microRNA生物標誌物及其用途的製作方法

2023-10-30 04:37:32 1

專利名稱：microRNA生物標誌物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬 於生物技術和醫學領域，涉及一種分析血清/血漿樣本中microRNA的穩 定性、並發現一組microRNA生物標誌物及其在肝癌患者檢測中的應用。本發明提供的生物 標誌物、檢測方法和檢測試劑盒具備早期篩查和診斷肝癌的能力。
背景技術：
microRNAs (miRNAs)是一類非編碼的長度為17 25nt的小RNA分子。它具有高 度保守性、時序性和組織特異性，在細胞生長和發育的調節過程中起多種作用。約50%的已 知人類miRNA基因定位於和腫瘤相關的染色體區域，而不斷累積的研究成果也已充分證實 miRNA的異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關。血液是醫學診斷中最常用的樣本來源。當前對於血液的臨床分析集中在一些蛋 白因子中，因核酸獲得困難且含量少、質量不高而很少涉及核酸。近年來有研究發現，血液 中的外源RNA與細胞內RNA相比，很少存在核糖體RNA，多數為< 30nt、獨立於細胞之外的 miRNA分子，它在人體中普遍存在。人體組織、血液及各種體液，包括汗液、尿液、淚液、羊水 等都存在小RNA。通常，血液中的miRNA與未成熟的膠原蛋白等形成顆粒存在，因而具有良 好的抗RNase降解能力，有較高的穩定性，因此可作為新的分子生物學標誌。目前，對miRNA 穩定性研究僅局限於存放時間、溫度及反覆凍融等，對血清RNA的穩定性研究未見系統化 分析報導。作為生物檢測樣本，血清具有取材方便，無創傷性，並可連續體外檢測的優點，由 於血清中miRNA特殊的穩定性，因此使基於miRNA定性和定量檢測技術尋找癌症特異性的 血清miRNA作為分子標記物的方法比傳統的蛋白分子標記方法將更加有效，進而可以克服 分子標記在抗體製備和定量分析上發展所遇到的瓶頸。因此，開發一種可輔助肝癌早期篩 查和診斷的血清miRNA作為生物標記物，具有廣泛的科研價值和臨床應用前景。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種miRNA生物標誌物及其用途。為了解決上述技術問題，本發明提供一種microRNA (miRNA)生物標誌物為 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 中的任意 1 個miR-21 :uagcuuaucagacugauguugamiR-25 cauugcacuugucucggucugamiR-29c :uagcaccauuugaaaucgguuamiR-93 caaagugcuguucgugcagguagmiR-198 gguccagaggggagauagguucmiR-221 agcuacauugucugcuggguuucmiR-222 :agcuacaucuggcuacugggu。本發明還同時提供了上述miRNA生物標誌物的用途用於製備具有肝癌檢測能力的試劑盒。本發明還同時提供了一種具有肝癌檢測能力的試劑盒，該試劑盒由反轉錄系統、 擴增系統和引物系統組成；所述反轉錄系統由M-MLV反轉錄酶、反轉錄體系5 XM-MLV緩衝液和RNase抑制劑 組成；所述擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，其包括real-time PCRMaster Mix 禾口 50XROX reference引物系統由 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 中的 任意1個的莖環(莖環結構)引物和擴增引物組成miR-21 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACA TC-3，miR-25 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGAC CG-3，miR-29c 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACC GAT-3'miR-93 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACCTACCT GC-3，miR-198 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACC TAT-3'miR-221 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAAC CCA-3'miR-222 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCA
