一種海洋解澱粉芽孢桿菌1a的分離方法與用途

2023-10-10 23:15:14

一種海洋解澱粉芽孢桿菌1a的分離方法與用途
【專利摘要】本發明是一種海洋解澱粉芽孢桿菌1A對果品產後病原真菌的抗菌與防病用途，所述的果品產後病原真菌為：蘋果炭疽病菌，葡萄白腐病菌，梨鏈格孢菌，柑橘青黴菌。所述的海洋解澱粉芽孢桿菌1A的分離方法通過採集連雲港海域海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、滸苔、跳跳魚樣品，富集後進行細菌的分離及純化，得到若干海洋細菌純菌株；再採用平板對峙法測定海洋細菌純菌株對供試4種果品產後病原真菌的抑制作用，篩選得到抑菌帶寬度大於5mm的菌株；再採用牛津杯法測定無菌發酵液對前述4種果品產後病原真菌的抑菌作用，篩選得到抑菌帶寬度均大於10mm的解澱粉芽孢桿菌1A。本發明具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種海洋解澱粉芽孢桿菌1A的分離方法與用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種菌株的分離方法，特別是一種海洋解澱粉芽孢桿菌IA的分離方法，本發明還涉及前述分離方法得到的解澱粉芽孢桿菌IA的用途。
【背景技術】
[0002]果實採後腐爛是一個全球性問題。新鮮水果在採收、分級、包裝、運輸、貯藏、批發、零售整個採後流通過程中都有可能腐爛損失，在世界範圍內新鮮果蔬貯運過程中約有25%的產品因腐爛變質不能利用，有些易腐水果採後腐爛損失達到30%以上。目前控制果品產後病害主要依靠化學防治，然而化學農藥的大量使用導致的農產品農藥殘留、病原菌抗藥性產生、環境汙染等問題已成為世界性難題。生物防治可彌補化學農藥的不足，成為植物病害防治的重要手段。應用有益微生物防治果品產後病害引起廣泛重視，並取得了許多成果。目前用於果品產後病害的微生物菌株主要來源於陸源微生物。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種來自海洋解澱粉芽孢桿菌IA的新的對果品產後病原真菌的抗菌與防病用途。
[0004]本發明所要解決的另一技術問題是提供了解澱粉芽孢桿菌IA的分離方法。
[0005]本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明公開了海洋解澱粉芽孢桿菌IA {Bacillus對果品產後病原真菌的抗菌與防病用途；所述的果品產後病原真菌為:蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides ),葡萄白腐病菌(CbflieWa 梨鏈格抱菌(kikuchiana)，柑橘青黴菌(Penicllium italicum)。
[0006]本發明中涉及的海洋解澱粉`芽孢桿菌IA的分離方法步驟如下:
(I)樣品的採集與富集:連雲港海域採集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、滸苔、跳跳魚樣品，置於採樣袋中，註明樣品名稱、採集日期以及採集地點，樣品進行如下處理:
海水樣品:採集來的海水混勻，5mL加入到裝有45mL富集培養基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ；
海泥樣品:取5g海泥放入事先滅好菌的裝有45ml的無菌海水的250ml的三角瓶中，混勻振蕩20min，取5ml樣品加入45ml富集培養基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ；
魚體樣品:魚體解剖之後，取腸道組織5g放入無菌研砵中加少量無菌海水研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入裝有45ml富集培養基的250ml三角瓶中，25°C，180r/min的條件下搖床培養2d ；
貝類樣品:取其消化腺5g剪碎無菌海水浸泡過夜後，將浸泡液和消化腺放入裝有入45mL富集培養基250ml三角瓶中，180r/min，25°C條件下搖床培養2d ；
滸苔樣品:用無菌海水衝洗滸苔樣品3次，取5g衝洗後的樣品研磨至糊狀，將液體加入到富集培養基中，並於25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ；
螃蟹樣品:用剪刀剪取5g蟹肉或者消化腺於放入已經滅菌後的無菌研砵中研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入45ml富集培養基的的250ml三角瓶中，並於25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ；
