改進賦形劑結晶作用的冷凍乾燥方法
2023-10-10 06:46:24 2
專利名稱：改進賦形劑結晶作用的冷凍乾燥方法
該申請要求2004年6月15日提出的美國臨時專利申請號60/580,140和2004年3月5日提出的美國臨時專利申請號60/550,020的優先權，該兩個專利申請在本文整體引用作為參考。
本文引用的所有的專利、專利申請和出版物因此整體引用作為參考。這些申請的公開引入本申請中作為參考，以便更全面描述在這裡描述和要求專利保護的發明申請之時所屬領域技術人員所已知的當前技術水平。
背景技術：
由於有效成分如蛋白質、核酸和病毒(例如作為疫苗的組分)的潛在不穩定性和降解，所以經常必須將它們製成固體形式以達到作為藥物產物的可接受的貨架壽命。最通常使用的製備固體蛋白質藥物的方法為冷凍乾燥。冷凍乾燥按傳統由兩個主要步驟組成(1)冷凍蛋白質溶液並且(2)在真空條件下乾燥凍結的固體。乾燥步驟進一步分成兩個階段一次乾燥和二次乾燥。一次乾燥步驟試圖去除凍結的水或溶劑(升華作用)且二次乾燥步驟試圖去除非凍結的「結合」水或溶劑(解吸)。冷凍乾燥去除水或其他溶劑通過大大降低有效成分的降解速度而穩定藥物製劑。這種方法通過去除製劑中的溶劑成分至不再支持化學反應或生物生長的水平來抑制降解過程。此外，溶劑的去除降低了分子流動性，同時降低了降解反應的可能性。溶劑的去除首先通過冷凍製劑以便使冷凍過程將一種或多種溶劑與溶質分離並將任何未凍結溶劑分子固定在凍結的溶劑晶體間的間隙區域實現。然後通過升華作用(一次乾燥)和接下來的解吸(二次乾燥)去除溶劑。
冷凍乾燥前的溶液中的溶質包含目的蛋白質或藥物(有效成分)和無活性成分(賦形劑)。當冷凍乾燥時，賦形劑可保留在與蛋白質相同的相中或者它們可從含蛋白質(有效成分)的相中分相。含蛋白質的相一般為無定形相。當賦形劑從含蛋白質相中分相時它們可形成結晶相或無定形相。
此外，結晶賦形劑通常在凍乾產物中用作膨脹劑並有時用作穩定劑。通常使用的結晶賦形劑包括胺基酸，如甘氨酸；多元醇，如甘露醇；以及鹽，如氯化鈉。通常需要在冷凍乾燥後完全結晶的結晶賦形劑。如果結晶賦形劑在冷凍乾燥後未完全結晶，它們可保留在與蛋白質相同的無定形相中。這可通過允許更大的分子流動性使蛋白質不穩定。完全的結晶作用增強幹燥和成塊，從而降低最終的殘留水分水平。完全的結晶作用也阻止了在貯存後出現不必要的結晶。因為更高程度的結晶作用降低無定形物質的數量，所以獲得了更高的玻璃化轉變溫度。一般地，這些種類的賦形劑的結晶作用通過在一次乾燥前於零度下(攝氏度)溫度進行的低溫退火步驟實現。然而，此零度下退火過程是緩慢的並且往往不能充分結晶或完全結晶。特別地，甘氨酸和氯化鈉的混合抑制任一賦形劑的結晶作用並且此種低溫退火過程不能有效促進結晶作用，所以需要多個低溫退火步驟以使賦形劑進一步結晶。
發明概述本發明提供了改進的冷凍乾燥(凍幹)包括蛋白質、核酸和病毒在內的有效成分的方法。與現有方法相比，本方法提高了冷凍乾燥過程中賦形劑結晶的程度。賦形劑結晶作用的改善部分地基於在二次乾燥前引入了退火步驟。該退火步驟在高溫度下(0℃以上)進行並且在其之前不需要多個零度以下的退火步驟。雖然諸如蛋白質、病毒和核酸的有效成分本身就是熱不穩定的，以致於暴露於高溫下造成降解，但是本發明意外發現高溫退火不引起有效成分的降解或不穩定。此外，本發明提供了通過該冷凍乾燥方法生產的凍乾產物，其中在產物中包含甘氨酸和氯化鈉，並且其中相對於不包括高溫退火的現有方法而言甘氨酸基本上完全結晶或更大程度結晶(或更多結晶)。
在一個方面，本發明提供了冷凍乾燥含水藥物製劑的方法，此方法包括(a)在低於-10℃的溫度下將含水藥物製劑冷凍；(b)在大約-35℃和大約20℃之間的溫度下將步驟(a)的藥物製劑乾燥；(c)在高於大約25℃的溫度下將步驟(b)的藥物製劑退火；和(d)在低於步驟(c)所用溫度的溫度下將步驟(c)的藥物製劑乾燥。在本發明的一個方面，步驟(a)的溫度低於-35℃且冷凍進行1個小時以上的持續時間。在另一方面，步驟(b)的溫度為大約-30℃和大約20℃之間，或者大約-25℃和大約10℃之間，或者大約0℃。在另一方面，步驟(c)的溫度為大約25℃和大約75℃之間，或者大約35℃和大約60℃之間，或者大約50℃。在另一方面，步驟(d)的溫度為大約25℃和大約35℃之間；在一個方面，步驟(d)的溫度為大約25℃。通過本方法冷凍乾燥的含水藥物製劑在本質上可含有任何有效成分，包括但不限於蛋白質、肽、核酸和病毒。
在另一方面，本發明提供了冷凍乾燥含水藥物製劑的方法，此方法包括(a)在低於-10℃的溫度下將含水藥物製劑冷凍；(b)在大約-35℃和大約0℃之間的溫度下將步驟(a)的藥物製劑退火；(c)在大約-35℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(d)在大約25℃和大約75℃之間的溫度下將步驟(c)的藥物製劑退火；和(e)在低於步驟(d)所用溫度的溫度下將步驟(d)的藥物製劑乾燥。在另一方面，步驟(b)的溫度為大約-25℃和-10℃之間，或者大約-20℃和-10℃之間，或者為大約-15℃。在另一方面，步驟(c)的溫度為大約-30℃和5℃之間，或者大約-25℃和10℃之間，或者大約-20℃和0℃之間，或者大約-20℃和-10℃之間，或者為大約0℃。在另一方面，步驟(d)的溫度為大約35℃和60℃之間，或者為大約50℃。在另一方面，步驟(e)的溫度為大約25℃。還在另一方面，該方法還可包含在步驟(b)之後和步驟(c)之前進行的再冷凍步驟，其中再冷凍步驟包括在低於-35℃，或者在大約-40℃--50℃的溫度下冷凍製劑。
在另一方面，本發明提供了冷凍乾燥方法，其中含水藥物製劑包含至少一種結晶賦形劑。結晶賦形劑選自胺基酸、鹽和多元醇。在一個方面，胺基酸為甘氨酸或組氨酸。在另一方面，鹽為氯化鈉。在另一方面，多元醇為甘露醇。在一個方面，含水藥物製劑包含結晶賦形劑的組合，其中組合為鹽和胺基酸的組合。在一個方面，組合中的鹽為氯化鈉，其中氯化鈉在製劑中以高於大約25mM的濃度存在，或者以大約25mM和200mM、30mM和100mM或者40mM和60mM之間的濃度存在，或者以大約50mM的濃度存在。在另一方面，組合中的胺基酸在製劑中以大約1％至大約10％、1.5％至5％、1.5％至3％的濃度存在，或者以大約2％的濃度存在。在另一方面，組合中的胺基酸為甘氨酸。
在一個方面，本發明提供了冷凍乾燥含水藥物製劑的方法，其中方法包括(a)在低於-35℃的溫度下將含水藥物製劑冷凍；(b)任選地在大約-20℃和大約-10℃之間的溫度下將步驟(a)的藥物製劑退火；(c)在大約-10℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(d)在大約35℃和大約60℃之間或者大約35℃和大約50℃之間的溫度下將步驟(c)的藥物製劑退火；和(e)在低於步驟(d)所用溫度的溫度下將步驟(d)的藥物製劑乾燥。
在一個方面，本發明提供了冷凍乾燥包含氯化鈉和甘氨酸的含水藥物製劑的方法，其中方法包括(a)在低於-35℃的溫度下將含水藥物製劑冷凍；(b)任選地在大約-20℃和大約-10℃之間的溫度下將步驟(a)的藥物製劑退火；(c)在大約-10℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(d)在大約35℃和大約50℃之間的溫度下將步驟(c)的藥物製劑退火；和(e)在低於步驟(d)所用溫度的溫度下將步驟(d)的藥物製劑乾燥。
