基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測方法及其試劑盒與流程

2023-10-10 20:26:34 2

本發明涉及一種基於磺化石墨烯螢光共振能量轉移納米探針的DNA螢光檢測方法及其試劑盒，屬於分析化學及納米技術領域。

背景技術：

氧化石墨烯可視為一種非傳統形態的單一的原子層軟性材料，可在橫向尺寸上擴展到數十微米，具有聚合物、膠體、薄膜以及兩性分子的特性。研究結果表明氧化石墨烯整個基面主體由兩個不同區域構成，分別為未被氧化的芳香苯環和封閉的脂肪族六元環，羥基、環氧基團以及大量sp2 C-C結構單元存在於氧化石墨烯表面，羧基、羰基存在於氧化石墨烯邊緣。氧化石墨烯的結構決定其能夠通過鍵堆疊作用對帶有裸露的環狀結構的化合物（核酸鹼基、芳香族化合物）產生強烈的非共價吸附。ss-DNA中的鹼基包含六元環結構，石墨烯會與裸露的鹼基發生強烈的π-π*相互作用、疏水作用等，從而吸附ss-DNA。但是，石墨烯結合不同分子結構的DNA的能力明顯不同。研究表明，螢光標記的單鏈DNA探針能夠快速、有效地吸附在氧化石墨烯的表面，由於氧化石墨烯螢光猝滅性質，只顯示出弱的螢光信號；體系中存在靶序列DNA時，靶序列DNA與探針DNA雜交形成螺旋狀雙鏈DNA分子，由於DNA雜交後空間結構發生改變，磷酸鹽骨架將鹼基有效屏蔽在其中，使石墨烯無法與鹼基接觸，從而造成結合能力的減弱，使得螢光標記的DNA探針從氧化石墨烯表面釋放，而顯示出強的螢光信號。通過螢光信號強弱變化可以高效測定特定序列的DNA的含量。

由以上可知，氧化石墨烯還原程度越高sp2雜化的晶域恢復越完全其對單鏈DNA的螢光猝滅效果就越高。但是，單純的還原氧化石墨烯雖然可使其sp2雜化的晶域恢復卻因含氧基團的離去降低了其在水中的溶解性。這大大限制了氧化石墨烯的還原程度及還原氧化石墨烯在生物領域、環境監測及臨床醫學中的應用。

本發明提供了一種基於磺化石墨烯螢光共振能量轉移納米探針的DNA螢光檢測方法及其試劑盒。磺化石墨烯在具有高還原程度的同時具有良好的水溶性。本發明所構建的方法具有特異性好、靈敏度高、背景信號低等突出優點。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供一種基於磺化石墨烯螢光共振能量轉移納米探針的DNA檢測方法。

本發明的另一個目的在於提供一種基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測試劑盒。試劑盒中包括磺化石墨烯溶液（a液），探針鏈DNA溶液（b液）。

為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案：

本發明所述的基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測方法，其特徵是將6-羧基螢光素標記單鏈DNA與目標鏈DNA加入到Tris-HCl緩衝液中，雜交反應後加入磺化石墨烯，室溫反應，測定520 nm處的螢光強度，激發波長為494 nm；所使用的磺化石墨烯由以下方法製備而得：將氧化石墨烯固體分散於去離子水中，超聲處理3小時得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯的分散體系加入5 wt %碳酸鈉溶液，以使得氧化石墨烯的分散體系的pH值為9~10，再加入30 mL濃度為0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌1小時，8000轉/分鐘離心水洗，得到中性的部分還原氧化石墨烯；將部分還原氧化石墨烯分散於去離子水中，得到部分還原氧化石墨烯懸浮液，然後加入對氨基苯磺酸重氮鹽，混勻後在冰浴條件下攪拌2小時，離心雙蒸水洗滌沉澱至其pH為7，得到呈中性的耦合物；將上述所得的耦合物分散於150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，100 ℃下攪拌24小時進行還原反應，然後滴加5 wt %碳酸鈉溶液沉澱磺化石墨烯，將上述製得的磺化石墨烯用雙蒸水進行徹底洗滌，然後將磺化石墨烯進行真空乾燥，得到磺化石墨烯固體。

