快速鑑定與黃麴黴毒素b1互作的宿主蛋白的方法

2023-10-30 18:31:17

快速鑑定與黃麴黴毒素b1互作的宿主蛋白的方法
【專利摘要】本發明涉及一種通過固相層析尋找出黃麴黴毒素B1的結合蛋白的方法，利用該方法可以快速有效地找出該毒素的結合蛋白，進而促進對該毒素的致毒機理的研究。更加具體地，該方法包含，將黃麴黴毒素B1與載體蛋白進行偶聯，將偶聯複合物固定在PVDF膜上，讓偶聯複合物與總蛋白孵育，進行非特異性洗滌和特異性洗脫並進行質譜鑑定。通過體外結合驗證發現該方法得到的真菌毒素的互作蛋白準確度較高。
【專利說明】快速鑑定與黃麴黴毒素BI互作的宿主蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於蛋白質工程領域，具體涉及一種通過固相層析篩選與黃麴黴毒素B1結合的蛋白的方法及對其是否與AFB1具有結合性的體外驗證分析。
【背景技術】
[0002]真菌毒素是真菌在食品或飼料裡生長所產生的代謝產物，對人和動物有極大危害。歷年來有大量關於真菌毒素汙染糧食和作物，導致事物中毒事件的報導，其中常見到的真菌毒素有:黃麴黴毒素、黃綠青黴素、橘青黴素、T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌稀醇等。其中，黃麴黴毒素(Aflatoxins, AFT)是主要由黃麴黴{aspergillus /Yara1S)寄生麴黴(Aspergillus parasiticus)產生的次生代謝產物,汙染的食物主要是花生、玉米、稻穀、小麥、花生油等糧油食品。黃麴黴毒素在1993年被世界衛生組織的癌症研究機構劃定為I類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質，其毒性作用主要是對肝臟的損害。在天然食物中以黃麴黴毒素B1 (Aflatoxin B1, AFB1)最為多見，危害性也最強。動物實驗表明，AFB1具有強肝臟毒性和致癌效應。
[0003]一直以來科學家圍繞AFB1的產毒機理、毒素的致毒機理展開了大量研究，但由於該毒素是小分子的特點，針對毒素被動物細胞吸收的機理研究很少。本發明設計了一種快速鑑定與AFB1互作的蛋白的方法，本發明通過固相親和層析法尋找出黃麴黴毒素的結合蛋白，利用該方法可以快速有效地找出與AFB1互作的結合蛋白，為促進對該毒素的致毒機理的研究奠定基礎。本方法包含，將AFB1與載體蛋白進行偶聯，將毒素與載體蛋白的偶聯複合物固定在PVDF膜上，讓偶聯複合物與宿主的總蛋白孵育，進行非特異性洗滌和特異性洗脫並進行質譜鑑定。通過該方法得到的AFB1的互作蛋白準確度高，能為毒素被動物細胞吸收機理的研究打下基礎。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種快速鑑定與黃麴黴毒素BI互作的宿主蛋白的方法，通過固相層析篩選與黃麴黴毒素B1結合的蛋白的方法，及對其與AFB1是否具有結合性的體外驗證分析。經此方法的篩選和驗證，目前已經發現40S核糖體蛋白SA和雌二醇β脫氫酶5能與AFBi結合，是AFBi的互作蛋白。
[0005]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
一種快速鑑定與黃麴黴毒素B1互作的宿主蛋白的方法，是先將黃麴黴毒素B1與牛血清白蛋白進行偶聯，再通過固相層析的方法，篩選與黃麴黴毒素B1結合的蛋白，經質譜分析鑑定後，再通過體外結合實驗驗證蛋白與黃麴黴毒素B1的結合性。
[0006]所述的通過固相層析的方法來篩選與黃麴黴毒素B1結合的蛋白，是將牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1偶聯複合物展示在甲醇活化後的PVDF膜上，3-5°C過夜孵育；將孵育了牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1的PVDF膜用質量分數為2%牛血清蛋白溶液進行封閉後，將膜置於小鼠肝臟總蛋白溶液中3-5°C過夜孵育以充分結合，同時用只展示牛血清蛋白分子的PVDF膜置於小鼠肝臟總蛋白溶液中作為陰性對照；再用3-5°C預冷的磷酸鹽緩衝液或磷酸鹽吐溫緩衝液進行非特異性洗脫，3-5°C振搖lOmin，洗滌四次，用2M的NaCl進行特異性洗脫，3-5°C振搖30min，洗脫液中的互作蛋白濃縮後進行SDS-PAGE分析，銀染後取差異條帶進行質譜分析鑑定。