在另一方面，本發明提供了冷凍含水藥物製劑的方法，其中所述的含水藥物製劑包含高於35mM的氯化鈉和大約250mM和大約300mM之間的甘氨酸或者大約250mM和大約270mM之間的甘氨酸，其中該方法包括(a)在低於-35℃的溫度下將含水藥物製劑冷凍；(b)在大約-15℃下將步驟(a)的藥物製劑退火；(c)在大約0℃下將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(d)在大約50℃下將步驟(c)的藥物製劑退火；和(e)在大約25℃下將步驟(d)的藥物製劑乾燥。此方法還可在步驟(b)之後和步驟(c)之前包括再冷凍步驟，其中再冷凍步驟包括在大約-40℃至大約-50℃下將步驟(b)的藥物製劑冷凍。
在一個方面，本發明提供了在冷凍乾燥過程中增強賦形劑結晶作用的方法，其包括(a)提供包含氯化鈉和另一種膨脹劑，如甘氨酸的含水藥物製劑；(b)將含水藥物製劑冷凍；(c)任選地在大約-35℃和大約0℃之間或者大約20℃和大約-10℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑退火；(d)在大約-35℃和大約10℃之間或者大約-5℃和大約5℃之間的溫度下將步驟(b)或步驟(c)的藥物製劑乾燥；(e)在大約25℃和大約75℃之間的溫度下將步驟(d)的藥物製劑退火，以致於使膨脹劑和/或氯化鈉在步驟(e)之後比步驟(e)之前更大程度的結晶；和(f)在與步驟(e)所用溫度相同或更低的溫度下將步驟(e)的藥物製劑乾燥，從而增強賦形劑結晶作用。在該方法中，膨脹劑可包含例如甘氨酸、丙氨酸或甘露醇(除氯化鈉外)。在一個方面，膨脹劑為甘氨酸。在另一方面，這種在冷凍乾燥過程中增強賦形劑結晶作用的方法還包括在步驟(c)之後和步驟(d)之前進行的再冷凍步驟，其中再冷凍步驟包括在大約-40℃和-50℃之間的溫度下或者在大約-50℃的溫度下將來自步驟(c)的製劑冷凍。
在另一方面，本發明提供了通過如下方法生產的凍乾產物，該方法包括(a)提供包含甘氨酸和氯化鈉的製劑；(b)冷凍製劑；(c)任選地在大約-35℃和大約0℃之間的溫度下將步驟(b)的製劑退火；(d)在大約-35℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(c)的製劑乾燥；(e)在大約25℃和大約70℃之間的溫度下將步驟(d)的製劑退火；和(f)在與步驟(e)所用溫度相同或更低的溫度下將步驟(e)的製劑乾燥，從而提供凍乾產物。通過該方法冷凍乾燥的製劑中的有效成分可包含蛋白質、核酸或病毒。此外，步驟(f)之後的凍乾產物中的甘氨酸可比步驟(e)之前更大程度結晶。
在一個方面，本發明提供了通過如下方法生產的凍乾產物，該方法包括(a)提供包含甘氨酸和氯化鈉的製劑；(b)冷凍製劑；(c)任選地在大約-20℃和大約-10℃之間的溫度下將步驟(b)的製劑退火；(d)在大約-5℃和大約5℃之間的溫度下將步驟(c)的製劑乾燥；(e)在大約35℃和大約60℃之間或者大約35℃和大約50℃之間的溫度下將步驟(d)的製劑退火；和(f)在與步驟(e)所用溫度相同或更低的溫度下將步驟(e)的製劑乾燥，從而提供凍乾產物。在另一方面，步驟(f)之後的凍乾產物中的甘氨酸基本為完全結晶的或者比無步驟(e)的凍乾產物中的甘氨酸更大程度地結晶(或者相對於在二次乾燥前不包括高溫退火步驟的冷凍乾燥方法而言更大程度地結晶)。在另一方面，凍乾產物在高貯存溫度和加速溫度下的長時間階段內基本穩定。長時間階段可為例如至少1個月、3個月、6個月、1年或更長。高貯存溫度和加速溫度可為例如大約25℃和大約50℃之間。穩定性可通過例如凍乾產物中存在的HMW實體的百分比、有效成分的濃度和有效成分的活性檢測。
圖例簡述
圖1描述了根據循環Lyo G、H或I冷凍乾燥的製劑1的固體塊的代表性的差示掃描量熱法(DSC)第一次掃描(圖1A)和第二次掃描(圖1B)(製劑1、2和3的成分見表2；Lyo G、H和I循環步驟見表3、4和5；實驗描述見實施例1)。在根據循環Lyo G、H或I冷凍乾燥的製劑1的固體塊的第一次掃描中觀察到結晶現象，這表明在固體塊中沒有完全結晶或充分結晶。如其中所述，當DSC第一次掃描中表明存在結晶作用時，這表明凍幹塊中沒有發生完全結晶或充分結晶。因此第一次掃描顯示發生了結晶現象，並且第二次掃描證實放熱現象為再結晶作用。
圖2描述了根據循環Lyo G、H或I冷凍乾燥的製劑2的固體塊的代表性的DSC第一次掃描(圖2A)和第二次掃描(圖2B)(製劑1、2和3的成分見表2；Lyo G、H和I循環步驟見表3、4和5；實驗描述見實施例1)。在根據循環Lyo G、H或I冷凍乾燥的製劑2的固體塊的第一次掃描中觀察到結晶現象，這表明在固體塊中沒有完全結晶或充分結晶。第二次掃描證實第一次掃描中觀察到的放熱現象為結晶作用。此外，第二次掃描顯示未出現轉變溫度Tg。
圖3描述了根據循環Lyo G、H或I冷凍乾燥的製劑3的固體塊的代表性的DSC第一次掃描(圖3A)和第二次掃描(圖3B)(製劑1、2和3的成分見表2；Lyo G、H和I循環步驟見表3、4和5；實驗描述見實施例1)。在根據循環Lyo G、H或I冷凍乾燥的製劑3的固體塊的第一次掃描中觀察到結晶現象，這表明在固體塊中沒有完全結晶或充分結晶。第二次掃描證實第一次掃描中觀察到的放熱現象為結晶作用。此外，第二次掃描顯示未出現轉變溫度Tg。
圖4描述了根據循環Lyo J冷凍乾燥的製劑4(「fix927lyoJ.001」；長虛點線)、製劑5(「fix50250lyoja.001」；非虛線)和製劑6(「fix50270lyoja.001」；虛線)固體塊的DSC第一次掃描(圖4A)和第二次掃描(圖4B)(製劑4、5和6的成分見表7；Lyo J、K和L循環步驟見表8、9和10；實驗描述見實施例2)。表11概括了實施例2中的DSC第一次和第二次掃描資料，其中根據Lyo J冷凍乾燥的製劑5和6在第一次掃描中顯示出現結晶現象，第二次掃描顯示未出現轉變溫度Tg。
圖5描述了根據循環Lyo K冷凍乾燥的製劑4(「fix927yoK.001」；長虛點線)、製劑5(「fix50250yok.001」；非虛線)和製劑6(「fix50270yok.001」；虛線)固體塊的DSC第一次掃描(圖5A)和第二次掃描(圖5B)(製劑4、5和6的成分見表7；Lyo J、K和L循環步驟見表8、9和10；實驗描述見實施例2)。圖5C提供了關於通過Lyo K循環冷凍乾燥的製劑4(「fix 927lyoK」)的固體塊的另一個第二次掃描資料。表11概括了實施例2中的DSC第一次和第二次掃描資料，其中根據Lyo K冷凍乾燥的製劑4、5和6在第一次掃描中顯示未出現結晶，在第二次掃描中顯示出現轉變溫度Tg。
圖6描述了根據循環Lyo L冷凍乾燥的製劑4(「fix927lyol.001」；長虛點線)、製劑5(「fix50250lyoL.001」；非虛線)和製劑6(「fix50270lyoL.001」；虛線)固體塊的DSC第一次掃描(圖6A)和第二次掃描(圖6B)(製劑4、5和6的成分見表7；Lyo J、K和L循環步驟見表8、9和10；實驗描述見實施例2)。圖6C提供了關於通過Lyo L循環冷凍乾燥的製劑4(「fix 927lyoL」)的固體塊的另一個第二次掃描資料。表11概括了實施例2中的DSC第一次和第二次掃描資料，其中根據Lyo L冷凍乾燥的製劑4、5和6在第一次掃描中顯示未出現結晶，在第二次掃描中顯示出現轉變溫度Tg。
