1－(取代苯基)－5－甲基－2－(1h)吡啶酮(i)化合物用於製備抗除腎間質纖維化外其...的製作方法

2023-10-10 18:51:39 1

專利名稱：1－(取代苯基)－5－甲基－2－(1h) 吡啶酮(i)化合物用於製備抗除腎間質纖維化外其 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及1-(取代苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮化合物的用途，具體地是在製備抗纖維化藥物中的用途。
背景技術：
纖維化(fibrosis)可發生於多種器官或組織，引起器官或組織內實質細胞減少，纖維結締組織增多，最終可導致器官或組織結構破壞和功能減退，甚至器官衰竭。目前對器官或組織纖維化的發生機制、診斷方法和防治措施已進行了廣泛的研究，現有技術中，在某些方面已取得了長足的進步，但仍有一些關鍵問題沒有解決。
現已知，器官或組織纖維化是由於多種原因(如炎症、免疫、毒物、缺血及血流動力學改變等)引起實質細胞損傷，然後導致實質細胞的炎症變性、壞死、並激活相應的巨噬細胞釋放多種細胞因子和生長因子，這些因子激活靜息狀態的細胞外基質(extracellular martrix，ECM)產生細胞，使之轉化為肌成纖維細胞；肌成纖維細胞增殖，並分泌細胞因子，通過旁分泌方式再作用於巨噬細胞。肌成纖維細胞可合成大量膠原等ECM成分，同時ECM降解減少，從而造成器官或組織纖維化。因此，器官或組織纖維化的發生和發展是細胞、細胞因子和ECM等相互作用、多因素參加的結果。鑑於ECM產生細胞在器官或組織纖維化形成中的重要作用，目前治療器官或組織纖維化的重要靶標之一是抑制ECM產生細胞的增殖、活化和誘導其凋亡。
由於各器官或組織功能、形態的不同，以及各器官或組織主要組成細胞的不同，使得不同器官或組織的纖維化在其發病機理中既有共性、也有個性；因此，在不同器官或組織纖維化的發病機制和治療靶點上也存在一定的差異。以ECM主要產生細胞為例，肝臟中是肝星狀細胞，腎小球中為腎小球繫膜細胞，腎間質中為腎間質成纖維細胞，肺臟中為肺成纖維細胞，心臟中為心成纖維細胞，腹膜中為腹膜間皮細胞。
吡啶酮類化合物在現有技術中已有公開。
美國專利US3839346A公開了下式結構的吡啶酮類化合物。
其中，取代基R數目為0或1，R取代基的種類代表硝基、氯原子、烷基、甲氧基。並公開了此類吡啶酮具有抗炎、解熱、降低血清尿酸水平、止痛等作用。
美國專利US4052509A也公開了式(O)結構的化合物，其中具體公開了苯環上的取代基為硝基、甲氧基、對甲基、三氟甲基、氯原子，還具體公開了苯環上沒有取代基的化合物，即1-苯基-5-甲基-2-(1H)吡啶酮。這些化合物具有良好的抗炎和鎮痛活性，並且毒性低。。
中國專利申請公開CN 1386737A提供了一類吡啶酮化合物，具有如下的結構。
當n＝1時，所述的取代基R表示F、Br、I。
當n＝2時，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I，飽和直鏈烴基、氧代飽和直鏈烴基、滷代飽和直鏈烴基。
所述的取代基團R在苯環上的位置具有鄰位、間位、對位等方式。
現有技術中(EP1138329A)，已知的一種有效的抗纖維化的藥物是吡非尼酮(pirfenidone，PFD 5-甲基1-苯基2(1氫)吡啶酮)。實驗表明，在腎纖維化、肺纖維化動物實驗和特異性肺纖維化病人的臨床治療中，PFD均具有阻止甚至逆轉ECM聚積的作用(Shimizu T，Fukagawa M，Kuroda T，et al.Pirfenidone prevents collagen accumulation in the remnant kidney in rats with partialnephrectomy.Kidney Int，1997，52(Suppl 63)S239-243；Raghu G，Johnson WC，LockhartD，et al.Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis with a new antifibrotic agent，pirfenidone.Am J Respir Crit Care Med，1999，1591061-1069)，能夠防止甚至逆轉纖維化發生和瘢痕形成，這已經在大量的體外和動物實驗中得到證實。PFD抗纖維化作用的機制尚處於研究之中，但大量的研究已經證明PFD是一種有效的細胞因子抑制劑，能夠通過參與調節某些因子，抑制成纖維細胞的生物學活性，導致細胞增殖受抑，基質膠原合成減少。
本申請發明人曾在《中南大學學報》(醫學版)(2004，29(2))上公開了化合物1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮對腎間質細胞抗纖維化作用的細胞實驗，結果顯示其具有良好的抗纖維化效果。

