具有抗血栓活性之肽及其製法的製作方法

2023-10-18 08:30:04

專利名稱：具有抗血栓活性之肽及其製法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗血栓活性之肽及其製法，以及含有該肽之醫藥組合物，詳言之，尤其涉及一種在活體內不會造成血小板減少、得自蛇毒之肽。
背景技術：
眾所周知，以心肌梗塞、腦血栓為首之所謂血栓症的發病，與血小板有密切關係(「血小板」；山中、山崎編；醫學書院，p158-163(1991))。近年來，就被視為導致這種血栓症之初期反應的血小板在血管內皮下組織的粘著而言，已有人指出，血中蛋白質之一的von Willebrand因子與血小板表面上之糖蛋白質Ib的結合是重要的(J.P.Cean等人，J.Lab.Clin.Med.，87，586-596(1976))。
這兩種蛋白質的結合在一般狀態下不會發生，已知，只有在活體內處在高剪切應力的狀態下才會發生(T.T.Vincent等人，Blood，65，823-831(1985))。此外，作為在活體外觀察這種結合的方法，使用抗生物質瑞斯託菌素(ristocetin)(M.A.Howard，B.G.Firkin，Thromb.Haemostasis，26，362-369(1971))、得自蛇毒之蛋白質botrocetin(M.S.Read等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，4514～4518(1978))等物質的方法，已被廣泛使用。把這些物質添加到血小板懸浮液中會引起血小板凝集，但這種凝集取決於von Willebrand因子與糖蛋白質Ib的結合(上述M.A.Howard，B.G.Firkin，M.S.Read等人)。
對於由上述瑞斯託菌素或botrocetin所造成的血小板凝集能顯示抑制作用的若干種化合物，已有人報告。例如，已知有金精三羧酸(M.D.Phillips等人，Blood，72，1989-1903(1988))、芳香族脒基化合物等色素物質(J.D.Geratz等人，Thromb.Haemostasis，39，411-425(1978))，以及von Willebrand因子或糖蛋白質Ib的部分片段肽等(Y.Fujimura等人，J.Biol.Chem.261，381-385(1986)，K.Titani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84，5610-5614(1987))。
此外，已有人報告從蛇毒中也可獲得同樣具有血小板凝集抑制活性的肽，WO9208472號國際公開手冊中記載，響尾蛇(Crotalushorridus horridus)蛇毒及Cerastes cerastes蛇毒都有由至少N末端胺基酸序列相同性高、分子量約為25千道爾頓的兩條不同的鏈構成的肽。Peng等人(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))也報告，得自小蝰蛇(Echis carinatus)的血小板凝集抑制肽，在離體活性、分子量等方面也與上述肽非常類似。這些得自蛇毒之血小板凝集抑制肽，在離體試驗中，均能以2～5μg/ml以下的低濃度抑制瑞斯託菌素或botrocetin所引起的血小板凝集。
在WO9208472號國際公開手冊中，並未提到動物給藥時的抗血栓性。因此，如本發明書之實施例1所示，發明人會考慮了該手冊中所記載的得自響尾蛇(Crotalus horridus horridus)蛇毒之肽的精製法，並對與所記載之肽具有相同性質的肽進行精製，探討了其對給藥時的作用。結果觀察到，在100μg/kg這樣少量的給藥時，血液中的血小板就幾乎完全消失。然而，WO9208472號國際公開手冊中，並未指出對動物給藥時存在的這一問題及其解決辦法。
此外，Peng等人從小蝰蛇(Echis carinatus)蛇毒得到的肽，也是SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定的分子量在非還原條件下約為26千道爾頓而在還原條件下約為14千道爾頓及約16千道爾頓的兩種肽，因此可以推斷系與上述得自響尾蛇(Crotalus horridushorridus)蛇毒之肽相同，但據報告，在這種肽對動物給藥時也觀察到顯著的血小板減少(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))。
得自蛇毒、可抑制von Willebrand因子與血小板結合的肽，其胺基酸序列之相同性均高，分子量也非常類似，由上述結果可推論這些肽兼備有在活體內引起血小板減少的活性。亦即，這些肽在離體試驗中雖可以低濃度抑制von Willebrand因子與血小板結合，但是，卻難以用來作為對活體給藥的抗血栓藥。本發明人，就引起血小板減少的機制進行如下考察。
能以低濃度抑制瑞斯託菌素、botrocetin所引起的血小板凝集的、得自蛇毒的肽的胺基酸序列，在諸如WO9208472號國際公開手冊中已有記述。根據這一胺基酸序列，這種得自蛇毒的肽與Drickamer等人所報告的具有鈣依存性植物血凝素活性的肽(稱為C型植物血凝素)(K.Drickamer，J.Biol.Chem.，263，9557-9560(1988))保持大致相同的半胱氨酸殘基位置，以及據信是植物血凝素活性所必需的共同序列的一部分(W.I.Weis等人，Science，254，1608-1615(1991))。
除以上外，還有從Botrops jararaca得到的botrocetin(Y.Usami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，928-932(1993))，從響尾蛇(Crotalus atrox)得到的響尾蛇植物血凝素(J.Hirabayashi等人，J.Biol.Chem.266，2320-2326(1991))，從白唇竹葉青(Trimerisurus albolatris)得到的alboaggregin(E.Yoshida等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，191，1386-1392(1993))等從蛇毒得到的在胺基酸序列上與C型植物血凝素相同性高的肽。
這些肽也是與C型植物血凝素保持大致相同的半胱氨酸殘基位置，以及據信是植物血凝素活性所必需的共同序列的一部分。此外還知道，C型植物血凝素具有使細胞、細菌等通過其細胞膜上之糖蛋白質(糖鏈)發生凝集的活性(上述K.Drickamer.J.Hirbayashi等人)。
離體測定血小板之凝集能時，許多情況下在採血血液中添加作為抗凝固劑的檸檬酸、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)，在血小板凝集測定系統中由於鈣被螯合，因而鈣依存性之反應受到抑制。因此，顯示血小板凝集抑制活性之上述得自蛇毒的肽是否具有植物血凝素活性，在離體試驗中難以檢出。
因而，得自蛇毒之肽在對動物給藥時，在活體內的鈣存在下會表現出C型植物血凝素活性，造成血小板凝集，可認為這就是觀察到微血管內凝集塊聚集、甚至血小板減少等現象的要因之一。
因此，為了使在離體試驗中能抑制von Willebrand因子與血小板結合、得自蛇毒的肽在動物實驗等活體試驗中也能作為有效抗血栓藥起作用，有必要獲得變換成不會造成血小板減少之分子的新穎活性肽。
發明之概要本發明系基於上述觀點開發而成者，為了獲得作為抗血栓藥的有效藥劑，其課題在於提供一種不會造成血小板減少且可抑制vonWillebrand因子與血小板結合之肽及其製法。
本發明者為了解決上述課題而進行深入研究的結果發現，將得自蛇毒之多肽在一定條件下解離獲得的單鏈肽，在對活體給藥時不會造成血小板之減少且具有抗血栓活性，從而實現了本發明。
具體地說，本發明涉及一種肽，其特徵在於此肽是從具有可抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的蛇毒多肽得到的單鏈肽，它在活體內，在能顯示上述活性的最小給藥量下，實質上不會造成血小板減少(以下稱為「本發明之肽」或「活性肽」)。
本發明還提供一種在活體內顯示出可抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的最小給藥量下實質上不會造成血小板減少的單鏈肽製法，其特徵在於，使具有活性的蛇毒肽與蛋白質變性劑、穀胱甘肽和/或半胱氨酸共存，在構成上述多肽的肽鏈內二硫鍵實質上獲得保存的情況下，將肽鏈間的二硫鍵切斷。
本發明還提供一種在活體內顯示出可抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的最小給藥量下實質上不會造成血小板減少的肽的製法，包括將嵌入了對上述肽或其一部分編碼之DNA片段的載體所轉形的大腸菌以適當培養基培養；將上述肽予以表達；以及在蓄積於大腸菌細胞內的上述肽與蛋白質變性劑共存後，通過將蛋白質變性劑除去或通過減少蛋白質變性劑濃度，生成上述肽鏈內的二硫鍵。
本發明還提供一種在活體內顯示出可抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的最小給藥量下實質上不會造成血小板減少的肽的製法，包括將嵌入了對上述肽或其一部分編碼之DNA片段的載體所轉形的昆蟲培養細胞或動物培養細胞以適當培養基培養；將上述之肽予以表達；以及將蓄積於上述細胞內或培養基中的上述肽回收。
本發明又提供一種含有上述肽和/或藥物上可接受的鹽作為有效成分的醫藥組合物。
又，在本說明書中單獨稱「肽」的情況下，有時係指單鏈肽，有時也指多肽。
以下詳細說明本發明。1本發明之肽本發明之肽，其特徵在於此肽是從具有抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的蛇毒多肽獲得的單鏈肽，且在活體內能顯示上述活性的最小給藥量下實質上不造成血小板減少。
作為蛇毒多肽，只要是具有能抑制von Willebrand因子與血小板結合之活性的多肽均可適用本發明，其實例為響尾蛇(Crotalushorridus horridus)，Cerastes cerastes，小蝰蛇(Echiscarinatus)，竹葉青(Trimeresurus albolabris)，蝰蛇(Viperapalaestina)等所產生的蛇毒肽。其中較好的是響尾蛇(Crotalushorridus horridus)所產生的蛇毒肽。
作為本發明之肽，其具體例是從響尾蛇(Crotalus horridushorridus)的蛇毒肽得到的單鏈肽，包括在N端有序列表序列號1所示胺基酸序列的肽。還可列舉具有序列表序列號2所示胺基酸序列，且在序列號2中從N末端起第4號與第15號、第32號與第120號、以及第95號與第112號之半胱氨酸殘基分別有二硫鍵的肽。此外，這種肽也可以用遺傳工程技術生產，此時，序列表序列號1或2中所示胺基酸序列的N末端有時會加成相當於轉譯開始密碼子的甲硫氨酸殘基，這種在N瑞加成了甲硫氨酸殘基的肽，也屬於本發明之肽。
此外，按照眾所周知的遺傳工程技術，使用大腸菌，昆蟲細胞或動物培養細胞等，也可生產具有序列表序列號2中所記載之胺基酸序列或其一部分且具有上述活性的肽。以大腸菌為宿主表達本發明之肽時，可在細胞內形成內含體，通過使這種內含體增溶並正確地形成二硫鍵，從而獲得具有活性的肽。此時，通過將與二硫鍵無關的半胱氨酸殘基以半胱氨酸以外的胺基酸如丙氨酸、絲氨酸等取代，防止形成錯誤的二硫鍵，可望提高所獲得之肽的穩定性。再者，序列號2中所示胺基酸序列中有對於活性並非必要的胺基酸或區域，也可製作使其中1個或2個以上的胺基酸發生了取代、缺失、嵌入之肽。例如，如後述實施例6所示，從具有序列號2所示胺基酸序列的肽，即使失去N末端的15胺基酸殘基或65胺基酸殘基和/或C末端的11胺基酸殘基，也能保持活性。
