純化或檢測靶蛋白的方法

2023-10-10 03:03:44 6

專利名稱：純化或檢測靶蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及純化和檢測蛋白質的領域。具體地，本發明涉及使用適體特異性地純 化或檢測介質(特別是溶液)中的目的蛋白，在所述介質中也可能包含與目的蛋白同源的 蛋白。
背景技術：
用於純化和檢測目的蛋白(也可被稱為「靶蛋白」)的方法通常包括將可能包含 目的蛋白的待測介質與能結合所述目的蛋白的化合物接觸的步驟。可結合靶蛋白的這些化 合物可具有各種性質。它們可以是(i)包含具有與蛋白結合的性質的化學基團的有機化合 物(例如DEAE、季銨、烷基鏈、矽烷醇)；(ii)或蛋白(例如抗體)、糖胺聚糖(肝素)、染料 (汽巴藍F3GA)或核酸(例如適體)。用於純化或檢測靶蛋白的方法的有效性依賴於例如結合靶蛋白的 化合物的親和 力和特異性。對於某些具有複雜組成的起始介質，尤其是包含很多不同蛋白質的起始溶液，純 化和檢測目的靶蛋白仍很困難。當在複雜的起始介質中待純化或檢測的靶蛋白與一種或多 種不同但彼此高度同源的蛋白共存時，這尤其是事實。實際上，當靶蛋白和一種或多種與這 種靶蛋白同源的蛋白存在於溶液中時，開發通過使用常規純化或檢測方法能高水平地區分 感興趣的靶蛋白與不需要的同源蛋白的純化或檢測工具變得困難。即使抗體——已知它們 對靶蛋白具有高特異性，也常常遭遇交叉反應，包括與很多和靶蛋白具有結構同源性的蛋 白的交叉反應。難於特異性地純化或檢測彼此同源的蛋白質的這種困難是許多應用領域中的缺 陷，包括目的在於特異地研究靶蛋白(不管是否將與靶蛋白潛在同源的任何其它蛋白質) 的學術研究領域，以及工業領域中，例如為了開發新的更有效的純化或檢測工具，以便與已 知的純化或檢測工具相比和管理或行政要求更為相容。當蛋白以重組形式(本文中稱為轉基因蛋白)在天然也表達所述轉基因蛋白的同 源蛋白的轉基因生物或微生物中產生時，難於特異性地純化或檢測彼此同源的蛋白質的困 難就會出現。這尤其包括，從固有地在其基因組中具有所謂的「直系同源」基因(編碼與轉 基因編碼的重組蛋白高度同源的蛋白)的生物中獲取重組蛋白時的情況。在轉基因動物中表達的人或動物轉基因蛋白常常與在該轉基因動物中天然表達 的內源性蛋白同源。在應該避免轉基因蛋白與該天然的內源性同源蛋白的共提取或共檢測 的情況下，該天然內源性同源蛋白的產生構成一個技術問題。當轉基因重組蛋白是待用於製備藥物的治療性蛋白時，重組蛋白純化製品中存在 的任何與該轉基因蛋白同源的內源性蛋白都可能在服用該藥物的患者中產生不想要的副 作用，包括誘導對該汙染性天然蛋白的不想要的免疫應答，這種免疫應答可能損害醫學治 療的有效性，並且甚至有時會導致可能對患者健康潛在有害的自身免疫反應。隨著在轉基 因動物中生產的治療性轉基因蛋白的越來越多的使用，這些問題也越來越多地出現。因此，為了獲得高度安全的治療性產品，應當特異性地純化轉基因蛋白，使之存在非常少量的不想要的同源蛋白，並且如有可能，完全缺乏不想要的同源蛋白。確實，用於檢測感興趣的靶 蛋白的方法應該是特異的、敏感的和有效的。根據稱為SELEX的方法選擇的RNA型適體(單鏈核糖核酸分子)，可與目的蛋白特 異地結合。在Liu等，RNA aptamers specific for bovinethrombin (對牛凝血酶有特異 性的RNA適體)，J. Mol. Recognit.，2003 16，23-27中，作者給出了與牛凝血酶結合但不與 人凝血酶結合的RNA型適體。儘管單獨地該文獻顯示通過SELEX法可以選擇能辨別溶液中 的同源蛋白質的高特異性RNA適體，但是至今為止尚無文獻描述過使用高特異性適體區分 同源蛋白的工業方法。高特異性適體的使用帶來了很多技術問題。首先，適體通過SELEX法在溶液中選 擇。為了適用於純化或檢測法，適體應該被固定在固相支持體上。有很多出版物顯示，當
適體被固定化時，適體的結合性質(親和力、特異性......)會受到損害。此外，RNA型適
