一種原卟啉‑鋅鋁水滑石複合物及其製備方法和應用與流程

2023-10-18 19:00:49 2

本發明屬於無機-有機複合功能材料和藥物緩控釋領域，具體涉及一種具有緩釋作用的原卟啉-鋅鋁水滑石複合物及其製備方法與應用。

背景技術：

原卟啉鈉(protoporphyrinsodium，prolmon，napp)，化學名為3,7,12,17-四甲基-8,13-二乙烯基-2,18-卟吩二丙酸鈉，又名保肝能，是從健康牛、豬血液中提製得到的原卟啉(protoporphyrinix)的水溶性鈉鹽。原卟啉鈉是一種常用的保肝藥，具有促進細胞組織呼吸，改善蛋白質和糖代謝，抗補體結合等作用。臨床用於各型病毒性肝炎的治療，可使症狀改善，肝腫縮小，氨基轉移酶、濁度試驗、黃疽指數等指標改善。

水滑石，又稱為層狀雙羥基複合金屬氧化物(layereddoublehydroxide，)，是具有獨特層狀結構的無機二維材料。水滑石其組成可表達如下：

[(m2+)1-x(m3+)x(oh)2]x+(an-)x/n·mh2o

上式中，二價金屬離子m2+可以是mg2+、ni2+、co2+、zn2+、cu2+等；三價金屬離子m3+可以是al3+、fe3+、cr3+等；an-是層間可交換的陰離子，包括無機陰離子(co32-、no3-、so42-或cl-)、有機陰離子和雜多陰離子；x值為0.16～0.33，對應於二價陽離子m2+與三價陽離子m3+的比率為4：1～2：1；m表示層間的水分子的數目。本發明所使用的是鋅鋁水滑石。鋅鋁水滑石在甲醯胺中可以被剝離成帶正電荷的二維平面納米片。

原卟啉鈉分子結構中含有coo-，為離子型化合物，在胃中質子化轉化為分子化合物後才能被人體吸收。但是弱酸性藥物對胃都有比較強的刺激性，如阿司匹林、布洛芬等，原卟啉鈉也具有胃酸刺激副作用。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種原卟啉-鋅鋁水滑石複合物及其製備方法和應用。原卟啉-水滑石複合物可作為原卟啉口服緩釋製劑，該緩釋製劑不但能夠克服原卟啉的胃酸刺激副作用，並可以有效地原卟降低啉光毒性。

為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：

本發明所提供的原卟啉-鋅鋁水滑石複合物由鋅鋁水滑石和原卟啉組成，兩者之間存在靜電相互作用，原卟啉吸附鋅鋁水滑石表面；原卟啉的重量含量為0.01-50％。水滑石(包括其類似物)，為層狀雙羥基複合金屬氧化物，是具有層狀結構的無機二維材料。本發明用到的水滑石是鋅鋁水滑石，並且層間陰離子為no3-，其組成為：[zn1-xalx(oh)2]x+(no3-)x·mh2o,x值為0.16-0.33，m值為0.5-2。

原卟啉(protoporphyrinix)，是帶有陰離子取代基的卟啉配合物。原卟啉及其水溶性鈉鹽原卟啉鈉結構如下：

本發明所述的原卟啉-鋅鋁水滑石複合物的製備方法，包括以下步驟：

(1)製備鋅鋁水滑石：配製鋅離子和鋁離子的混合鹽溶液、鹼液以及含有硝酸根離子的水溶液；所述混合鹽溶液中鋅離子和鋁離子的摩爾比為2:1，所述鹼液中氫氧根離子的物質的量為鋅離子和鋁離子物質的量之和的2倍；

在溫度15-30℃，氮氣保護及攪拌條件下，將上述混合鹽溶液和鹼液同時滴入到含有硝酸根離子的水溶液中，滴加完畢後升溫至50-70℃，老化1-3h，老化完畢將反應液倒入高溫高壓反應釜中，在110-130℃下水熱反應6-12h得到粗產品，所述粗產品通過離心、洗滌、乾燥後，得到硝酸根型鋅鋁水滑石；