關於鹼基序列部位特異的變異體的製備，可採用市售成套用具(例如Mutan-G、Mutan-K寶酒造公司)，也可利用PCR Protocols(Academic Press版)中所記述的PCR反應獲得變異體。
如上所述單鏈化的本發明之肽，可保持抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性且實質上不會顯示多肽所具有之血小板減少。具有此種性質的本發明之肽在活體內可顯示抗血栓活性，可用作抗血栓藥。2本發明之肽的製法從蛇毒肽獲得具有抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性而不會造成血小板減少之肽的手段之一，例如，可採用以下方法。
假定在活體內蛇毒肽給藥時的血小板減少，其原因之一是在鈣存在下產生的蛇毒肽的血凝素活性，則可認為通過將血凝素分子中與糖鍵部位對應的多個部位分別分離，就會觀察不到使將血小板交聯的活性。為了使糖鍵部位分離，例如，可將多肽逐一切斷成單鍵。
為了把多肽分成單鏈，眾所周知的方法是使多肽還原，或在還原後使半胱氨酸殘基的游離巰基發生羧甲基化、羧醯胺基甲基化、吡啶基乙基化等加以保護而使其穩定。然而，水溶性蛋白質一般有許多親水性胺基酸殘基側鏈朝外的高級結構，以強變性條件又會使半胱氨酸殘基間的二硫鏈切斷而使三級結構還原，對還原後的半胱氨酸殘基的游離巰基的保護等還會使二級結構喪失，在不少情況下會變得不溶於水。如後述實施例1所示，從響尾蛇(Crotalus horridus horridus)得到的雙鏈肽，可通過還原羧醯胺基甲基化、還原吡啶基乙基化、用巰基乙醇進行還原等，變成難溶於水的肽。
Peng等人(M.Peng等人，Blood，81，2321-2328(1993))曾報告，從小蝰蛇(Echis Carinatus)得到的雙鏈肽還原後的羧醯胺基甲基化反應混合物也具有與雙鏈肽相同的血小板凝集抑制活性，但根本沒有提到此處所觀察之凝集抑制是否特異，所生成的哪一種分子有活性等。
因此，本發明系針對得自蛇毒之肽，在溫和的變性條件下實施不會造成顯著高級結構破壞的溫和還原，使雙鏈肽中之單鏈內即分子內的二硫鏈實質上得以保存，而將鏈間即分子間的二硫鍵切斷，可獲得使其原先之高級結構至少維持在不會喪失活性之程度的高水溶性單鏈肽。
本發明中的活性肽可利用蛇毒中所含可抑制von Willebrand因子與血小板結合的多肽來製造。例如，可利用從響尾蛇(Crotalushorridus horridus)毒液或其冷凍乾燥品得到的肽製造。又，vonWillebrand因子與血小板結合的抑制，可根據在離體試驗中瑞斯託菌素或botrocetin所造成之血小板凝集(以下只稱「瑞斯託菌素凝集」或「botrocetin凝集」)的抑制作用來考察。
作為使這樣的多肽在保持肽鏈內半胱氨酸殘基間的二硫鍵的情況下將肽鏈間的二硫鍵切斷而使之單鏈化的具體手段，包括使該多肽與蛋白質變性劑、穀胱甘肽和/或半胱氨酸共存並使之反應的方法。作為蛋白質變性劑，可採用鹽酸胍、尿素等，鹽酸胍的最終濃度可採用0.01M至飽和濃度、較好是1M～6M的濃度範圍。又，穀胱甘肽和/或半胱氨酸系用以在溫和條件下進行還原，在其使用時，適當的濃度範圍為0.1mM～100mM，較好為1mM以至50mM。
反應系在含tris鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等的緩衝液、蒸餾水、或在其中添加了醇類等有機溶劑等的溶液中實施，通過在溶液狀態下在-10℃～100℃、較好在10℃～40℃的範圍內進行，可獲得作為目的之單鏈肽。此外，以凍結、融解處理也可獲得這種肽。
以上述方式製造的活性肽，可藉助於凝膠過濾、離子交換、吸附、逆相等各種柱色譜法，或親合柱色譜法、超過濾、電泳、逆流分配等方法的組合進行分離。
此外，本發明之肽，還可利用涉及使用將其編碼之基因的基因重組技術，來用微生物或培養細胞來製造。能將本發明之肽編碼的基因，可由從響尾蛇(Crotalus horridus horridus)毒腺得到的cDNA庫或從組織得到的基因組DNA庫，利用與從胺基酸序列之一部可預期的DNA片段雜交進行篩選，或是利用來自表達了基因庫DNA的以大腸菌為首的原核生物、酵母等真菌類、昆蟲或動物等之培養細胞等的轉形細胞之表達蛋白質進行篩選而獲得。此外，供參考的是，本發明之肽的胺基酸序列，也可藉組合使用對應於各胺基酸的密碼子設計的DNA序列以及適當調節序列來合成。
例如，從響尾蛇(Crotalus horridus horridus)毒腺提取全RNA，進一步精製mRNA級分，以這種mRNA為模板合成cDNA，並使用噬菌體等製備cDNA庫，通過利用從這種cDNA庫以本發明肽的胺基酸序列為基礎製作的寡核苷酸探子進行雜交，可選擇具有能將本發明肽編碼的cDNA的純系(克隆)。又，作為用於雜交的探子，還可藉助於使用以本發明肽之胺基酸序列為基礎製作的寡核苷酸引子的RT-PCR法，使用從mRNA放大的DNA片段。
保持具有將後述實施例得到的本發明肽編碼的基因的質粒pCHA1的E.coli HB101/pCHA1(E.Coli AJ13023)，從1994年8月12日開始，以FERM BP-4781之寄存編號，根據布達佩斯條約，國際寄存於日本通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(郵便番號305，日本國茨城縣筑波市東一丁目1番3號)中。
通過將所獲得之基因嵌入具有可在宿主內表達之啟動基因、開始轉譯信號等的質粒或病毒載體的DNA中，對於以大腸菌為首的原核生物、酵母等真菌類、昆蟲或動物等的培養細胞進行上述質粒導入或病毒感染，可在適當條件下表達生產所希望的肽。此時，既可在菌體或細胞內蓄積所希望的肽，也可使其在培養液中分泌生產。此外，既可以在所希望的肽中附加了作為轉譯開始密碼子的甲硫氨酸的形態直接表達，也可以附著了分泌信號序列的形態表達，再在分泌過程中切斷除去信號序列，生產所希望的肽。此外，還可作為與其它適當蛋白質(例如大腸菌麥芽糖鍵蛋白質)融合的嵌合體蛋白質予以表達，在這種情況下，在獲得所表達的嵌合體蛋白質後，可以用適當的蛋白酶或化學方法將其切斷，而獲得所希望的蛋白質。這樣表達生產的蛋白質，在不具有由高級結構狀態所產生的活性時，或者只具有弱活性時，也可通過適當變性條件、氧化還原條件處理，變成具有活性的高級結構。
以大腸菌為宿主生產本發明之肽時，如前所述，生成的肽是在細胞內形成內含體，再使這種內含體增溶、正確地形成二硫鍵，而獲得具有活性的肽。具體而言，將由嵌有對本發明之肽或其一部分編碼之DNA片段的載體所轉形的大腸菌以適當培養基培養，以表達上述肽，在積累於大腸菌細胞內的上述肽與蛋白質變性劑共存後，通過除去蛋白質變性劑或降低蛋白質變性劑濃度生成上述肽鏈內的二硫鍵，可獲得本發明之肽。這種二硫鍵在諸如上述肽具有序列號2所示胺基酸序列時，可在序列號2內的第4號與第15號、第32號與第120號以及第95號與第112號半胱氨酸殘基之間形成。
又，將由嵌有對上述肽或其一部分編碼之DNA片段的載體所轉形的昆蟲培養細胞或動物培養細胞以適當培養基培養，以表達上述肽，再將上述細胞內或培養基中所積累的上述肽回收，可獲得本發明之肽。3本發明之醫藥組合物按上述方式獲得的肽，即使對動物給藥也不會造成血小板減少，而且對血栓模型動物給藥時可顯著抑制血栓形成。
除金精三羧酸(Aurin tricarboxylic acid)等對蛋白質的非特異吸附性高的色素物質外，本發明首次涉及在活體內有抗血栓性的物質，其特徵在於能抑制von Willebrand因子與血小板結合。即，首次揭示了從得自蛇毒之肽以還原等方法獲得的單鏈肽存在著可抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性，而且對活體給藥時不會引起血小板減少，從而提供了非常有希望作為抗血栓藥的醫藥組合物。
本發明之醫藥組合物含有本發明之肽和/或其藥物上可接受的鹽作為有效成分。也可作為其中一種或二種以上的混合物使用。而且也可以含有除本發明之肽以外有抗血栓作用的物質。在這種情況下，本發明之肽也可以不是該醫藥組合物中的主成分。此外，還可以配入用於通常製劑中的其他材料，例如血清白蛋白等蛋白質，緩衝作用、滲透壓調整用的鹽，載體，賦形劑等成分。
作為劑型，可舉錠劑、膠囊劑、細粒劑、糖漿劑、坐藥、軟膏劑、注射劑、點眼劑等。其中，較好的是注射劑。而且，給藥方法，除經靜脈內給藥、皮下給藥、經口給藥外，也可以是點眼、經腸給藥等任何一種。其中較好的是經靜脈內給藥。
對動物或人類給藥時的給藥量，以本發明之肽和/或其藥物上可接受的鹽的量計，通常在0.1μg/kg～100mg/kg之範圍內就可望有預期效果，可在此範圍內選擇能給出最良好藥效的量。
附圖簡單說明

圖1是CH-1的逆相色譜圖。
圖2是CH-2的逆相色譜圖。
圖3是穀胱甘肽添加前CH-1的逆相色譜圖。
圖4是穀胱甘肽添加5日後CH-1所生成物質的逆相色譜圖。
圖5是CH-1所生成物質的逆相色譜圖。
圖6是在各條件下(a)峰1、(b)峰2的生成量(μg/管)所經歷的時間圖。
圖7是AS1051的胺基酸序列圖(片段A、B、C是用賴氨醯端肽酶消化，作為以二硫鍵連接的一個片段得到的)。
圖8是(a)CH-1及(b)AS1051對瑞斯託菌素凝集和botrocetin凝集的抑制活性(相對於對照組的抑制率)圖。
圖9是AS1051對土撥鼠血小板的瑞斯託菌素凝集和botrocetin凝集的抑制活性圖。
圖10是AS1051給藥(200μg/kg)後(a)瑞斯託菌素和(b)botrocetin對土撥鼠血小板的凝集活性圖。
圖11是AS1051(給藥量200μg/kg)對光激發血栓模型土撥鼠的抗血栓活性圖。
圖12是大腸菌中AS1051表達質粒pCAHT7的構築過程圖。
圖13是昆蟲培養細胞中AS1051表達質粒pCHAbac的構築過程圖。
圖14是在用昆蟲培養液表達的細胞破碎液中AS1051對由botrocetin引起的von Willebrand因子與固定化血小板結合的抑制活性圖。
圖15是在用昆蟲培養細胞表達的培養上清液中AS1051對由botrocetin引起的von Willebrand因子與固定化血小板結合的抑制活性圖。
圖16是動物培養細胞(CHO細胞)中AS1051表達質粒pCHASDX的構築過程圖。
圖17是在用CHO細胞表達的培養上清液中AS1051對由瑞斯託菌素引起的von Willebrand因子與固定化血小板結合的抑制活性圖。
圖18是在用CHO細胞表達的培養上清液中AS1051對由botrocetin引起的von Willebrand因子與固定化血小板結合的抑制活性圖。
圖19是從N末端起算第81號(但不包含轉譯開始的甲硫氨酸殘基)半胱氨酸殘基以丙氨酸取代而變異的AS1051以大腸菌表達之質粒pCHAT7Ala的構築過程圖。
圖20是用蛇毒製備的AS1051、用大腸菌生產的AS1051以及從N末端起算第81號半胱氨酸殘基以丙氨酸殘基取代的AS1051(Cys81Ala變異AS1051)對由瑞斯託菌素或botrocetin所引起的von Willebrand因子與固定化血小板結合的抑制活性圖。
圖21是各種縮短AS1051肽的構造概略圖。
圖22是AS1051A-1的HPLC色譜圖。
圖23是AS1051A-2的HPLC色譜圖。
圖24是AS1051A-3的HPLC色譜圖。
圖25是AS1051A-4的HPLC色譜圖。
圖26是AS1051A-5的HPLC色譜圖。
圖27是各種縮短AS1051肽對由瑞斯託菌素或botrocetin所引起的von Willebrand因子與固定化血小板結合的抑制活性圖。