(2)細菌的分離及純化:分別取ImL上述富集後的樣品放入盛有9mL無菌水的試管中，進行梯度稀釋，取10_4、10_5、10_6稀釋度樣品0.2mL塗布到直徑9cm的分離培養基平板上，每個稀釋梯度重複3次；觀察並挑取形態、顏色不同的菌落，採用三區劃線方法進行純化，得到若干海洋細菌純菌株；
(3)初篩:採用平板對 峙法測定海洋細菌純菌株對供試4種果品產後病原真菌的抑制作用；方法如下=PDA培養基平板中央接種直徑為8mm果品產後病原真菌菌苔，菌苔四周距離培養皿邊緣15_處劃線接種海洋細菌純菌株，重複3次，28°C倒置恆溫培養3d，測定抑菌帶寬度，篩選得到抑菌帶寬度大於5mm的菌株；所述的4種果品產後病原真菌為:蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌diplodiella)，.^鏈格抱菌(Alterrmria kikuchiana)，柑橘青黴菌(Penicllium i tali cum)；
(4)復篩:將抑菌帶寬度大於5mm的菌株進行搖瓶發酵製備無菌發酵液，方法如下:接種I環菌株於盛有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振蕩培養24h，調整菌液濃度為108cfu/mL，作發酵用種子液；將種子液按10%的接種量接入至裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振蕩培養36h，發酵液在4°C，12000 r/min條件下離心20min，棄沉澱，上清液，用孔徑為0.22 μ m的細菌過濾器過濾，即得無菌發酵液；採用牛津杯法測定無菌發酵液對前述4種果品產後病原真菌的抑菌作用，篩選得到對4種果品產後病原真菌的抑菌帶寬度均大於IOmm的菌株海洋解澱粉芽孢桿菌1A，該菌株分離自海水樣品；
所述的富集培養基、分離培養基、種子培養基和發酵培養基均為2216E培養基。
[0007]以下對本發明進行進一步說明。
[0008]本發明方法所涉及的材料解澱粉芽孢桿菌IA (,Bacillus amyloliquefaciensstrain 1A)(下稱菌株1A)已經於2013年7月I日在Genebank公開(登錄號為KF112077)，網址為:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/KFl 12077? 該菌株為公知公用材料，在本專利申請日起二十年內，公眾如果需要，淮海工學院海洋學院實驗室可對外提供。
[0009]以下是發明人做的相關實驗:
I材料與方法
1.1供試病原菌
炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides )葡萄白腐病舊 QConiella)、梨鏈格抱菌(Mtemaxi a kikuchi ana)、柑橘青黴菌(Penici I I i umi tal i--)，由中國農科院植保所提供，淮海工學院海洋學院實驗室保存。
[0010]1.2樣品的處理與富集
連雲港海域採集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、滸苔、跳跳魚等樣品，置於採樣袋中，註明樣品名稱、採集日期以及採集地點，樣品進行如下處理:
(I)海水樣品:採集來的海水混勻，5mL加入到裝有50mL富集培養基的250ml的三角瓶中，25°C、180r/min的條件下搖床培養2d。[0011](2)海泥樣品:取5g海泥放入事先滅好菌的裝有45ml的無菌海水的250ml的三角瓶中，混勻振蕩20min，取5ml樣品加入45ml富集培養基的的250ml的三角瓶中，25°C、180r/min的條件下搖床培養2d。
[0012](3)魚體樣品:魚體解剖之後，取腸道組織5g放入無菌研砵中加少量無菌海水研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入45ml富集培養基的的250ml的三角瓶中，25°C，180r/min的條件下搖床培養2d。
[0013](4)貝類樣品:取其消化腺5g剪碎無菌海水浸泡過夜後，將浸泡液和消化腺放入裝有入45mL富集培養基250ml的三角瓶中，180r/min，25°C條件下搖床培養2d。
[0014](5)滸苔樣品:用無菌海水衝洗滸苔樣品3次，取5g衝洗後的樣品研磨至糊狀，將液體加入到富集培養基中。並於25°C、180r/min的條件下搖床培養2d。
[0015](6)螃蟹樣品:用剪刀剪取部分蟹肉或者消化腺於放入已經滅菌後的無菌研砵中研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入45ml富集培養基的的250ml的三角瓶中，並於25°C、180r/min的條件下搖床培養2d。
[0016]1.3菌株的分離及純化
