菠蘿蛋白酶成分的製作方法

2023-10-18 12:58:44 1

專利名稱：菠蘿蛋白酶成分的製作方法
技術領域：
本發明涉及菠蘿蛋白酶成分。具體地，本發明涉及含有新型蛋白並具有免疫調節和抗腫瘤活性的菠蘿蛋白酶組分。
莖菠蘿蛋白酶(菠蘿蛋白酶)是在鳳梨科植物組織中發現的蛋白水解酶的統稱。它是來自鳳梨植物(Ananas comosus)莖的各種成分的混合物。已知菠蘿蛋白酶包含至少五種蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和過氧化物酶；它也可包含澱粉酶和纖維素酶活性。另外，也存在多種其它成分。
菠蘿蛋白酶曾用於治療多種病症包括炎症，具體地，它已用於治療腹瀉。菠蘿蛋白酶在治療感染性腹瀉方面的用途在WO-A-9301800中得到，其中證明菠蘿蛋白酶通過蛋白水解作用破壞病原體的腸道受體從而發揮作用，在WO-A-8801506中，認為菠蘿蛋白酶使病原體從腸道受體上脫離下來。
Taussig等，Planta Medica，1985，538-539和Maurer等，Planta Medica，1988，377-381都提出菠蘿蛋白酶可用於抑制腫瘤生長。US5,233,406、DE-A-4302060和JP-A-59225122也說明了菠蘿蛋白酶在治療癌症方面的用途。US5,223,406認為菠蘿蛋白酶能夠誘導腫瘤壞死因子(TNF)，DE-A-4302060認為菠蘿蛋白酶能夠通過腫瘤表面蛋白CD44的結構修飾防止轉移。
在WO-A-9400147中描述了各種實驗，這些實驗證明蛋白水解酶，尤其是菠蘿蛋白酶能抑制分泌。此申請也公開了菠蘿蛋白酶能降低毒素結合活性並能抑制諸如熱不穩定毒素(LT)和霍亂毒素(CT)的毒素及諸如熱穩定毒素(ST)的毒素的分泌效應，儘管ST具有與LT和CT非常不同的作用模式。這些觀察結果通過菠蘿蛋白酶混合物的一個成分莖菠蘿蛋白酶看來能調節環核苷酸途徑這一事實得到解釋，並且這一點在WO-A-9500169中得到進一步討論。另外，也證明菠蘿蛋白酶抑制由鈣依賴的途徑導致的分泌。
WO-A-9600082也涉及了菠蘿蛋白酶並且公開了粗製菠蘿蛋白酶能夠幹涉對生長重要的信號傳導途徑，尤其是導致生長因子如白細胞介素-2(IL-2)、血小板衍生的生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子(IGF)產生的信號傳導途徑。此文獻認為作為其封閉信號傳導途徑的能力的結果，菠蘿蛋白酶能作用為抗癌劑。另外，依據要處理的細胞類型以及細胞以前是否已活化，菠蘿蛋白酶可用作免疫抑制劑或免疫刺激劑。
從現有技術看，菠蘿蛋白酶很明顯是具有多種不同生理效應的混合物。並不是所有的菠蘿蛋白酶組分都已得到鑑定，因此除了我們已描述了其活性的莖菠蘿蛋白酶，還不清楚哪一個成分負責菠蘿蛋白酶各種不同效應的哪一種。如果菠蘿蛋白酶混合物要用作藥物，這當然是主要缺點，因為儘管菠蘿蛋白酶的一個成分可能產生希望的效果，菠蘿蛋白酶混合物的某些其它成分的作用可能產生不利的副作用。
因此，如果產生特定醫學活性的菠蘿蛋白酶單獨成分可以得到分離並且單獨施用以便減少副作用的可能性，這將是有益的。
本發明涉及已從菠蘿蛋白酶混合物分離的特定組分，該組分看來至少部分地負責免疫調節和抗腫瘤活性。
本發明的組分可以用常規方法，例如層析從菠蘿蛋白酶混合物分離。高效液相層析(HPLC)適於此目的，通過快速蛋白液相層析(FPLCTM)，使用裝有諸如S-sepharose的物質的柱子可以得到特別好的菠蘿蛋白酶蛋白的分離。正如將在實施例中更詳細描述的，在S-sepharose上使用300ml以上的乙酸緩衝液中的0-0.8M氯化鈉線性梯度進行層析，本發明的蛋白是從柱上下來的第三個峰，出現在第一個主要的莖菠蘿蛋白酶峰(從柱下下來的第四個峰)的上升邊緣上。
在本發明的第一個方面中，提供了具有由SDS-PAGE測定的約27.45kDa分子量的菠蘿蛋白酶組分，它可通過下列方法得到i.將菠蘿蛋白酶溶解於pH5.0的乙酸緩衝液中；ii.通過在S-Sepharose上快流高效液相層析，用300ml以上的溶於乙酸緩衝液中的0-0.8M氧化鈉線性梯度洗脫以分離菠蘿蛋白酶組分；iii.收集對應於從柱上下來的第三個峰的組分，出現在第一個主要莖菠蘿蛋白水解酶峰的上升邊緣；並且iv.從(iii)中收集的組分分離蛋白。
本發明的菠蘿蛋白酶組分，本發明人命名為CCZ，主要負責菠蘿蛋白酶的免疫刺激活性，因為已發現其它已知的成分如莖菠蘿蛋白酶(SBP)、comosain和ananain幾乎不具有免疫刺激活性並且實際上可能作用為免疫抑制劑。本發明人已發現由本發明人命名為CCU的菠蘿蛋白酶組分具有F9具有的某些免疫調節活性，F9也包含在菠蘿蛋白酶中(Garbin等，國際腫瘤學雜誌，(1994)5，197-203)。