實施發明之最佳形態以下說明本發明的實施例。實施例1得自響尾蛇(Crotalus horridus horridus)的抗血栓性單鏈肽的製備1得自響尾蛇(Crotalus horridus horridus)且對vonWillebrand因子與血小板結合有抑制活性的肽的製備首先，從得自響尾蛇(Crotalus horridus horridus)的蛇毒，進行對von Willebrand因子與血小板結合有抑制活性的肽的精製，並以下述方法確定的瑞斯託菌素凝集抑制活性為指標。
將1/10容量的3.8％檸檬酸鈉添加於從健康人採集的新鮮血液中，該血液以900rpm離心15分鐘，得到人類富血小板血漿(platelet rich plasma)，向其中添加同體積的含2％多聚甲醛的生理食鹽水，在4℃靜置一夜保存之。保存後，用離心分離法將血小板回收，並以含20mM磷酸緩衝液(pH7.4)的生理食鹽水洗滌二次。將測定樣品添加於由此製備的福馬林固定化血小板溶液中，再依次向其中添加人類血漿(最終濃度0.12％)、瑞斯託菌素硫酸鹽(Sigma公司制)(最終濃度0.5mg)，在振蕩攪拌後，以肉眼觀察對血小板凝集是否有抑制活性。反應溶液量為50ml，樣品經過適當稀釋，以添加2～20μl為宜。
將得自響尾蛇(Crotalus horridus horridus)的蛇毒凍結乾燥品(Sigma公司制)1g溶解於含20mM tris鹽酸(pH7.4)的生理食鹽水(10ml)中，以3000rpm離心10分鐘除去不溶物。上清液用Sephadex G-75(微細)(Pharmacia公司制)(直徑5.0cm，長90cm)、以相同緩衝液為溶劑進行凝膠過濾層析，分取於分級管中。收集溶出體積750～885ml，分三次每次15ml通過苯甲脒Sepharose(Pharmacia公司制)(直徑1.6cm，長5cm)柱，收集非吸附級分。
這種級分用排除分子量為10000的超濾膜(YM10，Amicon公司制)過濾濃縮，濃縮部分以50mM乙酸銨緩衝液(pH4.5)進行溶劑置換。而後，使之吸附於以同種溶劑平衡的CM Sepharose CL68(Pharmacia公司制)(直徑2.6cm，長30cm)離子交換層析柱中，以初溶劑洗滌50分鐘後，用0.5M乙酸銨緩衝液(pH6.4)與初溶劑的15％混合溶液至50％混合溶液進行直線濃度梯度(810分鐘)洗脫。分取溶出體積610ml～650ml的溶出級分，按與上述相同方式以超濾膜濃縮後，用含20mM tris鹽酸(pH7.4)的生理食鹽水溶液進行溶劑置換。此外，由於溶出體積540ml～580ml的溶出級分同樣存在血小板凝集抑制活性，因此，這個級分也進行同樣處理。
從離子交換層析柱得到的各血小板凝集抑制活性級分濃縮物取出一部分，以使用逆相柱(SSC-VP-304，仙修科學公司制，直徑4.6mm，長250mm)的高速液體色譜技術，以含0.1％三氟醋酸的乙腈濃度31％～52％之直線濃度梯度(20分鐘間)洗脫進行分析的結果顯示，兩個級分中分別含有不同的單一肽(圖1，2)。又，根據SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳得知，兩個活性級分中所含的這些肽，都是在非還原下顯示分子量約25千道爾頓的一條帶而在添加1％巰基乙醇的還原下顯示分子量約為14千道爾頓及15千道爾頓的兩條帶，均是類似的雙鍵肽(序列號1、3)。因此，把離子交換柱後半部溶出(溶出體積610ml～650ml)之溶出物稱為CH-1，在前半部溶出(溶出體積540ml～580ml)之溶出物稱為CH-2。
CH-1之氨基末端側的胺基酸序列分析按如下進行。CH-1約50μg在含有0.5M tris鹽酸(pH8.5)、10mM乙二胺四醋酸二鈉(EDTA·Na2)之7M鹽酸胍水溶液100μl中溶解後，添加4-乙烯基吡啶(1μl)、三正丁基膦(2μl)，在室溫下反應過夜，進行還原吡啶基乙基化。然後，反應液以使用TSKgel-Phenyl-5PW-RP(東曹公司制，直徑4.6mm，長度75mm)柱的液體色譜法使所產生的各種肽鏈分離。洗脫流速為1ml/分鐘，使用的直線濃度梯度為含有0.1％三氟乙酸的乙腈31％～52％，洗脫時間為20分鐘。將分離的各肽鏈凍結乾燥後，再溶解於30％乙腈中，然後使用蛋白質定序器470A(Applied Biosystems公司制)進行從氨基末端開始的胺基酸序列的解析。結果顯示，各鏈之氨基末端側的胺基酸序列就是如序列表序列號1、3所示，這些序列分別與WO9208470號國際公開手冊中所記載的從相同蛇毒分離的肽CHH-B之α鏈及β鏈之N-末端側的胺基酸序列一致。此外，如圖1、2所示，在利用逆相柱的分析中，從CH-1、CH-2的保持時間可以認為CH-2與同手冊中所記載的CHH-A相同，而CH-1與同手冊中所記載的CHH-B相同。2CH-1對動物給藥時的活性測定了上述得到的CH-1對土撥鼠給藥時的血小板數。把CH-1溶解於生理食鹽水中，配成10-100μg/ml的濃度，對土撥鼠經靜脈內給藥約5分鐘後，從腹部大動脈採取動物血。採血中使用0.32％檸檬酸作為血液凝固抑制劑，用Sysmex E-2000(東亞醫用電子)測定白血球數(WBC)、紅血球數(RBC)及血小板數(PLT)。
給藥量及各血球數值如表1所示。發現與給藥量有關的只有血小板減少，還發現在100μg/kg的給藥量下血小板幾乎完全消失。
表1

3使雙鏈CH-1變成單鏈的嘗試(1)CH-1的還原羧醯胺甲基化CH-1的還原羧醯胺甲基化按以下進行。將CH-1 200μg溶解於含0.5M tris鹽酸(pH8.5)和10mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)的7M鹽酸胍水溶液500μl中，添加二硫蘇糖醇水溶液(20mg/ml)50μl，在37℃保存1小時。然後，向此溶液中添加50μl碘乙醯胺水溶液(50mg/ml)，在避光下於室溫反應30分鐘。
反應後，使用透析膜Spectra/porl(Spectra公司制透過界限分子量6000～8000)，對5升含20mM tris鹽酸(pH7.4)的0.15M氯化鈉水溶液在4℃進行一夜透析。透析後，由於生成了白色不溶物，故在其中添加最終濃度為2％的表面活性劑Tween-20，但不溶物未溶解。繼之，將白濁之本溶液用Centricon-10(Amicon公司制)超過濾進行濃縮，製成最終100μl的懸浮液。將此懸浮液弱離心後，使用其上清液10μl，按1中所示方法調查對瑞斯託菌素凝集的抑制活性，但並未觀察到抑制活性。據信，這一結果可歸因於上述方法還原羧醯胺甲基化的CH-1並不具有瑞斯託菌素凝集抑制活性，或是對水的溶解度非常低。(2)CH-1的還原吡啶基乙基化CH-1的還原吡啶基乙基化按以下進行。將CH-1 200μg溶解於含有0.5M tris鹽酸(pH8.5)和10mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)的鹽酸胍水溶液200μl中，向其中添加4-乙烯基吡啶(1μl)和三正丁基膦(2μl)，在室溫反應一夜。反應液以利用逆相柱(SSC-VP304，仙修科學公司制，直徑4.6mm，長250mm)的高速液體色譜法，以含有0.1％三氟乙酸的乙腈濃度10％～59％的濃度梯度淋洗(20分鐘)進行洗脫，生成物以二種類的吡啶基乙基化肽混合物級分加以收集。
把分別收集的級分凍結乾燥後，將其全量溶解於含20mM tris鹽酸(pH7.4)的生理食鹽水50μl中，用其中的10μl按1中所示方法觀察瑞斯託菌素凝集的抑制活性，但並未觀察到抑制活性。此一結果據信可歸因於上述方法還原吡啶基乙基化的CH-1不具有瑞斯託菌素凝集抑制活性，或是對水的溶解度非常低。(3)CH-1用巰基乙醇還原及二硫鍵再形成CH-1用巰基乙醇還原以及還原後利用基於還原型-氧化型穀胱甘肽的氧化還原緩衝液進行二硫鍵再形成的操作按如下進行。
將CH-1 240μg溶解於含0.5M tris鹽酸(pH8.5)和10mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)的7M鹽酸胍水溶液120μl中，在37℃放置10分鐘。向此溶液中添加1/9量的10％巰基乙醇水溶液，使巰基乙醇的最終濃度成為1％後，在37℃放置1小時。然後，添加2ml將含有0.5M tris鹽酸(pH8.5)和10mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)的7M鹽酸胍水溶液稀釋成2/7的溶液(鹽酸胍濃度2M，以下簡稱為「2M鹽酸胍調製液」)後，以Centricon-10(Amicon公司制)進行超過濾濃縮。所得到的濃縮液中添加2M鹽酸胍調製液2ml，再進行超過濾濃縮，多次重複這一濃縮操作以除去巰基乙醇，得到含CH-1還原物的2M鹽酸胍調製液380μl。
將這樣得到的含CH-1還原物的溶液分成5份各76μl，利用基於還原型-氧化型穀胱甘肽的氧化還原緩衝液進行二硫鍵再形成的操作。各溶液中分別添加374μl 2M鹽酸胍調製液，再添加按表2所示比例混合氧化型與還原型穀胱甘肽的溶液50μl，再將內部置換了氮氣的容器密封，在室溫反應一夜。
表2

表中數值是溶液的混合比這五種反應液，以及剛用巰基乙醇還原後的溶液，利用有逆相柱(SSC-VP304，仙修科學公司制，直徑4.6mm，長250mm)的高速液體色譜法，以含0.1％三氟醋酸的乙腈濃度10％～59％的濃度梯度淋洗(20分鐘)進行洗脫，再進行觀察216mm吸光度的分析，但任何溶液中均未觀察到所生成的肽產生的峰。
上述結果據信可歸因於用巰基乙醇還原使CH-1變成溶解性低的還原物，而利用氧化還原緩衝液進行的氧化還原反應也不會使之變成溶解性高的物質。(4)CH-1用穀胱甘肽還原CH-1用穀胱甘肽的溫和還原反應按以下進行。將CH-140μg溶解於上述2M鹽酸胍調製液(450μl)後，添加溶解於同種溶液中的還原型穀胱甘肽(100mM)溶液50μl，在40℃放置3小時後再在室溫下放置5日，生成物之內容利用有逆相柱(SSC-VP318，仙修科學公司制，直徑4.6mm，長250mm)的高速液體色譜法分析。洗脫系利用含0.1％三氟乙酸的乙腈濃度10％～80％的濃度梯度(20分鐘)進行，觀察216nm的吸光度。
圖3和4中分別表示穀胱甘肽添加前(圖3)和穀胱甘肽添加5日後(圖4)的色譜圖。將用穀胱甘肽進行還原反應後的反應液全量以同樣的色譜法分離之，分別截取圖4中所示峰1、2、3的部分。分別凍結乾燥後，將其全量溶解於25μl含20mM tris鹽酸(pH7.4的0.15M氧化鈉水溶液中，取其中10μl按1中所示方式測定瑞斯託菌素凝集抑制活性，發現峰1及峰3有抑制活性。但峰3是原料(CH-1)的峰。從以上結果可確認，上述方法生成了具有瑞斯託菌素凝集抑制活性的新物質(峰1)。
此外，又考察了在鹽酸胍6M及2M存在下各種濃度的穀胱甘肽的影響。將CH-1(36μg)溶解於含0.5M Tris鹽酸(pH8.5)與10mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)的7M鹽酸胍水溶液稀釋成6/7所得之溶液(以下稱為「6M鹽酸胍調製液」)或是稀釋成2/7所得之溶液(以下稱為「2M鹽酸胍調製液」)234μl中。對於溶解了CH-1的6M和2M鹽酸胍調製液，分別添加下述10倍濃度的溶液26μl，使還原型穀胱甘肽的最終濃度為30mM、10mM、3mM與1mM而氧化型穀胱甘肽的最終濃度為30mM，1、2、3、4、7日後生成峰的內容用有逆相柱(SSC-VP318，仙修科學公司制，直徑4.6mm，長250mm)的高速液體色譜法分析。洗脫以含0.1％三氟乙酸的乙腈濃度24％～59％的濃度梯度(20分鐘)進行，觀察216nm的吸光度。