體_在現有技術中描述的唯一高特異性適體類型——是非常不穩定的分子，其在室溫會發 生改變。因此，RNA適體與工業純化或檢測方法並不相容。化學修飾的RNA可能是一個可 選方式，但是此類分子的目前合成成本無可爭議地與工業規模應用不相容。因為抗體對目的蛋白的強親和力以及它們的相對高特異性，抗體被廣泛地用於蛋 白質的純化和檢測方法中。然而，抗體並不總是適用於靶蛋白的純化或檢測。事實上，在生物系統中製備抗體 具有所有的固有缺陷，包括汙染病原體的風險、或純化工程抗體的難度。此外，抗體通常是 免疫原性的，當對患者施用時可能誘導強免疫反應。因此，當抗體用於純化治療性蛋白時， 存在抗體或抗體片段留在含治療性蛋白的溶液中並由此在服用這種溶液的患者中引起不 想要的反應的風險。這就是為什麼在純化方法中使用抗體難於與某些行政要求相容的原 因，特別是在農業-食品和醫藥工業中。而且，還得指出用於抗體的消毒方式是有限的，這 是因為抗體的敏感性蛋白性質，尤其是⑴在變性條件下(例如在尿素、DMSO等存在下)、 ( )使用高酸或鹼PH值時、(iii)使用某些有害的有機溶劑時，或(iv)在高溫下。最後， 值得提醒的是，抗體的選擇是一個持久的過程(約6個月)，而獲得純化抗體是一項複雜的 工作，這導致相對高的選擇和製備成本。因此，需要開發新的目的蛋白純化或檢測工具，其應該是有效的、容易實現的，並 且與已知方法相比應該更可靠。當溶液也可能包含與靶蛋白同源的蛋白質時，該改良方法 應該能選擇性地純化或檢測存在於溶液中的靶蛋白。更特別地，需要開發新的純化或檢測 工具，其能提高自轉基因生物生產治療性轉基因蛋白獲得的產品的人用安全性。發明概述本發明的目的是提供用於純化或檢測存在於溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包 括在進行該檢測或純化步驟之前，使所述溶液接觸通過間隔區(spacer)固定在固相支持 體上的DNA適體的步驟，所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結合，但不與也可能存在於 該溶液中的、與所述靶蛋白同源的任何蛋白結合。因此，本發明還涉及通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體的用途，所述固 定化適體與靶蛋白特異性結合，所述用途為用於純化或檢測存在於溶液中的所述靶蛋白， 其特徵在於所述固定化適體不結合與所述靶蛋白同源的蛋白並且所述溶液可包含至少一種與所述靶蛋白同源的蛋白。本發明還涉及從包含所述靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中 特異性純化靶蛋白的方法，其包括步驟(i)提供固相支持體，該固相支持體包括通過間 隔區固定在所述固相支持體上的DNA適體，其特徵在於所述固定化適體與所述靶蛋白特 異性結合，但不結合與所述靶蛋白同源的蛋白，(ii)將所述固相支持體接觸所述溶液，和 (iii)回收與所述適體結合的靶蛋白。本發明進一步涉及從包含所述靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶 液中特異性檢測靶蛋白的方法，其包括步驟(i)將所述溶液接觸通過間隔區固定在固相 支持體上的DNA適體，所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結合，但不結合與靶蛋白同源 的所述蛋白，和(ii)檢測在所述適體與所述靶蛋白之間形成的複合物。附圖簡述

圖1顯示特異性結合人因子VII的適體與人血漿來源的FVII (HP FVII)之間的結 合。圖1的曲線說明人抗-FVII適體與HP FVII之間隨時間的結合，其中HP FVII濃度範 圍為50至400nM。圖2顯示固定在晶片上的適體與HP FVII之間的相互作用的特異性。圖2表明 在存在或不存在多克隆抗-FVII抗體時，固定在晶片上特異性結合人因子VII的適體與HP FVII之間隨時間的結合。圖3顯示與人因子VII特異性結合的適體和兔血漿來源的FVII之間缺乏結合。圖 3的曲線說明特異性結合人因子VII的適體與兔血漿來源的因子VII之間隨時間的結合，其 中兔因子VII的濃度範圍為50至400nM。圖4顯示特異性結合人因子VII的適體與HP FVII、兔因子VII或轉基因人因子 VII之間的親和力的差異。圖4曲線說明特異性結合人因子VII的適體與HP FVII、兔因子 VII或轉基因人因子VII之間隨時間的結合，其中每種FVII的濃度為400nM。發明詳述本發明提供用於純化或檢測存在於溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括在進 行檢測或純化步驟之前，將所述溶液接觸通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體的步 驟，所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結合，但不與也可能存在於該溶液中的任何與所 述靶蛋白同源的蛋白結合。