同樣，因為本發明的菠蘿蛋白酶組分含有比粗製菠蘿蛋白酶低得多數量的成分，所以它不可能有這麼多副作用，並且當用作藥劑時其活性可以更清楚地確定。
本發明人已知鑑定並得到了CCZ組分的主要成分的胺基酸序列。認為此蛋白負責CCZ組分的生物學活性。
因此，在本發明的第二方面，提供了作為菠蘿蛋白酶組分的蛋白，具有由SDA-PAGE測定的約27.45kDa分子量，具有由等電聚焦測定的等電點9.7，並具有胺基酸序列Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp Trp Arg Gln Lys Gly Ala ValThr Glu Val Lys Asn Arg Gly本發明的CCZ組分能作用為免疫刺激劑和抗癌劑並且認為第二方面的蛋白可能負責這些活性。例如，從WO-A-9301800可知，菠蘿蛋白酶混合物是非特異的免疫刺激劑，但是以前已假定一個已知的菠蘿蛋白酶成分，可能是莖菠蘿蛋白酶負責此活性。現已發現事實並非如此，本發明的蛋白是免疫刺激劑而莖菠蘿蛋白酶幾乎不具有免疫刺激劑活性。
在本發明另一方面，提供了具有編碼第二方面蛋白的序列或與其互補的序列的核酸。這樣的核酸的序列可使用標準方法測定。
在本發明另一方面，提供了用於人或畜醫藥的本發明第一方面的CCZ組分或根據本發明第二方面所述的蛋白。
本發明的CCZ組分的一個用途是免疫刺激劑，因此，也提供了本發明第一方面的CCZ組分和第二方面的蛋白在製備免疫刺激劑方面的用途。
因此，CCZ組分或作為其主要成分的純化蛋白可用於治療其中免疫系統受抑制的病症的方法。此方法包括給病人施用有效量的本發明第一方面的CCZ組分或第二方面的蛋白。
因為其刺激免疫反應的能力，菠蘿蛋白酶的CCZ組分具有相當大的用於其中病人無免疫應答的很多臨床情況的潛力。初級免疫缺陷是遺傳異常的結果，而次級免疫缺陷可由營養不良、感染(例如HIV和瘧疾)、腫瘤(例如淋巴瘤、骨髓瘤及其它)、創傷(例如灼傷、擊傷和手術)、醫學治療(例如用藥如類固醇、環孢菌素和環磷醯胺)、蛋白質丟失(如腹瀉和灼傷)、糖尿病和老齡引起。
免疫缺陷導致對病毒、原生動物、細菌及真菌感染的易感性提高，並且它與每年的很多死亡相關，對許多國家中相當一部分健康消費負責。
免疫反應具有兩個功能性分類先天免疫系統和獲得性免疫系統。當病原體侵入機體時，獲得性免疫反應和先天免疫反應都會活化。先天免疫反應在感染因子和大多數潛在病原體建立感染前提供針對它們的第一道防線。在先天免疫的初始階段，獲得性免疫反應正在發展。如果第一道防禦被突破，獲得性免疫系統應當充分地發展以產生針對感染因子的特異反應，特異反應在正常情況下清除此因子。
本發明的菠蘿蛋白酶組分通過刺激獲得性和先天免疫作用為免疫調節劑。
首先，它通過增強T細胞活化和增加B細胞產生的抗體來增強獲得性免疫。增強的T細胞活化將導致細胞因子如IL-2、IL-3、IL-4、幹擾素-γ(IFN-γ)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-1、IL-5、IL-6、IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)和FWF-α的產生增加。另外，此蛋白可在病原體特異的獲得性免疫反應發展所需的時間期間促進由巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)和嗜中性粒細胞介導的先天免疫反應。
先天免疫反應的刺激使菠蘿蛋白酶的CCZ組分可用於T或B細胞反應功能不完全的情況。這可發生在次生免疫缺陷如上述的那些免疫缺陷中以及由遺傳異常引起的病症如在缺乏功能性T和/或B細胞的嚴重複合免疫缺陷病人中存在的病症中。
本發明的菠蘿蛋白酶組分也可促進T細胞亞類分化並補償選擇性T細胞亞類缺陷。
T細胞分為兩個亞群，促進抗體和細胞介導的免疫反應的CD4+或「輔助」T細胞以及殺細胞的CD8+或「細胞毒性」T細胞。兩種T細胞群對於機體抵禦多種病原體是必需的，任一T細胞群的減少都將有破壞性效應。這可通過CD4+T細胞數目減少的AIDS病人對機會感染的高易感性而得到證明。
CCZ組分在另一T細胞群缺乏時刺激一個T細胞群的能力意味著它可用於治療其中一個T細胞亞群減少的病人；例如患有barelymphocyte syndrome(缺乏功能性CD8+細胞)的病人或患有MHCI類缺陷(缺乏功能性CD4+細胞)或患有諸如AIDS病人中發生的各種次生免疫缺陷的病人。