(2)剝離鋅鋁水滑石獲得納米片凝膠：將上述硝酸根型鋅鋁水滑石加入甲醯胺溶液中，超聲溶脹15-35min得到混合液，然後再將混合液在冰浴中(控制混合液溫度不超過30℃)用超聲波粉碎機強力超聲15-35min，所得透明溶液靜置後形成無色鋅鋁水滑石納米片凝膠；

(3)製備原卟啉-鋅鋁水滑石複合物：將原卟啉鈉溶於無水乙醇中，用naoh溶液調節體系表觀ph為10，得到溶液a；

將步驟(2)得到的鋅鋁水滑石納米片凝膠溶於甲醯胺中，得到溶液b；

在溫度15℃-30℃，氮氣保護下，將溶液a滴加到溶液b中，升溫至40-50℃，繼續攪拌反應1-2h，產物通過離心、洗滌、乾燥處理後，即得原卟啉-鋅鋁水滑石複合物。

進一步，所述步驟(2)，硝酸根型鋅鋁水滑石與甲醯胺的比例為1000毫克∶40-60毫升。

所述步驟(3)，溶液b中鋅鋁水滑石納米片凝膠與甲醯胺的體積比為1∶3。

本發明製備的原卟啉-鋅鋁水滑石複合物在水溶液中的粒度為180-300nm。

本發明採用以上技術方案，利用原卟啉陰離子與水滑石之間的靜電相互作用，構建了一種新穎的原卟啉-水滑石複合物，發現原卟啉-水滑石複合物可作為原卟啉在胃部吸收的緩釋製劑，該緩釋製劑不但可克服原卟啉的胃酸刺激副作用，並可以有效地降低其光毒性，具有顯著的臨床應用價值。

本發明的顯著優點在於：

(1)製備鋅鋁水滑石的原材料價格低廉，來源豐富。

(2)製備過程操作簡便，重現性高。鋅鋁水滑石及其在甲醯胺中剝離所得的凝膠，性質穩定，便於儲存，有利於在工業生產中大批量製備。

(3)水滑石類化合物通常都有很小的比表面積(5-20m2/g)。本發明將鋅鋁水滑石在甲醯胺中剝離成帶正電荷，有二維平面屬性的納米片，可以有效地提高其比表面，進而提高鋅鋁水滑石與原卟啉的接觸面積，使鋅鋁水滑石能更多更牢固地承載原卟啉。

(4)甲醯胺是有毒性的，對生物體有較大的危害。本發明通過napp與甲醯胺中的鋅鋁水滑石納米片靜電引力相互作用，破壞水滑石納米片在甲醯胺中的溶膠體系，從而使複合物沉澱下來，然後用水洗掉沉澱上殘留的甲醯胺就可以徹底去掉甲醯胺。

(5)鋅鋁水滑石在胃中被胃酸分解成無機鹽，口服安全無毒。

(6)原卟啉-水滑石複合物可作為原卟啉口服緩釋製劑，該緩釋製劑不但可克服原卟啉的胃酸刺激副作用，並可以有效地降低原卟啉的光毒性。

附圖說明

圖1是硝酸根型鋅鋁水滑石(zn2-al-no3-ldhs)的x射線衍射(xrd)譜圖。

圖2是鋅鋁水滑石在甲醯胺中的剝離所得凝膠(zn2-al-ldhs-exfoliation)的x射線衍射(xrd)譜圖。

圖3是原卟啉-鋅鋁水滑石複合物(ppix-ldhs)、原卟啉鈉(napp)、鋅鋁水滑石(zn2-al-no3-ldhs)的紅外譜圖。

圖4是原卟啉鈉(napp)及其與鋅鋁水滑石的複合物(ppix-ldhs)在二甲基亞碸(dmso)中的紫外可見吸收光譜圖(napp濃度為2.3μm，ppix-ldhs為2.35μm)。