G-3，miR-21 PCR 正向引物5，miR-21 PCR 反向引物5，miR-25 PCR 正向引物5，miR-25 PCR 反向引物5，miR_29c PCR 正向引物5miR_29c PCR 反向引物5miR-93 PCR 正向引物5，miR-93 PCR 反向引物5，miR-198 PCR 正向引物5miR-198 PCR 反向引物5miR-221 PCR 正向引物5miR-221 PCR 反向引物5miR-222 PCR 正向引物5miR-222 PCR 反向引物518S rRNA PCR 正向引物5，-AAGACGGACCAGAGCGAA-3『
-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3『 -CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3』 -GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3』 -GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3』 『-CCCCGCCTAGCACCATTTGAAAT-3， 』 -CAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3『 -CGCCCAAAGTGCTGTTCGTG-3』 -GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3』 『-GGGGGTCCAGAGGGGAGATAGGT-3『 』 -AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3』 』 -GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3『 』 -GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3』 』 -GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3『 』 -AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3』
18S rRNA PCR 反向引物5，-GGCGGGTCATGGGAAT-3，。本發明還同時提供一種對miRNA穩定性分析的方法，對血清/血漿樣本進行一系 列條件的處理，包括以下步驟1)血清/血漿樣本不同溫度下處理3h :-80°C、-20°C、4°C、室溫(10 25°C )和 37 °C ；2)室溫下血清/血漿樣本不同存放時間的處理0、l、3、6、12、24h ；3) 370C RNaseA不同時間條件消化血清/血漿樣本的處理0、3、6、12h ；4) 370C DNase I不同時間條件消化血清/血漿樣本的處理0、3、6、12h ；5)血清/血漿樣本經不同反覆凍融次數的處理0、2、5、7、10次；6)37°C血清/血漿樣本經不同pH值溶液的處理對照、pH = 1、6、9、13 ；7)血清/血漿樣本經RT-qPCR方法進行血清/血漿RNA穩定性分析。由該系統方法得到miRNA是穩定的，具有成為標誌物的潛力。在本發明中，具有肝癌檢測能力的試劑盒的使用步驟如下1)獲取來源於被檢測個體的生物樣本；2)利用特異性的檢測技術檢測樣本中生物標誌物的表達；3)判定被檢測個體是否患有肝癌。上述步驟1)中的生物樣本為以下任意一種分離的被檢測個體的血清或血漿，或 者為分離的被檢測個體的肝組織，或者為分離的被檢測個體的唾液、汗液、尿液、淚液、羊水 或其它體液。上述步驟2)中的生物標誌物的檢測是對分離的血清或血漿進行直接檢測，或者 對血清或血漿中純化的RNA樣本進行檢測。特異性的檢測技術為實時螢光定量PCR技術， 該實時螢光定量PCR技術為莖環引物法或TaqMan探針法。本發明的目的之一在於通過一系列苛刻條件(不同溫度、不同存放時間、RNase A、 DNase I、不同反覆凍融次數和不同pH值溶液)處理血清，進而分析血清中miRNA的穩定性。本發明的目的之二，針對現有肝腫瘤標誌物敏感性和特異性不能滿足臨床診斷的 需要，本發明提出一組穩定的、高效率檢測肝癌的血清標誌物及其在輔助肝癌早期篩查與 臨床診斷中的應用。本發明所述的腫瘤血清標誌物，由miR-21、miR_25、miR_29c、miR-93、miR-198、 miR-221 和 miR-222 組成。本發明通過實驗方法得出以下結論，確定了血清中miRNA的穩定性，從而發現了 7 條miRNA可作為肝癌早期篩查與臨床診斷的血清學生物標記物；具體如下1. miRNA在血清中的特異性表達如圖1所示，經過RT-PCR定性檢測及PCR產物序列測定和分析表明，在肝癌細胞 系Huh-7總RNA (圖1-A)，肝癌組織總RNA (圖1-B)，血清總RNA (圖1-C)和血清(圖1-D) 中均檢測到目標miRNA的特異性表達，說明18S rRNA、miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221和miR-222等8種RNA在肝癌細胞系、肝癌組織及血清中均存在，為後續