刺激後，CD4+T細胞可分化成參與細胞介導的免疫反應的Th1細胞和參與體液(抗體)介導的反應產生的Th2細胞。已知本發明的蛋白刺激T細胞並且可選擇性地影響Th1和/或Th2細胞的發生。因此它可能刺激由Th1細胞產生的細胞因子如IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF和GM-CSF介導的反應和/或由Th2細胞產生的細胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TFG-β介導的反應。
最後，CCZ組分也有刺激T細胞介導的免疫反應的潛力並因此可作用為疫苗佐劑。
除了其作為免疫刺激劑的用途，本發明人已證明CCZ組分能提高干擾素-γ介導的氧化氮(NO)的產生。因此，菠蘿蛋白酶的CCZ組分可用於治療對增加的NO產生應答的疾病或症狀。
NO及其衍生物對包括真菌、細菌和病毒的許多病原體具有強的抗微生物活性。這包括寄生蟲如baesia、Brugia、Cryptosporidium、Encephalitoxoon、entamoeba、Leishmania、Naegleria、Ochocerca、Opisthorchis、Plasmldium、Schistosoma、Toxoplasma和Trypanosom。受NO影響的細菌包括芽孢桿菌屬、布魯氏菌屬、伯克氏菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、埃裡希氏體屬、弗朗西絲氏菌屬、克雷伯氏菌屬、軍團菌屬、利斯特氏小菌屬、微球菌屬、Pseudomonas Rickettsia、沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、耶爾森氏菌屬、衣原體尤其是沙眼衣原體和分枝桿菌屬如貪食分枝桿菌、麻風分枝桿菌和結核分枝桿菌。NO具有抵抗真菌如麴黴屬、念珠菌屬、隱球酵母屬、組織孢漿菌屬和酵母屬和病毒如柯薩奇病毒、Ectomelia virus、腦心肌炎病毒、Epstein-Barr病毒、單純皰疹病素(Herpes simplex virus)、人免疫缺陷病毒I型、日本腦炎病毒、小鼠肝炎病毒、細小病毒屬、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、猿猴病毒40、牛痘病毒和水皰性口腔炎病毒的活性。
CCZ組分在增加NO產生方面的活性賦予其免疫刺激劑活性並意味著CCZ可用作針對諸如上面所列出的寄生蟲、細菌、真菌和病毒的抗微生物劑。
因此，在本發明另一方面，提供了本發明的菠蘿蛋白酶的CCZ組分或第二方面的蛋白在製備抗微生物劑方面的用途。
本發明人也發現菠蘿蛋白酶的CCZ組分具有抗腫瘤活性。多個公開文獻也將NO產生與抗腫瘤活性聯繫起來。例如，Hibbs(1991，免疫學研究142，565-569)已證明在體外，巨噬細胞產生NO時殺死腫瘤細胞。因此，NO的產生增加可能是CCZ組分針對腫瘤作用的機制。然而，CCZ作為抗癌劑的效力不依賴於此理論的正確性。
在另一方面，本發明提供CCZ組分或本發明的第二方面的蛋白在製備抗癌劑方面的用途。
CCZ組分或此蛋白可用於治療實體瘤或軟體瘤或其它腫瘤。可用本發明的蛋白治療的腫瘤的例子包括卵巢瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤。另外，此蛋白可施用於接受癌症化療的病人以保護免受機會感染。
CCZ組分或此蛋白通常在施用給病人之前經過配製，因此在本發明的另一方面，提供包含本發明第一方面的CCZ組分或本發明第二方面的蛋白及藥學上或畜醫學上可接受的賦形劑的藥物或畜醫組合物。
除了其本身作為藥劑的用途，CCZ組分或其作為主要成分的蛋白可用作疫苗佐劑，因為在施用疫苗後它刺激免疫系統產生更大量的抗體。
當用作佐劑時，CCZ組分可在疫苗施用之前或之後單獨施用。選擇性地，它可包含於疫苗組合物中。
因此，在另一方面中，本發明提供包含疫苗、菠蘿蛋白酶的CCZ組分或本發明第二方面的蛋白作為佐劑以及藥學上或獸醫學上可接受的賦形劑或載體的疫苗組合物。
菠蘿蛋白酶的CCZ組分可在人或動物疫苗中用作佐劑。此疫苗可以是針對疾病如由病毒、細菌、真菌或原生動物因子引起的疾病或諸如癌症的疾病的疫苗。選擇性地，此疫苗可以是設計來為某些其它目的例如在實驗動物中產生抗體的製劑。此蛋白也可用於設計為產生針對自身抗原的宿主系統的治療，例如在自身免疫中。
CCZ組分或此蛋白可通過多種途徑施用包括腸道如口、鼻、頰、局部或肛門施用或非腸道施用通過靜脈、皮下、肌內或腹膜內途徑。