磺化石墨烯對6-羧基螢光素標記單鏈DNA的螢光猝滅率為98.0%。

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基螢光素標記單鏈DNA與40 μL目標鏈DNA加入到405 μL 濃度為10 mmol/L的pH為8.0且含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA的Tris-HCl緩衝液中，37 ℃條件下雜交30分鐘，加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應30秒，測定520 nm處的螢光強度，激發波長為494 nm。

目標鏈DNA檢測線性範圍為0.2~40 nmol/L，檢測限為12.36 pmol/L。

具體地說，本發明本發明所述的基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測方法，包括如下步驟：

（一）氧化石墨烯的製備

稱取325目鱗片石墨，加入到體積比為9:1的濃硫酸和磷酸混合溶液中。充分攪拌後，置於在0 ℃冰浴中。將高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力攪拌3小時後，將所得墨綠混懸液轉移至35 ℃溫水浴中，控溫1小時，然後再將混懸液轉移至50 ℃溫水浴中，控溫12小時。將一定量的冰水混合物緩慢加入到得到的紫黑色混懸液中，劇烈攪拌1小時。繼而往溶液中逐滴滴加30% 過氧化氫溶液，至溶液顏色突變為亮黃色。所得溶液經G1砂芯漏鬥（孔徑20-30微米）過濾，繼而4000 轉/分鐘離心30分鐘，分別經過水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最後用乙醚衝洗後經G5砂芯漏鬥（孔徑1.5-2.5微米）過濾。濾餅在室溫下過夜晾乾，得到氧化石墨烯固體。

（二）磺化石墨烯螢光共振能量轉移納米探針的製備

將步驟（一）製得的氧化石墨烯固體分散於去離子水中，超聲處理3小時得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯的分散體系加入5%碳酸鈉溶液，以使得氧化石墨烯的分散體系的pH值為9~10，再加入30 mL濃度為0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌1小時，8000轉/分鐘離心水洗，得到中性的部分還原氧化石墨烯。將部分還原氧化石墨烯分散於去離子水中，得到部分還原氧化石墨烯懸浮液，然後加入對氨基苯磺酸重氮鹽，混勻後在冰浴條件下攪拌2小時，離心雙蒸水洗滌沉澱至其pH為7，得到呈中性的耦合物。將上述所得的耦合物分散於150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，100 ℃下攪拌24小時進行還原反應，然後滴加5%碳酸鈉溶液沉澱磺化石墨烯，將上述製得的磺化石墨烯用雙蒸水進行徹底洗滌，然後將磺化石墨烯在一定溫度下進行真空乾燥，得到磺化石墨烯固體。

（三）DNA檢測

將40 μL濃度為500 nmol/L 6-羧基螢光素標記單鏈DNA（FAM-ssDNA）與40 μL不同濃度目標鏈DNA加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩衝液中（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA），混合均勻，在37 ℃條件下雜交30分鐘。然後加入15 μL濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯，反應 30秒，用螢光分光光度計檢測螢光（激發波長494 nm）。

為了實現上述試劑盒的目的，本發明採用以下技術方案：

本發明所述的基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測試劑盒，其特徵是包括a液和b液；a液為磺化石墨烯溶液，b液為含探針鏈FAM-ssDNA的Tris-HCl緩衝液。

a液為濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液。

b液為含44.94 nmol/L探針鏈FAM-ssDNA的10 mmol/L的Tris-HCl緩衝液，所述的Tris-HCl緩衝液其pH為8.0，且含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA。

具體地說，本發明所述的基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測試劑盒，具有如下特徵：

（四）試劑盒組成

a液包括上述技術方案（二）製備的磺化石墨烯加入超純水超聲分散所形成的溶液，其濃度為50 μg/mL。b液為含44.94 nmol/L探針鏈DNA的10 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA）。

本發明所述的一種基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測試劑盒的使用方法為：40 μL目標鏈DNA加入到445 μL b液中，混合後在37 ℃條件下雜交反應30分鐘，在混合溶液中加入15 μL a液，混合後室溫反應30秒，測定520 nm處的螢光強度F，激發波長為494 nm。