本發明進一步涉及通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體的用途，所述固定 化適體與靶蛋白特異性結合，用於純化或檢測存在於溶液中的所述靶蛋白，其特徵在於所 述固定化適體不結合與所述靶蛋白同源的蛋白並且所述溶液可包含至少一種與所述靶蛋 白同源的蛋白。在用於純化感興趣的靶蛋白的方法中，當靶蛋白包含於起始介質(通常是起始溶 液)中時，在⑴特異性識別該給定的靶蛋白的適體和(ii)所述靶蛋白之間選擇性地形成 複合物。之後，通過使所述適體與前面形成的複合物解離，回收待純化的靶蛋白。在用於檢測感興趣的靶蛋白的方法中，當靶蛋白包含於起始介質(通常是起始溶 液)中時，在⑴特異性識別給定靶蛋白的適體和(ii)所述靶蛋白之間選擇性地形成複合 物。之後，檢測尤其是(i)在所述適體與所述感興趣的蛋白之間形成的複合物、或(ii)與 所述適體複合的、或在之前形成的複合物解離後為游離形式的、感興趣的靶蛋白。
本發明的另一目的是，提供從包含靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特異性純化靶蛋白的方法，其包括以下步驟a)提供固相支持體，其包括通過間隔區固定在所述固相支持體上的DNA適體，特 徵在於所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結合，但不結合與所述靶蛋白同源的蛋白，b)將所述固相支持體接觸所述溶液，和c)回收與所述適體結合的靶蛋白。本發明的進一步目的是，提供從包含靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白 的溶液中特異性檢測靶蛋白的方法，其包括以下步驟a)將所述溶液接觸通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體，所述固定化適體 與所述靶蛋白特異性結合，但不結合與所述靶蛋白同源的蛋白，和b)檢測在所述適體與所述靶蛋白之間形成的複合物。如本文所用，「適體」旨在指單鏈核酸分子，其能夠與蛋白特異性結合。適體通常包 括5至120個核苷酸，並且可通過稱為selex (通過指數富集系統進化配體)的方法體外選 擇。適體具有很多優點。因為它們的寡核苷酸性質，所以適體具有低免疫原性，並且對苛刻 的物化條件(存在尿素、dms0、強酸或鹼ph值，使用有機溶劑或高溫)具有高抵抗力，當其 用作親和配體時，這使得多種消毒(sanitization)策略可以實施。此外，它們具有高度選 擇性。最後，適體的生產具有相對適中的成本。如本文所用，「dna適體」旨在指由脫氧核糖核苷酸組成的適體，與由核糖核苷酸組 成的rna適體相對。dna適體在溶液中有利地穩定，因此可工業應用在靶蛋白的純化或檢測 中。如本文所用，「蛋白」是指胺基酸的聚合物。這包括蛋白、蛋白片段、遺傳修飾 的蛋白、寡肽及其類似物。蛋白可以是抗體、抗病毒蛋白、激素、生長因子、凝血因子例如 因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因子 XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子II (凝血酶)、抗凝血酶III (AT III)、肝素輔因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白 S(PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)。優選該蛋白為天然或修飾的因子VII或其片段。如前所述，「通過間隔區固定在固相支持體上的dna適體」(之後也稱為「適體」) 用於本發明的方法，其能與給定靶蛋白選擇性結合，所述適體對所述給定靶蛋白的「同源」 蛋白具有降低的結合能力或無結合能力。這意味著，根據本發明，僅使用如下適體該適體 能夠顯著地區分感興趣的靶蛋白和不同於所述靶蛋白但與所述靶蛋白結構接近的蛋白。在本發明的某些實施方案中，用於區分靶蛋白與靶蛋白的「同源」蛋白的適體具有 這樣的能力，即，所述適體對感興趣的靶蛋白具有親和力，通過解離常數值(Kd)(以摩爾濃 度表示)定義的該親和力與所述適體對最接近的已知「同源」蛋白的解離常數值相比低至 少一個數量級。在本發明的一些其它實施方案中，適體不與感興趣的靶蛋白的「同源」蛋白結合。 根據本發明，當通過常規測量方法(例如根據biacore 型檢測和結合測量技術)不能檢 測到適體與同源蛋白的結合時，該適體不與同源蛋白結合。作為舉例，在實施例中已經證 實，當使用結合測量系統Biacore 時，與人因子vii選擇性結合的seq id no. ι的適體不 以可檢測的方式與兔因子vii結合。