在許多情況下，口腔途徑是優選的，因為這是常常病人發現最可接受的途徑。如果需要許多劑量的蛋白，例如當CCZ用於治療其中免疫系統受抑制的病症時，口服途徑可能是特別有用的。
如果選擇口腔施用，應該將CCZ組分或此蛋白配製成腸衣包的製劑以幫助其經過胃後仍然有效。選擇性地，可選用另外一種可口服施用的劑量形式如糖漿、配劑或被腸衣包被的硬或軟的明膠膠囊，它們任何之一者可以以腸衣包被。
然而，如果只施用單一劑量，例如當將CCZ組分或蛋白作疫苗佐劑時，用非腸道途徑將更為方便。
對非腸道施用，CCZ組分或蛋白可在去離子水或另一種藥物上可接受的溶劑或懸浮劑中製成製劑。
由臨床醫生決定給病人施用的CCZ組分或蛋白的合適劑量。然而，作為指導，合適的劑量為約0.5-20mg/kg體重。期望在大多數情況下，此劑量將為約1-15mg/kg體重，優選地1-10mg/kg體重。對於體重約70kg的人，通常劑量為約70-700mg。
本發明將參照下列實施例和附圖得到進一步描述，其中

圖1是在SP Sepharose高效介質中經陽離子交換層析後粗製菠蘿蛋白酶的紫外洗脫輪廓；圖2是，表示在SP Sepharose高效介質上經陽離子交換層析後粗製菠蘿蛋白酶組分的蛋白水解活性及其蛋白含量的曲線圖；圖3是SP Sepharose高效層析匯集的組分在4-20％T梯度膠上的SDS-PAGE，其中1-4泳道和6-9泳道分別包含組分CCT、CCV、CCX和CCZ及CCY、CCW、CCU和CCS，5和10泳道包含分子量標記；圖4表示在pH3-11梯度膠上電泳匯集的組分的等電聚焦，其中1、11和12泳道表示高IEF標記，2和13泳道表示粗製菠蘿蛋白酶，3至10泳道分別表示組分CCT、CCV、CCX、CCZ、CCY、CCW、CCU和CCS；並且圖5是表示從粗製菠蘿蛋白酶的HPLC得到的組分的比較免疫調節活性的曲線圖。CCZ和CCU提高了對T細胞依賴的抗原的B細胞，因此增強了獲得性免疫。
圖6表示了CCZ提高IFN-γ介導的巨噬細胞產生的亞硝酸鹽由此刺激了先天免疫。
圖7是一系列曲線，表示了莖菠蘿蛋白酶(SBP)和CCZ對腫瘤細胞的體外生長抑制效應。結果通過相當的蛋白數量代表。
圖8是與圖7中的曲線相似的曲線，但其中的數據被變為代表莖菠蘿蛋白酶和CCZ的相當的蛋白水解活性。
圖9是莖菠蘿蛋白酶和CCZ對CHI卵巢瘤體外生長的生長抑制活性的比較。
實施例1-菠蘿蛋白酶蛋白的純化a.材料菠蘿蛋白酶來自Solvay Enzymes Inc(德國)。快流速S Sepharose、Pharmalyfe 3-10TM、Ampholine 9-11TM、Ready Mix IEFTM(丙烯醯胺、甲叉雙丙烯醯胺)和IEFTM標記來自pharmacia Biotech。預灌制的4-20％丙烯醯胺凝膠和大範圍分子量標記來自Bio-RadLaboratories。所有其它試劑是分析級來自Sigma Chemical Co.或British Drug House。b.蛋白酶測定用合成的底物Z-Arg-Arg-pNA通過使用室內微量滴度板為基礎的測定菠蘿蛋白酶的水解活性。此測定根據Filippova等在AnalBiochem 143，293-297(1984)描述的為基礎進行。底物Z-Arg-Arg-pNA是根據Napper等在生物化學雜誌，301，727-735(1994)描述的。c.蛋白測定用Bio-Rad提供的試劑盒測定蛋白，它是Lowry等(生物化學雜誌(1951) 193，265-275)方法的改進。樣品與由0.9％鹽或20mM乙酸緩衝液pH5.0中的牛血清白蛋白標準(0-1.5mg/ml)進行比較。d.菠蘿蛋白酶的製備所有的下列步驟在室溫(20-25℃)下進行。將450mg粉末溶於15ml含0.1mmEDTA鈉的20mM乙酸緩衝液(pH5.0)中製備菠蘿蛋白酶溶液(30mg/ml)。溶液被分散在10個1.5ml微量離心管中於13.000×g離心10分鐘以去除不溶物質。匯集澄清的上清用於層析。e.快速S-Sepharose高效層析將25ml介質填充到XK 16/50TM柱中製備了S-sepharose柱(pharmacia Biotech)並用含0.1mM EDTA的20mM乙酸緩衝液(pH5.0)在FPLCTM系統上以3ml/min的速度平衡柱子。將5ml的菠蘿蛋白酶溶液加到柱上。收集未結合蛋白並用100ml乙酸緩衝液洗柱。用300ml以上的溶於乙酸緩衝液中的0-0.8M NaCl線性梯度洗脫與柱子結合的蛋白。通過整個梯度收集5ml組分，圖1表示從此方法得到的粗菠蘿蛋白酶的典型的紫外層析譜。