這種分析所得色譜圖之一例表示在圖5中(2M鹽酸胍，10mM還原型穀胱甘肽，4日)。由此分析系可知，在與圖4所示峰1相當的保持時間的洗脫物中，含有兩種物質(相當於圖5所示的峰1和2)。此外，峰4是原料(CH-1)的峰。這種峰1及峰2的物質生成量在各自反應條件下隨時間的變化表示於圖6中。4用還原型穀胱甘肽從CH-1製備單鏈肽在CH-1的生理食鹽水溶液(1.3mg/ml)290μl中，添加蒸餾水7.39ml、含0.5M Tris鹽酸(pH8.5)和10mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)的7M鹽酸胍水溶液3.57ml以及100mM還原型穀胱甘肽(貝林格曼海姆公司制)水溶液1.25ml，在28℃保存5日(鹽酸胍的最終濃度2M)。
保存後的溶液以3000rpm離心分離，再用三氟乙酸將其上清液調整至pH4以下的酸性後，利用逆相柱(Vydac214TP1022，拜達庫公司制，直徑22mm，長250mm)以流速15ml/min、含0.1％三氟乙酸的乙腈濃度27％～45％進行20分鐘的濃度梯度淋洗，分級收集生成的肽。
結果發現，生成了與圖5所示相同的生成物，將其峰1和峰2分別稱為AS1051和AS1052。各自的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳結果顯示，AS1051在非還原下是分子量約14千道爾頓的單鏈肽，在1％巰基乙醇存在之還原下是分子量約15千道爾頓的單鏈化肽，而AS1052在同樣的非還原下和還原下的分子量分別為約26和15千道爾頓，是由兩條相同的肽形成的均二聚體。
所得到的AS1051的胺基酸序列以及二硫鍵方式按如下確定。在AS1051 50μg的水溶液(50μl)中，依次添加含20mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的1M tris鹽酸緩衝液(20μl)、蒸餾水(120μl)、含賴氨醯端肽酶(和光純藥公司制)5μg的水溶液(10μl)，在37℃進行2小時酶消化反應。而後，將反應液供給使用逆相柱(SSC-VP318，仙修科學公司制，直徑4.6mm，長250mm)的高速液體色譜法利用，將消化片段分離、分級收集後，各消化片段用蛋白質定序器-470A(Applied Biosystems公司制)進行胺基酸序列解析，所確定的AS1051的胺基酸序列如序列號2及圖7所示。本序列與WO9208472號國際公開手冊中所記載之CHH-B的α鏈比較，其胺基酸殘基數少一個，而且第39、85、86號胺基酸不同。
圖7中所示3條片段A、B、C，由於是作為經由二硫鍵結合的一個消化片段得到的，因此，對這一片段進一步用蛋白酶Glu-C(貝林格曼海姆公司制)進行消化，並解析所生成片段的胺基酸序列，結果發現，二硫鍵是在Cys4與Cys15、Cys32與Cys120、Cys95與Cys112之間形成的。這種結合方式與含有蛇毒提取物的C型血凝素是相同的，因此可以判斷AS1051保持原有的二硫鍵結合方式。
此外，雙鏈AS1052的胺基酸序列分析結果顯示，它是由2條AS1051構成的均二聚體。5雙鏈肽(CH-1)與單鏈化肽(AS1051)的血小板凝集抑制活性比較在此比較了雙鏈CH-1、單鏈化肽AS1052對於血小板凝集的抑制活性。在添加了1/10容積的3.8％檸檬酸鈉、來自健康人的新鮮血液用900rpm離心15分鐘得到的人類富血小板血漿(Plateletrich plasmaPRP)中添加這些肽時的血小板凝集抑制活性，系使用Hematracer-801(二光Bioscience公司制)，在盛有12.5μl肽溶液的比色杯中添加100μl富血小板血漿，用攪拌棒在37℃攪拌3分鐘後，添加12.5μl凝集原，通過觀察透射光進行測定。
作為凝集原，系使用瑞斯託菌素(最終濃度1.2mg/ml)、botrocetin(1μg/ml)、ADP(3μM)、膠原(10μg/ml)，計算相對於未添加肽樣品的對照組的凝集抑制率。CH-1、AS1051對瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性表示在圖8中。對於瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性，兩種肽(雙鏈物(CH-1)及單鏈化物(AS1051))都觀察到大致相同的抑制活性。此外，兩者對於ADP、膠原凝集在20μg/ml的濃度均未顯示抑制，而對瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集等依賴於von Willebrand因子與糖蛋白質Ib結合的凝集則顯示特異的抑制。
此外，還發現雙鏈AS1052也具有與AS1051大致相同的抑制活性。6雙鏈肽(CH-1)與單鏈化肽(AS1051)對小鼠給藥的血小板數目比較對小鼠經靜脈內注射CH-1、AS1051(均為100μg/kg)的生理食鹽水溶液，以及作為對照只注射生理食鹽水，5分鐘後從心臟採血，按照與2相同的方式測定白血球數(WBC)、紅血球數(RBC)及血小板數(PLT)。
如表3所示，CH-1給藥組的血小板幾乎完全消失，相比之下，AS1051給藥組(100μg/kg)並未觀察到血小板數減少。此外，就白血球數(WBC)和紅血球數(RBC)而言，與對照組相比，CH-1、AS1051給藥組均無變化。從以上事實可以確認，單鏈化的AS1051不會引起雙鏈肽CH-1給藥時所觀察到的血小板減少現象。
表3

7使用土撥鼠測定單鏈化肽的抗血栓性首先，測定單鏈化肽AS1051對從土撥鼠得到的富血小板血漿的瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性。如圖9所示，可知AS1051對瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集的抑制活性與對於人類富血小板血漿的數值(圖8)大致相同。
其次，進行了對土撥鼠給藥AS1051後的血小板等血球數的測定，以及用AS1051給藥後採血的血液調製的富血小板血漿進行了旨在確定上述凝集是否受到抑制的活體外試驗。此外，又將200μg/kgAS1051經靜脈內對土撥鼠給藥，給藥5分鐘後採取動脈血，按照與2相同的方法測定白血球數(WBC)、紅血球數(RBC)及血小板數(PLT)(表4)。
表4

在給藥的AS1051中添加同量的牛血清白蛋白(bovine serumalbuminBSA)，以只給藥BSA者作為對照組。AS1051給藥組與對照組比較，並未觀察到血小板數等之變化。此外，又從這種血液調製富血小板血漿，用與上述相同的方法進行測定了瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集的狀態(圖10)。改變瑞斯託菌素添加量進行觀察的結果顯示，即使在能使對照組全部發生凝集的瑞斯託菌素濃度，AS1051給藥組也幾乎完全地使凝集受到抑制。而且，有關botrocetin凝集也獲得了相同結果。
從以上結果可知，AS1051對土撥鼠以200μg/kg靜脈給藥時，與上述5(對小鼠給藥)的情況相同也不會對血小板數造成影響，同時，可在血中保持足以抑制瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集的濃度。
其次，利用動物血栓模型，進行了AS1051在活體內抗血栓作用的評價。作為血型模型，採用松野等人(松野等人，血液與循環，4，p20-23，(1990))報告的光激發血栓模型。
將土撥鼠的頸動脈剝離，裝上都卜勒血流探針，在設置探針的血管上遊約5mm位置設置氙燈光源。然後，對該土撥鼠經靜脈內給藥含有BSA的AS1051(BSA與AS1051同量)，或作為對照只給藥含BSA的樣品，5分鐘後將四碘四氯螢光素溶液(10mg/kg)經靜脈內給藥同時照射540nm的光，給血管壁設置障礙，用脈衝式都卜勒血流計測定直至血流停止的時間。如圖11所示，AS1051(200μg/kg)給藥組與對照組相比，顯然直至血流停止的時間延長了，表明AS1051具有抗血栓活性(p＜0.01)。
實施例2用大腸菌生產抗血栓性單鏈肽為了利用遺傳工程技術生產本發明之肽，從響尾蛇(Crotalushorridus horridus)分離出對具有能抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的肽編碼的基因，將其用大腸菌表達。1響尾蛇(Crotalus horridus horridus)cDNA基因庫的製作(1)從響尾蛇(Crotalus horridus horridus)提取mRNA把響尾蛇(Crotalus horridus horridus)的毒腺摘出，立即用液氮冷凍，保存至使用時為止。此毒腺1.7g在RNA提取液(4M鹽酸異氰酸鈲、0.1M tris鹽酸(pH7.5)、1％β-巰基乙醇、0.1％月桂基肌氨酸鈉鹽)20ml中用Polytron均化器(Kinematica公司制)破碎。此破碎液以10000G離心分離10分鐘，除去不溶物後，將其上清液重疊於超離心分離管中等量的密度平衡化緩衝液(4M氯化銫、10mM乙二胺四乙酸二鈉pH7.5)上，然後以30000rpm在20℃離心分離18小時，分離出全RNA600μg。
從全RNA製備mRNA是使用POLY(A)Quik mRNA成套抽提設備(stratagene公司制)按照該設備規定的程序進行的。即，把所得到的全RNA中的500μg吸附在Oligo dT柱上，以高鹽緩衝液200μl洗滌2次、低鹽緩衝液200μl洗滌3次後，讓65℃、200μl溶出緩衝液通過該柱4次，分離精製mRNA(10μg)。(2)cDNA合成cDNA合成是使用TimeSavorDNA成套合成設備(Pharmacia公司制)按照該設備規定的程序進行的。即，使精製的mRNA3μg與無規六元引子0.3μg、1mM二硫蘇糖醇、含有反轉錄酶的第一股反應液混合，在37℃反應1小時，合成第一股。
將此反應液與含有大腸菌RNaseH、大腸菌DNA聚合酶的第二股反應液混合，在12℃反應30分鐘、在22℃反應1小時以合成cDNA。在65℃培養10分鐘後，反應液以苯酚/氯仿處理，使酶活性喪失。然後，使用附有成套設備的凝膠過濾旋轉柱，以400G下離心分離2分鐘，除去未反應的引子，獲得雙鏈cDNA(3μg)。(3)cDNA基因庫之製作在以上獲得之雙鏈cDNA的兩端，按照TimeSavor DNA成套設備規定的步驟，連接其所附的EcoRI/NotI接合體。即，將cDNA3μg、EcoRI/NotI接合體3μ1，聚乙二醇緩衝液30μl、ATP溶液1μl、T4DNA粘接酶1μl混合，在16℃進行1小時連接反應。而後，將反應液在65℃培養10分鐘使酶活性喪失後，添加ATP溶液1.5ul、T4多核苷酸酶1μl，在37℃反應30分鐘，進行接合體的5′端的磷酸化。此後，反應液在65℃培養10分鐘，再進行苯酚/氯仿處理使酶活性喪失。然後，使用附有成套設備的凝膠過旋轉柱，將反應液以400G離心分離2分鐘，除去未反應的接合體。
繼之，將兩端連接了接合體的cDNA連接到λ噬菌體載體λZAPII(stratagene公司制)的EcoRI部位，製作重組噬菌體DNA。即，對於連接了接合體的cDNA400ng，添加λZAPII/EcoRI/CIAP臂1μg，連接緩衝液(100mM Tris鹽酸(pH7.6))，25mM氯化鎂、300mM氯化鈉)，再等量添加含有T4DNA粘接酶的酶液B液(寶酒製造公司制，Ligation Kit)，在26℃進行10分鐘連接反應。
按上述方式得到的重組噬菌體DNA的包裝，系採用成套包裝設備GIGAPACKII GOLD(stratagene公司制)，按該設備規定的程序進行。即，上述連接了cDNA的λZAPII臂DNA3μg與成套包裝提取液混合，在22℃反應2小時進行包裝。向此反應液中添加500μl噬菌體稀釋液(0.58％氯化鈉、0.2％硫酸鎂、50mM Tris鹽酸(pH7.5)、0.01％明膠)。