適體選擇性結合的「靶蛋白」可以是任何類型的蛋白。靶蛋白尤其可以是治療性蛋白。「同源蛋白」或「與靶蛋白同源的蛋白」是指與靶蛋白具有顯著的結構同源性的蛋 白。如本文所用，「同源」旨在主要指兩種同源，分別是⑴由靶蛋白與同源蛋白之間 的胺基酸序列差異引起的同源，和(ii)由共價結合在胺基酸側鏈上的附加化學基團的差 異(包括糖鏈(chaines osidiques)的差異)引起的同源。對本領域技術人員來說清楚 明顯的是，感興趣的靶蛋白和「同源」蛋白可以彼此不同於胺基酸序列的差異和糖鏈的差 異。作為舉例說明，當胺基酸序列的差異發生在靶蛋白或同源蛋白的糖基化位點的胺基酸 上時，可能碰上兩種類型的結構差異。根據本發明，給定的靶蛋白和相應的同源蛋白可以包含彼此具有至少50%胺基酸 同一性的序列。根據本發明，兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的同一性百分比 可通過使用具有預設參數的Emboss匹配器-EBL0SUM62來計算，其中Gap_罰分為10. 0和 Extend_ 罰分為 0. 5。優選，靶蛋白與同源蛋白之間的胺基酸序列同一性為至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。如前所示，感興趣的靶蛋白與同源蛋白之間的差異可能產生於兩種蛋白之間的糖 基化差異。糖基化的差異涉及具有相同的胺基酸序列或具有相似的胺基酸序列但是不同的 聚糖結構的兩個蛋白。聚糖結構為被移植到蛋白的胺基酸共有序列上的糖鏈。糖基化差異 可涉及N-或0-糖基化以及在N-或0-糖基化後發生的糖苷分支。糖基化的差異不僅可以 涉及有或沒有這些鏈或支鏈，而且可以涉及有或沒有某些糖(例如巖藻糖、甘露糖、葡糖胺 或半乳糖胺殘基)。可用許多方法分析蛋白的糖基化。一種糖基化分析方法包括使用一種 或多種酶(PNGaseF、N-糖苷酶)或通過化學途徑(胼解、消除)將蛋白脫糖基化，然後 直接分析在凝膠、毛細管電泳或HPLC上獲得的聚糖(用紫外、螢光或MS檢測)或在酶介導 的解聚(神經氨酸酶和半乳糖苷酶)或化學誘導的解聚(胼解，消除)之後分析以 便對所述聚糖定序。另一種分析方法為對全蛋白使用質譜法，這些技術被稱為MALDI (基 質輔助雷射解吸/電離)、MALDI-T0F (飛行時間)、ESI (電噴霧離子化)。在本發明的某些實施方案中，根據本發明的適體為與凝血因子特異性結合的適 體，所述凝血因子選自因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子X(FX)、因子IX(因子IX)、 因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子II (凝血酶)、抗凝血酶III (AT III)、肝素輔因子II (HCII)、蛋白C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白S(PS)、因子V(FV)、von Willebrand因子(FvW)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)。有益地，適體與FVII特異性結合。 優選，根據本發明的適體與人因子VII特異性結合，但不與兔因子VII結合。反過來，根據 本發明的適體可以與兔因子VII結合，但不與人因子VII結合。與人因子VII特異性結合但不與兔因子VII結合的適體可以是包含與序列SEQ ID No. 1具有至少80%核苷酸同一性的核苷酸序列的適體。有益地，本發明的適體以如下解離常數值(Kd)表徵的親和力與靶蛋白結合，該解 離常數值為IpM至10 μ M、優選為IOnM至10 μ Μ。有益地，適體對靶蛋白的親和力與適體對 同源蛋白的親和力相比高1000至10000倍。