根據上述分析組分的蛋白和蛋白水解活性，圖2表示了對合成肽Z-Arg-Arg-pNA的蛋白水解活性及單個組分的蛋白含量。蛋白含量圖反映了u.v.圖，這與期望的一致，但主要的蛋白水解活性局限於與菠蘿蛋白酶(SBP)一致的兩個主要峰。在層析譜其它區域中觀察到的小活性可能與菠蘿蛋白酶明顯不同的其它蛋白酶相一致，如後來洗脫的Ananain和Comasain(CCS)。
從紫外模式圖確定的主要峰被從三個連續循環中匯集並根據表1所示的命名。匯集的部分用於物理化學定性。匯集的組分通過超濾濃縮，用PD10柱將緩衝液換成等滲鹽溶液(0.9％重量/體積NaCl)。在進行生物檢測前計算蛋白濃度和Z-Arg-Arg-pNA活性，示於表2。
根據下文所述對匯集組分進行分析。
表1 從SP Sepharose HP分級分離的菠蘿蛋白酶(QC2322)的匯集組分總結
表2用於檢測生物學活性的匯集的組分的計算蛋白含量和Z-Arg-Arg-pNA活性
f匯集組分的加工測定匯集組分的蛋白水解活性和蛋白含量，用含有最小排阻分子量10kDa的超濾膜的FiltronTM攪拌水室調節濃度至約1.4mg/ml蛋白或105nmoles/min/ml蛋白活性。然後用PD10TM柱(Pharmacia Biotech)將組分緩衝液換成等滲鹽(0.9％wv/Nacl)，無菌過濾(0.2μm)，然後調節蛋白含量或蛋白水解活性。將樣品凍存於-20℃，並用Jerne Hemolytic Plaque Assay檢測免疫調節活性。g十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)在預製的4-20％T梯度凝膠上分析匯集的FPLCTM樣品。將100μl樣品與等體積的20％w/v三氯乙酸(TCA)混合通過酸沉澱製備用於電泳的樣品。以13,000xg離心10分鐘收集沉澱的蛋白，棄去上清。用0.5ml二乙醚洗滌沉澱兩次，室溫下空氣中乾燥沉澱。將沉澱溶解於300μlSDS-PAGE樣品緩衝液中(62.5mM Tris-HclpH68含10％v/v甘油、2％w/v十二烷基磺酸鈉和40mM二硫蘇糖醇)並在水浴中於95℃加熱。
SDS-PAGE大範圍分子量標準以1∶20於SDS-PAGE樣品緩衝液中稀釋經過相似的處理後與樣品同時電泳。根據Bio-Rad’s說明書以240V在微型Protean IITM電泳系統上進行凝膠電泳，直到染色前沿到達凝膠底端(30-45分鐘)。
電泳結束後，分離的蛋白在軌道混合器上於含0.075％w/v膠體亮藍G-250、1.5％v/v磷酸、11.25％w/v硫酸銨和25％v/v甲醇的溶液染色過夜。在含有25％v/v甲醇和10％v/v乙酸的溶液中對凝膠進行脫色以得到清楚的背景。結果組分的純度通過SDS-PAGE示於圖3。除了柱流過(CCT)以外的所有匯集的組分表明存在的主要蛋白的分子量約25-28KDa。這與由其他作者從菠蘿蛋白酶分離到的半胱氨酸蛋白酶的分子量相一致(Rowan等，酶學方法；(1994)，244，555-568)。組分CCX、CCZ、CCY和CCW的純度看上去很高。在某些組分中可觀察到低分子量的次要組分，特別是CCT、CCV、CCX和CCS中。匯集的CCU和CCS組分中包含25-28KDa的雙重線；較高的CCX、CCZ、CCY和CCW的凝膠上樣意味著雙重線帶可能也存在於這些組分中。組分及其由SDS-PAGE測定的匯集組分的計算的分子量的概括示於表3。
匯集的CCX、CCZ、CCY+CCW和CCU組分中的蛋白經SDS-PAGE後被Western印跡轉移至硝酸纖維素膜並用針對純化的莖菠蘿蛋白酶蛋白(SBP)的免抗血清進行探測(結果未顯示)。匯集的組分中的所有蛋白帶都被血清中的抗體識別，表明免疫性相似的蛋白也許屬於半胱氨酸蛋白酶家族。表3存在於SP Sepharose HP匯集的組分中的蛋白根據SDS-PAGE測定的分子量總結
h等電聚集匯集的組分(0.5-1.0mg/ml)以1∶3稀釋於去離子水中並在pH3-11的梯度凝膠上進行電泳。用Ready Mix IEFTM灌制凝膠產生含有10％v/v甘油、5.0％Phrmalyfe 3-10TMt 2.5％Ampholine 9-11TM的5.5％T、3％C的聚丙稀醯胺凝膠。在700V預聚集後，10μl樣品和高pI標記被加到凝膠上。500V電泳10分鐘使樣品進入，2500V電泳1.5小時進行聚焦，3000V電泳10分鐘使條帶變細。電泳後，蛋白在含有20％W/V TCA的溶液中固定30分鐘，在脫色液中洗30分鐘以去除TCA，根據SDS-PAGE部分描述的(見上文)，用亮藍G-250進行染色。結果圖4表示除CCX外所有組分包含9.3pI標記之外聚焦的鹼性蛋白。