圖7提供了製劑4、5和6的冷凍乾燥前製劑和根據Lyo J、K和L冷凍乾燥後固體塊中存在的高分子量種類的百分比。(見實施例2)。對每一種製劑，一式三份檢測和測定10個小瓶。「PCTRL」指冷凍乾燥前的製劑4；「CTRL」指冷凍乾燥後的製劑4。「P50/250」指冷凍乾燥前的製劑5；「50/250」指冷凍乾燥後的製劑5。「P50/270」指冷凍乾燥前的製劑6；「50/270」指冷凍乾燥後的製劑6。
圖8提供了製劑4、5和6的冷凍乾燥前製劑和根據Lyo J、K和L冷凍乾燥後固體塊中因子IX蛋白質的凝固活性(圖8A)和凝固活性恢復百分比(圖8B)。(見實施例2)。對每一種製劑，每一種冷凍乾燥後製劑檢測8個小瓶。由於填充4mL而重構稀釋成5mL，所以圖8B中的預期最高恢復值為80％恢復。
圖9提供了製劑4、5和6的冷凍乾燥前製劑和根據Lyo J、K和L冷凍乾燥後固體塊中因子IX蛋白質的比活性恢復百分比(見實施例2)。
圖10提供了根據Lyo G冷凍乾燥的製劑2的固體塊(圖10A)和根據Lyo L冷凍乾燥的製劑6的固體塊(圖10B)的X射線衍射(XRD)模式圖。XRD模式圖表明凍幹樣品中存在結晶甘氨酸。此外XRD模式圖顯示了通過Lyo L冷凍乾燥的甘氨酸/氯化鈉製劑比通過Lyo G冷凍乾燥的甘氨酸/氯化鈉製劑具有更多結晶物質的定性模式。XRD峰高與結晶度相關，其中更高的峰反應了更多結晶物質的存在。
圖11顯示了根據Lyo Q冷凍乾燥的製劑7的固體塊的XRD模式圖(見實施例3)。將根據Lyo Q冷凍乾燥的製劑的XRD模式圖與根據Lyo G冷凍乾燥的製劑的XRD模式圖比較。使用根據Lyo G冷凍乾燥的製劑進行比較是因為Lyo G冷凍乾燥除了不具有50℃的熱處理以外，其餘冷凍乾燥循環參數與與Lyo Q冷凍乾燥相同。如可通過17.5°峰強度所觀察到，XRD模式圖比較顯示通過Lyo Q的冷凍乾燥造成甘氨酸結晶作用的增強。
發明詳述本發明涉及改進的冷凍乾燥藥物製劑的方法。冷凍乾燥至關重要，這是部分因為冷凍乾燥通過延緩或阻止降解來幫助穩定有效成分(如蛋白質、核酸和病毒)。本方法提供了冷凍乾燥步驟中改進的賦形劑結晶作用，從而提高了凍乾產物的穩定性和效果。因為如果結晶賦形劑留在含蛋白質或藥物的無定形相中，那麼賦形劑降低那一相的玻璃化轉變溫度(Tg)，所以通常需要結晶賦形劑在冷凍乾燥後完全結晶。具有降低的Tg的無定形相具有增強的分子流動性。增強的分子流動性可使降解反應速度增加。因此，對預期存在於無定形相中的藥物而言，提高那一相的玻璃化轉變溫度會造成提高的穩定性。相反地，較差的冷凍乾燥方法因未結晶賦形劑仍留在無定形相中導致產生具有降低玻璃化轉變溫度的製劑，該製劑預期具有較差的穩定性。
現有方法通過在一次乾燥前於低於零攝氏度的溫度下進行退火步驟使賦形劑結晶。然而，這種零度下退火方法是緩慢的且往往不能充分結晶或完全結晶。特別地，甘氨酸和氯化鈉的混合抑制了任一賦形劑的結晶並且此種低溫退火過程不能有效增強賦形劑的結晶，所以需要更長的循環。相反，本發明提供了在二次乾燥前引入高溫退火步驟的方法，這樣不需要多個零度下退火步驟來增強賦形劑的結晶。此外，雖然諸如蛋白質、病毒和核酸的有效成分本來就是熱不穩定的以致於暴露於高溫會造成降解，但是本發明意外發現高溫退火不引起有效成分的降解或不穩定。因此，本發明提供了增強冷凍乾燥過程中賦形劑結晶作用、包括增強包含甘氨酸和氯化鈉的製劑的賦形劑結晶作用的有效方法。
如此處所使用，術語「冷凍乾燥」、「冷凍乾燥的」和「凍幹的」涉及像「冷凍」溶液然後「乾燥」的方法。通常，本發明的冷凍乾燥方法包括下列步驟(1)冷凍，(2)一次乾燥，(3)在高於大約25℃的溫度下高溫退火和(4)在與高溫退火步驟相同或更低的溫度下二次乾燥。可在一次乾燥之前開展一個或多個任選的低溫退火步驟，並在低溫退火步驟之後開展任選的再冷凍步驟。
本發明意外發現，在二次乾燥之前的高溫退火不會使有效成分不穩定，因此本方法能在提供更有效、實用和高效的冷凍乾燥方案的同時增強了賦形劑結晶作用。與現有方法相比，本發明的冷凍乾燥方法在保持有效成分的穩定性和活性的同時允許增加結晶膨脹劑。本發明有時提到賦形劑完全結晶的目標，並且因為目前的技術靈敏度不能完全確定地告知賦形劑100％的結晶，所以本領域的技術人員會理解「完全結晶」是難以驗證的。因此，實際上本發明提供了相對現有方法而言增強賦形劑結晶作用的冷凍乾燥方法。因此，如此處所使用，可通過例如差示掃描量熱法(DSC)評價冷凍乾燥產物的「完全結晶」，其中本領域的技術人員會認識到，第一次掃描中的不可逆放熱現象代表著結晶，其表明結晶賦形劑在冷凍乾燥過程中沒有完全結晶(見實施例)。
冷凍乾燥過程冷凍乾燥循環在傳統上包括三個階段冷凍(熱處理)、一次乾燥(升華作用)和二次乾燥(解吸)。在多個實施方案中，本發明通過在二次乾燥前引入一個或多個退火階段改進了傳統的冷凍乾燥過程，其中退火和乾燥階段在特定的溫度範圍進行。在本發明中，除非另外指出，冷凍乾燥過程的特定溫度和溫度範圍指冷凍乾燥器裝置的架子溫度。架子溫度指冷卻劑流經冷凍乾燥器架子的控制溫度，其為人們在冷凍乾燥過程中根據溫度所要控制的。樣品的溫度(產物溫度)取決於架子溫度、室內壓強和一次乾燥過程中的蒸發/升華作用的速度(蒸發冷卻使產物溫度低於架子溫度)。本發明提供了改進的冷凍乾燥方法，以便提供例如更一致、穩定和美觀的產物。
在本發明中，對於固體百分比為重量/重量比而對於液體百分比為重量/體積比。
程式術語冷卻藥物製劑過程中冰(溶劑晶體)的形成使所有溶質濃縮。溶質濃縮最終將溶液從液態變成玻璃態。這種冷凍濃縮溶液的可逆轉變稱為最大限度冷凍濃縮溶液的玻璃化轉變溫度，Tg』。該溫度也稱為玻璃狀轉換溫度。Tg』用於將這種轉變與純的聚合物的真正玻璃化轉變的軟化點Tg區別開來。崩潰溫度Tcol為凍結基質中的空隙間水顯著地變為可流動的溫度。為進行參考，表1列出了一些通常使用的賦形劑和緩衝液和蛋白質(其中這些蛋白質不是製劑的有效成分，而是製劑的附加成分)。
表1緩衝液、賦形劑和蛋白質列表
當含水製劑的溫度降到0℃以下時水首先結晶出來。然後取決於冷凍的速度，製劑中具有最小溶解度的可結晶成分接著結晶出來。這個溫度(製劑中可結晶成分結晶的溫度)命名為結晶溫度。當在最小溶解度成分結晶之後含水製劑的溫度進一步降低時，可結晶成分和水以混合物同時結晶出來。這個溫度命名為共晶結晶/熔解溫度，Teut。由於賦形劑的相互作用一些多組分製劑不表現出Teut。
冷凍冷凍乾燥中的第一步是冷凍步驟。將製劑或樣品冷凍成固體，其將物質中的水分轉變成冰。在一個實施方案中，可在低於-10℃的溫度下進行含水藥物製劑的冷凍。在另一個實施方案中，可在-35或-50℃或者低於-35或-50℃進行冷凍。在本發明中，一旦冷凍溫度(如在架子溫度中)達到大約-35℃到大約-50℃之間的目標溫度時，然後將冷凍溫度保持(「冷凍保持」步驟)到樣品凍結，或者保持大約1小時到大約24小時、大約3小時到大約12小時、大約5小時到大約10小時、或者大約5小時。冷凍的時間取決於諸如每瓶溶液體積等因素，而與製劑組成無關。
低溫退火(任選的步驟)在本發明中，低溫退火步驟是任選的。因為可結晶成分可能不完全結晶或不充分結晶，所以現有方法在乾燥前使用一個或多個低溫退火步驟。然而因為低溫退火步驟需要長時間的和多個循環，所以這些現有方法效率低，並且這些現有方法不足以促進充分結晶或完全結晶。
製劑成分的完全結晶可提供必需的塊結構或者由於完全結晶有效成分在製劑中可更穩定。將可結晶成分如甘氨酸從無定形相中去除可增加無定形相的Tg』。增加的Tg』使得可在較高溫度下進行更有效的一次乾燥。此外，賦形劑的更完全結晶也可提高冷凍乾燥後的Tg，這對有效成分的穩定性是至關重要的。