在根據本發明的純化或檢測方法中，DNA適體通過間隔區固定於固相支持體上。固定於固相支持體上的適體特別適合於檢測或純化存在於溶液中的靶蛋白。如本文所用，「間隔區」是指在適體與固相支持體之間插入的分子。有益地，該間隔 區與適體的一個末端以及與固相支持體結合。有益地，包括間隔區的這些結構不直接固定 適體在固相支持體上。間隔區的性質可根據本領域技術人員的知識選擇；優選該間隔區為 非特異性寡核苷酸序列或聚乙二醇(PEG)。當其為非特異性寡核苷酸序列時，所述序列優選 含有至少5個核苷酸、優選5個至15個核苷酸。為了固定適體在間隔區上，適體可用各種化學基團進行化學修飾，例如能共價固 定適體的基團，例如硫醇、胺或任何其它能與存在於支持體上的化學基團反應的基團，或能 非共價固定適體的基團，例如生物素-鏈黴親和素系統。這些技術也可用於固定間隔區到 固相支持體上。一旦通過間隔區固定在固相支持體上，有利地適體在其自由端(即不與間隔區結 合的末端)被修飾，包括但不限於化學修飾的核苷酸(例如2』 -氧甲基或2』 -氟嘧啶、 2』 _核糖嘌呤、亞磷醯胺)、反轉核苷酸(reversednucleotide)、或化學基團(PEG、聚陽離 子、膽固醇)。這些修飾能保護適體免遭酶促降解。固相支持體可以是親和色譜柱，包括源於瓊脂糖或纖維素的凝膠或合成凝膠，例 如丙烯醯胺、甲基丙烯酸酯或苯乙烯衍生物；晶片，例如適於表面等離子共振的晶片；膜， 例如聚醯胺、聚丙烯腈或聚酯膜；磁性或順磁性珠。有益地，包含靶蛋白且可包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液是生物溶液，例如 體液、細胞、細胞勻漿物、組織、組織勻漿物、器官或整個生物體。優選溶液是獲自動物的液 態生物溶液，例如血、血源性產品、哺乳動物乳或哺乳動物乳來源的產品。可以是血漿、血漿 冷凍沉澱物、澄化的乳(clarified milk)或其衍生物。根據本發明的動物是沒有葉綠體的、 活的多細胞的、非人真核生物。在特別優選的實施方案中，該溶液從轉基因動物獲得。有益 地，該溶液是哺乳動物乳或轉基因哺乳動物乳來源的產品。根據本發明，轉基因動物是哺乳 動物，例如奶牛、山羊、雌兔、豬、猴、大鼠、小鼠、或鳥、或昆蟲例如蚊、蠅或蠶。在優選的實施 方案中，轉基因動物是轉基因哺乳動物，優選為轉基因雌兔。有益地，該轉基因哺乳動物在 能使所述轉基因蛋白在所述轉基因哺乳動物的乳中表達的特異性啟動子控制下，在乳腺中 產生轉基因蛋白。在轉基因動物的乳中產生轉基因蛋白的方法可包括以下步驟將包含編碼轉基因 蛋白的基因的DNA分子注射到非人哺乳動物的胚胎中，其中所述基因在編碼天然分泌於乳 中的蛋白的基因的啟動子(例如酪蛋白啟動子、酪蛋白啟動子、乳清蛋白啟動子、乳 球蛋白或乳清酸性蛋白啟動子(WAP))的控制下。然後將胚胎插入到相同物種的哺乳動物 雌性中。在胚胎來源的哺乳動物充分發育後，在該哺乳動物中誘導泌乳，之後收集乳。該乳 包含所述轉基因蛋白。在EP 0527063中給出在非人哺乳動物雌性的乳中生產蛋白的方法的實例，可重 復該實例的教導以製備本發明的蛋白。含WAP啟動子的質粒可以通過引入包含WAP基因啟 動子的序列而獲得，製備這種質粒以便接收外源基因置於WAP基因啟動子的控制下。使用 含啟動子以及編碼本發明蛋白的基因的質粒，通過顯微注射到雌兔胚胎的雄性原核中，獲 得轉基因雌兔。然後將該胚胎轉移至激素預備的雌體的輸卵管中。轉基因的存在可以基於由出生的轉基因幼兔提取的DNA，通過DNA印跡法揭示。通過特異性放射免疫試驗可以確定 哺乳動物乳中的濃度。其它文獻也描述了在非人哺乳動物雌性的乳中獲得蛋白的方法。可以提及的文獻 包括，但不限於，US 7，045，676 (轉基因小鼠)和EP 1739170 (轉基因哺乳動物中生產von Willebrand 因子)。因此，本發明的再一目的是，提供通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體的 用途，所述固定化適體與人因子VII特異性結合，用於純化或檢測存在於轉基因雌兔乳中 的所述人因子VII，特徵在於所述固定化適體不與兔因子VII結合，並且所述轉基因雌兔 乳中可包含兔因子VII。本發明的進一步目的是，提供通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體的用 途，所述固定化適體與兔因子VII特異性結合，用於檢測可能存在於轉基因雌兔乳中的所 述兔因子VII，特徵在於所述固定化適體不與人因子VII結合，並且在所述轉基因雌兔乳 中包含人因子VII。人因子VII和兔因子VII具有約75%的胺基酸序列同源性(通過BLAST確定的)。本發明的進一步目的是，提供選擇與靶蛋白特異性結合但不結合 與所述靶蛋白同 源的蛋白的適體的方法，其包括以下步驟a)在有利於結合的條件下將適體混合物接觸與靶蛋白同源的所述蛋白，並回收不 與同源蛋白結合的那些適體，b)在有利於結合的條件下將步驟a)中所得的適體混合物接觸所述靶蛋白，c)將那些未結合的適體從那些與所述靶蛋白結合的適體中分離，d)解離適體-靶蛋白對，e)擴增解離的適體以獲得富含適體的混合物，其與靶蛋白結合但不結合與靶蛋白 同源的蛋白，和f)按需重複步驟幻、13)、(3)、(1)、6)多個循環，直至獲得與靶分子特異性結合但不 結合與所述靶蛋白同源的蛋白的適體。