實驗提供基礎。2. miRNA的穩定性研究如圖2 圖4所示，細胞系、組織樣本提取得到的總RNA/血清直接用於不同溫度下處理 3h :-80°C、-20°C、4°C、室溫和 37°C (A)；不同存放時間處理0、1、3、6、12、24h(B)； 37°C RNase A不同時間消化處理0、3、6、12h (C) ；37°C DNase I不同時間消化處理0、3、6、 12h(D)；不同反覆凍融次數處理0、2、5、7、10次(E) ；37°C不同pH值溶液的處理對照、pH =1、6、9、13(F)後，各miRNA的表達較對照相比差別不大，但mRNA(18S rRNA)顯著降低。 miRNA在各種介質的各種苛刻條件下都是穩定的，由此說明miRNA具有成為腫瘤標誌物的 潛力。3. miRNA在血清中的個體差異性分析及性別相關性分析如圖5 所示 ，miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 共 7條miRNA表達水平的Ct值分布較集中(圖5-A)。各miRNA表達水平經Pearson相關性 分析得到R值接近1，ρ < 0. 05 (圖5-B)。該結果說明Pearson相關性分析結果可靠，且 miRNA的表達在個體間相關性好，個體差異性很小。血清中miRNA的性別相關性分析，R2 = 0. 0953 (圖5-C)表明，肝癌特異的miRNA的表達與性別無關。4.臨床肝癌血清樣本的檢測分析如圖6所示，經臨床肝癌血清樣本和正常血清樣本各10例的RT-qPCR分析作圖 可得，miR-21 (圖 6-A)、miR-25 (圖 6_B)、miR_29c (圖 6_C)、miR-93 (圖 6_D)、miR-198 (圖 6-E) ,miR-221 (圖6-F)和miR-222 (圖6-G) 7條miRNA肝癌血清樣本中檢測所得的Ct值顯 著低於正常血清樣本的Ct值，從而推得該7條miRNA在肝癌血清樣本中的表達顯著高於正 常血清樣本。也即該7條miRNA可特異性檢測肝癌，是肝癌腫瘤標誌物。本發明人經過廣泛而深入的研究，首次系統分析血清中miRNA的穩定性；首次鑑 別和分離了與肝癌相關的血清miRNA，在此基礎上完成了本發明；首次通過miRNA實時定量 PCR 技術在血清中對 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 的表 達水平進行檢測，進一步分析這些miRNA在血清中檢測的個體差異性與相別相關性，並以 臨床肝癌血清樣本為材料，提供了針對肝癌血清miRNA檢測的試劑盒。所提供的試劑盒專 門針對於血清miRNA的檢測分析，結果準確可靠。本發明的有益效果(1)本發明系統化分析了血清中miRNA的穩定性，為其成為新 的血清來源腫瘤標誌物提供基礎；(2)由於血清具有取材方便，無創傷性，並可連續體外檢 測的優點，因此從血清中尋找生物標誌物可以將肝癌的早期篩查和診斷提高至一個新的水 平，進而提高治癒率和降低死亡率；(3)通過實時螢光定量PCR技術對肝癌臨床樣本的血清 水平miRNA的檢測，定量準確，相對於晶片技術或者分子雜交技術(NorthernBlot)，該方法 簡便快速且經濟實用；(4)該腫瘤標誌物可與其他分子指標相結合，為肝癌篩查，診斷，治 療與預後提供新的綜合性試劑盒，方便臨床應用。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖 1 :RT-PCR 定性檢測 18S rRNA、miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、miR-198、 miR-221和miR-222在肝癌細胞系Huh-7總RNA(圖1_A)、組織總RNA(圖1_B)、血清總 RNA(圖1-C)及血清(圖1-D)中的特異性表達。圖2 肝癌Huh-7細胞系中miRNA的穩定性分析；A表示肝癌Huh-7細胞系提取得到的總RNA分別在_80°C、_20°C、4°C、室溫和37°C下處理3h後各基因的擴增情況，即相對表達量；B表示肝癌Huh-7細胞系提取得到的總RNA在室溫下分別放置0、1、3、6、12、24h後