取ImL處理好的樣品放入盛有9mL無菌水的試管中，進行梯度稀釋，取10_4、10_5、10_6稀釋度樣品0.2mL塗布到直徑9cm的分離培養基平板上，每個稀釋梯度重複3次。觀察並挑取形態、顏色不同的菌落，採用三區劃線方法進行純化。
[0017]1.4菌株對幾種水果儲藏病原菌的抑制作用測定
採用平板對峙法測定分離菌`株對供試4種病原真菌的抑制作用。PDA培養基平板中央接種直徑為8mm病原真菌菌苔，菌苔四周距離培養皿邊緣15mm處劃線接種分離菌株，重複3次，28°C倒置恆溫培養3d，測定抑菌帶寬度。抑菌作用較強的菌株進行搖瓶發酵製備無菌發酵液，測定發酵液的抑菌作用。
[0018]將抑菌帶寬度大於5mm的菌株進行搖瓶發酵製備無菌發酵液，方法如下:接種I環菌株於盛有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振蕩培養24h，調整菌液濃度為108cfu/mL，作發酵用種子液；將種子液按10%的接種量接入至裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，280C，180r/min振蕩培養36h，發酵液在4°C，12000 r/min條件下離心20min,棄沉澱，上清液，用孔徑為0.22 μ m的細菌過濾器過濾，即得無菌發酵液。
[0019]1.5菌株對幾種水果儲藏病原菌的菌絲破壞作用觀察
液體共培養法:病原真菌在PDA平板中培養5d後,用直徑為5 mm的打孔器在培養好的病原真菌的菌落邊緣打取菌苔5塊，放入裝有50mL海水H)培養基的250mL的三角瓶中，再向三角瓶中接種菌體濃度為1.0 X IO8個/ mL的IA菌株懸浮液lmL，在28°C、180 r/min條件下恆溫震蕩培養5d，顯微鏡下觀察病原真菌的菌絲形態。
[0020]1.6菌株無菌發酵液對病原真菌孢子萌發的抑制作用
用5mL無菌水洗下培養5 d的梨供試的水果產後病原真的菌落，用4層無菌紗布過濾除去菌絲，濾液在室溫，4000 r/min下離心IOmin，沉澱即為分生孢子，用製備好的無菌發酵液配製孢子懸浮液，濃度為IO6個孢子/mL，取20 μ L孢子懸浮液滴加在無菌玻片上，置於鋪有溼潤濾紙的培養皿內，28°C下恆溫保溼培養，分別於2，4，6，8，IOh觀察孢子萌發情況，測定芽管長度，計算孢子萌發率和抑制率。
[0021]孢子萌發率(％)=(萌發孢子數/觀察孢子總數)X 100%。[0022]抑制率(％)=(對照孢子萌發率或芽管長度-孢子萌發率或芽管長度)/對照孢子萌發率或芽管長度X100%
1.7菌株無菌發酵液對幾種水果防腐作用測定
取無病無傷、大小和成熟度相似的新鮮蘋果、梨、柑橘，用2 %的NaClO溶液表面消毒後，清水洗淨晾乾。在果實腰部9cm2的區域用無菌針刺成微孔，進行如下處理:
(1)塗抹接種100μ L的菌株IA菌懸液，2 h後接種病原菌孢子懸液100 μ L ;
(2)先接種病原菌的孢子懸液100μ L，2 h後塗抹100 μ L的菌株IA菌懸液；
(3)單純接種病原菌的孢子懸液100μ L ;
(4)只塗抹接種IOOyL的菌株IA菌懸液。處理後的果實放到保溼缸內，保持95%的溼度，在25 1:條件下恆溫保溼培養，7 d後統計果實的發病率和病斑直徑，每個處理10個果實。
[0023]葡萄的處理:取健康無病葡萄果實50粒，75%酒精表面消毒2min，無菌水衝洗3次進行如下處理:
(O從葡萄的基部塗抹菌株IA發酵液20 μ L，乾燥後接種葡萄白腐病菌的菌懸液10μ L ；
(2 )從葡萄的基部接種葡萄白腐病菌的菌懸液10 μ L，2 h後塗抹菌株IA發酵液20 μ L ;
(3)只接種菌株IA菌懸液20μ L ;
(4)只接種葡萄白腐病菌菌懸液10μ L，25 °C條件下保溼培養，觀察果實始病時間，計算果腐率。試驗重複3次。
[0024]抑制率(％)=(對照發病面積或果腐率-處理髮病面積或果腐率)/對照發病面積或果腐率X 100%
1.8菌株的鑑定
1.8.1形態學觀察
對分離到有較強抗菌作用的菌株接種於LB培養基平板上，28°C恆溫培養24h，觀察記錄菌落形態，測定菌體大小，並進行革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色。
[0025]1.8.2生理生化鑑定
生理生化試驗參考文獻方法，測定吲哚試驗、M.R.試驗、V.P.試驗、硫化氫試驗、油脂水解試驗、石蕊牛奶試驗、接觸酶試驗、糖醇發酵試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、半固體瓊脂穿刺試驗、好氧性和明膠液化等生理生化指標。
[0026]1.8.3 16SrDNA序列的擴增分析
採用CTAB法提取不同菌株的基因組DNA，應用細菌16SrDNA基因通用引物:27F:5』 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』
