不能夠全面地反映種群的結構和種群演替情況，用於環境樣本中微生物的定量檢測則更加不準確。

發明內容
針對環境微生物樣本中DNA提取的難度較大、得率小，甚至無法提取，樣品損失較大、費用較高，不能全面真實地反映環境樣本中微生物的種類和數量的問題，本發明提供一種環境微生物樣本(汙水、生物反應器汙泥等)直接用於PCR反應的DNA前處理緩衝液及菌體DNA、核酸DNA的製備方法，它具有成本低廉、快速，能夠獲得高質量的DNA，獲得的DNA能夠真實的反映環境樣本中微生物的數量和種類的優點。本發明的上述目的是通過下述技術方案實現的環境微生物樣本直接用於PCR反應的DNA前處理緩衝液由貯存液和十二烷基磺酸鈉製成，其中貯存液由下述成分組成70gNaCl、2g KCl、12gNa2HPO4和2g KH2PO4。
環境微生物樣本直接用於PCR反應的菌體DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、首先紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min後棄上清液0.9ml；c、在剩餘的0.1ml樣本中加入上述DNA前處理緩衝液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續充分震蕩2min，得到菌體DNA。所述環境微生物樣本為OD值≤0.1的汙水(例如油田水系統中汙水或生活汙水)。
環境微生物樣本直接用於PCR反應的核酸DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min後棄上清液0.9ml；c、在剩餘的0.1ml樣本中加入上述DNA前處理緩衝液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續充分震蕩2min，得到菌體DNA；d、在PCR管內加入10μl菌體DNA、4μlPCR緩衝液和6μl去離子水，在94℃反應5min、4℃反應1min的條件下循環5次，獲得核酸DNA。所述環境微生物樣本為OD值≤0.1的汙水(例如油田水系統中汙水或生活汙水)。
環境微生物樣本直接用於PCR反應的菌體DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中，同時加入0.9ml上述DNA前處理緩衝液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩衝液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重複b、c步驟；e、然後在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內加入DNA前處理緩衝液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，製備完畢得到菌體DNA。所述環境微生物樣本為生物反應器內的汙泥或汙水。
環境微生物樣本直接用於PCR反應的核酸DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中，同時加入0.9ml上述DNA前處理緩衝液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩衝液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重複b、c步驟；e、然後在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內加入DNA前處理緩衝液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，製備完畢得到菌體DNA；e、在PCR管內加入10μl菌體DNA、4μlPCR緩衝液和6μl去離子水，在94℃反應5min、4℃反應1min的條件下循環5次，獲得核酸DNA。所述環境微生物樣本為生物反應器內的汙泥或汙水。
「菌體DNA」是將環境樣本中的除微生物菌體以外的雜質去除，獲得在緩衝液中只含有微生物菌體的直接用於PCR擴增的以菌體直接作為模板的DNA。本發明的快速製備直接用於PCR擴增的菌體DNA的方法，是將環境樣本中的除微生物菌體以外的雜質去除，獲得在緩衝液中只含有微生物菌體的菌體DNA，它的意義在於對於建立環境樣本的文庫和定量檢測具有重要的意義，適用的分子生物學操作主要包擴常規的PCR、樣本中特意的基因的擴增，以及基於菌體DNA的目的微生物的快速檢測的研究。在菌體DNA的基礎上，一步法快速獲得核酸DNA，核酸DNA是我們通常意義的菌體裂解後的含有鹼基的核酸；它的意義和操作範圍是在分子生物學中必須以核酸為直接操作對象的分子生物學試驗，如分子雜交等。
