川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用的製作方法
2023-10-10 16:44:14
專利名稱：川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
中藥川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMPz)，化學名為四甲基吡嗪，是從中藥川芎的總生物鹼中分離得到的一種有效活性生物鹼，化學結構為1-(5-羥甲基-2-呋喃基)-9H-吡啶並[3，4-b]吲哚。我國在20世紀70年代初，由北京製藥工業研究所從川芎提取物中分離出單體川芎嗪，現在已由人工合成。祖國傳統醫藥認為它辛散溫通，既可活血又可行氣，適用於氣滯血淤的病症。現代實驗研究則認為川芎嗪具有擴張小動脈和小靜脈，抗血小板聚集，改變血液流變性，改善微循環障礙，降低毛細血管通透性，增強機體耐缺氧能力，清除羥自由基，抗脂質氧化等作用。
由於川芎嗪具有擴張微血管，抗血小板聚集，改善微循環障礙和抗氧化損傷等作用，現在已被廣泛用於治療心血管疾病和腦缺血性疾病等，也有用川芎嗪來治療非增殖期糖尿病視網膜病變的臨床初步研究，如竇敬芳等(竇敬芳，翁孝剛。川芎嗪治療非增殖期糖尿病視網膜病變臨床研究。眼科新進展，1998，18(3)138～140.)報導了36例非增殖期糖尿病視網膜病患者，川芎嗪治療後取得了較為滿意的療效，總有效率為68.69％。然而，非增殖期糖尿病不產生新生血管，不屬於新生血管性視網膜疾病，其與新生血管性視網膜疾病的治療機理、治療手段存在很大的差異。另外，在體內研究方面，迄今為止尚未見到川芎嗪在新生血管性視網膜疾病方面的實驗研究，較多的研究集中在缺血再灌注損傷模型等方面。
新生血管性視網膜疾病是一類常見的致盲眼病，包括增殖期糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑變性、視網膜中央靜脈阻塞、早產兒視網膜病變、視網膜血管炎等。這類疾病的共同特點是新生血管生成，使疾病的治療變得非常棘手，嚴重影響了患者的生存質量，給患者家庭及社會帶來沉重的負擔。
目前的研究認為，新生血管性視網膜疾病是由於各種原因導致機體內新生血管生成的刺激因子與抑制因子之間失去平衡而造成的。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growthfactor，VEGF)作為最主要的新生血管生成刺激因子，在其中發揮了重要的作用。缺氧誘導的視網膜新生血管形成(OIR)的動物模型是國際同行公認的成熟的新生血管性視網膜疾病的動物模型，並且已經被證實是由於在缺氧期眼內分泌過多的VEGF所引起的。
關於川芎嗪對視網膜病變的研究既往已有一些報導，如陳瑞華等(陳瑞華，陳少強，陳振彬等，糖尿病大鼠早期視網膜超微結構改變及藥物治療效果。福建醫科大學學報，2001，35119)將川芎嗪用於治療STZ誘導的糖尿病大鼠，川芎嗪100mg/Kg灌胃治療12周和20周後，微血管瘤形成明顯減少，視網膜組織結構改善，大鼠視網膜VEGF表達明顯減弱。但是，由於STZ誘導的糖尿病大鼠視網膜不產生新生血管，該模型僅模擬了部分背景期糖尿病視網膜病變而不能代表增殖期改變。另外，目前雖有報導川芎嗪對體外培養的人臍靜脈內皮細胞的作用(徐曉玉，楊麗蓉，川芎嗪對人臍靜脈內皮細胞ECV304增殖的影響，中草藥，2004，35(10)1150-1152)，但由於人臍靜脈內皮細胞和視網膜血管內皮細胞有很大的差異，尤其是後者具備內屏障的功能而前者無，川芎嗪對視網膜血管內皮細胞的作用直接關係到該藥治療新生血管性視網膜疾病的機理及其效應，因此有必要進行更進一步的研究。
綜上所述，至今為止採用川芎嗪製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物未見任何報導。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用。