各基因的擴增情況，即相對表達量；C表示肝癌Huh-7細 胞系提取得到的總RNA在37°C時，經RNase A分別消化0、3、 6、12h後各基因的擴增情況，即相對表達量；D表示肝癌Huh-7細胞系提取得到的總RNA在37°C時，經DNase I分別消化0、3、 6、12h後各基因的擴增情況，即相對表達量；E表示肝癌Huh-7細胞系提取得到的總RNA分別經反覆凍融處理0、2、5、7、10次後 各基因的擴增情況，即相對表達量；F表示肝癌Huh-7細胞系提取得到的總RNA在37°C時，分別經不同pH值溶液的處 理對照、PH = 1、6、9、13後各基因的擴增情況，即相對表達量。 圖3 肝癌組織中miRNA的穩定性分析；A表示肝癌組織提取得到的總RNA分別在_80°C、-20°C、4°C、室溫和37°C下處理 3h後各基因的擴增情況，即相對表達量；B表示肝癌組織提取得到的總RNA在室溫下分別放置0、l、3、6、12、24h後各基因的 擴增情況，即相對表達量；C表示肝癌組織提取得到的總RNA在37°C時，經RNase A分別消化0、3、6、12h後 各基因的擴增情況，即相對表達量；D表示肝癌組織提取得到的總RNA在37°C時，經DNase I分別消化0、3、6、12h後 各基因的擴增情況，即相對表達量；E表示肝癌組織提取得到的總RNA分別經反覆凍融處理0、2、5、7、10次後各基因的 擴增情況，即相對表達量；F表示肝癌組織提取得到的總RNA在37°C時，分別經不同pH值溶液的處理對照、 pH = 1、6、9、13後各基因的擴增情況，即相對表達量。圖4 血清中miRNA的穩定性分析；A表示血清樣本分別在-80°C、-20°C、4°C、室溫和37°C下處理3h後各基因的擴增 情況，即相對表達量；B表示血清樣本在室溫下分別放置0、l、3、6、12、24h後各基因的擴增情況，即相對
表達量；C表示血清樣本在37°C時，經RNaseA分別消化0、3、6、12h後各基因的擴增情況， 即相對表達量；D表示血清樣本在37°C時，經DNase I分別消化0、3、6、12h後各基因的擴增情況， 即相對表達量；E表示血清樣本分別經反覆凍融處理0、2、5、7、10次後各基因的擴增情況，即相對
表達量；F表示血清樣本在37°C時，分別經不同pH值溶液的處理對照、pH = 1、6、9、13後
各基因的擴增情況，即相對表達量。圖5 血清中miRNA的個體差異性分析和性別相關性分析；A表示血清中miRNA的Ct值分布；
B表示血清中miRNA的Pearson相關性分析；C表示血清中miRNA的性別相關性分析。圖6 :7條miRNA在肝癌血清/正常血清樣本中的Ct值比較分析；A表示miR-21在肝癌血清/正常血清樣本中擴增後的Ct值；B表示miR-25在肝癌血清/正常血清樣本中擴增後的Ct值；C表示miR-29c在肝癌血清/正常血清樣本中擴增後的Ct值；
D表示miR-93在肝癌血清/正常血清樣本中擴增後的Ct值；E表示miR-198在肝癌血清/正常血清樣本中擴增後的Ct值；F表示miR-221在肝癌血清/正常血清樣本中擴增後的Ct值；G表示miR-222在肝癌血清/正常血清樣本中擴增後的Ct值。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面通過實施例對本發明進行更 加詳細的說明。實施例1生物標誌物及檢測引物和探針本發明提供了一組miRNA 生物標誌物，包含 miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221和miR-222。該組生物標誌物的具體序列如下miR-21 :uagcuuaucagacugauguuga(SEQ ID NO 1)miR-25 :cauugcacuugucucggucuga(SEQ ID NO :2)miR_29c :uagcaccauuugaaaucgguua(SEQ ID NO :3)miR-93 :caaagugcuguucgugcagguag(SEQ ID NO :4)miR-198 :gguccagaggggagauagguuc(SEQ ID NO :5)miR-221 :agcuacauugucugcuggguuuc(SEQ ID NO :6)miR-222 :agcuacaucuggcuacugggu(SEQ ID NO :7)莖環引物法用莖環引物法檢測miRNA的表達，需要針對miRNA的具體序列涉及特 異性莖環引物、及PCR引物。在PCR擴增過程中，用SYBR-green顯色實時定量地檢測目標 miRNA的擴增情況。