在本發明中，低溫退火步驟可在大約-35℃到大約0℃的溫度進行，或者在大約-25℃和-10℃之間的溫度下進行，或者在大約-20℃和-10℃之間的溫度下進行。在一個實施方案中，低溫退火步驟在大約-15℃的溫度下進行。
通過從冷凍步驟(也稱為「冷凍保持」)提高溫度達到低溫退火步驟溫度。將調節溫度從冷凍溫度提高到低溫退火溫度的過程稱為「退火坡度」步驟，其在本發明中是任選的。退火坡度步驟可以不同速度進行，例如以每分鐘大約0.1℃到大約5℃的速度進行。
再冷凍(任選步驟)本發明的冷凍乾燥方法還包括對在低溫退火步驟之後包括再冷凍步驟的選擇。再冷凍步驟可在大約-35℃到-50℃間的冷凍溫度(冷凍保持溫度)進行大約1-10小時、3-7小時或5小時。冷凍坡度步驟可以例如每分鐘大約-0.5℃到-5℃的速度進行。
真空起始在馬上進行一次乾燥之前，將製劑於馬上進行一次乾燥之前的步驟的溫度下放於真空下。這個步驟稱為「真空起始」。這樣，如果再冷凍步驟在一次乾燥之前，那麼真空起始在再冷凍步驟溫度下進行。真空可為大約20到大約300微米之間的水平。一旦啟動真空，就要在其餘冷凍乾燥過程保持真空，雖然真空水平可以改變。
一次乾燥乾燥分成兩個階段一次乾燥和二次乾燥。一次乾燥去除凍結的水(冰的升華作用)且二次乾燥去除非凍結的「結合」水(水的解吸)。在一次乾燥中，目的是從樣品中去除未結合的或易去除的冰。一次乾燥步驟開始時的未結合水應為游離冰的形式，這通過將其由固體直接轉變成蒸氣去除，該轉變過程稱為升華作用。
在本發明中，一次乾燥步驟可在大約-35℃和大約20℃之間的溫度下進行，或者在大約-25℃和10℃之間的溫度下進行，或者在大約-20℃和0℃之間的溫度下進行。在一個實施方案中，一次乾燥步驟在0℃下進行。
調節溫度從一次乾燥前步驟的溫度提高到一次乾燥溫度稱為「一次乾燥坡度」步驟，其為任選步驟。一次乾燥坡度步驟可以每分鐘大約0.1℃到大約5℃的速度進行。
可開展一次乾燥步驟達到足夠時間以確保全部凍結水基本從樣品中去除。本領域的技術人員會理解，一次乾燥時間可隨構型變化，因為一次乾燥的持續時間取決於填充量和幾何形狀(塊的表面積-阻力/流動)。在一個實施方案中，一次乾燥的持續時間大於10小時，在另一個實施方案中，一次乾燥的持續時間為大約10到大約100小時。在另一個實施方案中，一次乾燥的持續時間為大約30-50小時。在另一個實施方案中，一次乾燥的持續時間為38小時。
可使用多種方法監測一次乾燥步驟的完成。一種方法是在冷凍乾燥過程中觀察產物溫度的變化。另一種方法是觀察室內壓力的變化，其中當升華作用結束時，室內不再有引起壓力變化的水。當產物(樣品)溫度接近架子溫度時一次乾燥步驟結束，這可通過因升華速度降低使得產物溫度軌跡的斜率顯著改變而得到證明；當升華作用結束時蒸發冷卻結束。為防止過早結束，可使一次乾燥持續時間額外增加2-3小時。另一種監測一次乾燥完成的方法是壓力上升檢測。通過斷開真空源，室內壓力可以取決於產物中水分數量的速度上升。可在壓力上升的速度低於特定值時確定一次乾燥過程的結束。另一種確定一次乾燥步驟結束的方法為測量傳熱速度(Jennings，T.A.，Duan，N.(1995)，J.Parent.Sci.Technol.，49，272-282)。
高溫退火本發明的方法包括在二次乾燥前進行一個或多個高溫退火(或熱處理)步驟。在現有方法中，當二次乾燥在高溫度下進行時，在一次乾燥之前必需進行零度下退火步驟。然而，本發明公開了不需要零度下退火步驟而進行高溫二次乾燥的方法。本發明已經確定，如果在二次乾燥過程中或即將進行二次乾燥之前進行高溫退火步驟，則高溫乾燥前的零度下退火步驟不是必需的。本發明已經確定，高溫退火步驟在保持有效成分穩定性的同時提高了賦形劑結晶作用，這包括甘氨酸結晶作用。
因此，本發明提供了在二次乾燥之前的高溫退火步驟，其中高溫退火步驟在高於大約25℃的溫度下進行。在一個實施方案中，高溫退火步驟溫度為大約25℃到大約75℃或者大約35℃到大約60℃。在另一個實施方案中，高溫退火步驟在大約50℃的溫度下進行。在另一個實施方案中，高溫退火步驟在大約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60℃的溫度下進行。在另一個實施方案中，退火步驟的溫度為通過示差掃描量熱法所觀察到的對應結晶開始的溫度或高於其的溫度。一旦本領域的技術人員認識到結晶動力學可以更慢且步驟持續時間可以更長，則可考慮使用稍微低於結晶開始溫度的溫度。高於結晶開始溫度的溫度是優選的，因為結晶的動力學更快且步驟持續時間可更短。
調節溫度從一次乾燥提高到高溫退火稱為「高溫退火坡度」(坡度步驟在本發明中是暗示的，因為從一個保持溫度到另一個保持溫度的變化本來就包括某種坡度)並且可以每分鐘大約0.1到大約20℃的速度進行。
高溫退火步驟的持續時間取決於許多因素，其中包括填充體積。高溫退火步驟可例如進行1小時到大約24小時。在一個實施方案中，高溫退火步驟進行大約1小時到大約15小時。在另一個實施方案中，高溫步驟進行大約10小時。令人驚訝的是，本發明的高溫退火步驟不負面影響蛋白質穩定性或活性(見實施例2)。這是未預料到的，因為已知蛋白質為熱不穩定的。此外，實施例2表明高溫退火步驟引起賦形劑(在這個實施例中為甘氨酸)結晶的增加。
二次乾燥即使通過前面提到的升華過程去除所有的游離冰，樣品還可能含有足夠的限制其結構完整性和貨架壽命的結合水。在二次乾燥過程中，將產物中與固體結合的水轉變成蒸氣。因為在相同溫度下剩下的結合水與游離液體相比具有更低的壓力，這是一個緩慢過程。雖然在前面的乾燥和退火方法中去除了一些結合水，但是在去除游離冰之後需要二次乾燥，以獲得足夠低的殘餘水分水平，所述的殘餘水分水平提供給最終產物所需生物學特性和結構特性。
取決於冷凍乾燥過程，甘露醇可結晶為甘露醇水合物。當儲藏時，甘露醇水合物可轉變成結晶甘露醇，從而釋放出水。然後，釋放的水可(1)參與化學反應和(2)降低無定形相的Tg，以允許更大的分子流動性和降解反應。高溫退火步驟可用於將結晶甘露醇水合物轉變成結晶甘露醇，以便在二次乾燥過程中可去除剩餘的水。
在本發明中，可在與高溫步驟所用溫度相同或更低溫度下進行二次乾燥步驟。在一個實施方案中，二次乾燥步驟在大約0℃到低於35℃或者大約15℃到大約35℃的溫度下進行。在另一個實施方案中，二次乾燥步驟在大約25℃下進行。
調節溫度從高溫退火步驟降低到二次乾燥步驟溫度的步驟稱為「二次乾燥坡度」，其在本發明中為任選步驟。二次乾燥坡度步驟可以每分鐘大約0.1℃到大約10℃的溫度降低速度進行。
開展二次乾燥步驟達到足夠時間以將凍乾產物中的殘餘水分水平降低到所期望水平。在本發明中，所期望殘餘水分水平低於2％。在一個實施方案中，通過本方法生產的凍乾產物的殘餘水分水平為低於1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.10％。可使用卡爾·費歇爾測定法測定樣品中的殘餘水分水平。此外，也可使用壓力上升檢測和測量熱轉移速率確定二次乾燥步驟的結束。備選地，可使用電子溼度計或殘餘氣體分析器(Nail.S.L.，Johnson，W.，(1992)Dev.Biol.Stand.74，137-150)。同樣地，可通過使用架子溫度(其中二次乾燥步驟的架子溫度與高溫步驟中所用溫度相同或更低)與持續時間的不同組合系統測定二次乾燥的最低持續時間。可通過數種方法包括乾燥失重、卡爾·費歇爾滴定法、熱重分析(TGA)、氣相色譜法(GC)或紅外光譜法測定凍幹製劑中的殘餘水分含量。