所述新生血管性視網膜疾病為增殖期糖尿病視網膜病變或年齡相關性黃斑變性或視網膜中央靜脈阻塞或早產兒視網膜病變或視網膜血管炎。
本發明研究川芎嗪對體外培養的人視網膜血管內皮細胞增殖的影響，實驗表明川芎嗪對正常和缺氧條件下培養的人視網膜血管內皮細胞增殖有抑制作用，並闡明該抑制作用與川芎嗪促進細胞凋亡有關。體內實驗發現川芎嗪對OIR模型中新生血管的形成有明顯的抑制作用，明顯降低了病變視網膜中VEGF的表達，能有效減輕視網膜的病變程度。從而為川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用提供了有力的實驗基礎，為治療新生血管性視網膜疾病提供了一種新的可行的治療方案。
圖1是ELISA P14小鼠視網膜檢測VEGF蛋白表達的示意圖，其中，1為對照組；2為實驗組1(川芎嗪100mg/Kg)；3為實驗組2(川芎嗪200mg/Kg)；圖2是RT-PCR檢測P14小鼠視網膜VEGF mRNA表達的示意圖，其中，1為對照組；2為實驗組1(川芎嗪100mg/Kg)；3為實驗組2(川芎嗪200mg/Kg)；圖3是P17小鼠行螢光素心臟灌注視網膜鋪片觀察視網膜新生血管，其中，圖3A中左上為正常P17小鼠；右上為對照組；左下為實驗組1(川芎嗪100mg/Kg)；右下為實驗組2(川芎嗪200mg/Kg)；圖4是P17小鼠眼球行冰凍切片和GSA染色檢測視網膜新生血管，其中圖4A中，左上為正常小鼠視網膜；右上為對照組；左下為實驗組1(川芎嗪100mg/Kg)；右下為實驗組2(川芎嗪200mg/Kg)；圖5是體外培養人視網膜血管內皮細胞並用VIII因子進行細胞鑑定的結果示意圖；圖6是MTT檢測川芎嗪幹預後第2、4、6天細胞增殖情況，其中，圖6A是正常細胞組凋亡結果；圖6B是缺氧細胞組凋亡結果示意圖；圖7是川芎嗪幹預後48小時檢測細胞凋亡情況，其中，圖7A是正常細胞組凋亡結果；圖7B是缺氧細胞組凋亡結果示意圖。
具體實施例方式
藥品與主要試劑鹽酸川芎嗪注射液，無錫市第七製藥有限公司產品，規格40mg/2ml，批號050112；MTT，DMSO。所有數據以x±s表示，輸入SAS統計軟體，採用方差分析方法進行比較，並作多樣本均數間兩兩比較的q檢驗，兩因素相關關係採用相關分析，以P＜0.05為差異有顯著性。
實施例1體內實驗1.氧誘導的血管增殖性視網膜病變小鼠模型的製備及給藥將出生後第7天(P7)的C57/BL小鼠與母鼠放入含氧體積分數為75％±3％的飼養箱內連續飼養5天，飼養溫度維持在(23±2)℃，每天照明12h，用自動氧氣分析儀監測並調控箱內氧氣含量。P12放回正常空氣中飼養，這時小鼠視網膜處於相對缺氧狀態，P17時視網膜內有大量新生血管形成。P12-P16每天一次給小鼠腹腔注射藥物，分為三組，實驗組1為腹腔注射川芎嗪100mg/Kg，實驗組2為腹腔注射川芎嗪200mg/Kg，對照組為腹腔注射等量生理鹽水。
2.ELISA檢測P14小鼠視網膜VEGF蛋白的表達取P14實驗小鼠每組各3隻，水合氯醛過量麻醉處死小鼠，取出每組小鼠眼球各6隻放入250ul細胞裂解液中，超聲粉碎，12000G 4℃離心30min，收集上清液，置於-70℃冰箱中保存。用BCA法檢測蛋白濃度，ELISA試劑盒檢測視網膜蛋白提取液中VEGF表達每孔加入50ul Assay Diluent RDlN，向孔內加入50ul標準品、樣品，輕輕拍打孔板1分鐘，蓋上膠帶，室溫下孵育2小時，吸去每孔的液體，加入400ulWash Buffer清洗，重複此步驟4次，每孔加入100ul Conjugate，蓋上新的膠帶，室溫下孵育2小時，用Wash Buffer清洗每孔，清洗步驟同前，然後每孔加入100ul Subtrate Solution，室溫下孵育30分鐘，注意避光，最後每孔加入100ul Stop Solution，輕輕拍打孔板以充分混合，用酶標儀讀取每孔450nm的光密度和570nm的光密度，用450nm的讀數減去570nm的讀數以校正。計算1mg/ml視網膜蛋白中VEGF的含量。