莖環引物和相應的PCR擴增引物的具體信息如下miR-21 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACA TC-3，(SEQ ID NO 8)miR-25 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGAC CG-3，(SEQ ID NO 9)miR-29c 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACC GAT-3，(SEQ ID NO 10)miR-93 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACCTACCT GC-3，(SEQ ID NO 11)miR-198 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACC TAT-3，(SEQ ID NO 12)miR-221 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAAC CCA-3，(SEQ ID NO 13)
miR-222 蓮環引物5，-GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCAG-3，(SEQ ID NO: 14)miR-21 PCR 正向引物5，-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3，(SEQ ID NO 15)miR-21 PCR 反向引物5，-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3，(SEQ ID NO 16)miR-25 PCR 正向引物5，-GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3，(SEQ ID NO 17)miR-25 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 18)miR-29c PCR 正向引物5，-CCCCGCCTAGCACCATTTGAAAT-3，(SEQ ID NO 19)miR-29c PCR 反向引物5，-CAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 20)miR-93 PCR 正向引物5，-CGCCCAAAGTGCTGTTCGTG-3，(SEQ ID NO 21)miR-93 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 22)miR-198 PCR 正向引物5，-GGGGGTCCAGAGGGGAGATAGGT-3，(SEQ ID NO 23)miR-198 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 24)miR-221 PCR 正向引物5，-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3，(SEQ ID NO 25)miR-221 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 26)miR-222 PCR 正向引物5，-GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3，(SEQ ID NO 27)miR-222 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3，(SEQ ID NO 28)18S rRNA PCR 正向引物5，-AAGACGGACCAGAGCGAA-3，(SEQ ID NO 29)18S rRNA PCR 反向引物5，-GGCGGGTCATGGGAAT-3，(SEQ ID NO 30)實施例2實驗材料及實驗試劑本發明中使用肝癌細胞系Huh-7、肝癌組織及22例臨床正常血清樣本(其中包括 男性、女性各11例)、10例臨床肝癌血清樣本。上述均為離體組織。實驗試劑均為常用的分子生物學試劑，主要有=Trizol試劑，氯仿，異丙醇，乙醇， DNA聚丙烯醯胺凝膠電泳試劑等常規生化試劑均購於上海生工公司。M-MLV反轉錄酶與 RNase抑制劑、反轉錄用dNTP混合物(各10mM，RNase-free)均購自TaKaRa公司。螢光定 量PCR試劑盒為TOYOBO產品。實施例3莖環引物法檢測肝癌細胞系、組織及血清中miRNA的表達l、cDNA 合成在4個無RNaseWO. 2mL PCR管中分別加入IOOng肝癌Huh_7細胞系總RNA、IOOng 肝癌組織總RNA、40ng血清提取得到的RNA、13 μ L血清，上述若總體積不足13 μ L則加DEPC 水補至總體積13 μ L，然後70°C變性8min後迅速置於冰上3min，再依次加入0. 5 μ LRNase 抑制劑(40U/ μ L)，1 μ L dNTP 混合物(各 10mM，RNase-free)，4 μ L 5 X M-MLV 緩衝液， 1 μ L實施例1所告知的莖環引物(2 μ Μ)和0. 