冷凍乾燥製劑待冷凍乾燥的製劑包含三種主要成分(1)一種或多種有效成分、(2)一種或多種賦形劑和(3)一種或多種溶劑。賦形劑包括可藥用試劑，其在儲存過程中提供良好的凍幹塊性質(膨脹劑)以及提供蛋白質的冷凍乾燥保護和/或超低溫保護(「穩定劑」)、pH值的維持(緩衝劑)和蛋白質的正確構象從而保證生物活性(包括有效成分穩定性，如蛋白質穩定性)的基本保留。因此，就賦形劑而言，製劑實例可包括緩衝劑、膨脹劑、蛋白質穩定劑和抗菌劑的一種或多種。有效成分指例如試劑或治療藥物。當有效成分指藥物時，藥物的活性與其效果有關。當有效成分指試劑時，試劑的活性指其反應性。
糖/多元醇許多糖或多元醇在溶液中以及凍融和冷凍乾燥過程中用作非特異性蛋白質穩定劑。糖或多元醇所提供的穩定水平通常取決於其濃度。在一個實施方案中，本發明考慮在待通過公開方法冷凍乾燥的製劑中使用二糖。二糖可包括但不限於海藻糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖。可使用的其他糖或多元醇包括但不限於甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、肌醇、棉子糖和麥芽三糖。甘露醇是也可用作膨脹劑的結晶多元醇。
聚合物聚合物可在溶液中以及凍融和冷凍乾燥過程中用於穩定蛋白質。一種常用的聚合物為血清白蛋白，其已用作冷凍保護劑和冷凍乾燥保護劑。然而，由於對血液會帶來病原體的憂慮限制了血清白蛋白在治療產品和治療相關產品中的應用。因此，在一個實施方案中，本發明提供了通過所公開方法冷凍乾燥的不含白蛋白的製劑。其他聚合物包括但不限於葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、明膠、聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。因為聚合物形成無定形相，所以其不是結晶賦形劑。
非水溶劑非水溶劑一般使溶液中的蛋白質不穩定。在低濃度下某些非水溶劑可具有穩定作用。這些穩定的非水溶劑包括多羥基醇，如PEG、1，2-亞乙基二醇、甘油和一些極性和非質子溶劑，如二甲基亞碸(DMSO)和二甲基甲醯胺(DMF)。然而，非水溶劑對本發明而言不是優選使用的。
表面活性劑冷凍過程中冰-水界面的形成可引起蛋白質的表面變性。表面活性劑可降低蛋白質溶液的表面張力並降低這些界面的蛋白質吸附和/或聚集的推動力。同樣地，表面活性劑可在冷凍乾燥過程中與有效成分競爭冰/水界面。表面活性劑可包括，例如Tween 80TM(聚山梨酯80；也可考慮其他聚山梨酯)、Brij35、Brij 30、Lubrol-pxTM、Triton X-10TM、PluronicF127和十二烷基硫酸鈉(SDS)。
作為膨脹劑的鹽多種鹽可用作膨脹劑。代表性的鹽膨脹劑包括例如NaCl、MgCl2和CaCl2。
胺基酸某些胺基酸可用作冷凍保護劑和/或冷凍乾燥保護劑和/或膨脹劑。可使用的胺基酸包括但不限於甘氨酸、脯氨酸、4-羥基脯氨酸、L-絲氨酸、穀氨酸鈉、丙氨酸、精氨酸和賴氨酸氫氯化物。也可使用短鏈胺基酸，如二胺基酸或三胺基酸，這包括二賴氨酸。因為大多數胺基酸一般容易結晶出來，所以其為有效的膨脹劑。然而，酸鹽的形成降低了它們結晶的趨勢。此外，蛋白質製劑中的無定形賦形劑可抑制膨脹劑的結晶作用，從而影響蛋白質穩定性。因此在現有方法中，因為NaCl具有低的共晶溫度和玻璃化轉變溫度，所以甘氨酸和NaCl的組合不是優選的。在本發明中，本方法提供了高溫退火步驟和高溫二次乾燥步驟而沒有先前的零度下退火步驟，這增加了甘氨酸結晶程度，甚至在氯化鈉存在條件下製備時亦如此。
緩衝劑可在製劑中選擇使用許多涵蓋寬pH範圍的緩衝劑。緩衝劑包括例如醋酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸、磷酸(鈉或鉀)、二乙醇胺和Tris。緩衝劑包括在冷凍乾燥前維持溶液pH值在可接受範圍內的那些試劑。
「填充」蛋白質的濃度上限通常高於「劑量」蛋白質形式的濃度上限。例如，緩衝液濃度可從幾個毫摩爾到其溶解度的上限，例如組氨酸可高達200mM，本領域的技術人員可考慮達到/維持適當的生理適宜濃度。
有效成分通過本方法冷凍乾燥的製劑可基本包括任何有效成分，如蛋白質、核酸、病毒和其組合。蛋白質可包括，例如凝血因子、生長因子、細胞因子、抗體和嵌合構建體。對於蛋白質而言，存在於製劑中的有效成分可為重組蛋白質或從生物體中分離的蛋白質。
甘氨酸/NaCl製劑就現有的冷凍乾燥方法而言，在甘氨酸存在條件下(一般地大約2％，或者大約250mM)包含大約20mM或更多氯化鈉的製劑中，甘氨酸的結晶作用被氯化鈉抑制。在使用現有冷凍乾燥方法時，在包含高於30mMNaCl的製劑中，甘氨酸結晶顯著減少。相反，本發明提供了其中鹽基本不抑制胺基酸賦形劑(例如氯化鈉和甘氨酸)結晶的冷凍乾燥方法。
因子IX製劑在一個實施方案中，本發明提供了通過所公開方法製備的冷凍乾燥的因子IX產物。可通過本方法冷凍乾燥的適宜因子IX製劑包括美國專利號6,372,716、美國專利號5,770,700和美國專利申請公布號US2001/0031721中公開的因子IX製劑。
例如，可冷凍乾燥的因子IX製劑包含因子IX、膨脹劑和冷凍保護劑。因子IX濃度可為例如大約0.1mg/mL到大約20mg/mL(相當於大約20到至少4000U/mL)或者大約0.4mg/mL到大約20mg/mL。用於因子IX製劑的膨脹劑可包括，例如甘氨酸和/或鎂鹽、鈣鹽、鈉鹽或氯化物鹽，其中膨脹劑的濃度為大約0.5mM到大約400mM。在一個實施方案中，膨脹劑為甘氨酸，其中甘氨酸濃度為大約0.1M到大約0.3M、大約0.2M到大約0.3M或者大約0.25M到大約0.27M。在另一個實施方案中，膨脹劑為濃度為大約0.25M到大約0.27M的甘氨酸和濃度為大約50mM的氯化鈉。用於因子IX製劑的適宜冷凍保護劑包括例如，多元醇，如濃度為大約0.5％到大約2％的甘露醇和蔗糖。因子IX製劑還可包含表面活性劑和/或去垢劑，如聚山梨酯(例如Tween-80)或聚乙二醇(PEG)，其也可在冷凍步驟中用作冷凍保護劑。表面活性劑範圍可為大約0.005％到大約0.05％。賦形劑的濃度可具有例如大約250mOsM到大約350mOsM、或者大約300mOsM±50mOsM的組合重量摩爾滲透壓濃度，並且賦形劑還可含有適當緩衝劑以保持生理適宜的pH值，例如大約6.0-8.0範圍的pH值。緩衝劑可包括，例如組氨酸、磷酸鈉或磷酸鉀，在大約5mM到大約50mM時全部具有大約6.5到7.5的目標pH值。在一個實施方案中，因子IX製劑包含因子IX、10mM組氨酸、1％蔗糖、50mM氯化鈉、0.005％聚山梨酯80和250-270mM的甘氨酸。重構的冷凍乾燥因子IX製劑中的最終NaCl濃度應≥40mM以便在施用因子IX製劑時減少血紅細胞凝集/聚集。因此，在一個實施方案中，通過本方法冷凍乾燥的因子IX製劑包含至少40mM的氯化鈉。
可以理解和預計，本領域的技術人員可根據此處所公開本發明的原理對代表性實施方案進行更改並且此種修飾、改變和替代旨在包括於本發明的範圍之內。
下面所述實施例舉例說明本發明的幾個實施方案。這些實施例僅為舉例說明的目的，並不意味著對本發明的限制。
實施例實施例1不具有高溫退火的冷凍乾燥方法進行三個不同的冷凍乾燥循環以便鑑定增強甘氨酸結晶作用和保持蛋白質穩定性的冷凍乾燥方法。另一個檢測的優勢包括冷凍乾燥產物是否具有低於1％的殘餘水分含量。在這個實施例中進行的冷凍乾燥循環分別表示為如表3、4和5所述的「Lyo G」、「Lyo H」和「Lyo I」。這些循環不包括高溫退火步驟，結果甘氨酸結晶不完全或者與包括高溫退火步驟的方法相比較不完全。此外，不具有高溫退火步驟的循環產生殘餘水分含量低於2％的冷凍乾燥產物。
