產紫杉醇枝狀枝孢黴菌及用其製備紫杉醇的方法

2023-10-10 09:38:19

專利名稱：：產紫杉醇枝狀枝孢黴菌及用其製備紫杉醇的方法
技術領域：
：本發明屬於微生物生物技術、生物製藥領域，具體涉及產紫杉醇枝狀枝孢黴(C7fldo^on'wwc/a^wpor/oWas)及一株產紫杉醇枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株，以及用其製備抗癌藥物紫杉醇的方法。
背景技術：
：從紅豆杉樹皮中提取的紫杉醇是目前國際上公認的重要抗腫瘤藥物。由於紅豆杉資源的短缺，導致紫杉醇藥源緊張。微生物發酵法生產紫杉醇是解決紫杉醇藥源問題的最有效途徑之一。自1993年Stierie等首次報導了從太平洋紅豆杉樹皮中分離到一種可產紫杉醇的內生真菌以來，國內外已有多種可產紫杉醇的真菌報導，這為人們展示了一個利用微生物發酵生產紫杉醇的誘人前景。微生物發酵生產紫杉醇具有易培養、易控制、生產成本低，可通過優化發酵條件等手段大幅度提高紫杉醇產量等優點，其大規模工業化生產比較容易實現，應用前景廣闊。但是，目前發現的產紫杉醇真菌的紫杉醇產量都比較低，首次發現的安德魯紫杉菌(roxowycas(3"J^fl"ae)的紫杉醇產率只有2450ng/L(Stierleetal.，1993，5We"ce，260:214-216)。因此，需要提供新的紫杉醇產量高的菌株。
發明內容本發明的目的在於提供一種產紫杉醇的枝狀枝孢黴及用其製備紫杉醇的方法。本發明提供的枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的分類鑑定是由中國典型培養物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,CCTCC)根據其形態特徵與生理生化特性、以及18SrDNA序列(GenBankno.EU375523)等進行鑑定並鑑定到種。該菌種保藏號為CCTCCNo.M208208,保藏日期為2008年11月10日，分類命名為枝狀枝孢黴(C7a^w/x^wm本發明枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的形態特徵和生理生化特徵見圖1和表1。本發明提供的由發酵製造紫杉醇的方法，是在培養基中培養枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株以在其細胞內和培養基中聚集紫杉醇後，從其細胞內和培養基中提取紫杉醇。在溫度為25°C、180rpm振蕩培養的條件下，野生枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株在300ml土豆葡萄糖液體培養基中發酵10天，可以得到大約160p^L的紫杉醇，是首次發現的產紫杉醇真菌安德魯紫杉菌的紫杉醇產量(2450ng/L)的36倍，是目前已報導在未優化培養條件下的紫杉醇產量較高的野生菌株。上述土豆葡萄糖液體培養基按下述配比和條件製備馬鈴薯300g，葡萄糖30g，馬鈴薯去皮，切成塊後用800ml蒸餾水煮沸半小時，然後用紗布過濾，再加葡萄糖，溶化後補蒸餾水至1L，自然pH值，121°C，滅菌15分鐘後使用。枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株所產紫杉醇已經被本發明人證實，其結構和天然紅豆杉植物中分離、純化得到的紫杉醇標準品完全一致。圖1為枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的形態觀察圖，其中，(1A)為菌落，(1B)為分生孢子梗(光學顯微鏡)，(1C)為分生孢子(電鏡)。具體實施方式使用本發明提供的枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株進行發酵培養可以製備紫杉醇，其發酵製備紫杉醇的優化方案為(1)將枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株接種在PDA培養基平板上，25°C28'C靜置培養1015天後，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌35次，然後用無菌生理鹽水稀釋至1061S個孢子/ml的數目。(2)按每300500ml液體發酵培養基接種15ml枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的孢子懸液，將枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株接種到液體發酵培養基中，發酵培養是在需氧條件下、20°C30°C、pH4.08.0下進行的，發酵培養1015天後，分別收集菌絲體和發酵液；(3)菌絲體在45-C5(TC條件下烘乾，然後研磨粉碎，過200目篩子收集細粉，每l.Og細粉用6ml甲醇/氯仿抽提35次，合併所有抽提液，甲醇/氯仿的體積比為l:01:1;(4)發酵液用氯仿振蕩抽提35次，發酵液與氯仿的體積比為l:l3:1，合併所有抽提液；(5)將步驟(3)和(4)中得到的抽提液分別在45"C5(TC條件下減壓蒸餾回收溶劑，並將蒸餾回收溶劑後的殘餘物質溶解在適量的100%甲醇中，即獲得紫杉醇粗提溶液。