在檢查了所獲得之重組噬菌體的酵價後，使用噬菌體包裝反應液的一半，利用作為受體菌的大腸菌E.Coli XL-1 Blue(stratagene公司制)，製作噬菌體基因庫。即，在10片直徑150mm的噬菌斑形成培養基(雄鹿胰化腖1％，酵母萃取物0.5％、氯化鈉0.5％、硫酸鎂1mM，麥芽糖0.2％)上，以使每片上有20,000個噬菌斑的方式塗覆用噬菌體稀釋液稀釋的噬菌體和受體菌，在37℃培養12小時，獲得重組噬菌體之基因庫。2用以分離靶基因的探子DNA的獲得(1)利用RT-PCR法擴大靶基因部分片段以從響尾蛇(Crotalus horridus horridus)提取的全RNA作為材料，利用RT-PCR法，進行對可抑制von Willebrand因子與血小板結合的肽編碼的DNA片段的擴大。
以序列號2中所記載之肽的胺基酸序列為基礎，選取密碼子縮聚少的部位，製作RT-PCR(反轉錄聚合酶連鎖反應)用之引子。該引子系委託Biologica公司進行化學合成。這些引子的鹼基序列表示在序列表序列號4和5中。但在序列號4中，第3號及第6號核苷酸是A與G的混合物，而第12號核苷酸是T、C、A與G的混合物。此外，在序列號5中，第3號核苷酸是T、C、A與G的混合物，第6號及第15號核苷酸是T與C的混合物，第9號核苷酸是A與G的混合物。
對於以上述方式調製的響尾蛇(Crotalus horridus horridus)全RNA，使用上述引子進行RT-PCR。第一股的合成，是在全RNA5μg中混合反轉錄酶SUPERSCRIPTII(GIBO公司制)2.5μl、添加在酶液中的第一股緩衝液20μl、0.1M二硫蘇糖醇10μl、10mM dNTP5μl，在42℃反應1小時而合成第一股。反應液在95℃培養5分鐘，使反轉錄酶喪失活性。其次，以這種第一股作為模板進行PCR反應。即，將第一股反應液5μl、PCR反應緩衝液10μl、10mM dNTP5μl、引子各800pmol、Taq聚合酶10U混合，使用DNA熱循環器(Parkin-Elmer公司制)，以95℃0.5分鐘、52℃1分鐘、72℃2分鐘作為1個循環，進行25個循環的反應。
將此PCR反應液供2％瓊脂糖凝膠電泳，解析擴大的DNA。結果在約300鹼基對的位置上觀察到DNA條帶。(2)擴大片段的鹼基序列的確定以上述方式擴大的DNA片段，使用pCR-ScriptSK(+)無性系化成套設備(stratagene公司制)按該設備規定的步驟，在質粒上進行亞無性系化。即，在PCR反應液中添加混合粘接緩衝液、1mMATP、作為載體的pCR script(stratagene公司制)10ng、限制性內切酶SrfI(5單位)以及T4DNA粘接酶，在25℃進行1小時連接反應，然後將反應液在65℃培養10分鐘，使粘接酶喪失活性。用這種反應物，按勝任細胞法使E.coli DH5α轉形，並塗覆在L-Ap板片(雄鹿胰化腖1％，酵母萃取物0.5％，氯化鈉0.5％，氨苄青黴素鈉100μg/ml)上，在37℃培養18小時。將形成了菌落的菌體從板片上分離下來，將其一部分進行液體培養，再依鹼式法(MolecularCloning，2版，Vol.1，Cold Spring Harbor Press編)進行質粒調製。這種質粒命名為pCHAprobe。
pCHAprobe無性系化片段的鹼基序列是使用DNA定序器A373(Applied Biosystems公司制)，以M13M4或M13reverse(寶酒製造公司制)作為引子，按該定序器的使用法，用dye Terminator法進行解析的。結果顯示，無性系化的DNA片段由272個鹼基對構成，具有序列號6所示的鹼基序列。將此序列轉譯成胺基酸觀察時證明，它相當於所要得到的肽的一部分，所得到的無性系化片段是靶肽AS1051基因的一部分。(3)探子的標識pCHAprobe用無性系化嵌入片段兩端所存在的限制性內切酶SacI、BamHI切斷，以2％瓊脂糖凝膠電泳分離出340鹼基對大小的DNA片段，使用DNA回收成套設備(Takara EASYTRAP寶酒製造公司制)按該設備規定的步驟回收DNA。此DNA25ng用[α-32P]dCTP及無規引子標記成套設備(寶酒製造公司制)進行放射性同位素標記。該標記反應液用凝膠過濾Nick柱(Pharmacia公司制)將未反應的[α-32P]dCTP除去，獲得標記化的探子。3利用噬菌斑雜交取得靶基因從cDNA噬菌體基因庫，利用上述探子進行噬菌斑雜交，篩選出對AS1051肽全長編碼的基因。
從按上述方式形成了λZAPII cDNA噬菌體基因庫的噬菌斑板片，按濾紙所附說明書把噬菌斑轉錄於尼龍濾紙Hibond(Amersham公司制)上。此濾紙進行鹼處理使噬菌體溶解後，在80℃烘烤2小時，將噬菌體DNA固定在濾紙上。
此濾紙與32P標記化探子1×106cpm/ml，在含有5×SSPE緩衝液(20×SSPC3.6M氯化鈉、0.2M磷酸鈉緩衝液pH7.7、20mMEDTA二鈉)、30％甲醯胺、5×Denhardt溶液(100×Denhardt溶液2.0％牛血清白蛋白、2％Ficoll400、2％聚乙烯基吡咯烷酮)及0.5％SDS的溶液中，在37℃雜交16小時。此後，該濾紙在6×SSC(20×SSC3M氯化鈉、0.3M檸檬酸三鈉)、0.1％SDS中在室溫洗滌2次，再在2×SSC、0.1％SDS中在50℃洗滌2次，將與濾紙非特異結合的探子除去。將此濾紙與X射線底片HP20(富士film公司制)一起在-80℃曝光24小時。從噬菌體板片上把相當於底片陽性斑點位置的純系分離下來，作為一次篩選陽性純系。重複相同的篩選操作，取得形成單一噬菌斑的陽性純系。
在所獲得之陽性純系的λZAPII cDNA噬菌體上感染輔助噬菌體ExAssist(stratagene公司制)，通過將其感染在非琥珀阻遏株大腸菌的SOLRCELL(stratagene公司制)上，獲得了具有在質粒pBluescript SK(-)(stratagene公司制)的EcoRI部位嵌入了cDNA片段的質粒的大腸菌。從這種菌體用鹼式SDS法調製質粒，利用DNA定序器A373(Applied Biosystems公司制)確定嵌入片段的鹼基序列。
結果發現，4個陽性純系具有對所要得到的肽編碼的鹼基序列，將分別予以編碼的質粒命名為pCHA1、pCHA2、pCHA3及pCHA4。此外，具有pCHA1的E.coli HB101/pCHA1(Ecoli AJI3023)，從平成6年8月12日起以FERM BP-4781寄存編號，根據布達佩斯條約，國際寄存於日本通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(郵便番號305，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)。按上述方式無性系化的AS1051肽編碼基因的鹼基序列表示在序列表序列號7中，而由這種基因編碼的肽的胺基酸序列則表示在序列號8中。這種基因具有作為轉譯開始胺基酸的甲硫氨酸以下22個胺基酸所構成的典型分泌信號。4以大腸菌為宿主的AS1051肽的表達生產及活性肽的取得(1)大腸菌表達質粒pCHAT7的製作在具有T7啟動子的質粒pGEMEX-1(Promega公司制)中導入對上述得到的AS1051肽編碼的DNA片段，製作大腸菌用表達質粒(參照圖12)。
首先，為便於以後操作起見，製作pGEMEX-1所存在的兩個限制性內切酶NdeI切斷部位中缺失了離I7啟動子遠的NdeI切斷部位的質體。即，用NdeI使pGEMEX-1部分消化，切斷末端用DNA平滑化成套設備(寶酒製造公司制)平滑化，再用粘接成套設備(寶酒製造公司制)再環狀化。用所獲得的質粒使大腸菌轉形，從轉形株中獲得在所希望的位置只存在一個NdeI切斷部位的質粒，命名為pGEMEX(NdeI)。
上述pCHA1及pGEMEX(NdeI)用限制性內切酶NdeI及SacI切斷，利用瓊脂糖凝膠電泳提取分別為100鹼基對和3200鹼基對的DNA片段。pCHA1所產生的100鹼基對的DNA片段含有AS1051肽編碼基因的3′末端側區域(相當於序列號7中的核苷酸號490～559)。
利用粘接成套設備(寶酒製造公司制)進行這些DNA片段的連接反應，用這種反應液使大腸菌E.coli HB101轉形，在含有氨苄青黴素的板片上從所分離的轉形體獲得重組質粒pCHA(NS)。
然後，在所獲得的質粒pCHA(NS)中嵌入AS1051肽編碼基因的5′末端側區域(相當於序列號7中的核苷酸號135～489)，製作了在大腸菌內將AS1051肽表達生產的質粒。
為了把AS1051肽編碼基因的5′末端區域組合到pCHA(NS)中，合成了用PCR法使這一區域擴大所需的DNA引子。此時，作為5′末端側的引子，為了使擴大片段的5′末端有NdeI部位，使用了含有NdeI識別序列的引子(CHANdeI引子序列號9)。此外，這種引子在5′末端側AS1051肽的N末端胺基酸的天冬氨酸的密碼子前有作為轉譯開始信號的鹼基序列ATG(序列號9中的核苷酸號9～11)。而且，這種開始密碼子是與NdeI識別序列(序列號9中的核苷酸號6～11)重複的。
另一方面，作為3′末端側之引子，為了構築用於後述昆蟲培養細胞表達系中的表達質粒，使用了含有HindIII識別序列的引子(CHAHindIII序列號10，HindIII識別序列系核苷酸號10～15)。
藉助於使用上述引子的PCR反應，使AS1051肽編碼基因擴大。PCR反應以94℃15秒、50℃1分鐘、72℃2分鐘為1個循環，重複25個循環。然後，PCR反應液用苯酚/氯仿處理使Taq聚合酶喪失活性，用乙醇沉澱法將由擴大的400鹼基對構成的DNA片段精製後，用限制性內切酶NdeI消化。這種DNA片段與用限制性內切酶NdeI消化的pCHA(NS)採用粘接成套設備(寶酒製造公司制)連接。用所獲得之質粒，以勝任細胞法，使E.coli HB101株轉形，轉形體用含有氨苄青黴素的板片培養16小時。
從所生長的轉形體用鹼式SDS法調製質粒，使用T7引子及SP6引子(stratagene公司制)，以DNA定序器A373(AppliedBiosystems公司制)確定鹼基序列，從而確認構築了目的AS1051肽表達載體。所製作的表達載體命名為pCHAT7。以上的質粒構築過程表示在圖12中。(2)利用大腸菌生產肽為了利用AS1051肽表達載體pCHAT7由大腸菌生產AS1051肽，用pCHAT7以勝任細胞法使E.coli JM109(DE3)(Promaga公司制)轉形，在含有氨苄青黴素的板片上在25℃培養2日，選擇保有該質粒的菌株。這種E.coli JM109(DE3)是具有連接於lacUV5啟動子下遊的T7噬菌體RNA聚合酶基因、可通過添加IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃苷)誘發lacUV啟動子進行轉錄而生成T7噬菌體RNA聚合酶、使得只有T7啟動子才能有效地表達這樣構築成的菌株。因此，保有上述質粒的菌株可將AS1051肽有效率地表達。