本發明涉及的環境微生物的樣本主要包括，如油田水系統中汙水、生物反應器內的汙泥、生活汙水、土壤樣本等，能溶於水或部分溶於水的含有微生物的樣本。對於油田汙水採用震蕩的方法製備菌體DNA和核酸DNA。對於生物反應器內的汙水和汙泥採用震蕩加「梯度離心」的方法，除去大量的固體顆粒和雜質，能有效的使微生物從中分離開來，對於土壤樣本、能溶於水或部分溶於水的含有微生物的樣本來說，該方法同樣適用。本發明的方法其結果表明，快速製備直接用於PCR擴增的菌體DNA的方法，可以直接用於PCR反應，能夠有效的擴增出目的片段，該法對於含有大量的化學物質的油田汙水效果較好。對於汙水處理只需要20min，對於汙泥處理需要30min；在此基礎上的一步法快速獲得核酸DNA的方法，可以獲得較高濃度的DNA。油田汙水全部過程只需要45min即可，對於汙泥需要55min，本發明的方法成本極其低廉，快速，菌體DNA和核酸DNA的得率為98％以上，獲得的DNA能夠真實的反映環境樣本中微生物的種類和數量，可以用於各種分子生物學試驗。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式的DNA前處理緩衝液的組成成分和藥品濃度為10×的貯存液(70g NaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2PO4)和SDS，所述SDS的加入量為貯存液質量的1‰，工作液為稀釋10倍的DNA前處理緩衝液，pH為7.5。
具體實施例方式
二本實施方式的快速製備直接用於PCR擴增的菌體DNA的方法是通過以下步驟實現的(以石油汙水為例，OD值(吸光度)≤0.1)a、以下步驟在超淨工作檯下完成工作檯先紫外線滅菌20～40min，然後取樣將用含有高純氮氣的厭氧管取回的油田汙水的水樣，取1mL注入到經滅菌的1.5mL的離心管中；b、在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min，從管中輕輕的棄上清液0.9mL；c、在剩餘的0.1mL水樣中加入DNA前處理緩衝液0.9mL，在震蕩器上充分震蕩5min；d、13000r/min離心2min，棄上清液0.98mL，充分震蕩2min，製備完畢得到菌體DNA。短時間內使用4℃保存即可，長時間不用要-20℃保存。本實施方式所述DNA前處理緩衝液的組成成分和藥品濃度為10×的貯存液(70g NaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2PO4)和SDS，所述SDS的加入量為貯存液質量的1‰，工作液為稀釋10倍的DNA前處理緩衝液，pH為7.5。
具體實施例方式
三對於生物反應器內的汙泥處理主要採用梯度離心的方法，具體步驟為a、以下步驟在超淨工作檯下完成，紫外線滅菌工作檯20～40min，取樣將用滅菌管取回的反應器汙泥的水樣，取0.1mL注入到經滅菌的1.5mL的離心管中，同時加入0.9mL DNA前處理緩衝液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個1.5mL的離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩衝液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重複b、c步驟；e、13000r/min離心2min，棄上清液，管內加入DNA前處理緩衝液20μL，在震蕩器上充分震蕩5min，製備完畢得到菌體DNA。短時間內使用4℃保存即可，長時間不用要-20℃保存。本實施方式所述DNA前處理緩衝液的組成成分和藥品濃度為10×的貯存液(70gNaCl；2g KCl；12g Na2HPO4；2g KH2HPO4)和SDS，所述SDS的加入量為貯存液質量的1‰，工作液為稀釋10倍的DNA前處理緩衝液，pH為7.5。
具體實施例方式
四本實施方式與具體實施方式
二、三不同的是，一步法快速獲得核酸DNA可以用於各種分子生物學實驗，實驗的步驟在菌體DNA的方法的基礎上，增加兩步1、PCR管內為20μL體系，管內加入10μL的菌體DNA，4μL的PCR緩衝液Buffer(10×)，6μL的去離子水；2、PCR反應的體系94℃5min，4℃1min，然後94℃1min，4℃1min，循環5次，即可獲得核酸DNA，想獲得高純度的DNA，也可以將PCR產物放入帶過濾膜的離心管中，1200r/min離心2min即可。
本實施方式中，對於水質比較清澈的汙水來說，菌體DNA可以不經過具體實施方式