用於選擇本發明適體的方法與現有技術中所述的SELEX法有不少相同之處，但是 其額外地包括所謂的「扣除」步驟(步驟a)。因此，本發明的方法稱為「扣除SELEX」。適體選擇SELEX法為將蛋白接觸DNA或RNA核酸組合文庫(通常為1015分 子)，去除不與靶結合的核酸，分離並擴增與靶結合的核酸。重複該方法直至溶液充分地 富含對目的蛋白具有良好親和力的核酸(Tuerk和Gold，「通過指數富集系統進化配體 噬菌體 T4DNA 聚合酶的 RNA 配體(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment :RNA ligandsto bacterioph age T4 DNA polymerase)，，(1990)Scien ce, 249(4968) 505-10以及Ellington和Szostak，「體外選擇結合特異性配體的RNA分子 (In vitroselection of RNA molecules that bind specific ligands)，，(1990)Nature Aug30 ；346 (6287) :818_22)。SELEX 法的其它實例在 EP 0786469,EP 66893UEP 1695978、 EP 1493825中給出，其教導可被重新用於實施本發明的適體選擇方法。可通過任何能從不與靶蛋白結合的適體中分離出與靶蛋白結合的適體(稱為適 體-靶蛋白對)的方法，實現分離步驟(步驟C)。可通過很多現有技術已知的方法進行該 分離。因此，適體-靶蛋白對可被保留在硝酸纖維素濾膜上，而游離適體則不被保留。特異性保留適體-靶蛋白對的柱也可用於該分離步驟。也可使用其它方法，如液-液萃取、凝膠遷移檢測或密度梯度離心。分離方法的選擇將取決於靶蛋白的性質以及適體-靶蛋白對， 可以基於本領域技術人員已知的原則作出決定。解離步驟(步驟d)可通過任何能使所述化學物解離的方法實現。有益地，解離可 通過離子強度的增加或PH值的變化而發生。可通過任何能增加適體拷貝的量或數目的方法，實現步驟e)的擴增。有益地，適 體的擴增通過PCR(聚合酶鏈反應)來進行。有益地，擴增通過用於DNA的PCR或通過用於 RNA的RT-PCR來實現。「扣除SELEX」法的特徵在於稱為「扣除」的步驟(步驟a)，其能去除結合與靶蛋白 同源的蛋白的適體。在進行包括步驟a)、b)、c)、d)和e)的一個循環後，以下循環可重頭 包括步驟a)、b)、c)、d)和e)，或者可用在之前循環的步驟e)中擴增的適體合併物從步驟 b)直接開始。因此，可以在每個新循環的開始執行扣除步驟a)，或者可以在完成至少一個 無步驟a)的循環後執行扣除步驟a)，直至獲得與靶蛋白特異性結合但不結合與靶蛋白同 源的蛋白的適體。有益地，每二個或每三個循環進行一個步驟a)。以下實施例舉例說明本發明，但不限制本發明的範圍。
實施例實施例1 適體(SEQ No. 1)與人因子VII的結合包含SEQ ID No. 1的適體由Sigma-Proligo公司合成。SEQ No. 1 5』 PGGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGAGCCUAUGUAACAGAUGCAGAUCCCUAGUC⑶CCCAACACCAUA AC-3』 -生物素該適體通過嫁接生物素在其3'-端被修飾。粗體的核苷酸鹼基(SEQNo. 1)被 2』 -氧甲基化，這可以通過使適體對核酸酶更具有抵抗力而使適體穩定。然後將該適體固 定在含有親和素的SA晶片(Biacore GE)上。由此，以2700RU的固定率(其中IRU約相當 於Ipg固定化產品/mm2)，通過適體的3'-端，定向固定該適體。將純化的人血漿來源的因子VII (HP FVII，純度99 % )用運行緩衝液Ofepes 20mM pH = 8，NaCl 50mM, CaCl2 2mM和BSA 0. 01% )稀釋，從而獲得其中該人血漿來源的 因子VII的濃度水平為50、100、200和400nM的四個樣品。將每個樣品相繼注射到相同的 含通過生物素-鏈黴親和素相互作用固定的適體的晶片中。通過注射僅含有運行緩衝液的 空白而獲得對照。在以20μ Ι/min的流速注射運行緩衝液到晶片240秒後，以相同的流速 進行所有注射120秒。然後以30 μ Ι/min的流速注射洗脫緩衝液(NaCl，5M)達60秒，以將 人血漿來源的因子VII與適體解偶聯。一式兩份進行每次注射(樣品和空白)。晶片使得 可以通過表面等離子共振(RPS)實時觀察人血漿源因子VII與固定化適體之間的相互作用 的產生和破壞。