5 μ L M-MLV反轉錄酶(200U/ μ L)，使總體積 至20 μ L，混勻後稍離心，在PCR儀中進行cDNA第一鏈合成，反應參數設置為16°C 15min, 42°C 60min 和 85°C 5min。得模板 cDNA。即，本發明的7個莖環引物和18S rRNA分別各對應肝癌Huh-7細胞系總RNA、或肝 癌組織總RNA、或血清提取得到的RNA、或血清，因此對應的有32個模板cDNA。2、將cDNA產物進行PCR擴增反應在0. 2mL PCR管中依次加入2 μ L IOXPCR反應緩衝液，1. 6 μ L dNTP混合物(各 IOmM)，0. 1 μ LTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，對應的PCR正向和反向引物(10 μ Μ)各0.4 μ L，0. 8 μ L模板cDNA (步驟1所得)和去離子水14. 7 μ L，總體積為20 μ L。混勻後稍離心在 PCR儀中進行擴增反應。反應參數為94°C 3min，循環條件為94°C 15s，60°C 30s, 72°C lmin， 共35個循環。反應結束後取4yL反應液，進行12% DNA聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳結果 如圖1所示。圖1中的M代表20bp DNA Ladder。根據該圖，可得知經過RT-PCR定性檢測 及PCR產物序列測定和分析表明，在肝癌細胞系Huh-7總RNA (圖1-A)，肝癌組織總RNA (圖 1-B)，血清總RNA (圖1-C)和血清(圖1-D)中均檢測到目標miRNA的特異性表達，說明18S rRNA、miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 等 8 中 RNA 在肝癌 細胞系、肝癌組織及血清中均存在，為後續實驗提供基礎。 3、將cDNA進行螢光定量PCR在新的0. 2mL PCR 反應管中依次加入 10 μ L real-time PCR Master Μ χ,Ο. 4μ L 50 X ROXreference，相應的PCR正向和反向引物(10 μ Μ)各0. 4 μ L，2 μ L模板cDNA (步驟 1所得)和6. 8μ L去離子水。混勻後進行PCR反應，反應條件為95°C lmin，循環條件為 950C 15s和60°C lmin，共40個循環。通過該反應可得該8條基因在不同樣本中的表達量， 進而進行後續分析。4、數據處理螢光定量PCR定量檢測miRNA的相對表達變化量時，表達量倍數的變化用公 式RQ = 」Cr ,其中ACt = CTtreatfflent-CTcontrolo統計學分析採用SPSS16. O統計分析軟體， Excel2003等數據分析工具，當相對標準誤(STDEV) < 0. 5，ρ值彡0. 05時，認為結果在統 計學上有顯著性差異。如圖2-5所示，分析內容包括該8條基因在系統穩定性處理前後表 達量的比較；miRNA在血清中表達的個體差異性分析和性別相關性分析。該結果說明miRNA 在肝癌細胞系、組織及血清中穩定存在，可作為肝癌的生物標誌物。根據圖2，可得知肝癌Huh-7細胞系提取得到的總RNA經系統處理後，各miRNA的 表達量較對照相比差別不大，但18S rRNA的表達量較對照相比顯著降低。根據圖3，可得知肝癌組織提取得到的總RNA經系統處理後，各miRNA的表達量 較對照相比差別不大，但18S rRNA的表達量較對照相比顯著降低。根據圖4，可得知血清樣本經系統處理後，各miRNA的表達量較對照相比差別不 大，但18S rRNA的表達量較對照相比顯著降低。根據圖5，可得知血清中miRNA擴增所得的Ct值分布較集中，該7條本發明的 miRNA在血清中表達的個體差異性小且與性別不相關。因此，我們得出以下結論miRNA在肝癌細胞系、組織及血清中穩定存在，在血清 中表達的個體差異性小且與性別不相關，可作為肝癌的生物標誌物。實施例4利用本發明提供的試劑盒檢測樣本中miRNA的表達一種用於篩查和診斷肝癌病人療效與預後的試劑盒，擴增系統和引物系統組成。 其中，反轉錄系統由反轉錄酶、反轉錄體系緩衝液和RNA酶抑制劑組成；擴增系統由含Taq 酶的miRNA表達定量檢測混合液組成；引物系統由miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221和miR-222的莖環結構引物和擴增引物組成；具體為反轉錄系統由M-MLV反轉錄酶、反轉錄體系5XM-MLV緩衝液和RNase抑制劑組 成；
擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，包括real-time PCR MasterMix 禾口 50XROX reference ；引物系統由 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 的蓮 環結構引物和擴增引物組成，同實施例1中的引物序列。該實施例中，分別以10個健康人和10個肝癌患者的血清為樣本，分別用7種不同 的microRNA生物標誌物進行試驗，從而獲得圖6所述的結果。具體如下l、cDNA 合成

在無RNase的0. 2mL PCR管中加入13 μ L正常血清/肝癌血清，70°C變性8min後 迅速置於冰上3min，再依次加入0. 5 μ L RNase抑制劑(40U/ μ L)，1 μ L dNTP混合物(各 10mM,RNase-free) ,4μ L 5XM-MLV 緩衝液，1 μ L 特異的莖環引物(2 μ Μ)和 0. 5 μ L M-MLV 反轉錄酶(200U/ μ L)，使總體積至20 μ L，混勻後稍離心，在PCR儀中進行cDNA第一鏈合 成，反應參數設置為16°C 15min，42°C 60min和85°C 5min。得模板cDNA。2、將cDNA進行螢光定量PCR在新的0. 2mL PCR 反應管中依次加入 10 μ L real-time PCR Master Μ χ,Ο. 4μ L 50 X ROXreference, PCR 正向和反向引物(10 μ Μ)各 0· 4 μ L，2 μ L 模板 cDNA 和 6· 8 μ L 去 離子水。混勻後進行PCR反應，反應條件為95°C lmin，循環條件為95°C 15s和60°C lmin, 共40個循環。通過該反應可得該7條miRNA在不同正常血清/肝癌血清樣本中的表達量， 進而進行後續分析。3、數據處理螢光定量PCR定量檢測所得miRNA的Ct值，採用Excel 2003數據分析工具，當相 對標準誤(STDEV) < 0. 5，時，認為結果可靠。如圖6所示，可得7條miRNA在肝癌血清/正 常血清樣本中的Ct值比較分析。結果說明該7條miRNA在肝癌血清中特異性表達，可作為 肝癌的生物標誌物。根據圖6，經臨床肝癌血清樣本和正常血清樣本各10例的RT-qPCR分析得該7條 miRNA在肝癌血清樣本中檢測所得的Ct值顯著低於正常血清樣本的Ct值。從而推得該7條 miRNA在肝癌血清樣本中的表達顯著高於正常血清樣本。也即該7條miRNA可特異性檢測 肝癌，是肝癌腫瘤標誌物。因此，我們得知，當檢測樣本所得的Ct值顯著低於已知正常血清 樣本的Ct值時，為肝癌患者；當檢測樣本所得的Ct值與已知正常血清樣本的Ct值差別不大 時，為正常人。上述實施例是對本發明的解釋說明，而非對本發明進行限制，在本發明的精神和 權利要求的保護範圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發明的保護範圍。如， 所述miRNA還可應用於肝癌患者的組織，唾液，尿液，血漿，淚液、羊水等體液的檢測。顯然， 本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一 種 microRNA 生物標誌物，其特徵是為 miR-21、miR-25、miR_29c、miR-93、 miR-198、miR-221 和 miR-222 中的任意 1 個miR-21 :uagcuuaucagacugauguuga miR-25 :cauugcacuugucucggucuga miR-29c :uagcaccauuugaaaucgguua miR-93 :caaagugcuguucgugcagguag miR-198 :gguccagaggggagauagguuc miR-221 :agcuacauugucugcuggguuuc miR-222 :agcuacaucuggcuacugggu0
2.如權利要求1所述的miRNA生物標誌物的用途，其特徵是用於製備具有肝癌檢測 能力的試劑盒。
3.一種具有肝癌檢測能力的試劑盒，其特徵是該試劑盒由反轉錄系統、擴增系統和 引物系統組成；所述反轉錄系統由M-MLV反轉錄酶、反轉錄體系5XM-MLV緩衝液和RNase抑制劑組成；所述擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，其包括real-time PCRMaster Mix 禾口 50XROX reference ；所述引物系統包括 miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221 和 miR-222 中 的任意1個的莖環引物和擴增引物miR-21 蓮環引物5， -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAACATC-3'miR-25 