發明內容
本發明是在上述現有技術基礎上，進一步公開吡啶酮類化合物對除腎間質纖維化外其他器官纖維化或組織纖維化的作用。
本發明提供如式(I)所示化合物用於製備抗除腎間質纖維化外其他器官或組織纖維化藥物的應用； 當n＝1時，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I、硝基、烷基、氧代烷基、滷代烷基；當n＝2時，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I，烷基、氧代烷基、滷代烷基。
其中，優選n＝1時，R為氟原子、硝基、甲氧基、甲基、三氟甲基、氯原子。
最優選氟原子的位置為間位(即3-氟取代)。
本發明所涉及的烷基是指直鏈或支鏈的具有1-6個碳原子數的烷基，優選1-4個碳原子，更優選直鏈烷基。
本發明對各種導致器官或組織纖維化的ECM產生細胞進行的細胞實驗表明，1-(取代苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮對各種ECM產生細胞具有抑制作用，且其作用強於吡非尼酮。因此，該類化合物可作為製備抗除腎間質纖維化外其他器官纖維化或組織纖維化藥物的活性成分。
具體實施例本發明中以1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮為例說明1-(取代基苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮化合物在製備抗纖維化藥物中的應用。1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮可按中國專利申請CN 1386737中公開的方法製備。
實施例11-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(AKF-PD)與吡非尼酮(pirfenidone，PD)抑制小鼠腎小球繫膜細胞增殖的作用比較，用噻唑藍(MTT)方法檢測。細胞用含10％小牛血清的DMEM培養基常規培養，將細胞製成1×105/ml的細胞懸液，每孔100ul接種於96孔板中。待細胞貼壁後換無血清DMEM培養基，24小時後棄去無血清培養基，換含不同濃度AKF-PD和PD的含10％小牛血清的培養基，每個濃度設5個復孔。分別於加藥後8、20、44小時後，每孔加MTT10ul，4小時後將MTT吸出，每孔加MTT溶解液100ul，15min後待MTT完全溶解，酶標儀570nm測OD值。結果見表1。
表1 AKF-P與PD對小鼠腎小球繫膜細胞的影響

*p＜0.05vs對照組**p＜0.01vs對照組***p＜0.001vs對照組+p＜0.05vsAKF-PD++p＜0.01vsAKF-PD+++p＜0.001vsAKF-PD
在24小時，AKF-PD 500μg/ml能抑制小鼠腎小球繫膜細胞的增殖，而PD 500μg/ml不能抑制小鼠腎小球繫膜細胞的增殖；1000μg/ml、2500μg/ml的AKF-PD和PD均能抑制小鼠腎小球繫膜細胞的增殖，但AKF-PD1000μg/ml、2500μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。在48小時，100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml AKF-PD和PD均能抑制小鼠腎小球繫膜細胞的增殖，但AKF-PD在100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。
結論AKF-PD能抑制小鼠腎小球繫膜細胞的增殖，且其作用強於pirfenidone。
實施例21-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(AKF-PD)與吡非尼酮(pirfenidone，PD)抑制大鼠心肌成纖維細胞增殖的作用比較，用噻唑藍(MTT)方法檢測。細胞用含10％小牛血清的DMEM培養基常規培養，將細胞製成1×105/ml的細胞懸液，每孔100ul接種於96孔板中。待細胞貼壁後換無血清DMEM培養基，24小時後棄去無血清培養基，換含不同濃度AKF-PD和PD的含10％小牛血清的培養基，每個濃度設5個復孔。分別於加藥後8、20、44小時後，每孔加MTT10ul，4小時後將MTT吸出，每孔加MTT溶解液100ul，15min後待MTT完全溶解，酶標儀570nm測OD值。結果見表2。
表2 AKF-PD與PD對大鼠心肌成纖維細胞的影響