結果如圖1所示，P14小鼠視網膜VEGF蛋白表達如下實驗組1為232.4±13.75，實驗組2為201.3±10.94，對照組為249.5±12.13。經統計學分析顯示，實驗組1和組2小鼠視網膜VEGF蛋白表達均比對照組減少(F＝19.94，P＝0.0002)。說明腹腔注射川芎嗪可以降低小鼠視網膜VEGF蛋白的表達。
3.RT-PCR檢測P14小鼠視網膜VEGF mRNA的表達取P14實驗小鼠每組各1隻，水合氯醛過量麻醉處死小鼠，取出小鼠眼球2隻，分離視網膜，迅速置於研缽中，倒入適量事先準備好的液氮，研磨組織至成粉末狀，加入1mlTrizol，研磨至完全溶解。分別提取每組總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度和含量。2％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提mRNA完整性。以RNA為模板反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，加入引物、2×Taq Platinμm PCR MasterMix等，主要循環反應條件如下小鼠β-actin預變性94℃5min，然後94℃10s，55℃30s，72℃1min，共30個循環，72℃延伸10min。VEGF預變性94℃5min，然後94℃10s，72℃2min，共30個循環，72℃延伸10min。PCR產物以2％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統顯帶，拍照。顯影結果經全自動圖像分析系統Gel analyzer軟體處理，計算每個目的條帶的積光光密度值(OPTDI)，計算各個處理組VEGF與β-actinOPTDI的比值，得出VEGF mRNA相對於β-actin mRNA的表達量。
結果如圖2所示，P14小鼠視網膜VEGF mRNA表達(VEGF/β-actin)如下實驗組1為0.795±0.069，實驗組2為0.638±0.082，對照組為1.056±0.085。經統計學分析顯示，實驗組1和組2小鼠視網膜VEGF mRNA表達均比對照組減少(P＜0.0001)。說明腹腔注射川芎嗪可以降低小鼠視網膜VEGF mRNA的表達。
4.P17小鼠行螢光素心臟灌注視網膜鋪片觀察視網膜新生血管在P17，用2.5％的水合氯醛(1.2ml/100g)腹腔麻醉小鼠，固定四肢。剪開腹壁，在肝上緣用止血鉗夾住腹主動脈。剪開膈肌並暴露心臟，剪開右心耳，經左心室將50mg/ml螢光素標記的葡聚糖1ml快速注入。若小鼠心臟變大和舌尖、四肢變黃，則說明心臟灌注成功。取出眼球，在10％的甲醛中室溫固定半小時。顯微鏡下去除角膜、虹膜和晶體，小心完整地剝離視網膜，從視網膜鋸齒緣到4個象限的赤道部做放射狀切開，視網膜平鋪在玻片上，水溶性封片劑封口，加蓋玻片。用螢光顯微鏡檢測平鋪的視網膜，Image-Pro Plus(Media Cybernetics，美國)軟體測量視網膜新生血管的面積。
結果如圖3所示，實驗組1視網膜新生血管面積為0.748±0.061mm2，實驗組2視網膜新生血管面積為0.535±0.057mm2，對照組的新生血管面積為0.954±0.051mm2。統計學分析顯示，實驗組1和組2視網膜新生血管面積比對照組明顯減少(F＝105.29，P＜0.0001)。說明腹腔注射川芎嗪可以抑制小鼠視網膜新生血管形成。