蓮環引物5， -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTCAGACCG-3'miR-29c 蓮環引物5， -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACTAACCGAT-3'miR-93 蓮環引物5』 -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACCTACCTGC-3'miR-198 蓮環引物5』 -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACCTAT-3'miR-221 蓮環引物5』 -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAAACCCA-3，miR-222 蓮環引物5』 -GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACACCCAG-3， miR-21 PCR 正向引物5，-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGATG-3， miR-21 PCR 反向引物5，-CCAGTCGAGGGTCCGAGGTATT-3， miR-25 PCR 正向引物5，-GGCGGCATTGCACTTGTCTCG-3， miR-25 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-29c PCR 正向引物5，-CCCCGCCTAGCACCATTTGAAAT-3， miR-29c PCR 反向引物5，-CAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-93 PCR 正向引物5，-CGCCCAAAGTGCTGTTCGTG-3，miR-93 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-198 PCR 正向引物5，-GGGGGTCCAGAGGGGAGATAGGT-3， miR-198 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-221 PCR 正向引物5，-GCGAGCTACATTGTCTGCTGGGTT-3， miR-221 PCR 反向引物5，-GTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， miR-222 PCR 正向引物5，-GACGCAGCTACATCTGGCTACTGG-3， miR-222 PCR 反向引物5，-AGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3， 18S rRNA PCR 正向引物5，-AAGACGGACCAGAGCGAA-3， 18S rRNA PCR 反向引物5，-GGCGGGTCATGGGAAT-3，。
4. 一種對miRNA穩定性分析的方法，其特徵在於，對血清/血漿樣本進行一系列條件的 處理，包括以下步驟1)血清/血漿樣本不同溫度下處理3h:-80°C、-20°C、4°C、室溫和37°C ；2)室溫下血清/血漿樣本不同存放時間的處理0、l、3、6、12、24h；3)370C RNaseA不同時間條件消化血清/血漿樣本的處理0、3、6、12h ；4)370C DNase I不同時間條件消化血清/血漿樣本的處理0、3、6、12h ；5)血清/血漿樣本經不同反覆凍融次數的處理0、2、5、7、10次；6)37°C血清/血漿樣本經不同pH值溶液的處理對照、pH=1、6、9、13 ；7)血清/血漿樣本經RT-qPCR方法進行血清/血漿RNA穩定性分析。
全文摘要
本發明公開了一種microRNA生物標誌物，為miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221和miR-222中的任意1個，其序列對應為SEQ ID NO1～SEQ ID NO7。本發明還同時公開了上述miRNA生物標誌物的用途用於製備具有肝癌檢測能力的試劑盒。本發明還同時公開了一種具有肝癌檢測能力的試劑盒，該試劑盒由反轉錄系統、擴增系統和引物系統組成；引物系統包括miR-21、miR-25、miR-29c、miR-93、miR-198、miR-221和miR-222中的任意1個的莖環引物和擴增引物。本發明能用於肝癌篩查和診斷。
文檔編號C12N15/11GK102002494SQ20101022024
公開日2011年4月6日 申請日期2010年7月8日 優先權日2010年7月8日
發明者丁先鋒, 呂佳嵐, 姚虎, 徐立堅, 朱恆怡, 李豔, 郭江峰 申請人:浙江理工大學