與固定化適體的結合導致由該裝置記錄的以共振單位(RU)表達的信號的 增加(圖1)。用RPSBiacore TlOO裝置(GE)實施這些測量。藉助於Biaevaluation軟體 (GE)，對所記錄的相互作用進行建模。根據別構結合建模，估計適體與HP FVII的結合的Kd 值為1.4μΜ。為了證實與固定化適體結合的產品實際上為因子VII，在相同的晶片上進行包括(i)人血漿源因子VII 200nM和(ii)抗-FVII多克隆抗體IOOnM(Abcam)的注射序列。注 射和分析條件如上文所述的那些相同。如果適體實際上保留FVII，那麼抗-FVII多克隆抗 體注射應該在抗體與結合適體的FVII結合之後引起信號增加(RU)。抗體單獨被注射作為 對照。以RU表達的信號增加清楚地顯示所述適體識別FVII (圖2)。此實施例顯示固定化後的適體可以以顯著的親和力與人血漿來源的因子VII特 異性結合。實施例2 適體(SEQ No. 1)與兔因子VII的結合將兔血漿來源的因子VII (American Diagnostica)在如實施例1相同的緩衝液中 稀釋成50、100、200、400nM的濃度水平，之後在如實施例1相同的條件下注射到包含固定化 適體的相同晶片中。圖3中所示的記錄的RU信號說明，完全不存在適體與兔血漿來源的FVII的結合， 儘管兔血漿來源的FVII與人血漿來源的FVII之間存在高胺基酸序列同源性(胺基酸序列 同源性約為75% )。此實施例顯示，該適體與人血漿來源的FVII特異性結合，但不與兔因子VII結合。實施例3 適體(SEQ No. 1)在人血漿源因子VII、轉基因因子VII和兔血漿源因子 VII之間的親和力差異在與實施例1相同的條件下，將人血漿源因子VII、兔血漿源因子VII和人轉基因 因子VII相繼注射到相同的晶片中。所得的數據(圖4)顯示，適體與HP FVII和轉基因 FVII結合——具有不同但仍強的親和力，但該適體不與兔因子VII結合。
權利要求
用於純化或檢測存在於溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括在進行檢測或純化步驟之前，將所述溶液接觸通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體的步驟，所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結合，但不與所述靶蛋白的任何同源蛋白結合，該同源蛋白也可存在於該溶液中。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於所述靶蛋白與所述同源蛋白具有超過50%、優 選超過60 %、優選超過70 %、優選超過80 %、優選超過90 %的胺基酸序列同一性。
3.根據權利要求1或2的方法，其特徵在於所述靶蛋白與所述同源蛋白具有糖基化 同源性。
4.根據權利要求1 3中任一項的方法，其特徵在於所述靶蛋白為凝血因子，其選 自因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因 子XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子II (凝血酶)、抗凝血酶III (AT III)、肝素輔因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白 S (PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)。
5.根據權利要求4的方法，其特徵在於所述靶蛋白為人因子VII或兔因子VII。
6.根據權利要求5的方法，其特徵在於所述同源蛋白為兔因子VII或人因子VII。
7.根據權利要求5或6的方法，其特徵在於所述適體包括與SEQIDNo. 1具有至少 80%同一性的核苷酸序列。
8.根據權利要求1 7中任一項的方法，其特徵在於所述固相支持體選自晶片、親和 色譜柱、磁性或順磁性珠和膜。
9.根據權利要求1 8中任一項的方法，其特徵在於所述間隔區選自非特異性寡核 苷酸序列或聚乙二醇(PEG)類型的序列。
10.根據權利要求1 9中任一項的方法，其特徵在於所述溶液為體液，尤其是乳、乳 源產品、血或血源產品。
11.根據權利要求10的方法，其特徵在於所述溶液為轉基因哺乳動物乳或轉基因哺 乳動物乳來源的產品。