5.P17行冰凍切片和GSA染色檢測視網膜新生血管在P17，處死小鼠並迅速取下眼球，OCT包埋。整個眼球從一側的虹膜根部開始到另一側的虹膜根部切成10um的系列冰凍切片。相隔100um收集1張切片，連續收集14張。用生物素標記的凝集素(griffonia simplicifolia lectin B4，GSA，Vector Laboratories，美國)進行組織化學染色，GSA可以選擇性結合到血管細胞上切片在體積分數10％正常牛血清中孵育30min，室溫下用生物素標記的GSA孵育2h，衝洗，過氧化物酶/卵白素(Vector laboratories，美國)孵育45min，衝洗，最後用二氨基聯苯胺孵育顯色，用伊紅作對比染色。同軸顯微鏡檢查，Image-Pro Plus(Media Cybernetics，美國)軟體測量視網膜表面的GSA染色陽性的細胞及其面積。14張切片GSA陽性細胞的總面積作為每隻眼球新生血管的總量，用作一個單一的實驗值。每鼠雙眼新生血管的總量的均數用作統計分析的單一實驗值。
結果如圖4所示，實驗組1視網膜新生血管面積為0.151±0.010mm2，實驗組2視網膜新生血管面積為0.104±0.014mm2，對照組的新生血管面積為0.210±0.021mm2。統計學分析顯示，實驗組1和組2視網膜新生血管面積比對照組明顯減少(F＝94.96，P＜0.0001)。說明腹腔注射川芎嗪可以抑制小鼠視網膜新生血管形成。
實施例2體外實驗1.體外培養人視網膜血管內皮細胞並進行細胞鑑定眼球源自人角膜移植供體，離體後6-12h獲得。在無菌條件下沿赤道部剪開眼球，去除眼前段組織，小心分離視網膜組織和玻璃體組織，取出視網膜神經層，用D-Hanks液漂洗2-3次後剪碎，去除肉眼可見的大血管組織。加入2％胰蛋白酶於室溫中消化30分鐘，終止消化後1500rpm離心5min，去上清。用0.067％II型膠原酶室溫下消化15分鐘，終止消化後1500rpm離心5min，去上清，加入含20％胎牛血清和0.5ng/ml的β-內皮細胞生長因子(β-Endothelial cellgrowth factor，β-ECGF)的內皮細胞培養液混勻，接種於預先塗上纖維連接蛋白的培養瓶。將培養瓶置於5％CO2，37℃培養箱內培養。每兩天換1/2液，不斷洗去崩解的細胞碎片及死亡的其他細胞，待細胞匯合成單細胞層後，按1∶2或1∶3傳代。用細胞形態學觀察和VIII因子相關抗原免疫組織化學染色進行鑑定。
結果如圖5所示。圖A為DAB染色，染色陽性細胞為血管內皮細胞。圖B為螢光素染色鑑定，染色陽性細胞為血管內皮細胞。
2.在正常和缺氧條件下培養細胞並加幹預正常條件下培養的細胞分為三組，實驗組1為培養液中加入100ug/ml川芎嗪，實驗組2為培養液中加入200ug/ml川芎嗪，對照組中加入的是D-Hank’s液。缺氧條件培養細胞用的是氯化鈷致細胞化學缺氧，細胞的培養液中加入125umol/L氯化鈷，也分三組加幹預，分組情況同前。
3.MTT檢測幹預後第2、4、6天細胞增殖情況取2-4代近融合的內皮細胞，以每孔1*103的密度接種細胞於96孔板上。用含10％胎牛血清的人內皮細胞培養液在37℃、5％CO2環境中培養，24h後給予幹預，分組如上。幹預後第2、4、6天分別取每個處理組的6個平行孔內加入MTT溶液(5g/L)20ul，置於37℃培養箱中4小時，然後棄去上清液，每孔加入150ul二甲基亞碸，振蕩10分鐘，在酶聯免疫儀上以490nm波長測定各孔的吸光度(OD)值。以時間為橫軸，平均光吸收值為縱軸繪製細胞生長曲線。
結果如圖6所示。在正常條件下培養的細胞，第4天對照組細胞OD值為0.059±0.002，實驗組1 OD值為0.053±0.002，實驗組3 OD值為0.040±0.005，經統計學分析顯示，實驗組1和組2細胞增殖分別比對照組減少了24.90％和66.73％(F＝44.05，P＜0.0001)。第6天對照組細胞OD值為0.085±0.005，實驗組1 OD值為0.060±0.009，實驗組2 OD值為0.048±0.009，經統計學分析顯示，實驗組1和組2細胞增殖分別比對照組減少了46.03％和66.46％(F＝30.28，P＜0.0001)。而在缺氧條件下培養的細胞，第4天對照組細胞OD值為0.075±0.014，實驗組1 OD值為0.069±0.018，實驗組2 OD值為0.048±0.008，經統計學分析顯示，實驗組1和組2細胞增殖分別比對照組減少了27.54％和77.30％(F＝6.79，P＝0.008)。第6天對照組細胞OD值為0.111±0.004，實驗組1 OD值為0.073±0.005，實驗組3 OD值為0.053±0.007，經統計學分析顯示，實驗組1和組2細胞增殖分別比對照組減少了50.13％和79.64％(F＝136.43，P＜0.0001)。說明川芎嗪對正常和缺氧條件下培養的人視網膜血管內皮細胞增殖有抑制作用。