表2顯示了這個實施例使用的三種製劑。每一種製劑含有在pH 6.8條件下為250IU/mL的因子IX。
表2製劑
表3、4和5顯示了Lyo G、H和I的冷凍乾燥步驟。所有小瓶在真空下塞住瓶口。
表3冷凍乾燥循環「Lyo G」
表4冷凍乾燥循環「Lyo H」
表5冷凍乾燥循環「Lyo I」
將製劑1、2和3的每一個一式兩份根據Lyo G、Lyo H和Lyo I的方案冷凍乾燥。然後使用卡爾·費歇爾法評價每一種冷凍乾燥產物的殘餘水分含量。如可從表6所見，使用Lyo G、Lyo H和Lyo I冷凍乾燥的製劑的水分含量均不低於1％。
表6殘餘水分含量
此外，評價通過Lyo G、H和I方案產生的製劑1、2和3的凍幹塊的完全結晶情況。通過DSC評價完全結晶情況。在第一次掃描(圖1A、2A和3A)中觀察到不可逆的放熱現象。在第二次掃描中沒有放熱現象證實其為不可逆的。本領域的技術人員認識到這個不可逆的放熱現象代表著結晶。這表明結晶賦形劑在冷凍乾燥過程中不完全結晶。圖1A顯示了對凍幹製劑1的第一次掃描，圖1B顯示了對凍幹製劑1的第二次掃描，其中掃描對於用Lyo G、H和I冷凍乾燥的製劑而言是有代表性的。圖2A顯示了對凍幹製劑2的第一次掃描，圖2B顯示了對凍幹製劑2的第二次掃描，其中掃描對於用Lyo G、H和I冷凍乾燥的製劑而言是有代表性的。圖3A顯示了對凍幹製劑3的第一次掃描，圖3B顯示了對凍幹製劑3的第二次掃描，其中掃描對於用Lyo G、H和I冷凍乾燥的製劑而言是有代表性的。如在圖1、2和3中所見，所有通過Lyo G、H和I方案製備的凍幹樣品在第一次掃描過程中顯示有結晶現象(並且在第二次掃描過程中沒有玻璃化轉變)，這表明甘氨酸在冷凍乾燥過程中不完全結晶。
實施例2具有高溫退火的冷凍乾燥方法為了提供塊結構中賦形劑完全結晶或者改善結晶的方法，檢測了包含高溫退火步驟的冷凍乾燥方法。一個附加目標是改善最終殘餘水分百分比到1％以下。
表7顯示了實施例2中所用的製劑。每一種製劑含有在pH 6.8條件下為250IU/mL的因子IX。
表7實施例2中所用的製劑
表8、9和10顯示了Lyo J、K和L的冷凍乾燥步驟。所有的小瓶在真空下塞住瓶口。
表8冷凍乾燥循環「Lyo J」
表9冷凍乾燥循環「Lyo K」
表10冷凍乾燥循環「Lyo L」
將製劑4、5和6每一個一式兩份根據Lyo J、Lyo K和Lyo L的方案冷凍乾燥。然後使用卡爾·費歇爾法評價每一種凍乾產物的水分含量(見表11)。
然後評價通過Lyo J、K和L循環產生的製劑4-6的凍幹塊的完全結晶情況。通過DSC評價完全結晶情況。
同樣，如果在第一次掃描中觀察到結晶現象，那麼樣品在冷凍乾燥過程中沒有完全結晶。圖4A顯示了對凍幹製劑4(「fix927lyoJ.001」)、凍幹製劑5(「fix50250lyoja.001」)和凍幹製劑6(「fix50270lyoja.001」)的第一次掃描，圖4B顯示了對它們的第二次掃描，其中製劑通過LyoJ冷凍乾燥。圖5A顯示了對凍幹製劑4(「fix927yoK.002」)、凍幹製劑5(「fix50250yok.001」)和凍幹製劑6(「fix50270yok.001」)的第一次掃描，圖5B顯示了對它們的第二次掃描，其中製劑根據LyoK冷凍乾燥。圖5C給出了通過LyoK循環冷乾燥的製劑4(「fix 927lyo K」)的另一個第二次掃描。圖6A顯示了對凍幹製劑4(「fix927lyol.001」)、凍幹製劑5(「fix50250lyoL.001」)和凍幹製劑6(「fix50270lyoL.001」)的第一次掃描，圖6B顯示了對它們的第二次掃描，其中製劑根據LyoL冷凍乾燥。圖6C顯示了根據LyoL冷凍乾燥的製劑4(「fix 927Lyo L」)的另一個第二次掃描。
表11給出了根據Lyo J、K或L冷凍乾燥的製劑4、5和6的DSC第一和第二次掃描資料總結。
表11來自實施例2的水分百分比和DSC第一次掃描和第二次掃描的資料總結
對於製劑5和6，由於在第一次掃描中觀察到了結晶現象，所以Lyo J不能使賦形劑完全結晶。不希望被理論束縛，這可能是由於Lyo J中二次乾燥步驟持續時間為零且高溫退火步驟只有3小時的事實。Lyo J能使製劑4中的賦形劑完全結晶，但是製劑4不含有氯化鈉和甘氨酸組合，而製劑5和6確實具有氯化鈉和甘氨酸的組合。Lyo K能使賦形劑完全結晶且最終塊結構中的殘餘水分低於1.2％。Lyo L具有更優的結果，因為發生了完全結晶且最終塊結構中的殘餘水分低於1％。
此外，對根據Lyo L循環冷凍乾燥的塊結構的三個月穩定性研究表明水分含量保持低於1％。另外，經X射線衍射分析顯示，與不經高溫(高於35℃)退火步驟冷凍乾燥的樣品相比，用高溫退火步驟冷凍乾燥的樣品的甘氨酸結晶作用增強(見圖10A和圖10B)。
還通過測定(1)最終塊結構中存在的高分子量(HMW)種類的百分比、(2)因子IX凝固活性的恢復百分比和(3)因子IX比活性的恢復百分比來檢測了凍乾產物的穩定性。通過大小排阻層析(SEC-HPLC)測定高分子量的百分比。使用一步活化的部分促凝血酶原激酶時間測定法測定凝固活性。通過將凝固活性除以蛋白質濃度計算比活性，且蛋白質濃度通過使用SEC-HPLC確定。圖7顯示了通過Lyo J、K和L冷凍乾燥的製劑4-6的HMW百分比。圖8A和8B顯示了冷凍乾燥前和冷凍乾燥後因子IX的凝固活性資料(由於填充4mL而重構稀釋成5mL，所以圖8B中的預期最高恢復值為80％恢復)。圖9顯示了比活性恢復百分比。如通過HMW百分比和效果測定法所示，這些結果表明通過具有高溫退火和乾燥步驟的方法冷凍乾燥的因子IX沒有負面影響。
實施例3具有高溫退火的冷凍乾燥方法提供長期的穩定性實施例2的結果表明製劑不受50℃熱處理(或者「退火保持」，見表9和表10)步驟的負面影響。實際上，這個熱處理步驟導致包含氯化鈉和甘氨酸的製劑的殘餘水分值百分比(％)較低。該種水分百分比的降低與甘氨酸結晶作用的增強相關。為了進一步證明具有高溫熱處理步驟的冷凍乾燥循環不負面影響有效成分的穩定性，開展下列實驗。
表12顯示了該實施例中填充和冷凍乾燥的製劑。製劑含有在pH 6.8條件下為69IU/mL或者在pH 6.8條件下為550IU/mL的重組因子IX。
表12實施例3中所用的製劑
開展兩種冷凍乾燥循環(Lyo P和Lyo Q)，其唯一區別是一個在完全真空下塞住瓶口而另一個為在小瓶中的頂部空間為氮氣。表13和表14列出了Lyo P和Lyo Q的冷凍乾燥循環。對Lyo P而言，所有小瓶在真空下塞住瓶口。對Lyo Q而言，所有小瓶的頂部空間為氮氣。
表13冷凍乾燥循環「Lyo P」
表14冷凍乾燥循環「Lyo Q」
通過Lyo P和Lyo Q產生多個塊結構(所有塊結構外觀良好)以檢測在不同溫度、不同時間儲存過程中塊結構的殘餘水分水平。在所檢測的所有時間和溫度條件下，塊結構具有低於1.5％的殘餘水分水平(殘餘水分水平低於2％通常是可接受的)。即使在50℃儲存9個月和12個月之後，塊結構的殘餘水分水平仍然低於1％。結果列於下面表15中表15殘餘水分水平
通過測定塊結構中存在的HMW種類百分比檢測通過Lyo P和Lyo Q產生的塊結構的穩定性。對儲存於2-8℃和更高儲存溫度情況下的塊結構進行穩定性檢測。低於3％HMW是可接受的。對於每個時間點用一個小瓶進行實驗，而對每一時間點的樣品一式三份用SEC-HPLC測定。結果在下面表16A-D中給出表16A對於Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的HMW百分比結果