[0007]所述的通過體外結合實驗驗證蛋白與黃麴黴毒素B1的結合性，對經質譜鑑定的黃麴黴毒素B1互作蛋白進行基因克隆、誘導表達、純化後，通過ELISA的方法驗證相應蛋白與黃麴黴毒素B1的結合性；
所述的通過體外結合實驗驗證，具體步驟為:將牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1偶聯複合物包被於孔中，在3-5°C下過夜，2wt.%的牛血清蛋白溶液在37°C下封閉2 h後，加入純化的黃麴黴毒素B1互作蛋白37°C孵育2 h，再相繼加入一抗和二抗，最後相繼加入TMB顯色和H2SO4終止液，同時設置包被牛血清蛋白的陰性孔作為對照，經此方法驗證出40S核糖體蛋白SA和雌二醇β脫氫酶5與黃麴黴毒素B1有結合性。
[0008]所述的一抗為抗蛋白的His標籤抗體，37°C孵育I h ;二抗為抗His抗體的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，37°C孵育I h。
[0009]本發明的優點在於:真菌毒素是真菌在食品或飼料裡生長所產生的代謝產物，對人和動物有極大危害。一直以來科學家圍繞真菌毒素，特別是AFB1的致毒機理展開了大量研究，但由於該毒素是小分子的特點(很難鑑定與其互作的宿主蛋白)，針對毒素被動物細胞吸收的機理，以及被細胞吸收後細胞內與其互作蛋白的了解很少。本發明提供了一種確實可行，並且快速簡便的篩選與真菌毒素(以黃麴黴毒素為例)互作蛋白的方法，為進一步了解真菌毒素的致毒機理奠定基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1 AFBi的結構分子式。
[0011]圖2 AFB1與BSA偶聯路線。
[0012]圖3 AFBU BSA和偶聯產物三種物質的紫外掃描圖；其中I為牛血清蛋白；2為黃麴黴毒素B1 ；3為牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1偶聯複合物。
[0013]圖4 AFBl結合蛋白的SDS-PAGE分析；其中M為Marker ;1為牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1偶聯複合物；2為牛血清蛋白；3為牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1偶聯複合物；4為牛血清蛋白；1和2泳道是PBST洗滌組，3和4是PBS洗滌組。
[0014]圖5鑑定的AFB1結合蛋白的體外表達與純化。其中，A圖:Rpsa蛋白的表達純化。M:Marker ；1 =IPTG誘導PET28a菌菌液；2: IPTG誘導PET28a_rpsa重組菌菌液；3:純化的Rpsa蛋白；B圖:AkrIc6蛋白的表達純化。M:Marker ；1:1PTG誘導PET28a菌菌液；2 =IPTG誘導PET28a-akrlc6重組菌菌液；3:純化的Akrlc6蛋白；C圖:Cyb5a蛋白的表達純化。M:Marker ；1 =IPTG誘導PET28a菌菌液；2 =IPTG誘導PET28a_cyb5a重組菌菌液；3:純化的Cyb5a蛋白。
[0015]圖6鑑定的AFB1結合蛋白與AFB1的體外結合驗證。把交聯產物BSA-AFBl包被在酶標孔中，再加入純化的蛋白和一抗(抗蛋白的抗體)、二抗、顯色液、終止液，測OD值，通過OD值來判斷黃麴黴毒素BI與蛋白的結合性。【具體實施方式】
[0016]一、聚丙烯醯胺凝膠的配製
(1)2mol/L Tris-HCl (pH8.8):稱取24.2 g Tris base加適量超純水溶解，用鹽酸調PH值至8.8，加超純水定容至100 mL。
[0017](2)1 mol/L Tris-HCl (pH6.8):稱取 12.1 g Tris base 加適量超純水溶解，用鹽酸調PH值至6.8，加超純水定容至100mL。
[0018](3)30 %丙烯醯胺儲存液:稱取29.2 g丙烯醯胺，0.8 g N』，N』-亞甲叉雙丙烯醯胺，加超純水溶解至100 mL，待其完全溶解後用濾紙過濾，4 °C避光保存。