4.幹預後48小時檢測細胞凋亡情況取2-4代細胞，將細胞以相同密度接種於培養瓶中，培養24h後加入幹預分組如上。作用48h後，收集細胞並用70％冷乙醇固定，4℃冰箱過夜。用PBS洗滌2遍後將細胞重懸於200ul結合緩衝液中，加入10ul AnnexinV-FITC和5ul PI，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘，加入300ul結合緩衝液，用流式細胞儀以激發波長488nm進行檢測，每個樣本檢測30000個細胞。流式細胞儀測定結果輸入計算機，應用分析程序軟體進行處理，直接給出細胞直方圖及凋亡百分比，其中左下象限代表正常細胞胞(An-/PI-)，右下象限代表早期凋亡細胞(An+/PI-)，右上象限代表晚期凋亡及壞死細胞(An+/PI+)。
如圖7所示，在正常條件下培養的細胞中，對照組細胞凋亡比例為2.3％，實驗組1凋亡比例為27.0％，實驗組2凋亡比例為52.8％。在缺氧條件下培養的細胞，對照組凋亡比例為4.5％，實驗組1凋亡比例為18.7％，實驗組2凋亡比例為49.1％。說明在正常和缺氧條件下川芎嗪都可以促進體外培養的人視網膜血管內皮細胞的凋亡。
表1 表2本發明發現了川芎嗪對正常和缺氧條件下培養的人視網膜血管內皮細胞增殖的抑制作用，並闡明該抑制作用與川芎嗪促進細胞凋亡有關；體內實驗發現川芎嗪對OIR模型中新生血管的形成有明顯的抑制作用，降低病變視網膜中VEGF的表達，能有效減輕視網膜的病變程度。為川芎嗪在以新生血管生成為特點的各種新生血管性視網膜疾病的藥物製備中提供了新的應用。
權利要求
1.川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用，其特徵是所述新生血管性視網膜疾病為增殖期糖尿病視網膜病變。
3.根據權利要求1所述的川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用，其特徵是所述新生血管性視網膜疾病為年齡相關性黃斑變性。
4.根據權利要求1所述的川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用，其特徵是所述新生血管性視網膜疾病為視網膜中央靜脈阻塞。
5.根據權利要求1所述的川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用，其特徵是所述新生血管性視網膜疾病為早產兒視網膜病變。
6.根據權利要求1所述的川芎嗪在製備治療新生血管性視網膜疾病的藥物中的應用，其特徵是所述新生血管性視網膜疾病為視網膜血管炎。
全文摘要
本發明公開了一種川芎嗪在製備治療血管增殖性視網膜病變的藥物中的應用，實驗發現川芎嗪對正常和缺氧條件下培養的人視網膜血管內皮細胞增殖有抑制作用，並闡明該抑制作用與川芎嗪促進細胞凋亡有關；體內實驗發現川芎嗪對OIR模型中新生血管的形成有明顯的抑制作用，降低病變視網膜中VEGF的表達，能有效減輕視網膜的病變程度。從而提供川芎嗪在臨床中新的應用，為治療新生血管性視網膜病變提供了一種新的治療途徑。
文檔編號A61P27/02GK101045057SQ200610132470
公開日2007年10月3日 申請日期2006年12月30日 優先權日2006年12月30日
發明者梁小玲, 謝素貞, 丁小燕 申請人:中山大學中山眼科中心