基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方法
2023-10-18 06:34:39 2
專利名稱：基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程技術領域的用於電泳的樣品製備方法，特別是一種 基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方法。
技術背景電泳技術就是利用在電場的作用下，由於待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑑定或提純的技術。己經被廣泛地應用於分析化學、生物化學、臨床化學、毒劑學、藥理學、免疫學、微生物學、食品化學等各個領域。電泳的 解析度是最重要的指標之一。毛細管電泳技術，又稱高效毛細管電泳或毛細管分離法，是在電泳技術的基 礎上發展的一種分離技術。其基本原理是根據在電場作用下離子遷移的速度不同 而對組分進行分離和分析，以兩個電解槽和與之相連的內徑為20 100wm的毛 細管為工具，其內填充有交聯的聚丙烯醯胺凝膠或聚二甲基丙烯醯胺、線性聚丙 烯醯胺、聚環氧乙烯等聚合物作為分離介質。基於毛細管電泳原理的測序儀是一種重要的DNA分析手段，常規的測序儀一 般每次讀取DNA序列的長度為500個鹼基(nt)左右，並且對複雜序列(如GC 重複序列，單串聯序列等)往往測序質量很差，得到的序列很短，甚至根本得不 到有效結果。如何提高測序的長度以及測序的質量不僅決定了測序的成敗，而且 直接關係到測序成本的高低。近年來，在毛細管電泳中的分離介質中加入各種添加劑以改善其篩分能力、 粘度和自塗敷功能是最常用且非常有效的手段。經對現有技術的文獻檢索發現，Zhou等在《Electrophoresis》(電泳)(2007 年28期1072-1080頁)上發表的"Novel quasi-interpenetrating network/glod nanoparticles composite matrices for DNA sequencing by CE，，(用於毛細 管電泳DNA測序的新型準互穿聚合物網絡/金納米粒子複合介質)，該文中提出含有膠體金粒子的溶液作為分離介質來分離DNA片段和測序，具體方法為將具 有自塗敷功能的準互穿聚合物網絡與膠體金混合，得到準互穿聚合物網絡/金納 米粒子複合介質，來分離DNA片段和測序，具有快速，分離能力高，重複性好等 特點。其不足在於要經過複雜的化學方法將膠體金粒子引入到用於麗A分離的聚合物中製備複合介質，還要將其事先裝如毛細管中。不僅製備過程複雜，而且 在使用過程中不能根據使用目的進行調整和改變。 發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種基於納米顆粒提高電泳分 辨率與測序質量的方法。本發明可以提高電泳的解析度和毛細管電泳測序質量與有效測序長度。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明在上樣過程中在樣品或上樣緩衝液中添加膠體金， 一方面，膠體金粒子可與單鏈DNA分子結合，不僅可以富集 DNA分子，而且可以增加DNA移動的速度；另一方面，膠體金粒子在毛細管中的 聚合物網絡中形成交鏈點，從而增強了分離的有效性。通過使用不同直徑和濃度 的膠體金使有效測序長度和質量達到最佳。所述膠體金，其粒徑為5 nm 60 nm,用量為0. 001 nmol/L 1 nmol/L。 所述膠體金，其粒徑為10 nm時，用量為O. 1 nmol/L 1 nmol/L。 所述膠體金，其粒徑為20 nm時，用量為0. 03 0. 4 nmol/L。 所述膠體金，其粒徑為30 nm 60咖時，用量範圍為0.001 nmol/L 0. 03 nmol/L。所述的膠體金，可以是商業購買的，也可以是自行製備的，製備可以有多種 方法，如白磷還原法、檸檬酸納還原法、檸檬酸納一鞣酸還原法都可用於製備膠 體金。例如參照Freas在1973年創立的檸檬酸三納還原法，先將0. 01 %的HAuCl4 溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三納水溶液，開始是藍色，再加熱 出現紅色，煮沸7 10min出現透明的橙紅色即可，所有溶液採用滅菌後純水配 置。對粒徑大小沒有限制，使用前不需稀釋。本發明積極進步的效果在於本發明使用簡單，應用廣泛，對電泳有顯著增 效效果等優點。具體表現在，1)與目前所使用的將膠體金製備成複合介質的方 法相比，本發明的方法極為簡單，使用方便，可根據實際需要使用不同大小和/ 或濃度的金納米顆粒以實現不同的測序目的；2)本發明可以應用於任意廠家和型號的測序儀上，並且提高測序長度為100 1000 nt，從而可降低測序價格20% 以上。3)本發明可以明顯改善富含GC等DNA複雜序列的測序效果。
圖1在上樣樣品中加入10 nm膠體金(終濃度為0.34 nmol/L)後的DNA測序圖譜。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案 為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護 範圍不限於下述的實施例。下面以在毛細管電泳(DNA測序儀)為例來說明本發明的方法與效果。實施例11) 按常規方法製備測序模板與測序反應以及其它上樣前的準備；2) 每一樣品加入上樣緩衝液8 PL，分別加入終濃度為0. 34 nmol/L，粒徑 為10咖的膠體金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，離心，將上樣緩衝液和 膠體金溶液甩至管底，則在加樣孔中的樣品為待測序樣品、上樣緩衝液和膠體金 的混合物。然後將樣品放進MegaBACE DNA測序儀中進行測序。