與層析介質功能基團的局部電荷相互作用可解釋為什麼CCX中pI3.8和3.85的蛋白在pH5.0時吸附到陽離子交換樹脂上。CCZ在pI9.7處表現出一條單一的帶，而匯集的CCY、CCW和CCU組分包含在pH9.5-9.8範圍內的多條等電點帶。至少這種異源性部分可由共同的莖菠蘿蛋白酶主鏈上碳水化合物部分的差異解釋。此值與文獻中報導的菠蘿蛋白酶的pI9.45-9.55相一致(Rowan等，酶學方法，(1994)，244，555-568)。匯集的CCS組分包含兩個pI大於10.25的鹼性蛋白。外推估計pI為10.4和10.45。這相當於ananain和comasain，並且與其它的(Rowan等，上述)pI大於10的估計一致。在每一個匯集的組分的蛋白質pI概括於表4。表4SP Sepharose HP匯集組分中存在的蛋白的估計等電點總結
i Western印跡根據廠商說明，用TransblotTM儀器(Bio-Racl)以100V在Towbin緩衝液中轉移1小時將按上述SDS-PAGE電泳的樣品轉移至硝酸纖維素膜上(0.45μm孔徑)。蛋白轉移後，用蒸餾水洗膜然後在60℃培養箱中乾燥過夜。乾燥後，膜在含有500mM Nacl(Tris緩衝液)的20mM Tris-HCl(pH7.5)的1％BSA溶液中封閉30分鐘，然後用Tris緩衝液將膜洗兩次，每次10分鐘。然後用含0.05％v/v Tween20TM的Tris緩衝液中含有的以1∶50稀釋的抗菠蘿蛋白酶抗血清(兔)探測膜2小時。用包含Tween20TM的Tris緩衝液洗膜3次並用抗兔辣根過氧化物酶與膜孵育2小時後對印跡顯色。通過與四氯荼酚物溫育觀察免疫反應條帶。
實施例2-CCZ蛋白的N端胺基酸分析在一個單獨的實驗中，匯集的CCZ組分進行SDS PAGE電泳，按上述方法轉移至PVDF膜上。用0.025％w/v考馬斯藍R-250對膜染色，在40％v/v甲醇中溶解10分鐘，然後在50％v/v甲醇中脫色。膜在室溫下空氣乾燥，然後對染色的蛋白進行N-端胺基酸序列測定。簡單地，將蛋白帶從膜上切下放在測序儀的上半部分用裝配有聯機乙內醯苯硫脲胺基酸分析儀的氣相測序儀(Applided Biosystems)，通過Edman降解進行CCZ蛋白N-端胺基酸分析。表5CCZ蛋白與已知的從菠蘿蛋白酶分離的蛋白酶N端序列的相似性
所有蛋白具有序列同源性。與莖菠蘿蛋白酶相比，Ananain和Comasain在20個胺基酸中只有2個不同。相反，與莖菠蘿蛋白酶相比，CCZ中的21個胺基酸有8個不同。CCZ與ananain和comasain的20個胺基酸中有6個不同。儘管很明顯這些蛋白是結構相關的，但是CCZ蛋白是最不同的，表明與從菠蘿蛋白酶分離的其它蛋白酶有明顯差異。CCZ代表粗製菠蘿蛋白酶提取物中以前未知的新型蛋白，看來它是植物半胱氨酸蛋白酶家族的新成員。實施例3-分析分級分離的蛋白的免疫調節活性a材料雌性BAL B/A小鼠來自A.Tuek和Son Ltd.(UK)。在所有實施中採用8-10周齡之間的小鼠。Alsevers溶液中的綿羊紅血細胞(SRBC)購自TCS Biologicals(Buckingham，UK)。脈鼠補體購自Gibco Laboratories。其它試劑均為分析級，購自SigmaChemical Co。b Jerne溶血板實驗Jerne溶血板實驗(Weir，D.M.(編輯)，1986，實驗免疫學手冊，1-4，第4段，Blackwell Scientific Publications，OxfordUK)用於分析分級分離蛋白的佐劑潛力。實驗用兩次單獨製備的菠蘿蛋白酶分級分離樣品進行。每一個樣品有一個獨特的編號(表1)，如果適合，通過超濾(見實施例1(f))將樣品滲濾濃縮到等滲鹽溶液中。所有的實驗以雙盲方式進行。
根據表6所示，用粗製菠蘿蛋白酶、分級分離的蛋白或鹽溶液靜脈注射小鼠一次。粗製菠蘿蛋白酶(200μg；1500μmoles/min/ml)被懸浮於0.9％(200μl)鹽溶液中並在施用前立即過濾除菌。分級分離樣品(200μl)同樣地過濾除菌。用滅菌鹽溶液處理的小鼠用作對照。1500μmoles/min/ml粗製菠蘿蛋白酶的劑量速度相當於Sigma Aldrich Ltd的Materials Safety Datasheet所給出的菠蘿蛋白酶LD50的約三分之一。在施用粗製菠蘿蛋白酶、分級分離蛋白或鹽溶液後，通過腹膜內注射綿羊紅血細胞(SRBC)(100μl；107細胞)免疫小鼠。用鹽溶液(100μl)單獨處理的小鼠作為陰性對照。免疫後3天處死小鼠，在這個時候取出脾並通過尼龍網濾器過濾分離脾細胞。用Jerne溶血板實驗測定產生針對SRBC抗原抗體的B細胞的數目(即每106脾細胞的蝕斑形成細胞(PFC)。c數據分析以平均數±標準差表示數值。用獨立t-檢驗(斯氏t檢驗；2-向)檢驗PFC平均數之間的差異。當一個以上的處理的平均數與對照相比時，採用方差分析(ANOVA)。d結果Jerne溶血板實驗結果示於圖5和表6。表6PFC形成(分泌針對SRBC抗體的B細胞數目)