紫杉醇粗提溶液依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江,等。2002,林產化學與工業，22:45-48)進行純化後可直接用於高相液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)分析。對於HPLC，色譜柱為C18反向柱(5x300mm，Waters),流動相為甲醇H20(68:32,v/v)，流速為1.0ml/min，紫外波長設定為227nm。通過對比紫杉醇標準品的吸收峰停留時間、峰面積和枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵後分離純化獲得的紫杉醇的吸收峰停留時間、峰面積，可計算其紫杉醇的濃度。上述發酵條件的進一步優化條件為在初始pH為5.0的300ml液體發6酵培養基中接種1ml濃度為1S個孢子/ml的枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的孢子懸液，220rpm，28.0'C條件下恆溫發酵培養14天。在該優化的發酵條件下，枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株可生產591.3pg/L的紫杉醇。上述優化的液體發酵培養基按下述配比和條件製備葡萄糖100g，酵母粉15g，蛋白腖6g，KH2P045g，MgS04-7H203g，苯甲酸鈉15mg,苯丙氨酸25mg,絲氨酸5mg，甘氨酸15mg，水楊酸25mg，加入適量蒸餾水溶化後，用蒸餾水定容至lL，調節pH至5.0，121'C，滅菌15分鐘後使用。下面通過藉助實施例將更加詳細說明本發明，且以下實施例僅是說明性的，本發明並不受這些實施例的限制。採集華中科技大學校園苗圃種植的曼地亞紅豆杉樹皮組織，用無菌小刀切成(0.5x0.5x0.5cm)小塊，用70%(v/v)酒精進行表面消毒3min，用滅菌的ddH20漂洗3次，然後用無菌小刀剝取內表皮並均勻放置在含有50pg/ml的氨節青黴素的PDA培養基平板上，在25。C28-C的培養箱中靜置培養，根據真菌生長情況，採用菌絲頂端分離純化法將形態不同的真菌分離到新的PDA培養基平板上。分離後的真菌在25。C28'C培養傳代並檢測純度，直至獲得單克隆。最後，每個真菌的單克隆再次通過菌絲頂端分離法將真菌接種到新的PDA斜面進行保藏，並收集相應真菌的孢子製備孢子懸液，加入終濃度為15%(v/v)的甘油在-7(TC進行低溫保藏。枝狀枝孢黴HUST-RBB2是依據實施例1從曼地亞紅豆杉樹皮內表皮中自行分離到的一株產紫杉醇內生真菌。上述PDA培養基按下述配比和條件製備馬鈴薯300g，葡萄糖30g，瓊脂20g，馬鈴薯去皮，切成塊後用800ml蒸餾水煮沸半小時，然後用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂，溶化後補蒸餾水至1L，自然pH值，121°C，滅菌15分鐘後使用。用接種針將保藏於PDA斜面的枝狀枝孢黴HUST-RBB2挑取少許，接種到300ml土豆葡萄糖液體培養基中(1L三角燒瓶)，在25-C、180rpm條件下培養10天。將發酵液在4。C、12000rpm條件下，離心10min，分別收集菌絲體和發酵液,依據上述優化方案中的步驟(3)(5)，製備獲得2ml溶解在100%甲醇中的紫杉醇粗提液。依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江,等.2002,林產化學與工業，22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。取10pi用於HPLC分析，儀器為Agilent1200HPLCSystem,色譜柱為C18反向柱(5x300mm，Waters)，流動相為甲醇H20(68:32,v/v)，流速為1.0ml/min，紫外波長設定為227nm，柱溫為25。C。通過HPLC法計算其紫杉醇的濃度發現，枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株在該條件下，可以生產約160pg/L的紫杉醇。取實施例2中所得枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵後分離純化的紫杉醇10進行質譜分析(由華中科技大學分析測試中心完成)。質譜儀為Agilent1100LC/MSDTrap,採用電噴霧質譜(electrospraymassspectrometry)技術，噴射電壓(asprayvoltage):2.2kV;柱型C18分離柱(5x300mm,Waters);進樣量10pi;檢測波長227nm;流動相為甲醇H20(68:32，v/v);流速lml/min，以標準品紫杉醇做對照。結果表明，枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株所產紫杉醇和天然紅豆杉植物中分離的紫杉醇標準品具有一樣的分子量。