表16B對於Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的HMW百分比結果
表16C對於Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的HMW百分比結果
表16D對於Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)的HMW百分比結果
還通過測定因子IX的濃度來檢測通過Lyo P和Lyo Q冷凍乾燥的藥物產物的穩定性。在儲存於2-8℃和加速溫度下的塊結構進行穩定性檢測。對於每個時間點用一個小瓶進行實驗，並且對於每一時間點的樣品一式三份測定。結果(單位為μg/mL)在下面表17A-D中給出。注意*表17A-D中的-80℃時間點為對照，其中檢測了冷凍乾燥前填充藥物產物(BDP)對照。將4毫升BDP填充到每一小瓶中並冷凍乾燥。將冷凍乾燥後的小瓶用5mL注射用水(WFI)重構。這導致藥物產物濃度比BDP對照濃度低20％。通過SEC-HPLC測定重構小瓶中的因子IX的濃度。
表17A對於Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX蛋白質濃度結果
表17B對於Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX蛋白質濃度結果
表17C對於Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX蛋白質濃度結果
表17D對於Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)因子IX蛋白質濃度結果
還通過測定因子IX凝固活性的效果檢測通過Lyo P和Lyo Q產生的塊結構的穩定性。對儲存於2-8℃和加速溫度下的塊結構進行這些測定。對於每一時間點用一個小瓶進行實驗，並且下面表18A-D中提供的結果以IU/mL為單位。此外，在表18A-D中，-80℃資料點為使用冷凍乾燥前填充藥物產物對照(BDP)的對照。將4毫升BDP填充到每一小瓶中並冷凍乾燥。將得到的小瓶用5mL WFI重構。這導致藥物產物效果比BDP對照效果低20％。因此對表18A而言，44IU/mL相當於重構BDP的100％活性(在12個月時效果比BDP-80℃對照低20％)。類似地，對表18B而言，593IU/mL相當於重構BDP的100％活性；對表18C而言，49IU/mL相當於重構BDP的100％活性；對表18D而言，697IU/mL相當於重構BDP的100％活性。使用一步活化的部分促凝血酶原激酶時間測定法通過測定凝固活性來確定因子IX的效果。
表18A對於Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX效果結果
表18B對於Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX效果結果
表18C對於Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX效果結果
表18D對於Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX效果結果
還通過測定因子IX的比活性確定通過Lyo P和Lyo Q產生的塊結構的穩定性。通過將凝固活性除以蛋白質濃度來計算因子IX比活性。下面的數據單位為IU/mg。
表19A對於Lyo P(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX比活性結果
表19B對於Lyo P(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX比活性結果
表19C對於Lyo Q(69IU/mL或250IU/瓶)的因子IX比活性結果
表19D對於Lyo Q(550IU/mL或2000IU/瓶)的因子IX比活性結果
還對凍幹塊結構進行X射線衍射(XRD)以觀察高溫熱處理步驟是否提高了甘氨酸結晶作用(見圖11)。XRD用於鑑定凍幹塊結構中存在的結晶結構。Lyo G用於比較，因為其除了在二次乾燥前不具有50℃熱處理步驟之外其他冷凍乾燥循環參數與Lyo Q的相同。圖11顯示Lyo Q不能增強甘氨酸的結晶。
總之，實施例3的結果表明(1)如通過％HMW、效果和比活性所測量，高溫熱處理步驟不影響有效成分因子IX的穩定性和活性；(2)穩定性資料顯示因子IX在熱處理過程是穩定的並且在加速溫度下長期儲存中是穩定的；(3)高溫熱處理步驟增加了結晶甘氨酸的數量。作為額外的優勢，高溫熱處理步驟降低了樣品的最終殘餘水分值。因此實施例3的結果還提供了進一步的證據證明，二次乾燥前的高溫退火或熱處理步驟不導致有效成分不穩定但是卻提高了賦形劑結晶作用和整體結晶效率。
實施例4低溫退火步驟是任選的在具有和不具有-15℃和50℃退火步驟條件下進行矩陣排列的冷凍乾燥循環以確定低溫退火步驟是否為提高甘氨酸結晶所必需。由10mM組氨酸、1％蔗糖、260mM甘氨酸、50mM NaCl和0.005％聚山梨酯80，pH 6.8組成的製劑緩衝液用於所有的循環。對凍幹塊結構的分析包括DSC、XRD和殘餘水分％。表20顯示了所開展的冷凍乾燥循環。
表20冷凍乾燥循環
下面的表21顯示了實驗的分析結果表21結果
*2個小瓶的平均值。
基於DSC資料，很明顯，包括低溫退火步驟(在此為-15℃)對是否在第一次掃描檢測到結晶現象沒有影響。高溫退火步驟(在此為50℃)足以消除在DSC第一次掃描中所觀察到的再結晶現象。雖然低溫退火步驟是任選的，但是包括該步驟是有利的，因為來自XRD資料的17.5°峰暗示-15℃退火步驟進一步提高了甘氨酸的結晶作用。
權利要求
1.冷凍乾燥含水藥物製劑的方法，該方法包括(a)將含水藥物製劑冷凍；(b)將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(c)在高於大約25℃的溫度下將步驟(c)的藥物製劑退火；和(d)在低於步驟(c)所用溫度的溫度下將步驟(c)的藥物製劑乾燥。
2.權利要求1的方法，其中步驟(a)中的冷凍在低於-10℃的溫度下進行。
3.權利要求1的方法，其中步驟(a)中的冷凍在低於-35℃的溫度下進行。
4.權利要求1的方法，其中步驟(b)中的乾燥在大約-35℃和大約20℃之間的溫度下進行。
5.權利要求1的方法，其中步驟(b)中的乾燥在大約-25℃和大約10℃之間的溫度下進行。
6.權利要求1的方法，其中步驟(b)中的乾燥在大約-20℃和大約0℃之間的溫度下進行。
7.權利要求1的方法，其中步驟(b)中的乾燥在大約0℃的溫度下進行。
8.權利要求1的方法，其中步驟(c)中的退火在大約25℃和大約75℃之間的溫度下進行。
9.權利要求1的方法，其中步驟(c)中的退火在大約35℃和大約60℃之間的溫度下進行。
10.權利要求1的方法，其中步驟(c)中的退火在大約50℃的溫度下進行。
11.權利要求1的方法，其中步驟(d)中的乾燥在大約25℃的溫度下進行。
12.冷凍乾燥含水藥物製劑的方法，該方法包括(a)將含水藥物製劑冷凍；(b)在大約-35℃和大約0℃之間的溫度下將步驟(a)的藥物製劑退火；(c)在大約-35℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(d)在大約25℃和大約75℃之間的溫度下將步驟(c)的藥物製劑退火；(e)在低於步驟(d)所用溫度的溫度下將步驟(c)的藥物製劑乾燥。