目標鏈DNA檢測線性範圍為0.2~40 nmol/L，檢測限為12.36 pmol/L。

所述的一種基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測試劑盒的使用方法，能區分單鹼基錯配DNA和目標鏈DNA。

具體地說，所述的一種基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測試劑盒的使用方法具有如下特徵：

（五）試劑盒使用方法

將目標鏈DNA 40 μL 加入到445 μL技術方案（四）的b液，混合後37 ℃雜交30分鐘。加入15 μL技術方案（四）的a液，混合後室溫條件下反應30秒，立即用494 nm激發波長檢測其520 nm處螢光強度（F）。以F（含有目標鏈DNA）與F0（空白）的差值（F- F0）對目標鏈DNA繪製標準曲線進行定量。螢光分光光度法測定的檢測限為12.36 pmol/L。

本發明的優點：

（1）本發明使用磺化石墨烯為探針，具有吸附單鏈DNA能力強、用量少、反應迅速等特點。

（2）本發明使用的磺化石墨烯納米材料其本身具有良好的水溶性，螢光背景低等性質，不需要任何前修飾步驟。

（3）本發明在檢測DNA中測定靈敏度高，DNA檢測限為12.36 pmol/L。

（4）本發明檢測DNA選擇性好，能有效區分單鹼基錯配和非互補DNA序列。

附圖說明

圖1為氧化石墨烯、磺化石墨烯與FAM-ssDNA作用的螢光光譜圖。

圖2為磺化石墨烯對FAM-ssDNA的猝滅動力學曲線。

圖3為檢測不同濃度目標DNA時的螢光光譜圖。

圖4為目標DNA的標準曲線。

圖5為DNA檢測特異性圖。

具體實施方式

本發明的一個方面在於提供一種基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測方法。以下結合附圖及若干實施例對本發明檢測方法的技術方案作進一步的說明。

實例1：

稱取325目鱗片石墨2.7 g，加入到316 mL濃度為18.4 mol/L的濃硫酸和36 mL濃度為14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分攪拌後，置於在0 ℃冰浴中。將16.2 g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力攪拌3小時後，將所得墨綠混懸液轉移至35 ℃溫水浴中，控溫1小時，然後將所得墨綠混懸液轉移至50 ℃溫水浴中，控溫12小時得到紫黑色混懸液混合物。360 mL冰水緩慢加入到得到的紫黑色混懸液混合物中，劇烈攪拌1小時。繼而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%過氧化氫溶液，溶液顏色突變為亮黃色，攪拌30 分鐘。所得溶液經G1砂芯漏鬥（孔徑20-30微米）過濾，繼而4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液；加入180 mL 超純水充分振蕩洗滌，4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉澱顏色呈土黃色；再加入180 mL 30wt% 鹽酸充分振蕩洗滌，經G1砂芯漏鬥（孔徑20-30微米）過濾去除不溶顆粒，濾液4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉澱顏色繼續加深；接著多次用無水乙醇將沉澱物洗至pH值為中性，4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉澱呈棕黃色；最後用乙醚衝洗沉澱，經G5砂芯漏鬥（孔徑1.5-2.5微米）過濾。濾餅在室溫下過夜晾乾，得到棕色的氧化石墨烯。

實例2：

在裝有冷凝管、攪拌器、滴液漏鬥和溫度計的150 mL四頸瓶中放入10 mL 5 wt%碳酸鈉溶液及2.1 g對氨基苯磺酸晶體，攪拌下溫熱使其溶解，再加入0.8 g亞硝酸鈉與6 mL水配成的溶液，用冰浴冷至0~5 ℃。在不斷攪拌下，將3 mL濃鹽酸與10 mL水配成的溶液滴入上述混合溶液中，在冰浴中繼續攪拌15 min，得到對氨基苯磺酸重氮鹽。