將保有表達質粒的E.coli JM109(DE3)/pCHAT7接種於10個盛有100ml LB-Ap培養基(1％雄鹿胰化腖、0.5％酵母萃取物、0.5％氯化鈉、100μg/ml氨苄青黴素)的500ml錐形燒瓶中，在30℃振蕩培養16小時。在培養基中添加最終濃度為0.5mM的誘導劑IPTG，再於37℃振蕩培養4小時。培養後，離心分離法收集菌體，然後將其懸浮於100ml緩衝液(30mM tris鹽酸pH7.5，10mM EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，30mM氯化鈉)中以洗滌菌體。再次用離心分離法收集菌體，將其懸浮在20ml之菌體破碎緩衝液(0.5MEDTA，pH8)中。向此懸浮液中添加蛋白溶菌酶20mg，在0℃處理1小時，將菌體的細胞壁破壞。然後，此懸浮液在超聲波破碎器Insonator200M(Kubota公司制)中以180W功率破碎處理10分鐘。破碎液以6000rpm離心20分鐘，得到菌體不溶性部分(內含體)。(3)內含體增溶及活化將從1升培養液得到的內含體溶解在含有10mM EDTA、0.5M Tris鹽酸(pH8.5)的7M鹽酸胍溶液28.6ml中，向其中添加71.4ml蒸餾水，然後在4℃保存2天進行空氣氧化。然後，將三氟乙酸0.5ml添加於該溶液中使其成為酸性後，離心法除去不溶物，上清液用配備逆相柱(Vydac 214TP1022，Vydac公司制)的高速液體色譜法分離，獲得重組體AS1051(9.0mg)。所獲得的精製肽在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上顯示與實施例14所示AS1051具有相同分子量。此外，對所獲得的重組體AS1051，也按照與實施例15相同的方法測定其對血小板凝集的抑制活性，結果表明，它不抑制ADP凝集和膠原凝集，而對於瑞斯託菌素凝集和botrocetin凝集則顯示與實施例14所獲得之AS1051具有同等的抑制活性。
以上述方式獲得的重組體AS1051的胺基酸序列按下述方式確定。首先，將1μl 4-乙烯基吡啶添加於含重組體AS1051 500μg的2mM EDTA、0.1M Tris鹽酸(pH8.5)溶液(450ml)中，然後再添加賴氨醯端肽酶(和光純藥公司制)15μg，在37℃進行3小時酶消化。消化物按與實施例14所示方法相同的方法供給逆相HPLC，分離消化切斷的肽。各消化片段的胺基酸序列分析的結果確認，重組體AS1051的胺基酸序列是在序列號2所示氨基末端結合了甲硫氨酸殘基的序列。再者，作為二硫鍵方式，Cys4-Cys15之間二硫鍵的存在是用含有兩殘基的片段肽的質譜(MS)確認的，此外，與實施例14相同，將圖7中所示片段A、B、C以二硫鍵交聯的片段肽，以V8蛋白酶(和光純藥公司制)進行酶消化(0.1M碳酸氫銨溶液中，V8蛋白酶3μg)，再解析以逆相柱分離的片段肽的胺基酸序列，也確認了Cys32-Cys120、Cys95-Cys112之間二硫鍵的存在。
所獲得的重組體AS1051對小鼠以1000μg/kg靜脈內給藥時，並未發現血小板減少現象。實施例3利用杆狀病毒/昆蟲培養細胞表達系統生產抗血栓性單鏈肽將實施例2所獲得之AS1051基因以昆蟲培養細胞表達系統表達，生產抗血栓性單鏈肽。1桿狀病毒AS1051表達載體的製作杆狀病毒表達系統，是使用MaxBac杆狀病毒表達系統(Invitrogen公司制)構建的(參照圖13)。即，將實施例2得到的pCHA1用限制性內切酶EcoRI消化，利用DNA平滑化成套設備(寶酒製造公司制)按該設備規定的步驟將其末端平滑化。進一步用限制性內切酶PstI將其消化，消化物供給瓊脂糖凝膠電泳，回收400鹼基對的DNA片段。另一方面，以限制性內切酶HindIII將表達載體pBlueBacIII消化，利用DNA平滑化成套設備將其末端平滑化。然後，進一步用限制性內切酶PstI將其消化，消化物供給瓊脂糖凝膠電泳，回收10,300鹼基對的DNA片段。使用粘接成套設備把回收的這些DNA片段連接，利用勝任細胞法使E.coli HB101轉形，在含氨苄青黴素的板片上選擇轉形體。所製作的質粒稱為pCHAbac。質粒的構築過程表示在圖13中。2用pCHAbac使昆蟲培養細胞Sf9株轉形和重組病毒的取得昆蟲培養細胞的轉形及重組病毒的取得，是按照MaxBac杆狀病毒表達系統(Invitrogen公司制)的規定步驟進行的。具體地說，將野生型核多角體病病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virusAcMNPV)DNA 1μg、pCHAbac 3μg，用脂質體法導入昆蟲培養細胞草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)9株(Sf9株)內。這種病毒導入細胞在TNM-FM(FBS+)培養液(Invitrogen公司制)中在270℃培養48小時後，將培養液回收，獲得病毒溶液。
使這種病毒溶液感染於昆蟲培養細胞Sf9株，以含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)150μg/ml的FNM-FH(FBS+)軟瓊脂培養基在27℃下培養7日。選擇受發生了野生型AcMNPV與pCHAbac重組的病毒感染的細胞(藍色)。將此細胞用巴斯德移液管從板片上拾取，予以適當稀釋，再感染於Sf9細胞。上述純化操作重複2次，取得只有重組病毒存在的病毒溶液。3利用杆狀病毒/昆蟲培養細胞表達系統表達AS1051肽用重組病毒表達AS1051肽。在細胞培養用燒瓶(NUNCLON260ml，底面積75cm2Nunc公司制)中的FNM-FH(FBS+)培養液10ml中接種6×106個Sf9細胞，再進一步添加純化重組病毒3×106cfu，在27℃培養24小時。此後，從燒瓶中取出培養液，添加不含胎牛血清的FNM-FH(FBS-)培養液10ml，再於27℃下培養7日。培養完成後，取出培養液4ml，用Centricon-10(Amicon公司制)濃縮成400μl，得到培養上清濃縮液(10倍濃縮液)。
另一方面，在取出了培養液的燒瓶中添加緩衝液(30mM Tris鹽酸pH7.5、10mM EDTA、30mM氯化鈉)，用吸移法使細胞從燒瓶壁剝離後，回收細胞懸浮液，用離心分離法將細胞洗滌1次後，再懸浮於緩衝液2ml中。這種細胞懸浮液用超聲波破碎機Insonator 200M(Kubota公司制)以180W功率處理5分鐘使細胞破碎。破碎後，以10000G離心分離30分鐘，通過回收其上清液獲得細胞破碎液。作為對照樣品，系使感染了野生型AcMNPV病毒的Sf9細胞和未感染病毒的Sf9細胞在與上述相同的條件下培養並進行樣品調製而得到的物質。
將以上述方式調製的上清濃縮液5μl，或細胞破碎液10μl，分別在添加1％巰基乙醇的還原條件下供給SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，進行CBB(Coomassie Brilliant Blue)染色。結果顯示，在感染了重組病毒的培養上清濃縮液和細胞破碎液兩者任何一種中，均有顯著量之蛋白在15千道爾頓的位置檢出。另一方面，對照組單獨Sf9細胞或感染了野生型病毒AcMNPV的Sf9細胞培養上清濃縮液及細胞破碎液，在15千道爾頓的位置均無法檢出蛋白。這種分子量15千道爾頓的數值，與從蛇粗毒精製之AS1051的分子量一致。4利用杆狀病毒/昆蟲培養細胞表達系統生產的AS1051肽的活性按上述方式得到的昆蟲培養細胞內的重組體蛋白以及培養上清液中的重組體蛋白對botrocetin所引起的von Willebrand因子與血小板結合的抑制作用，用以下方法測定。
福馬林固定化血小板的調製進行如下。添加了1/10容積的3.8％檸檬酸鈉、從健康人採集的新鮮血液以900rpm離心15分鐘，在所得到的人類富血小板血漿(platelet rich plasmaPRP)中添加與此相同容積的、含有溶解了2％多聚甲醛的20mM磷酸緩衝液(pH7.4)的0.15M氯化鈉水溶液，在4℃靜置保存過夜。保存後，用離心分離法將血小板回收，用含有20mM磷酸緩衝液(pH7.4)的0.15M氯化鈉水溶液洗滌2次。洗滌後，將固定化血小板懸浮於相同溶液中保存。
對於用上述方式獲得的固定化血小板，沿襲Chopek等人的方法(M.W.Chopek等人，Biochemistry，25，3146-3155(1986))進行125I標記von Willebrand因子與固定化血小板結合的抑制試驗。即，在所調製的固定化血小板懸浮液中，添加待測定樣品、botrocetin及125I標記von Willebrand因子，在室溫反應30分鐘，對與血小板結合的von Willebrand因子量用γ計數器(PackardMulti-Prias，Packard公司制)測定。此時，反應液量是50μl，其中待測定樣品是添加5μl測定的。
針對從AS1051重組病毒感染Sf9細胞和對照組Sf9細胞按上述方法調製的細胞破碎液，測定了對botrocetin所引起的vonWillebrand因子與血小板結合的抑制活性，其結果表示在圖14中。此外，針對從AS1051重組病毒感染Sf9細胞及對照組Sf9細胞按上述方法調製的培養上清濃縮液(3倍濃縮液)，測定了對botrocetin所引起的von Willebrand因子與血小板結合的抑制活性，其結果表示在圖15中。由些結果可知，感染了重組病毒的細胞破碎液及細胞培養上清液，對von Willebrand因子與血小板結合都能幾乎完全予以抑制。由此事實可知，藉助於用杆狀病毒/昆蟲培養細胞表達系統生產，AS1051肽可作為細胞內的可溶性蛋白質及細胞外分泌蛋白質，以具有可抑制血小板與von Willebrand因子結合的活性之形態製造。
實施例4用動物培養細胞表達系統生產抗血栓性單鏈肽藉助於利用CHO細胞的動物培養細胞表達系統表達AS1051基因，生產了抗血栓性單鏈肽。
通過用限制性內切酶PstI使pCHA1消化而切出AS1051基因，所獲得的DNA片段兩端用DNA平滑化成套設備(寶酒製造公司制)平滑化，進而在兩端連接XhoI接頭(寶酒製造公司制)。這種DNA片段用限制性內切酶XhoI消化後，供給瓊脂糖凝膠電泳，提取500鹼基對的DNA片段。把這種DNA片段嵌入CHO細胞表達載體pSD(X)(M.Murata等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，2434-2438(1988))的XhoI部位。這種載體pSD(X)，是具有pBR322與SV40的複製開始點、氨苄青黴素抗性基因、氨甲蝶呤抗性基因，還具有SV40啟動子、SV40剪接信號以及poly A加成信號，可在CHO細胞中表達外來基因的載體。以上之質粒的構築過程表示在圖16中。
用上述嵌入了AS1051基因的pSD(X)使大腸菌HB101轉形，從所獲得的轉形體得到AS1051基因在預期方向上嵌入載體中的表達質粒，將其命名為pCHASDX。利用這種質粒pCHASDX，依磷酸鈣法(Current Protocols in Molecular BiologyGreene PublishingAssociates)，使CHO細胞的二氫葉酸氧化還原酶缺失株轉形。該轉形體用含有α-MEM(核酸-)(GIBCO公司制)、10％胎牛血清(FCS)、氨甲蝶呤0.05μM的培養基培養，選育在染色體上組合了表達質粒的轉形體。
所獲得的細胞株以培養基中氨甲蝶呤濃度分階段上升至0.5μM的方式培養，通過選擇氨甲蝶呤抗性株，獲得了據信在CHO細胞的染色體上AS1051基因業已擴大的株。從使此株的信號純系增殖而得到的細胞，用ISOGEN成套設備(Nippon Gene公司制)提取全RNA，再使用引子CHA16Y(序列號13)及CHA115Q(序列號14)，按照與實施例22所述相同的RT-PCR法進行AS1051基因擴大，用瓊脂糖凝膠電泳進行擴大DNA解析。結果檢出了比從AS1051基因的核苷酸序列推測還大的DNA片段擴大，從而確認AS1051基因的mRNA已在CHO細胞中轉錄。用這種細胞進行了AS1051肽的表達研究。具體地說，此細胞2×104個在含有α-MEM(核酸-)、10％胎牛血清、氨甲蝶呤0.5μM的培養基5ml中培養4日後，換成含有氨甲蝶呤0.5μM的無血清培養基AS104(味之素公司制)，再培養3日。
將培養完成後的培養基回收，取其中4ml以Centricon-10(Amicon公司制)濃縮至100μl，再將濃縮液依次稀釋，按實施例34記載的方法，測定對瑞斯託菌素及botrocetin所引起的vonWillebrand與血小板結合的抑制活性。AS1051肽生產細胞及對照組不生產AS1051肽的細胞的培養上清液，濃縮或稀釋成一定濃度的溶液時的抑制活性表示在圖17和圖18中。如兩圖中所示，肽生產細胞的培養上清液的抑制活性依賴於濃度，並顯示含有活性型的AS1051。