二、三中的處理，直接進行核酸DNA的製備，它同樣屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1.DNA前處理緩衝液，其特徵在於所述DNA前處理緩衝液由貯存液和十二烷基磺酸鈉製成，其中貯存液由下述成分組成70g NaCl、2g KCl、12gNa2HPO4和2g KH2PO4。
2.根據權利要求1所述的DNA前處理緩衝液，其特徵在於所述十二烷基磺酸鈉的加入量為貯存液質量的1‰。
3.菌體DNA的製備方法，其特徵在於所述菌體DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min後棄上清液0.9ml；c、在剩餘的0.1ml樣本中加入權利要求1所述DNA前處理緩衝液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續充分震蕩2min，得到菌體DNA。
4.根據權利要求3所述菌體DNA的製備方法，其特徵在於所述環境微生物樣本為OD值≤0.1的汙水。
5.菌體DNA的製備方法，其特徵在於所述菌體DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中，同時加入0.9ml權利要求1所述DNA前處理緩衝液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩衝液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重複b、c步驟；e、然後在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內加入DNA前處理緩衝液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，製備完畢得到菌體DNA。
6.根據權利要求5所述菌體DNA的製備方法，其特徵在於所述環境微生物樣本為生物反應器內的汙泥或汙水。
7.核酸DNA的製備方法，其特徵在於所述核酸DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中；b、樣本在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心1min後棄上清液0.9ml；c、在剩餘的0.1ml樣本中加入權利要求1所述DNA前處理緩衝液0.9ml，在震蕩器上充分震蕩5min，13000r/min離心2min，棄上清液0.98ml，繼續充分震蕩2min，得到菌體DNA；d、在PCR管內加入10μl菌體DNA、4μlPCR緩衝液和6μl去離子水，在94℃反應5min、4℃反應1min的條件下循環5次，獲得核酸DNA。
8.根據權利要求7所述核酸DNA的製備方法，其特徵在於所述環境微生物樣本為OD值≤0.1的汙水。
9.核酸DNA的製備方法，其特徵在於所述核酸DNA的製備方法是通過以下步驟實現的a、紫外線條件下對工作平臺滅菌20～40min，然後取環境微生物樣本0.1ml注入到經滅菌的離心管中，同時加入0.9ml權利要求1所述DNA前處理緩衝液，在震蕩器上充分震蕩5min；b、3600r/min離心1min，從管中搜集上清液移入另一個離心管中；c、加入與上清液等體積的DNA前處理緩衝液，再次在震蕩器上充分震蕩5min；d、重複b、c步驟；e、然後在13000r/min的條件下離心2min，棄上清液，管內加入DNA前處理緩衝液20μl，在震蕩器上充分震蕩5min，製備完畢得到菌體DNA；e、在PCR管內加入10μl菌體DNA、4μl PCR緩衝液和6μl去離子水，在94℃反應5min、4℃反應1min的條件下循環5次，獲得核酸DNA。
10.根據權利要求9所述核酸DNA的製備方法，其特徵在於所述環境微生物樣本為生物反應器內的汙水或汙泥。
全文摘要
DNA前處理緩衝液及菌體DNA、核酸DNA的製備方法，它涉及環境微生物樣本直接用於PCR反應的DNA前處理緩衝液及菌體DNA、核酸DNA的製備方法。針對環境微生物樣本中DNA提取的難度較大，得率小，甚至無法提取，樣品損失較大，費用較高，不能全面真實反映環境樣本中微生物的種類和數量的問題，本發明的DNA前處理緩衝液由貯存液和SDS製成。常規的汙水(OD值≤0.1)菌體DNA製備震蕩、離心、棄上清液、剩餘的樣本中加入DNA前處理緩衝液、震蕩、離心、棄上清液、震蕩。對於汙泥處理主要採用梯度離心的方法。一步法快速獲得核酸DNA的方法是在菌體DNA的基礎進行PCR擴增。本發明具有成本低廉、快速的優點。
文檔編號C07H21/04GK1752094SQ20051001045
公開日2006年3月29日 申請日期2005年10月21日 優先權日2005年10月21日
發明者魏利, 馬放 申請人:哈爾濱工業大學