3) 以測序軟體輸出測序圖譜並對有效測序長度和測序質量進行打分評價， 如圖1所示，加入膠體金的樣品有效測序長度為740 nt (測序儀給出的測序圖 讀長為755 nt)，測序質量評分98分。而不加膠體金樣品的有效測序長度為55 nt(測序儀給出的測序圖讀長為282 nt，之後無信號)，評分78。本實施例中膠體金的直徑為10 nm;本實施例中的膠體金濃度為0.34 nmol/L。本實施例中的是從Sigma購買的膠體金。本實施例中的膠體金可以添加在樣 品中。本實施例中的使用是MegaBACE DNA測序儀。對於其它序列的DNA也可以 採用上述方法提高有效測序長度與測序質量評分。實施例21) 按常規方法製備測序模板與測序反應以及其它上樣前的準備；2) 每一樣品加入上樣緩衝液8叱，分別加入終濃度為0. 26 nmol/L，粒徑 為20 nm的膠體金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，離心，將上樣緩衝液和膠體金溶液甩至管底，則在加樣孔中的樣品為待測序樣品、上樣緩衝液和膠體金 的混合物。然後將樣品放進MegaBACE DNA測序儀中進行測序。3)以測序軟體輸出測序圖譜並對有效測序長度和測序質量進行打分評價， 結果顯示在上樣樣品中添加膠體金較未添加膠體金進行測序的處理其有效測序 長度增加，質量評分也明顯提高。本實施例中膠體金的直徑為20 nm;本實施例中的膠體金濃度為0.26 nmol/L。本實施例中的膠體金是從Sigma商業購買的。膠體金可以添加在樣品中。本 實施例中的使用是MegaBACE DNA測序儀。對於其它序列的DNA也可以採用上述 方法提高有效測序長度與測序質量評分。實施例31) 按常規方法製備測序模板與測序反應以及其它上樣前的準備；2) 每一樣品加入上樣緩衝液8化，分別加入終濃度為0. 02 nmol/L，粒徑 為30 nm的膠體金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，離心，將上樣緩衝液和 膠體金溶液甩至管底，則在加樣孔中的樣品為待測序樣品、上樣緩衝液和膠體金 的混合物。然後將樣品放進MegaBACE DNA測序儀中進行測序。3) 以測序軟體輸出測序圖譜並對有效測序長度和測序質量進行打分評價， 結果顯示在上樣樣品中添加膠體金較未添加膠體金進行測序的處理其有效測序 長度增加，質量評分也明顯提高。本實施例中膠體金的直徑為30 nm;本實施例中的膠體金濃度為0.02 咖ol/L。本實施例中的膠體金是從Sigma商業購買的。膠體金可以添加在樣品中。本 實施例中的使用是MegaBACE DNA測序儀。對於其它序列的DNA也可以採用上述 方法提高有效測序長度與測序質量評分。實施例41) 按常規方法製備測序模板與測序反應以及其它上樣前的準備；2) 每一樣品加入上樣緩衝液8叱，分別加入終濃度為0. 005 nmol/L，粒 徑為60 nm的膠體金溶液(Sigma公司)，用普通膜封口，離心，將上樣緩衝液和膠體金溶液甩至管底，則在加樣孔中的樣品為待測序樣品、上樣緩衝液和膠體 金的混合物。然後將樣品放進MegaBACE DNA測序儀中進行測序。3)以測序軟體輸出測序圖譜並對有效測序長度和測序質量進行打分評價， 結果顯示在上樣樣品中添加膠體金較未添加膠體金進行測序的處理其有效測序 長度增加，質量評分也明顯提高。本實施例中膠體金的直徑為60 nm;本實施例中的膠體金濃度為0.005 皿ol/L。本實施例中的膠體金是從Sigma商業購買的。膠體金可以添加在樣品中。本 實施例中的使用是MegaBACE DNA測序儀。對於其它序列的DNA也可以採用上述 方法提高有效測序長度與測序質量評分。
權利要求
1、一種基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方法，其特徵在於，通過在上樣過程中將膠體金添加到樣品或上樣緩衝液中，一方面膠體金粒子與單鏈DNA分子結合，富集DNA分子且增加DNA移動的速度，另一方面，膠體金粒子在毛細管中的聚合物網絡中形成交鏈點，從而增強了分離的有效性。
2、 根據權利要求1所述的基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方 法，其特徵是，所述膠體金，其粒徑為5 nm 60 nm，用量為0. 001 nmol/L 1 nmol/L。
3、 根據權利要求1所述的基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方 法，其特徵是，所述膠體金，其粒徑為10 nm，用量為0. 1 nmol/L 1 nmol/U
4、 根據權利要求1所述的基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方法，其特徵是，所述膠體金，其粒徑為20 nm，用量為0.03 0.4 nrool/L。
5、 根據權利要求1所述的基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方 法，其特徵是，所述膠體金，其粒徑為30 nm 60 nm，用量範圍為0. 001 nmol/L 0.03廳1/L。
全文摘要
本發明涉及一種生物工程技術領域的基於納米顆粒提高電泳解析度與測序質量的方法。本發明通過在上樣過程中將膠體金添加到樣品或上樣緩衝液中，一方面膠體金粒子與單鏈DNA分子結合，富集DNA分子且增加DNA移動的速度，另一方面，膠體金粒子在毛細管中的聚合物網絡中形成交鏈點，從而增強了分離的有效性。所述膠體金，其粒徑為5nm～60nm，用量為0.001nmol/l～1nmol/l。本發明具有優化電泳的顯著效果，製備簡單，應用廣泛等優點。
文檔編號G01N27/447GK101221148SQ200810033000
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月24日 優先權日2008年1月24日
發明者呂軍鴻, 李雪玲, 鈞 胡 申請人:上海交通大學