[0019](4) 10 % SDS:稱取10 g SDS (電泳級)，加超純水溶解至100 mL，室溫保存。
[0020](5) 10%過硫酸銨:稱取100 mg過硫酸銨，加超純水溶解至I mL。
[0021](6) 4X 分離膠緩衝液:量取 75 mL 2 mol/L Tris-HCl (pH8.8),4 mL 10% SDS,加2 ImL ddH20，可在4 °C保存數月。
[0022](7) 4X 濃縮膠緩衝液:量取 50 mL I mol/L Tris-HCl (pH6.8),4 mL 10% SDS,加46 mL ddH20，可在4 °〇保存數月。
[0023](8)電極緩衝液:稱取3 g Tris base, 14.4 g甘氨酸，I g SDS，加適量超純水溶解，用鹽酸調pH值 至8.3，加超純水定容至1000 mL。也可製成10X的儲存液，在室溫下可長期保存。
[0024](9) 5X 上樣緩衝液:稱取 10 mg溴酚藍，加入0.6 mL I mol/L Tris_HCl(pH6.8)，2.5 mL甘油，2 mL 10 % SDS, 0.5 mL β-疏基乙醇和4.4 mL ddH20，可在4 °C保存數周，
或在-20 °C保存數月。
[0025](10)考馬氏亮藍染色液:稱取I g考馬氏亮藍R-250，200 mL甲醇，50 mL冰醋酸，加蒸餾水溶解至500 mL。
[0026](11)考馬氏亮藍脫色液:量取450 mL甲醇，100 mL冰醋酸，加蒸餾水至1000 mL。
[0027]二、基因克隆及蛋白純化試劑名稱及方法
(O 1.0%瓊脂糖凝膠:稱取0.2 g瓊脂糖於20 mL0.5XTBE,加熱溶解，將其倒入制膠板中，插入梳子，
(2)5XTBE:稱量 54.0 g Tris 鹼，27.5 g 硼酸，加入 800 mL，加入 20 mL 0.5 mol/L的EDTA (pH8.0)，至充分溶解後用水定容到I L，室溫儲存。
[0028](3)LB 培養基:稱量 10 g Tryptone, 5 g Yeast Extract ,10 g NaCl，加入800 mL去離子水，pH值調至7.0，定容至I L，高溫高壓滅菌後，4°C保存。
[0029](4)氨苄青黴素(Amp) (100 mg/mL):溶解I g氨苄青黴素鈉鹽於足量的水中，最後定容至10 mL，過濾除菌，分裝成小份於-20°c貯存。
[0030](5)卡那黴素(Kan) (50 mg/mL):溶解0.5 g卡那黴素於足量的水中，最後定容至10 mL，過濾除菌，分裝成小份於-20°C貯存。
[0031](6)IPTG (異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)(I mol/L):溶解 238 mg 的 IPTG 於 I mL水中，過濾除菌，貯存於_20°C。
[0032](7)0.1 mol/L CaCl2:稱取54 g CaC12_6H20，去離子水將溶液定容至 I L，用 0.22μ m濾器過濾除菌，分裝成10 mL小份貯存於_20°C。(8) Buffer B, C, D, E ( L_l):稱取 13.8 g NaHP04.H20,1.2 g Tris Base,480.5g尿素，溶解後，分別調節pH至8.0，6.3，5.9，4.5，使用前調節pH值。
[0033]三、ELISA方法中各試劑的名稱及配製方法
(I)0.05 M的碳酸鹽包被緩衝液(pH 9.6):分別稱取1.59 g碳酸鈉和2.93 g的碳酸氫鈉溶解於800 mL的雙蒸水中,用2 mol/L的氫氧化鈉調節其pH值至9.6,最後定容至1000 mL。
[0034](2) IX 磷酸鹽緩衝液(PBS):稱取 NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HP04.12H20 3.58g, KH2P04 0.27 g，溶於 I L 水中，調 pH 至 7.2 ~7.4，121 °C高壓滅菌 20 min。
[0035](3) 5%PBSM封閉液:在IOOmL的I XPBS ( pH 7.4)中加入4g的脫脂奶粉。
[0036](4) PBST 洗脫液:即含有 Tween-20 濃度為 0.05% 的 I XPBS。在 1000 mL 的I X PBS (pH 7.4)中加入 0.5 mL 的 Tween-20?