取實施例2中所得枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵後分離純化的紫杉醇500pl，減壓蒸餾回收溶劑後，將蒸餾後的殘餘物質重新溶解在100%的氖f^甲醇中，進1亍核磁共振i普(Nuclearmagneticresonancespectroscopy,NMR)分析(由華中科技大學分析測試中心完成)，儀器為Bruker400MHzinstrument,結果表明，枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株所產紫杉醇和天然紅豆杉植物中分離純化得到的紫杉醇標準品的iH、"C-NMR譜完全一致，即二者具有一樣立體化學結構。上述枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株用於生產紫杉醇是目前公布的紫杉醇產生菌中的優勢菌，對該菌株的進一步工程改造以及發酵條件優化，必將會使其紫杉醇產量更高。發酵條件的初步優化結果，通過藉助以下實施例將更加詳細說明。在PDA培養基平板上，25"C靜置培養枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株10天後，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌35次，然後用無菌生理鹽水稀釋獲得濃度為10S個孢子/ml的HUST-RBB2菌株的孢子懸液。配製以下初始發酵培養基各300ml，每升初始液體發酵培養基(I)中各組分的質量分別為葡萄糖80g，酵母粉50g，蛋白腖3g，KH2P042g，MgSCV7H201g，pH自然；每升初始液體發酵培養基(II)中各組分的質量分別為葡萄糖90g，酵母粉10g，蛋白腖5g，KH2P044g，MgS04'7H202g，pH自然；每升初始液體發酵培養基(III)中各組分的質量分別為葡萄糖100g，酵母粉15g,蛋白腖6g，KH2P045g，MgS04，7H203g，pH自然；每升初始液體發酵培養基(IV)中各組分的質量分別為葡萄糖IOOg，酵母粉10g，蛋白腖5g，KH2P043g，MgS04'7H203g，pH自然。各接入1ml枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的孢子懸液，在25°C、180rpm條件下恆溫發酵培養10天。將發酵液在4"C、12000rpm條件下，離心lOmin,分別收集菌絲體和發酵液，依據上述優化方案中的步驟(3)(5)，製備紫杉醇，並最終定容在2ml的100%甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002,林產化學與工業,22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用於HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，用初始發酵培養基(i)、(n)、(m)、(IV)進行枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的發酵，都有紫杉醇的合成，其中，初始發酵培養基(III)的紫杉醇產量最高，為179pg/L。依據實施例4的發酵培養基(III)組成配製發酵培養基，並分別將初始pH調至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然後各接入1ml枝狀枝孢黴HUST-RBB2的孢子懸液，在25°C、180rpm條件下恆溫培養IO天。4°C、12000rpm離心10min收集菌絲體和發酵液，依據上述優化方案中的步驟(3)(5),製備紫杉醇，並最終定容在2ml的100%甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002，林產化學與工業,22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用於HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，用發酵培養基(III)進行枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵，初始pH為4.08.0時，都有紫杉醇的合成，其中pH5.0是枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵產紫杉醇的最適初始pH值，該條件下紫杉醇的產量為191pg/L。在實施例5的基礎上，枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株分別在16.0°C、18.0°C、20.0°C、22.0°C、24.0°C、26.0°C、28.0°C、30.0。