1492R: 5』 -GGTTA CCTTGTTACGACTT-3』 擴增 16SrDNA 序列，PCR 反應體系見表 I。
[0027]表1菌株16SrDNA序列擴增PCR反應體系
【權利要求】
1.一種海洋解澱粉芽孢桿菌IA (Bacillus amyloliquefaciens)對果品產後病原真菌的抗菌與防病用途；所述的果品產後病原真菌為:蘋果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides )，葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella),梨鏈格抱菌(Alternariakikuchiana)，柑橘青黴菌(Penicllium italicum)。
2.一種如權利要求1所述用途中涉及的海洋解澱粉芽孢桿菌IA的分離方法，其特徵在於，其步驟如下: (1)樣品的採集與富集:連雲港海域採集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、滸苔、跳跳魚樣品，置於採樣袋中，註明樣品名稱、採集日期以及採集地點，樣品進行如下處理: 海水樣品:採集來的海水混勻，5mL加入到裝有45mL富集培養基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ； 海泥樣品:取5g海泥放入事先滅好菌的裝有45ml的無菌海水的250ml的三角瓶中，混勻振蕩20min，取5ml樣品加入45ml富集培養基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ； 魚體樣品:魚體解剖之後，取腸道組織5g放入無菌研砵中加少量無菌海水研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入裝有45ml富集培養基的250ml三角瓶中，25°C，180r/min的條件下搖床培養2d ； 貝類樣品:取其消化腺5g剪碎無菌海水浸泡過夜後，將浸泡液和消化腺放入裝有入45mL富集培養基250ml三角瓶中，180r/min，25°C條件下搖床培養2d ； 滸苔樣品:用無菌海水衝洗滸苔樣品3次，取5g衝洗後的樣品研磨至糊狀，將液體加入到富集培養基中，並於25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ； 螃蟹樣品:用剪刀剪取5g蟹肉或者消化腺於放入已經滅菌後的無菌研砵中研磨至糊狀，取研磨好的糊狀樣品5ml加入45ml富集培養基的的250ml三角瓶中，並於25°C、180r/min的條件下搖床培養2d ； (2)細菌的分離及純化:分別取ImL上述富集後的樣品放入盛有9mL無菌水的試管中，進行梯度稀釋，取10_4、10_5、10_6稀釋度樣品0.2mL塗布到直徑9cm的分離培養基平板上，每個稀釋梯度重複3次；觀察並挑取形態、顏色不同的菌落，採用三區劃線方法進行純化，得到若干海洋細菌純菌株； (3)初篩:採用平板對峙法測定海洋細菌純菌株對供試4種果品產後病原真菌的抑制作用；方法如下=PDA培養基平板中央接種直徑為8mm果品產後病原真菌菌苔，菌苔四周距離培養皿邊緣15_處劃線接種海洋細菌純菌株，重複3次，28°C倒置恆溫培養3d，測定抑菌帶寬度，篩選得到抑菌帶寬度大於5mm的菌株；所述的4種果品產後病原真菌為:蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella),梨鏈格抱菌(Alternaria kikuchiana)，柑橘青黴菌(Penicllium i tali cum)； (4)復篩:將抑菌帶寬度大於5mm的菌株進行搖瓶發酵製備無菌發酵液，方法如下:接種I環菌株於盛有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振蕩培養24h，調整菌液濃度為108cfu/mL，作發酵用種子液；將種子液按10%的接種量接入至裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振蕩培養36h，發酵液在4°C，12000 r/min條件下離心20min，棄沉澱，上清液，用孔徑為0.22 μ m的細菌過濾器過濾，即得無菌發酵液；採用牛津杯法測定無菌發酵液對前述4種果品產後病原真菌的抑菌作用，篩選得到對4種果品產後病原真菌的抑菌帶寬度均大於IOmm的菌株海洋解澱粉芽孢桿菌1A，該菌株分離自海水樣品； 所述的富集培養基、`分離培養基、種子培養基和發酵培養基均為2216E培養基。
【文檔編號】A23B7/155GK103695360SQ201410013742
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】馬桂珍, 暴增海, 王淑芳 申請人:淮海工學院