[0037](5)底物顯色A液:分別稱取27.2 g乙酸鈉和3.2 g檸檬酸於1000 mL燒杯中，加入0.6 mL的30%的雙氧水,最後定容至1000 mL。
[0038](6)底物顯色B液:分別稱取0.4 g乙二胺四乙酸鈉、1.9 g檸檬酸和0.4 g四甲基聯苯胺(TMB)於1000 mL燒杯中，加入100 mL甘油，最後定容至1000 mL。
[0039](7)終止液(2 mol/L硫酸):取111 mL的濃硫酸緩慢的滴入889 mL的雙蒸水中混勻即可。
[0040]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明，以下實施例是為了進一步說明本發明，但不應視為限制本發明。
[0041]實施例1快速鑑定與黃麴黴毒素B1互作的宿主(小白鼠)蛋白 I)真菌毒素與載體蛋白進行偶聯
黃麴黴毒素B1 (Aflatoxin B1簡稱AFB1)，購於美國Simga公司。根據AFB1的結構特點，採用碳二亞胺法進行偶聯。首先進行肟化反應，取2mg AFB ι與4mg CMO溶解於400 I吡啶中，25°C避光振搖反應4h，將反應產物冷凍乾燥即得AFB1肟化產物；取0.2mg AFB ι肟肟化產物溶於100 μ L DMF-水(6:9 V/V )中，加入2mg EDC避光混勻，再加入0.5% C-BSA溶液，25°C避光、100r/min反應4h後，再補加EDC 2mg繼續反應20h。將所得偶聯產物裝入透析袋在0.01mol/L PBS(pH7.4)中，置4°C透析3d，期間更換透析液。並對AFB1X-BSA和偶聯產物三種物質進行紫外掃描，比較偶聯產物吸收峰的變化。
[0042]2)將偶聯的複合物固定在PVDF膜上；
剪取10cm*lcm的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，在甲醇溶液中活化5s後，用PBS溶液加以洗滌，置於BSA-AFB1溶液中，於4°C慢搖過夜，讓蛋白分子與膜充分結合從而通過BSA將AFB1展示在膜表面。
[0043]3)將偶聯複合物與總蛋白孵育，偶聯複合物與總蛋白相互結合；
按碧雲天公司的細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒操作步驟提取小白鼠肝臟總蛋白，測蛋白濃度，並用PBS溶液將所提取的總蛋白稀釋至2mg/ml。將孵育了 BSA-AFB1的PVDF膜用2%BSA溶液進行封閉後，取膜置於小鼠肝臟總蛋白溶液中，於4°C慢搖孵育過夜，讓蛋白分子與AFB1或BSA進行結合。同時用只包被BSA分子的PVDF膜置於小鼠肝臟總蛋白溶液中作為陰性對照。
[0044]4)進行非特異性洗滌、特異性洗脫，得到與真菌毒素互作的蛋白。[0045]取4°C預冷的PBS或PBST緩衝液對孵育後的膜進行非特異性洗滌，每次40mL，4°C振搖lOmin，洗滌四次。取4°C預冷的含2M NaCl的PBS緩衝液對洗滌後的膜進行特異性洗脫，4°C振搖30min，收集洗脫溶液。將所得洗脫溶液裝入透析袋在0.01mol/L PBS (pH7.4)中，置4°C透析2d，期間更換透析液，並用PEG20000對透析後的溶液進行濃縮。然後將實驗組與對照組進行進一步的SDS-PAGE分析，銀染後可見有8條差異條帶，將其割膠進行質譜分析鑑定。具體質譜分析條件如下:
LC條件:高效液相色譜儀:Thermo Scientific Accera System ;色譜柱:BioBasic C18Column (100 x 0.18 mm,particle size: 5 um);樣品量:10uL ;流動相:A:水相(0.1% 甲酸)；B:已臆(0.1% 甲酸)；梯度:5% - 35%B in 20 minutes, 35% - 95%B in 2 minutes ;流速:2.5uL/min ；