C條件下，180rpm發酵培養IO天后，4°C、12000rpm離心10min收集菌絲體和發酵液，依據上述優化方案中的步驟(3)(5)製備獲得紫杉醇，並最終定容在2ml的100%甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002，林產化學與工業，22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取lOpl用於HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，用初始pH5.0的初始發酵培養基(III)進行枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵，培養溫度在20'C3(TC都有紫杉醇的合成，其中，28.(TC是枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵產紫杉醇的最適培養溫度，該條件下紫杉醇產量為211.5^g/L。在實施例6的基礎上，枝狀枝孢黴HUST-RBB2分別在搖床轉速為100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm條件下，28.0。C恆溫發酵培養IO天后，4°C、12000rpm離心10min收集菌絲體和發酵液，依據上述優化方案中的步驟(3)(5)製備獲得紫杉醇，並最終定容在2ml的100c/。甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江,等.2002，林產化學與工業，22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取IOpl用於HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，搖床轉速為100rpm260rpm時都有紫杉醇的合成，當搖床轉速為220rpm時，紫杉醇產量最高，為241.1pg/L。依據實施例7的發酵條件，進行枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的產紫杉醇發酵，並在發酵過程中，從第三天開始採樣，每天採樣一次，每次300ml，共採樣15天。4°C、12000rpm離心10min收集菌體，依據上述優化方案中的步驟(3)(5)製備獲得紫杉醇，並最終定容在2ml的100Q/。甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002，林產化學與工業，22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10用於HPLC分析(條件同[實施例2]),測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，發酵第5天出現紫杉醇，發酵第14天時，紫杉醇產量最高，為299.1pg/L。在實施例8的基礎上，分^j在發酵培養基(III)中添加不同濃度的苯甲酸鈉、苯丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸，進行枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株產紫杉醇發酵，發酵14天後，4'C、12000rpm離心10min收集菌體，依據上述優化方案中的步驟(3)(5)製備獲得紫杉醇，並最終定容在2ml的100%甲醇中，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002，林產化學與工業，22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用於HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，苯甲酸鈉添加量為15mg/L時，紫杉醇產量最高，為329.0pg/L;苯丙氨酸添加量為20mg/L時，紫杉醇產量最高，為345.0pg/L;絲氨酸添加量為10mg/L時，紫杉醇產量最高，為323.5pg/L;甘氨酸添加量為15mg/L時，紫杉醇產量最高，為314.2pg/L。選擇添加終濃度各為10mg/L、15mg/L、20mg/L的苯甲酸鈉，15mg/L、20mg/L、25mg/L苯丙氨酸、5mg/L、10mg/L、15mg/L絲氨酸，10mg/L、15mg/L、20mg/L甘氨酸進行正交試驗分析，實施例結果表明，前體物組合為15mg/L苯甲酸鈉、25mg/L苯丙氨酸、5mg/L絲氨酸、15mg/L甘氨酸時，枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株發酵生產紫杉醇的產量最高，為569.5在實施例9的基礎上，分別添加不同終濃度的水楊酸到狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的發酵體系中，發酵培養14天後，依據上述優化方案中的步驟(3)(5)製備獲得紫杉醇，依據常規紫杉醇純化方法(餘龍江，等.2002，林產化學與工業，22:45-48)進行純化後，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。