13.權利要求12的方法，其中步驟(a)中的冷凍在低於-10℃的溫度下進行。
14.權利要求12的方法，其中步驟(a)中的冷凍在低於-35℃的溫度下進行。
15.權利要求12的方法，其中步驟(b)中的退火在大約-25℃和大約10℃之間的溫度下進行。
16.權利要求12的方法，其中步驟(b)中的退火在大約-20℃和大約-10℃之間的溫度下進行。
17.權利要求12的方法，其中步驟(b)中的退火在大約-15℃的溫度下進行。
18.權利要求12的方法，其中步驟(c)中的乾燥在大約-25℃和大約-10℃之間的溫度下進行。
19.權利要求12的方法，其中步驟(c)中的乾燥在大約-20℃和大約-10℃之間的溫度下進行。
20.權利要求12的方法，其中步驟(c)中的乾燥在大約0℃的溫度下進行。
21.權利要求12的方法，其中步驟(d)中的退火在大約35℃和大約60℃之間的溫度下進行。
22.權利要求12的方法，其中步驟(d)中的退火在大約50℃的溫度下進行。
23.權利要求12的方法，其中步驟(e)中的乾燥在大約25℃的溫度下進行。
24.權利要求12的方法，其還包括在步驟(b)之後和步驟(c)之前進行的一個再冷凍步驟，其中再冷凍步驟在低於-35℃的溫度下進行。
25.權利要求24的方法，其中再冷凍步驟在大約-40℃和大約-50℃之間的溫度下進行。
26.權利要求1或12的方法，其中含水藥物製劑包含至少一種結晶賦形劑。
27.權利要求26的方法，其中結晶賦形劑選自胺基酸、鹽和多元醇。
28.權利要求27的方法，其中胺基酸為甘氨酸或組氨酸。
29.權利要求27的方法，其中鹽為氯化鈉。
30.權利要求27的方法，其中多元醇為甘露醇。
31.權利要求1或12的方法，其中含水藥物製劑包含結晶賦形劑組合，其中該組合為鹽和胺基酸。
32.權利要求31的方法，其中鹽為氯化鈉。
33.權利要求32的方法，其中氯化鈉在製劑中以高於大約25mM的濃度存在。
34.權利要求32的方法，其中氯化鈉在製劑中以大約25mM和200mM之間的濃度存在。
35.權利要求32的方法，其中氯化鈉在製劑中以大約30mM和100mM之間的濃度存在。
36.權利要求32的方法，其中氯化鈉在製劑中以大約40mM和60mM之間的濃度存在。
37.權利要求32的方法，其中氯化鈉在製劑中以大約50mM的濃度存在。
38.權利要求31的方法，其中胺基酸在製劑中以大約1％至大約10％之間的濃度存在。
39.權利要求31的方法，其中胺基酸在製劑中以大約1.5％至大約5％之間的濃度存在。
40.權利要求31的方法，其中胺基酸在製劑中以大約1.5％至大約3％之間的濃度存在。
41.權利要求31的方法，其中胺基酸在製劑中以大約2％的濃度存在。
42.權利要求38、39、40、41或42的方法，其中胺基酸為甘氨酸。
43.冷凍乾燥包含氯化鈉和甘氨酸的含水藥物製劑的方法，其中該方法包括(a)在低於-35℃的溫度下將含水藥物製劑冷凍；(b)任選地在大約-20℃和大約-10℃之間的溫度下將步驟(a)的藥物製劑退火；(c)在大約-10℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(d)在大約35℃和大約50℃之間的溫度下將步驟(c)的藥物製劑退火；和(e)在低於步驟(d)所用溫度的溫度下將步驟(d)的藥物製劑乾燥。
44.權利要求43的方法，其中步驟(e)中的溫度為大約25℃。
45.冷凍乾燥包含高於35mM氯化鈉和大約250mM至大約300mM甘氨酸的含水藥物製劑的方法，其中方法包括(a)在低於-35℃的溫度下將含水藥物製劑冷凍；(b)在大約-15℃下將步驟(a)的藥物製劑退火；(c)在大約0℃下將步驟(b)的藥物製劑乾燥；(d)在大約50℃下將步驟(c)的藥物製劑退火；和(e)在大約25℃下將步驟(d)的藥物製劑乾燥。
46.權利要求45的方法，其還包括在步驟(b)之後和步驟(c)之前的再冷凍步驟，其中再冷凍步驟包括在大約-50℃下再冷凍步驟(b)的藥物製劑。
47.權利要求46的方法，其中步驟(a)進行大約5小時；步驟(b)進行大約5小時；步驟(c)進行大約38小時；步驟(d)進行大約5小時；以及步驟(e)進行大約9.5小時。
48.增強冷凍乾燥過程中賦形劑結晶的方法，其包括(a)提供包含甘氨酸和氯化鈉的含水藥物製劑；(b)將含水藥物製劑冷凍；(c)任選地在大約-35℃和大約0℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑退火；(d)在大約-35℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(b)或步驟(c)的藥物製劑乾燥；(e)在大約25℃和大約75℃之間的溫度下將步驟(d)的藥物製劑退火，以便甘氨酸在步驟(e)之後比步驟(e)之前更大程度結晶；和(f)在與步驟(e)所用溫度相同或更低的溫度下將步驟(e)的藥物製劑乾燥，從而增強賦形劑的結晶。
49.通過以下過程產生的凍乾產物，其中所述過程包括(a)提供包含甘氨酸和氯化鈉的製劑；(b)冷凍製劑；(c)任選地在大約-35℃和大約0℃之間的溫度下將步驟(b)的藥物製劑退火；(d)在大約-35℃和大約10℃之間的溫度下將步驟(b)或步驟(c)的藥物製劑乾燥；(e)在大約25℃和大約75℃之間的溫度下將步驟(d)的藥物製劑退火；和(f)在與步驟(e)所用溫度相同或更低的溫度下將步驟(e)的藥物製劑乾燥，從而提供凍乾產物。
50.權利要求49的凍乾產物，其中製劑還包含有效成分。
51.權利要求50的凍乾產物，其中有效成分為蛋白質、核酸或病毒。
52.權利要求50的凍乾產物，其中有效成分為因子IX。
53.權利要求49的凍乾產物，其中步驟(f)之後的凍乾產物中的甘氨酸比通過二次乾燥前沒有高溫退火步驟的過程製備的凍乾產物中的甘氨酸更大程度結晶。
54.通過以下過程產生的凍乾產物，其中所述過程包括(a)提供包含甘氨酸和氯化鈉的製劑；(b)冷凍製劑；(c)任選地在大約-20℃和大約-10℃之間的溫度下將步驟(b)的製劑退火；(d)在大約0℃和大約5℃之間的溫度下將步驟(c)的製劑乾燥；(e)在大約35℃和大約50℃之間的溫度下將步驟(d)的製劑退火；和(f)在與步驟(e)所用溫度相同或更低的溫度下將步驟(e)的製劑乾燥，從而提供凍乾產物。
55.權利要求54的凍乾產物，其中步驟(f)之後的凍乾產物中的甘氨酸比通過二次乾燥前沒有高溫退火步驟的過程製備的凍乾產物中的甘氨酸更大程度結晶。
56.權利要求54的凍乾產物，其中凍乾產物在長時間高儲存溫度下基本穩定。
57.權利要求56的凍乾產物，其中長時間包括大約3個月和大約1年之間，並且其中加速的溫度包括大約25℃和大約50℃之間。
全文摘要
本發明提供了改進的冷凍乾燥(凍幹)有效成分如蛋白質、核酸和病毒的方法。與現有方法相比，本方法提高了冷凍乾燥過程中賦形劑的結晶程度。賦形劑結晶的改善部分地基於在二次乾燥前或者在二次乾燥時進行的高溫退火步驟。重要的是，高溫退火步驟不破壞有效成分的穩定性。此外，在進行高溫退火步驟之前不需要零度下退火步驟以便使賦形劑完全結晶。
文檔編號A61K9/00GK1933811SQ200580006921
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月4日 優先權日2004年3月4日
發明者J·朱諾, S·諾爾斯 申請人:惠氏公司