實施例5變異AS1051肽的生產將具有從N末端起算第81號(但不包含轉譯開始的甲硫氨酸殘基)的半胱氨酸殘基以丙氨酸取代而變異(以下簡稱「Cys81Ala變異」)的AS1051肽用大腸菌表達，考察其對von Willebrand因子與血小板結合的抑制活性。1Cys81Ala變異AS1051肽的生產根據《PCRprotocols》(Acadmic Press版)中所記載的部位特異性鹼基序列變異法，將變異導入AS1051基因中，使得與AS1051肽的二硫鍵無關的半胱氨酸殘基(序列號2中第81號半胱氨酸殘基)由丙氨酸取代。以pCHA1作為模板，使用實施例2合成的引子CHANdeI(序列號9)及新合成的引子CHAAlaF(序列號11)，或使用新合成的引子CHAAlaR(序列號12)及實施例2合成的引子CHAHindIII(序列號10)，進行PCR反應。各反應生成物分別供給瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠中提取擴大的DNA片段。以這些DNA片段作為模板，使用引子CHANdeI及CHAHidIII，進行第二次PCR反應，製作雙異基因。用限制性內切酶NdeI使PCR擴大DNA片段消化，供給瓊脂溏凝膠電泳，從凝膠中提取360鹼基對的DNA片段。把這種DNA片段嵌入由限制性內切酶NdeI消化的pCHA(NS)的NdeI部位。以上質粒的構築過程表示在圖19中。
用這樣製作的質粒，以勝任細胞法使大腸菌HB101轉形，在含氨苄青黴素的板片上選擇轉形體。從這種轉形體用鹼式SDS法調製質粒，並使用T7引子及SP6引子(Stratagene公司制)，按實施例8所記載的方法確定鹼基序列，並選擇導入了目的變異的質粒。所獲得的表達載體命名為pCHAT7Ala。用pCHAT7Ala使大腸菌JM109(DE3)轉形，按照與實施例24相同的方法培養轉形體，表達生產具有Cys81Ala變異的AS1051肽。將菌體蛋白質供給SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳後確認，可在大腸菌菌體內作為內含體積累生產與實施例24所生產的基因重組野生型AS1051肽大致同量的重組肽。2Cys81Ala變異AS1051肽內含體的增溶與活化按照實施例24所記載的方法進行了內含體的增溶與活化。所獲得的精製蛋白在SDS電泳上顯示與實施例14所示AS1051的分子量相同的分子量。此外，也確認二硫鍵樣式與AS1051相同。進而對於所獲得的Cys81Ala變異AS1051肽，按與實施例15相同的方法測定其對血小板凝集的抑制活性時，發現對ADP凝集、膠原凝集並無抑制，而對瑞斯託菌素凝集、botrocetin凝集則有與AS1051相同程度的抑制。再者，對於瑞斯託菌素、botrocetin所引起的vonWillebrand因子與固定化血小板結合，也顯示出與實施例14所得到的AS1051及實施例24所得到的重組AS1051有同等的抑制活性(圖20)。這樣獲得的變異AS1051肽，在30℃保存於溶液中或在4℃透析時均是穩定的，反之，重組AS1051肽在30℃保存於溶液中以及在4℃透析時均出現不溶化現象。由此結果可判斷，重組變異AS1051肽的穩定性比重組AS1051肽更高。
實施例6縮短AS1051肽的生產其N末端部分和/或C末端部分縮短的AS1O51肽用大腸菌表達，考察了縮短AS1051肽對yon Willebrand因子與血小板結合的抑制活性。1縮短AS1051肽的生產從具有Cys81Ala變異的AS1051肽(稱為「AS1051Cys81Ala肽」)構建其N末端之15胺基酸殘基或65胺基酸殘基和/或C末端之11胺基酸殘基缺失的肽的表達系統。即，所生產的肽，是有第16號酪氨酸殘基至第126號精氨酸殘基的肽(AS1051A-1)，有第67號酪氨酸至第126號精氨酸殘基的肽(AS1051A-2)，有第1號天冬氨酸殘基至第115號穀氨酸殘基的肽(AS1051A-3)，有第16號酪氨酸殘基至第115號穀氨酸殘基的肽(AS1051A-4)，以及有第67號酪氨酸殘基至第115號穀氨酸殘基的肽(AS1051A-5)等5種。這些肽的構造概略表示在圖21中。其中，胺基酸號碼是除轉譯開始的甲硫氨酸外所數的數目，也就是序列號2中所示胺基酸序列中的胺基酸號碼。
縮短AS1051肽表達質粒的製作進行如下。用pCHAT7Ala作為模板，對於AS1051A-1使用引子CHA16Y(序列號13)和CHAHindIII(序列號10)、對於AS1051A-2使用引子CHA67Y(序列號15)和CHAHindIII、對於AS1051A-3使用引子CHANdeI(序列號9)和CHA115Q(序列號14)、對於AS1051A-4使用引子CHA16Y和CHA115Q、對於AS1051A-5使用引子CHA67Y和CHA115Q，分別進行PCR反應。
關於用CHA16Y和CHAHindIII、以及用CHA67Y和CHAHindIII作為引子的擴大產物，是用NdeI使各擴大產物消化後供給瓊脂糖凝膠電泳，提取各為310鹼基對和160鹼基對的DNA片段。將各DNA片段嵌入pCHA(NS)的NdeI部位，用所獲得的重組質粒使E.coli HB101按氯化鈣法轉形，在含氨苄青黴素的板片上選擇轉形體。從這些轉形體選擇那些具有在相對於質粒的靶方向上嵌入了擴大DNA片段的質粒的轉形體。這樣獲得的表達質粒中，有310鹼基對的嵌入片段者命名為pCHAT7Ala(16Y126R)，而有160鹼基對的嵌入片段者命名為pCHAT7Ala(67Y126R)。
另外，關於用CHANdeI和CHA115Q、用CHA16Y和CHA115Q以及用CHA67Y和CHA115Q作為引子的擴大產物，是用NdeI及HindIII使各擴大產物消化後供給瓊脂糖凝膠電泳，提取各為360鹼基對、310鹼基對、160鹼基對的DNA片段。將各DNA片段連接在用NdeI及HindIII消化後的pCHA(NS)上，用所獲得的重組質粒使E.coliHB101按氯化鈣法轉形，在含氨苄青黴素的板片上選擇轉形體。這樣獲得的表達質粒中，有360鹼基對的嵌入片段者命名為pCHAT7Ala(1D115Q)，有310鹼基對的嵌入片段者命名為pCHAT7Ala(16Y115Q)，而有160鹼基對的嵌入片段者命名為pCHAT7Ala(67Y115Q)。
用上述5種縮短AS1051肽表達質粒使E.coli JM109(DE3)轉形，獲得各自的轉形體。這些轉形體按照與實施例2記載的方法一樣進行培養，培養後的菌體用顯微鏡觀察時確認，5種轉形體均形成了內含體。此外，各轉形體的菌體蛋白質用SDS-聚丙烯醯胺電泳解析時確認，在從各縮短AS1051肽的胺基酸序列推測的分子量位置上，均有顯著量的蛋白質。
從各轉形體按與實施例2相同的方式調製內含體，把這些內含體溶解在含10mM EDTA、0.5Mtris鹽酸(pH8.5)的7M鹽酸胍溶液286μl中後，在4℃保存過夜，然後以每次10μl的方式供給配備了SSC-VP318-1251柱(直徑4.6mm，長250mm仙修科學公司制)的高速液體色譜法，進行含0.1％三氟乙酸的乙腈濃度31％～52％的濃度梯度淋洗，獲得分別如圖22(AS1051A-1)、圖23(AS1051A-2)、圖24(AS1051A-3)、圖25(AS1051A-4)及圖26(AS1051A-5)所示由內含體產生的峰。
將溶解於上述7M鹽酸胍溶液中保存過夜的AS1051A-1、AS1051A-2、AS1051A-3、AS1051A-4及AS1051A-5的殘餘全量，分別用三氟乙酸將其pH調整至酸性後，使用逆相柱(Vydac214TP1022，Vydac公司制，直徑22mm，長250mm)，以流速15ml、含0.1％三氟乙酸的乙腈濃度30％～60％的濃度梯度淋洗(20分鐘)分級收集。所獲得的肽分別添加10倍量的胎牛血清白蛋白後冷凍乾燥，再溶解於生理食鹽水中。以這些溶液為樣品，按照與實施例15所示方法相同的方法，測定對botrocetin及瑞斯託菌素所引起的von Willebrand因子與福馬林固定化血小板結合的抑制活性。結果表示在圖27中。如圖所示，任何一種縮短AS1051肽，凡是在圖中示的濃度，都有顯著的結合抑制活性。
按照本發明，可從在活體內給藥時會引起血小板減少的得自蛇毒的肽，獲得不會使血小板減少又能抑制與血栓症發病有密切關係的von Willebrand因子與血小板結合的肽，還可提供有希望成為抗血栓藥的醫藥組合物。
序列表序列號1序列長38序列型胺基酸形態直鏈狀序列種類肽序列Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr1 5 10 15Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys20 25 30Ser Glu Gln Ala Lys Gly35序列號2序列長126序列型胺基酸形態直鏈狀序列種類肽序列Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr1 5 10 15Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys20 25 30Ser Glu Gln Ala Lys Gly Gly His Leu Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu35 40 45Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu50 55 60Thr Arg Tyr Ile Trp Ile Gly Leu Arg Val Gln Asn Lys Gly Gln Pro65 70 75 80Cys Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Leu Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe85 90 95Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu Arg Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys100 105 110Glu Gln Gln His Ser Phe Ile Cys Lys Phe Thr Arg Pro Arg115 120 125序列號3序列長21序列型胺基酸形態直鏈狀序列種類肽序列Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Arg Val1 5 10 15Phe Gln Gln Glu Met20序列號4序列長17序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列CARGARATGA CNTGGGC 17序列號5序列長17序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列TCNACYTTRA ACCAYTC 17序列號6序列長272序列型核酸鏈數雙鏈形態直鏈狀序列種類cDNA來源生物名響尾蛇(Crotalus horridus horridus)序列特徵序列CAGGAGATGA CTTGGGCCGA TGCAGAGAGG TTCTGCTCGG AGCAGGCGAA GGGCGGGCAT 60CTCCTCTCTG TCGAAACCGC CCTAGAAGCA TCCTTTGTGG ACAATGTGCT CTATGCGAAC120AAAGAGTACC TCACACGTTA TATCTGGATT GGACTGAGGG TTCAAAACAA AGGACAGCCA180TGCTCCAGCA TCAGTTATGA GAACCTGGTT GACCCATTTG AATGTTTTAT GGTGAGCAGA240GACACAAGGC TTCGTGAGTG GTTCAAAGTC GA272序列號7序列長690序列型核酸鏈數雙鏈形態直鏈狀序列種類cDNA來源生物名響尾蛇(Crotalus horridus horridus)株名序列特徵表示特徵的記號CDS存在位置66..512確定特徵的方法P序列CTGAGCAGAC TTGCTACCTG TGGAGGCCGA GGAACAGTTC TCTCTGCAGG GAAGGAAAGA 60ACGCC ATG GGG CGA TTC ATC TTC GTG AGC TTC AAC TTG CTG GTC GTG TTC110