*p＜0.05vs對照組**p＜0.01vs對照組***p＜0.001vs對照組+p＜0.05vsAKF-PD++p＜0.01vsAKF-PD+++p＜0.001vsAKF-PD在24小時，100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml AKF-PD和PD均能抑制大鼠心肌成纖維細胞的增殖，但AKF-PD 1000μg/ml、2500μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone；在48小時，100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml AKF-PD和PD均能抑制大鼠心肌成纖維細胞的增殖，但AKF-PD100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。
結論AKF-PD能抑制大鼠心肌成纖維細胞的增殖，且其作用強於pirfenidone。
實施例31-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(AKF-PD)與吡非尼酮(pirfenidone，PD)抑制人肝星狀細胞增殖的作用比較，用噻唑藍(MTT)方法檢測。細胞用含10％小牛血清的DMEM培養基常規培養，將細胞製成1×105/ml的細胞懸液，每孔100ul接種於96孔板中。待細胞貼壁後換無血清DMEM培養基，24小時後棄去無血清培養基，換含不同濃度AKF-PD和PD的含10％小牛血清的培養基，每個濃度設5個復孔。分別於加藥後8、20、44小時後，每孔加MTT10ul，4小時後將MTT吸出，每孔加MTT溶解液100ul，15min後待MTT完全溶解，酶標儀570nm測OD值。結果見表3。
表3 AKF-PD與PD對人肝星狀細胞的影響

*p＜0.05vs對照組**p＜0.01vs對照組***p＜0.001vs對照組+p＜0.05vsAKF-PD++p＜0.01vsAKF-PD+++p＜0.001vsAKF-PD從12小時開始，500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml的AKF-PD和PD均能抑制人肝星狀細胞的增殖；但24小時AKF-PD 1000μg/ml、2500μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone，48小時AKF-PD 500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。
結論AKF-PD能抑制人肝星狀細胞的增殖，且其作用強於pirfenidone。
實施例41-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(AKF-PD)與吡非尼酮(pirfenidone，PD)抑制大鼠肺成纖維細胞增殖作用的比較，用噻唑藍(MTT)方法檢測。細胞用含10％小牛血清的DMEM培養基常規培養，將細胞製成1×105/ml的細胞懸液，每孔100ul接種於96孔板中。待細胞貼壁後換無血清DMEM培養基，24小時後棄去無血清培養基，換含不同濃度AKF-PD和PD的含10％小牛血清的培養基，每個濃度設5個復孔。分別於加藥後8、20、44小時後，每孔加MTT10ul，4小時後將MTT吸出，每孔加MTT溶解液100ul，15min後待MTT完全溶解，酶標儀570nm測OD值。結果見表4。
表4 AKF-PD與PD對大鼠肺成纖維細胞的影響

*p＜0.05vs對照組**p＜0.01vs對照組***p＜0.001vs對照組+p＜0.05vsAKF-PD++p＜0.01vsAKF-PD+++p＜0.001vsAKF-PD在24小時，AKF-PD 1000μg/ml能抑制大鼠肺成纖維細胞的增殖，AKF-PD 2500μg/ml和PD2500μg/ml均能抑制大鼠肺成纖維細胞的增殖，但AKF-PD 2500μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。在48小時，500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml的AKF-PD和PD均能抑制大鼠肺成纖維細胞的增殖，但AKF-PD 500μg/ml、1000μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。
結論AKF-PD能夠抑制肺成纖維細胞的增殖，且其作用強於pirfenidone。
實施例51-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(AKF-PD)與吡非尼酮(pirfenidone，PD)抑制人皮膚疤痕成纖維細胞增殖作用的比較，用噻唑藍(MTT)方法檢測。細胞用含10％小牛血清的DMEM培養基常規培養，將細胞製成1×105/ml的細胞懸液，每孔100ul接種於96孔板中。待細胞貼壁後換無血清DMEM培養基，24小時後棄去無血清培養基，換含不同濃度AKF-PD和PD的含10％小牛血清的培養基，每個濃度設5個復孔。分別於加藥後8、20、44小時後，每孔加MTT10ul，4小時後將MTT吸出，每孔加MTT溶解液100ul，15min後待MTT完全溶解，酶標儀570nm測OD值。結果見表5。
表5 AKF-PD與PD對人皮膚疤痕成纖維細胞的影響