並通過HPLC法(條件同[實施例2])測定其紫杉醇的含量，實施例結果表明，添加水楊酸濃度為25mg/L時，紫杉醇產量最高，為591.3綜上，枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株優化後的每升液體發酵培養基中各組分的質量分別為葡萄糖100g，酵母粉15g，蛋白腖6g，KH2P045g，MgS04.7H203g，苯甲酸鈉15mg,苯丙氨酸25mg，絲氨酸5mg，甘氨酸15mg，水楊酸25mg。優化後的發酵條件為在初始pH為5.0的300ml液體發酵培養基中接種1ml濃度為10S個孢子/ml的枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的孢子懸液，220rpm，28.0。C條件下恆溫發酵培養14天。以上所述為本發明的較佳實施例而己，但本發明不應該局限於上述實施例所公開的內容。所以，凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的範圍。12表1:枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的形態特徵和生理特徵tableseeoriginaldocumentpage13權利要求1、產紫杉醇枝狀枝孢黴(Cladosporiumcladosporioides)具有產紫杉醇的能力，用於發酵生產紫杉醇，一株保藏號為CCTCCNo.M208208的枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株具有較強的產紫杉醇的能力。2、一種由發酵製造紫杉醇的方法，其特徵在於在培養基中培養枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株以在其細胞內和培養基中聚集紫杉醇後，從其細胞內和培養基中提取紫杉醇。3、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，該方法具體包括下述步驟(1)將枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株接種在PDA培養基平板上，25°C28"C靜置培養1015天後，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌35次，然後用無菌生理鹽水稀釋至106108個孢子/ml的數目。(2)按每300500ml液體發酵培養基接種15ml枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的孢子懸液，將枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株接種到液體發酵培養基中，在203(TC、pH4.08.0、需氧條件下發酵培養1015天後，分別收集菌絲體和發酵液；(3)菌絲體在45-C5(TC條件下烘乾，然後研磨粉碎，過200目篩子收集細粉，每1.0g細粉用6ml甲醇/氯仿抽提35次，合併所有抽提液，甲醇/氯仿的體積比為l:01:1;(4)發酵液用氯仿振蕩抽提35次，發酵液與氯仿的體積比為l:l3:1，合併所有抽提液；(5)將步驟(3)和(4)中得到的抽提液分別在45t:5(rC條件下減壓蒸餾回收溶劑，並將蒸餾回收溶劑後的殘餘物質溶解在適量的100%甲醇中，即獲得紫杉醇粗提溶液。4、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於，每升優化後的液體發酵培養基中各組分的質量分別為葡萄糖100g，酵母粉15g，蛋白腖6g，KH2P045g，MgS04.7H203g，苯甲酸鈉15mg,苯丙氨酸25mg，絲氨酸5mg，甘氨酸15mg，水楊酸25mg。5、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於，發酵的優化條件為在初始pH為5.0的300ml液體發酵培養基中，接種1ml濃度為108個孢子/ml的枝狀枝孢黴HUST-RBB2菌株的孢子懸液，220rpm、28.(TC條件下恆溫發酵培養14天。全文摘要本發明涉及到從曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)中分離到的一種產紫杉醇的內生真菌枝狀枝孢黴(Cladosporiumcladosporioides)。在溫度為25℃、180rpm振蕩培養的條件下，野生菌株枝狀枝孢黴HUST-RBB2在300ml土豆葡萄糖液體培養基中發酵10天，可以得到大約160μg/L的紫杉醇，是目前已報導在未優化培養條件下的較高紫杉醇產量的野生菌株。在初步優化的發酵條件下，枝狀枝孢黴HUST-RBB2發酵可生產約591.3μg/L紫杉醇。通過該菌株發酵生產紫杉醇，具有生產周期短、菌種選育和保藏容易等優點。該發明為利用微生物發酵生產紫杉醇提供了新的菌種及相應的發酵生產工藝。文檔編號C12N1/14GK101486972SQ200810236808公開日2009年7月22日申請日期2008年12月10日優先權日2008年12月10日發明者餘龍江,周蓬蓬,鵬張申請人:華中科技大學