Met Gly Arg Phe Ile Phe Val Ser Phe Asn Leu Leu Val Val Phe1 5 10 15CTC TCC CTA AGT GGA ACT CTA GCT GAT TTG GAA TGT CCC TCC GGT TGG 158Leu Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp20 25 30TCT TCC TAT GAT CGG TAT TGC TAC AAG CCC TTC AAA CAA GAG ATG ACC 206Ser Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr35 40 45TGG GCC GAT GCA GAG AGG TTC TGC TCG GAG CAG GCG AAG GGC GGG CAT 254Trp Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys Ser Glu Gln Ala Lys Gly Gly His50 55 60CTC CTC TCT GTC GAA ACC GCC CTA GAA GCA TCC TTT GTG GAC AAT GTG 302Leu Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val65 70 75CTC TAT GCG AAC AAA GAG TAC CTC ACA CGT TAT ATC TGG ATT GGA CTG 350Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Thr Arg Tyr Ile Trp Ile Gly Leu80 85 90 95AGG GTT CAA AAC AAA GGA CAG CCA TGC TCC AGC ATC AGT TAT GAG AAC 398Arg Val Gln Asn Lys Gly Gln Pro Cys Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Asn100 105 110CTG GTT GAC CCA TTT GAA TGT TTT ATG GTG AGC AGA GAC ACA AGG CTT 446Leu Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu115 120 125CGT GAG TGG TTT AAA GTT GAC TGT GAA CAA CAA CAT TCT TTC ATA TGC 494Arg Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys Glu Gln Gln His Ser Phe Ile Cys130 135 140AAG TTC ACG CGA CCA CGT TAAGATCCGG CTGTGTGAAG TCTGGAGAAG 542Lys Phe Thr Arg Pro Arg145CAAGGAAGCC CCCCACCTCT CCCCACCCCC CACCTTCCGC AATCTCTGCT CTTCCCCCTT602TGCTCAGTGG ATGCTCTCTG TAGCCGGATC TGGGTTTTCT GCTCCAGATG GGTCAGAAGA662TCCAATAAAT TCTGCCTACC CAAAAAAA 690序列號8序列長149序列型胺基酸形態直鏈狀序列種類肽序列Met Gly Arg Phe Ile Phe Val Ser Phe Asn Leu Leu Val Val Phe Leu1 5 10 15Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asp Leu Glu Cys Pro Ser Gly Trp Ser20 25 30Ser Tyr Asp Arg Tyr Cys Tyr Lys Pro Phe Lys Gln Glu Met Thr Trp35 40 45Ala Asp Ala Glu Arg Phe Cys Ser Glu Gln Ala Lys Gly Gly His Leu50 55 60Leu Ser Val Glu Thr Ala Leu Glu Ala Ser Phe Val Asp Asn Val Leu65 70 75 80Tyr Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Thr Arg Tyr Ile Trp Ile Gly Leu Arg85 90 95Val Gln Asn Lys Gly Gln Pro Cys Ser Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Leu100 105 110Val Asp Pro Phe Glu Cys Phe Met Val Ser Arg Asp Thr Arg Leu Arg115 120 125Glu Trp Phe Lys Val Asp Cys Glu Gln Gln His Ser Phe Ile Cys Lys130 135 140Phe Thr Arg Pro Arg145序列號9序列長34序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列GGCGGCATAT GGATTTGGAA TGTCCCTCCG GTTG 34序列號10序列長40序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列TATCTCGAGA AGCTTACAGC CGGATCTTAA CGTGGTCGCG 40序列號11序列長26序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列GATGCTGGAG GCTGGCTGTC CTTTGT 26序列號12序列長27序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列GGACAGCCAG CCTCCAGCA TCAGTTA 27序列號13序列長35序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列GGTGGATCCA TATGTACAAG CCCTTCAAAC AAGAG 35序列號14序列長36序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列CTCAGAAAGC TTTTATTGTT GTTCACAGTC AACTTT 36序列號15序列長35序列型核酸鏈數單鏈形態直鏈狀序列種類其他核酸，合成DNA序列GGTGGATCCA TATGTATATC TGGATTGGAC TGAGG 3權利要求
1.一種肽，其特徵在於此肽是從具有可抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性、得自蛇毒的多肽得到的單鏈肽，在活體內顯示上述活性的最小給藥量下實質上不會造成血小板減少。
2.按照權利要求1的肽，其中所述蛇毒是響尾蛇(Crotalushorridus horridus)的蛇毒。
3.按照權利要求2的肽，其特徵在於在N末端區域有序列號1所示胺基酸。
4.按照權利要求2的肽，含有序列號2所示胺基酸序列或其一部分胺基酸序列。
5.按照權利要求4的肽，其特徵在於它是含有序列號2中所示胺基酸序列或其一部分胺基酸序列的肽，其中，在序列號2所示胺基酸序列中，在第4號與第5號、第32號與第120號、以及第95號與第112號半胱氨酸殘基之間分別有二硫鍵。
6.一種肽，其特徵在於在權利要求4的肽中，序列號2所示胺基酸序列的第81號半胱氨酸殘基被其它胺基酸取代。
7.一種在活體內顯示抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的最小給藥量下實質上不會造成血小板減少的單鏈肽製法，其特徵在於通過使具有上述活性的得自蛇毒的肽與蛋白質變性劑、穀胱甘肽和/或半胱氨酸共存，在使構成上述多肽的肽鏈內二硫鍵實質上得到保存的情況下，將肽鏈間的二硫鍵切斷。
8.一種DNA片段，它將權利要求1～6中任何一項所述的肽編碼。
9.一種DNA片段，它將序列號2中所示胺基酸序列或其一部分胺基酸序列編碼。
10.一種重組載體，是將權利要求7或8所述DNA片段嵌入適合於選自由大腸菌、昆蟲培養細胞和動物培養細胞組成的一組的宿主細胞轉形的載體中而形成的。
11.一種轉形體，是從選自由大腸菌、昆蟲培養細胞和動作培養細胞組成的一組的宿主細胞藉助於權利要求10所述重組載體轉形而成的。
12.一種在活體內顯示抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的最小給藥量下實質上不會造成血小板減少的單鏈肽製法，包括從權利要求10所述重組載體轉形的大腸菌以適當培養基培養；使權利要求1所述肽表達；以及使蓄積於大腸菌細胞內的上述肽與蛋白質變性劑共存後，藉助於將蛋白質變性劑除去或減少蛋白質變性劑的濃度，生成上述肽鏈內的二硫鍵。
13.按照權利要求12所述的製法，其特徵在於該肽具有序列號2所記載的胺基酸序列或其一部分，所述二硫鍵是在序列號2所示胺基酸序列的第4號與第15號、第32號與第120號、以及第95號與第112號半胱氨酸殘基之間形成的。
14.一種在活體內顯示抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性的最小給藥量下實質上不會造成血小板減少的肽製法，包括從權利要求10所述重組載體轉形的昆蟲細胞或動物細胞以適當培養基培養；使權利要求1所述的肽表達；以及將蓄積於上述細胞內或培養基中的上述肽回收。
15.一種醫藥組合物，含有權利要求1～6中任何一項所述的肽和/或其藥物上可接受的鹽作為有效成分。
全文摘要
本發明涉及通過讓具有抑制von Willebrand因子與血小板結合的活性、得自蛇毒的多肽與蛋白質變性劑、穀胱甘肽和/或半胱氨酸共存，在使構成上述多肽之肽鏈內的二硫鍵在實質上獲得保存的情況下，將肽鏈間之二硫鍵切斷，而獲得在活體內能顯示上述活性之最小給藥量下實質上不會造成血小板減少之肽。或者，將上述肽或其變異體或其一部分，利用能將其編碼之基因的遺傳工程技術製造。
文檔編號C12N15/12GK1135760SQ94194226
公開日1996年11月13日 申請日期1994年9月21日 優先權日1993年9月22日
發明者福地直之, 山本浩史, 長野充代, 鬼頭守和, 田中朗子, 石井康一, 小林幹, 吉元良太 申請人:味之素株式會社