與鹽溶液對照相比，粗製菠蘿蛋白酶(QC2322)的施用導致了PFC的明顯增加(菠蘿蛋白酶PFC/106脾細胞，68±47；鹽溶液對照，29±7；P＜0.05)。分級分離的蛋白CCZ和CCU也誘導比鹽溶液對照明顯高的PFC(分別為102±31和86±31PFC/106脾細胞；P＜0.002)，比粗製菠蘿蛋白酶提取物產生的PFC多。CCZ和CCU成分與描述詳盡的莖菠蘿蛋白酶、comosain、ananain和F9酶從FPLCTM柱的洗脫不同，表明CCZ和CCU是不同的分子。當檢測純化的莖菠蘿蛋白酶(CCW和CCY成分的聯合)的佐劑效應時，結果顯示很小的PFC增加(46±29PFC/106脾細胞)表明莖菠蘿蛋白酶不是負責菠蘿蛋白酶佐劑活性的成分。相似地，ananain和comosain(CCS)也具有很小的免疫調節活性。所以，粗菠蘿蛋白具有很小的佐劑效應並不歸因於原來認為具有免疫用的粗製混合物的成分。某些檢驗的成分有比對照高的PFC(與莖菠蘿蛋白酶相似)，但這些值沒有明顯的不同。這些成分及莖菠蘿蛋白酶中觀察到的PFC的輕微升高與以前將胰蛋白酶施用於小鼠時觀察到的相似，反應或許應歸功於非特異的蛋白水解效應。實施例4-CCZ提高巨噬細胞產生硝酸鹽，所以能刺激先天免疫反應實施例3表明CCZ通過增強對T細胞依賴抗原的B細胞反應提高獲得性免疫反應。我們下一步通過探討其對參與先天免疫的主要細胞群，巨噬細胞的效應探討CCZ是否能增強先天免疫。
對細胞內寄生蟲的主要的宿主防禦機制是巨噬細胞產生氧化氮(NO)。所以，我們探討了是否CCZ能夠影響NO產生。a材料用重組IFN-γ(100u/ml)刺激培養的鼠巨噬細胞系RAW264。用Greiss實驗(Roach等(1991)，感染與免疫，59，3935-3944)測定培養上清中的硝酸鹽水平。b方法用CCZ(50μg/ml)、粗製菠蘿蛋白酶(50μg/ml)或莖菠蘿蛋白酶(50μg/ml)處理或以鹽溶液模擬處理RAW264巨噬細胞。然後洗細胞三次去除處理劑並用IFN-γ刺激細胞。
c結果粗製菠蘿蛋白酶和CCZ，而不是莖菠蘿蛋白酶顯著提高IFN-γ介導的硝酸鹽產生(圖6)。在CCZ處理的細胞中，IFN-γ硝酸鹽產生增加比鹽溶液處理細胞明顯高，表明CCZ與IFN-γ協同作用提高NO產生。當用CCZ或菠蘿蛋白酶單獨刺激巨噬細胞時，幾乎不產生硝酸鹽，提示CCZ和莖菠蘿蛋白酶都不能刺激硝酸鹽產生。為了保證已經存在於CCZ混合物中的可能汙染的內毒素負責NO的提高，實驗中包含了多粘菌素B(內毒素的強有力的抑制劑)。多粘菌素B的包含並不影響IFN-γ誘導的CCZ處理細胞中NO的產生，暗示可能汙染的內毒素不負責觀察到的效應(數據未顯示)。
考慮到氧化氮產生對於宿主對細胞內病原體抵禦的重要性，CCZ刺激巨噬細胞特定產生這種代謝物的能力暗示它可控制多種細胞內感染。實施例5-菠蘿蛋白酶片段對一系列人腫瘤細胞系的體外生長抑制。
除了在宿主對感染防禦中的關鍵作用外，NO也表明是強有力的殺腫瘤細胞劑。Hibbs(1991，免疫學研究，142，565-569)已表明當巨噬細胞產生NO時，它們在體外殺死腫瘤細胞。因此氧化氮在腫瘤治療中可能有用(Sagar等，(1995)，腫瘤治療綜述，21，159-181)。因此，我們研究(CCZ是否能夠在體外阻斷幾種不同人腫瘤細胞系的生長並因此作用為抗癌劑。測定了CCZ蛋白和莖菠蘿蛋白酶對代表五種最常見人實體瘤十五種人腫瘤細胞系的比較生長抑制特性卵巢瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。
消化細胞系並將單個活細胞以每孔4×103的密度用160∶1生長培養基接種於96孔微量滴定板上。貼壁培養過夜後，將CCZ、SBP或菠蘿蛋白酶加到四個孔的生長培養基中，得到孔中的終濃度範圍為50、10、2.5、1和0.25g/ml。8個孔作為未處理細胞對照。在加到孔中之前立即用無菌水稀釋提取物。根據以前描述的(Kelland等於，癌症研究，53，2581-2586(1993))，抽提物暴露96小時後，用溶於1％乙酸中的0.4％硫氰酸鹽染色以測定每個孔中的細胞數目。從濃度比％對照吸光度(在540nm處讀)曲線上計算50％抑制濃度(IC50以g/ml)。結果提取物被成功地溶解，IC值示於圖7。