MS條件:質譜儀:LTQ-XL(Thermo Scientific);噴霧電壓:3.5 kV;毛細管溫度:275°C ;鞘氣流速:15arb ;母離子掃描範圍:400-2000m/z ；Isolation width:2 Da0
[0046]二級質譜條件:AGC Target le4，I microscans ;碰撞能量:35% CID0
檢索:搜索使用的資料庫為從UNIPR0T (http://www.uniprot.0rg/)下載的Musmusculus.fasta蛋白庫。質譜分析所獲得的原始數據用Proteome Discovererl.2軟體進行相對定量分析。
[0047]5)質譜結果分析
對質譜結果進行分析，將與對應的條帶大小不一致及匹配肽段太小的蛋白刪掉，得到32種蛋白；再經文獻分析，最後確定有必要進一步驗證的二種蛋白:40S核糖體蛋白SA(Rpsa)和雌二醇β脫氫酶5 (Akrlc6)，細胞色素b5 (Cyb5a)。
[0048]表1 AFB1結合蛋白條帶的質譜分析
【權利要求】
1.一種快速鑑定與黃麴黴毒素B1互作的宿主蛋白的方法，其特徵在於:先將黃麴黴毒素&與牛血清白蛋白進行偶聯，再通過固相層析的方法，篩選與黃麴黴毒素B1結合的蛋白，經質譜分析鑑定後，再通過體外結合實驗驗證蛋白與黃麴黴毒素B1的結合性。
2.根據權利要求1所述的一種快速鑑定與黃麴黴毒素B1互作的宿主蛋白的方法，其特徵在於:所述的通過固相層析的方法來篩選與黃麴黴毒素B1結合的蛋白，是將牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1偶聯複合物展示在甲醇活化後的PVDF膜上，3-5°C過夜孵育；將孵育了牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1的PVDF膜用質量分數為2%牛血清蛋白溶液進行封閉後，將膜置於小鼠肝臟總蛋白溶液中3-5°C過夜孵育以充分結合，同時用只展示牛血清蛋白分子的PVDF膜置於小鼠肝臟總蛋白溶液中作為陰性對照；再用3-5°C預冷的磷酸鹽緩衝液或磷酸鹽吐溫緩衝液進行非特異性洗脫，3-5°C振搖10-15min，洗滌三-四次，用2M的NaCl進行特異性洗脫，3-5°C振搖25-30min，洗脫液中的互作蛋白濃縮後進行SDS-PAGE分析，銀染後取差異條帶進行質譜分析鑑定。
3.根據權利要求1所述的一種快速鑑定與黃麴黴毒素B1互作的宿主蛋白的方法，其特徵在於:所述的通過體外結合實驗驗證蛋白與黃麴黴毒素B1的結合性，對經質譜鑑定的黃麴黴毒素B1互作蛋白進行基因克隆、誘導表達、純化後，通過ELISA的方法驗證相應蛋白與黃麴黴毒素B1的結合性。
4.根據權利要求3所述的一種快速鑑定與黃麴黴毒素B1互作的宿主蛋白的方法，其特徵在於:所述的通過體外結合實驗驗證，具體步驟為:將牛血清蛋白-黃麴黴毒素B1偶聯複合物包被於孔中，在3-5°C下過夜，2wt.%的牛血清蛋白溶液在37°C下封閉2 h後，加入純化的黃麴黴毒素B1互作蛋白37°C孵育2 h，再相繼加入一抗和二抗，最後相繼加入TMB顯色和H2SO4終止液，同時設置包被牛血清蛋白的陰性孔作為對照，經此方法驗證出40S核糖體蛋白SA和雌二醇β脫氫酶5與黃麴黴毒素B1有結合性。
5.根據權利要求4所述的一種快速鑑定與黃麴黴毒素B1互作的宿主蛋白的方法，其特徵在於:所述的一抗為抗蛋白的His標籤抗體，37°C孵育I h ;二抗為抗His抗體的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，37°C孵育I h。
【文檔編號】G01N33/68GK103743913SQ201410031331
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】莊振宏, 黃亞玲, 汪世華, 袁軍 申請人:福建農林大學