12.用於從包含靶蛋白且可包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特異性純化靶蛋白 的方法，其包括以下步驟a)提供固相支持體，其包括通過間隔區固定在所述固相支持體上的DNA適體，特徵在 於所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結合，但不結合與所述靶蛋白同源的蛋白，b)將所述固相支持體接觸所述溶液，和c)回收與所述適體結合的靶蛋白。
13.根據權利要求12的方法，其特徵在於所述靶蛋白與所述同源蛋白具有超過50%、 優選超過60 %、優選超過70 %、優選超過80 %、優選超過90 %的胺基酸序列同一性。
14.根據權利要求12或13的方法，其特徵在於所述靶蛋白為凝血因子，其選自 因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因子 XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子11(凝血酶)、抗凝血酶III(AT III)、肝素輔因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白 S(PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)，優選人或兔因子VII。
15.根據權利要求14的方法，其特徵在於所述適體包括與SEQIDNo. 1具有至少80%同一性的核苷酸序列。
16.根據權利要求12 15中任一項的方法，其特徵在於所述固相支持體選自晶片、 親和色譜柱、磁性或順磁性珠和膜。
17.根據權利要求12 16中任一項的方法，其特徵在於所述間隔區選自非特異性寡 核苷酸序列或聚乙二醇(PEG)類型的序列。
18.根據權利要求12 17中任一項的方法，其特徵在於所述溶液為體液，尤其是乳、 乳源產品、血或血源產品。
19.根據權利要求18的方法，其特徵在於所述乳為轉基因哺乳動物乳或轉基因哺乳 動物乳來源的產品。
20.用於從包含靶蛋白且可包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特異性檢測靶蛋白 的方法，其包括以下步驟a)將所述溶液接觸通過間隔區固定在固相支持體上的DNA適體，所述固定化適體與所 述靶蛋白特異性結合，但不結合與所述靶蛋白同源的所述蛋白，和b)檢測在所述適體與所述靶蛋白之間形成的複合物。
21.根據權利要求20的方法，其特徵在於所述靶蛋白與所述同源蛋白具有超過50%、 優選超過60 %、優選超過70 %、優選超過80 %、優選超過90 %的胺基酸序列同一性。
22.根據權利要求20或21的方法，其特徵在於所述靶蛋白為凝血因子，其選自 因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因子 XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子11(凝血酶)、抗凝血酶III(AT III)、肝素輔因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白 S(PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)，優選人或兔因子VII。
23.根據權利要求22的方法，其特徵在於所述適體包括與SEQIDNo. 1具有至少80% 同一性的核苷酸序列。
24.根據權利要求20 23中任一項的方法，其特徵在於所述固相支持體選自晶片、 親和色譜柱、磁性或順磁性珠和膜。
25.根據權利要求20 24中任一項的方法，其特徵在於所述間隔區選自非特異性寡 核苷酸序列或聚乙二醇(PEG)類型的序列。
26.根據權利要求20 25中任一項的方法，其特徵在於所述溶液為體液，尤其是乳、 乳源產品、血或血源產品。
27.根據權利要求26的方法，其特徵在於所述乳為轉基因哺乳動物乳或轉基因哺乳 動物乳來源的產品。
全文摘要
本發明涉及用於純化或檢測存在於溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括在進行檢測或純化步驟之前，將所述溶液與和所述靶蛋白特異性結合的適體接觸的步驟，其中所述適體不與也可能存在於溶液中的與所述靶蛋白同源的任何蛋白結合。
文檔編號G01N33/68GK101821282SQ200880111453
公開日2010年9月1日 申請日期2008年8月13日 優先權日2007年8月14日
發明者A·施圖魯, F·戴諾, G·佩雷, L·塞列特 申請人:Lfb生物技術公司