從圖7中看出，CCZ蛋白在體外表現出對所有細胞系的能力與QC2322(粗製菠蘿蛋白酶)和莖菠蘿蛋白酶的相當。CCZ對所有15個系表現的平均IC50為11.9μg/ml，對SKOV-3(卵巢瘤)、LOVO(結腸癌)、MDA231(乳腺癌)、MDA361(乳腺癌)和MOR(肺癌)的活性普遍較低。
在此實施例中所用的方法依賴於檢測吸附於微量板孔上的細胞。用菠蘿蛋白酶組分處理後對細胞染色測定生長抑制活性。死的或將要死的細胞從孔上脫離下來從而不被染色。用高濃度的酶如胰蛋白酶處理也能使細胞從孔上下來；一種被稱為「胰酶消化」的方法。因此，CCZ和菠蘿蛋白酶的生長抑制活性由於蛋白水解活性使細胞從孔上非特異的移下來導致的而不是這些組分的特異的「抗腫瘤」效應。
鑑於此，圖7中給出的結果調整每一組分的蛋白水解活性。調整的結果示於圖8。
用這種解釋，從圖8看出得到了有些不同的結果分析。一旦考慮到每一組分的蛋白水解活性，可以看出CCZ比粗製菠蘿蛋白酶或莖菠蘿蛋白酶明顯更高的抗癌活性。
為了證實CCZ的確具有生長抑制活性，粗製菠蘿蛋白酶、莖菠蘿蛋白酶和CCZ被稀釋成包含有相當量的蛋白水解活性(5.7μmoles/min/nl)並檢測其阻止CH1卵巢瘤生長的能力。圖9證實CCZ的確比粗菠蘿蛋白酶或莖菠蘿蛋白酶更強有力的生長抑制活性。
權利要求
1.一種菠蘿蛋白酶組分，具有由SDS-PAGE測定的約27.45KDa的分子量，並可通過下列方法得到i.將菠蘿蛋白酶溶解於pH5.0的乙酸緩衝液中；ii.通過在S-Sepharose上快流高效液相層析，用300ml以上的溶於乙酸緩衝液中的0-0.8M氧化鈉線性梯度洗脫以分離菠蘿蛋白酶組分；iii.收集對應於從柱上下來的第三個峰的組分，出現在第一個主要莖菠蘿蛋白水解酶峰的上升邊緣；並且iv.從(iii)中收集的組分分離蛋白。
2.一種是菠蘿蛋白酶成分的蛋白，具有由SDS-PAGE測定的約27.45KDa分子量，具有由等電聚焦測定的等電點9.7，並具有氨基端序列Val-Leu-Pro-Asp-Ser-Ile-Asp-Trp-Arg-Gln-Lys-Gly-Ala-Val-Thr-Glu-Val-Lys-Asn-Arg-Gly。
3.具有編碼如權利要求2中所述的蛋白的序列或與其互補序列的核酸。
4.如權利要求1或權利要求2中所述的菠蘿蛋白酶組分或蛋白；用於人或獸醫藥。
5.如權利要求1或權利要求2中所述的菠蘿蛋白酶組分或蛋白，用作免疫刺激劑。
6.如權利要求1或權利要求2中所述的菠蘿蛋白酶組分或蛋白在製備免疫刺激劑方面的用途。
7.如權利要求6中所述的菠蘿蛋白酶組分或如權利要求6中所述的蛋白的用途，其中免疫刺激劑用於治療初級免疫缺陷或由營養不良、感染(例如HIV和瘧疾)、腫瘤(例如淋巴瘤、骨髓瘤及其它)、創傷(例如灼傷、擊傷和手術)、醫學治療(例如用藥如類固醇、環孢菌素和環磷醯胺)、蛋白丟失(如腹瀉和灼傷)、糖尿病和老齡導致的次級免疫缺陷。
8.如權利要求7中所述的蛋白或用途，其中的免疫刺激劑是疫功佐劑。
9.如權利要求1中所述的菠蘿蛋白酶組分或如要利要求2中所述的蛋白，用作抗微生物劑。
10.如權利要求1或權利要求2中所述的菠蘿蛋白酶組分或蛋白在製備抗微生物劑方面的用途。
11.如權利要求1中所述的菠蘿蛋白酶組分或如權利要求2中所述的蛋白，用作抗癌劑。
12.如權利要求1或權利要求2中所述的菠蘿蛋白酶組分或蛋白在製備抗癌劑方面的用途。
13.如權利要求11中所述的蛋白或如權利要求12中所述的用途，其中抗癌劑用於治療卵巢瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤。
14.一種藥物或獸醫組合物，包含權利要求1的菠蘿蛋白酶組分或權利要求2的蛋白及藥學上或獸醫上可接受的賦形劑。
15.一種疫苗組合物，包含疫苗、含有權利要求1的菠蘿蛋白酶組分或權利要求2的蛋白的佐劑及藥學上或獸醫上可接受的賦形劑或載體。
16.如權利要求14或權利要求15中所述的組合物，配製成用於腸道如口、鼻、頰或肛門施用。
17.如權利要求14或權利要求15中所述的組合物，配製成用於非腸道施用，例如通過靜脈內、皮下、肌內或腹膜內途徑。
全文摘要
一種新的菠蘿蛋白酶成分是免疫刺激劑、抗微生物劑和抗癌劑。它可用於治療免疫系統受抑制的病症或作為疫苗佐劑或可用於治療實體瘤或軟體瘤或其它腫瘤。
文檔編號A61P37/08GK1249002SQ9880282
公開日2000年3月29日 申請日期1998年2月25日 優先權日1997年2月25日
發明者T·L·邁諾特, C·恩格沃達, K·皮克 申請人:科特克斯(英國)有限公司