實例3：

將實施例1製得的氧化石墨烯固體分散於去離子水中，超聲處理3小時得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯的分散體系加入5 wt %碳酸鈉溶液，以使得氧化石墨烯的分散體系的pH值為9~10，再加入30 mL濃度為0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌1小時，8000轉/分鐘離心水洗，得到中性的部分還原氧化石墨烯。將部分還原氧化石墨烯分散於75 mL去離子水中，得到部分還原氧化石墨烯懸浮液，然後加入實例2製得的對氨基苯磺酸重氮鹽，混勻後在冰浴條件下攪拌2小時，離心雙蒸水洗滌沉澱至其pH為7，得到呈中性的耦合物。將上述所得的耦合物分散於150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，100 ℃下攪拌24小時進行還原反應，然後滴加5 wt %碳酸鈉溶液沉澱磺化石墨烯，將上述製得的磺化石墨烯用雙蒸水進行徹底洗滌，然後將磺化石墨烯在60 ℃下進行真空乾燥，得到磺化石墨烯固體。

實例4：

在445 μL 濃度為10 mmol/L的Tris-HCl緩衝液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中加入40 μL濃度為500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶液和15 μL濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液，室溫反應30秒，測定螢光光譜（激發波長494 nm）。由圖1可知，磺化石墨烯的螢光猝滅率為98.0%，顯著高於氧化石墨烯的15.6%。

實例5：

在445 μL 濃度為10 mmol/L的Tris-HCl緩衝液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中加入40 μL濃度為500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶液和15 μL濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液，室溫反應0~120秒，測定520 nm處的螢光強度（激發波長494 nm）。由圖2可知，磺化石墨烯可在30秒內猝滅FAM-ssDNA的螢光。

實例6：

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基螢光素標記單鏈DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）與40 μL不同濃度目標鏈DNA（0~500 nmol/L）（Takara Bio）加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩衝液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃條件下雜交30分鐘。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應30秒，用螢光分光光度計檢測螢光光譜（激發波長494 nm）。如圖3所示，螢光強度隨著目標鏈DNA濃度的增大而增大。

實例7：

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基螢光素標記單鏈DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）與40 μL不同濃度目標鏈DNA（0~500 nmol/L）（Takara Bio）加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩衝液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃條件下雜交30分鐘。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應30秒，測定520 nm處的螢光強度（激發波長494 nm）。如圖4所示，目標鏈檢測線性範圍為0.2~40 nmol/L，檢測限為12.36 pmol/L。

實例8：

將40 μL 500 nmol/L 6-羧基螢光素標記單鏈DNA（FAM-ssDNA）（Takara Bio）與40 μL 500 nmol/L目標鏈DNA或單鹼基錯配鏈DNA（Takara Bio）或非互補鏈DNA（Takara Bio），加入到405 μL 10 mmol/L的 Tris-HCl緩衝液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl 和1 mmol/L EDTA）中，37 ℃條件下雜交30分鐘。加入15 μL 50 μg/mL 磺化石墨烯，室溫反應30秒，測定520 nm處的螢光強度（激發波長494 nm）。如圖5所示，該檢測方法具有良好的特異性，可區分目標鏈與單鹼基錯配鏈，單鹼基錯配鏈螢光恢復僅相當於目標鏈的27.8%。

本發明的另一個目的在於提供一種基於磺化石墨烯的DNA螢光檢測試劑盒。試劑盒中包括提供磺化石墨烯（a液），含探針鏈DNA（FAM-ssDNA）的Tris-HCl緩衝液（b液）。

實例9：

a液的製備：稱取5 mg上述實例2製備所得磺化石墨烯，加入10 mL超純水，超聲5小時，得到濃度為50 μg/mL的磺化石墨烯水溶液。

實例10：

b液的製備：將40 μL 500 nmol/L FAM-ssDNA（Takara Bio）溶解於405 μL濃度為10 mmol/L 的Tris-HCl緩衝液（pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA），得到濃度為44.94 nmol/L的FAM-ssDNA。

實例11：

試劑盒使用方法：40 μL目標鏈DNA（Takara Bio）分別加入到445 μL實施例10製備的b液，混合後在37 ℃條件下雜交反應30分鐘。然後，在混合溶液中加入15 μL實施例9製備的a液，混合後室溫反應30秒，測定520 nm處的螢光強度F（激發波長494 nm）。根據F（含有目標鏈DNA）與F0（空白）的差值（F- F0）對目標鏈濃度繪製標準曲線，在0.2~40 nmol/L 範圍內F-F0與目標鏈DNA濃度呈線性關係，檢測限為12.36 pmol/L。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。