*p＜0.05vs對照組**p＜0.01vs對照組***p＜0.001vs對照組+p＜0.05vsAKF-PD++p＜0.01vsAKF-PD+++p＜0.001vsAKF-PD在24小時，100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml的AKF-PD和PD均能抑制人皮膚疤痕成纖維細胞的增殖，但AKF-PD 500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。在48小時，AKF-PD 500μg/ml、1000μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone。
結論AKF-PD能抑制人皮膚疤痕成纖維細胞的增殖，且其作用強於pirfenidone。
實施例61-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(AKF-PD)與吡非尼酮(pirfenidone，PD)抑制人腹膜間皮細胞增殖作用的比較，用噻唑藍(MTT)方法檢測。細胞用含10％小牛血清的DMEM培養基常規培養，將細胞製成1×105/ml的細胞懸液，每孔100ul接種於96孔板中。待細胞貼壁後換無血清DMEM培養基，24小時後棄去無血清培養基，換含不同濃度AKF-PD和PD的含10％小牛血清的培養基，每個濃度設5個復孔。分別於加藥後8、20、44小時後，每孔加MTT10ul，4小時後將MTT吸出，每孔加MTT溶解液100ul，15min後待MTT完全溶解，酶標儀570nm測OD值。結果見表6。
表6 AKF-PD)與PD對人腹膜間皮細胞的影響

*p＜0.05vs對照組**p＜0.01vs對照組***p＜0.001vs對照組+p＜0.05vsAKF-PD++p＜0.01vsAKF-PD+++p＜0.001vsAKF-PD在24小時，500μg/ml、1000μg/ml、2500μg/ml的AKF-PD和PD均能抑制人腹膜間皮細胞的增殖，AKF-PD 1000μg/ml、2500μg/ml的作用強於同等劑量的pirfenidone；在48小時，AKF-PD 1000μg/ml抑制人腹膜間皮細胞增殖的作用強於同等劑量的pirfenidone。
結論AKF-PD能夠抑制人腹膜間皮細胞的增殖，且其作用強於pirfenidone。
註上述實驗所用細胞除心肌成纖維細胞、皮膚疤痕成纖維細胞和腹膜間皮細胞是用已知的方法進行原代培養獲得外，其他細胞均有商品化產品可供購買。
權利要求
1.1-(取代苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(I)化合物用於製備抗除腎間質纖維化外其他纖維化器官或組織纖維化的藥物的應用； 當n＝1時，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I、硝基、烷基、氧代烷基、滷代烷基；當n＝2時，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I，烷基、氧代烷基、滷代烷基。
2.根據權利要求1所述的化合物在製備抗除腎間質纖維化外其他纖維化器官或組織纖維化藥物的應用，其特徵在於n＝1時，R選自氟原子、硝基、甲氧基、甲基、三氟甲基、氯原子。
3.根據權利要求2所述的化合物在製備抗除腎間質纖維化外其他纖維化器官或組織纖維化藥物的應用，其特徵在於R為3-氟。
全文摘要
本發明涉及1－(取代苯基)－5－甲基－2－(1H)吡啶酮化合物的用途，具體地是在製備抗纖維化藥物中的用途。本發明對各種導致器官或組織纖維化的ECM產生細胞進行的細胞實驗表明，1－(取代苯基)－5－甲基－2－(1H)吡啶酮對各種ECM產生細胞具有抑制作用，且其作用強於吡非尼酮。因此，該類化合物可作為製備抗除腎間質纖維化外其他器官纖維化或組織纖維化藥物的活性成分。
文檔編號A61P13/12GK1846699SQ20051003144
公開日2006年10月18日 申請日期2005年4月13日 優先權日2005年4月13日
發明者陶立堅, 胡高雲 申請人:中南大學湘雅醫院