圖5是原卟啉鈉(napp)及其與鋅鋁水滑石的複合物(ppix-ldhs)在二甲基亞碸(dmso)中的螢光光譜圖(napp濃度為2.3μm，ppix-ldhs濃度為2.35μm)。

圖6是原卟啉-鋅鋁水滑石複合物(ppix-ldhs)在ph＝2.4的緩衝溶液中，ppix隨時間的釋放曲線。

圖7是相同濃度(6.5μm)的原卟啉-鋅鋁水滑石複合物(ppix-ldhs)、原卟啉鈉(napp)、鋅鋁水滑石(zn2-al-no3-ldhs)在光照下使化學探針1,3-二苯基異苯並呋喃(dpbf)降解的曲線。

具體實施方式

本發明所述的原卟啉-鋅鋁水滑石複合物的製備方法包括以下步驟：

(1)製備鋅鋁水滑石：配製鋅離子和鋁離子的混合鹽溶液、鹼液以及含有硝酸根離子的水溶液；所述混合鹽溶液中鋅離子和鋁離子的摩爾比為2:1，所述鹼液中氫氧根離子的物質的量為鋅離子和鋁離子物質的量之和的2倍；

在溫度15-30，℃氮氣保護及攪拌條件下，將上述混合鹽溶液和鹼液同時滴入到含有硝酸根離子的水溶液中，滴加完畢後升溫至50-70，℃老化1-3h，老化完畢將反應液倒入高溫高壓反應釜中，在110-130℃下水熱反應6-12h得到粗產品，所述粗產品通過離心、洗滌、乾燥後，得到硝酸根型鋅鋁水滑石；

(2)剝離鋅鋁水滑石獲得納米片凝膠：將上述硝酸根型鋅鋁水滑石加入甲醯胺溶液中(1000毫克鋅鋁水滑石需要甲醯胺40-60毫升)，超聲溶脹15-35min得到混合液，然後再將混合液在冰浴中(控制混合液溫度不超過30℃)用超聲波粉碎機強力超聲15-35min，所得透明溶液靜置後形成無色的鋅鋁水滑石納米片凝膠；

(3)製備原卟啉-鋅鋁水滑石複合物：將原卟啉鈉溶於無水乙醇中，用naoh溶液調節體系表觀ph為10，得到溶液a；

將步驟(2)得到的鋅鋁水滑石納米片凝膠溶於其3倍體積的甲醯胺中，得到溶液b；

在溫度15℃-30℃，氮氣保護下，將溶液a滴加到溶液b中，升溫至40-50℃，繼續攪拌反應1-2h，產物通過離心、洗滌、乾燥處理後，即得原卟啉-鋅鋁水滑石複合物。

步驟(1)製備的鋅鋁水滑石的組成表達為：[zn1-xalx(oh)2]x+(no3-)x·mh2o，x值為0.16-0.33，m值為0.5-2，所得原卟啉-鋅鋁水滑石複合物中原卟啉的重量含量為0.01-50％。複合物在水溶液中的粒度為180-300nm。

測得原卟啉-鋅鋁水滑石複合物的表面電位為30-40mv，克服了因原卟啉呈弱酸性而具有胃酸副作用的不足。

在胃液環境條件下的緩釋實驗表明，原卟啉-鋅鋁水滑石複合物可在1小時左右緩釋出原卟啉，原卟啉-鋅鋁水滑石複合物可作為有效的原卟啉緩釋製劑，可改善原卟啉的胃酸副作用。

光敏毒性實驗表明，原卟啉-鋅鋁水滑石複合物可完全抑制原卟啉的光敏毒性。

為了進一步公開而不是限制本發明，以下結合實例對本發明作進一步的說明。

實施例1

(1)硝酸根型鋅鋁水滑石的合成：稱取1.19gzn(no3)2·6h2o(4mmol)，0.75gal(no3)3·9h2o(2mmol)，溶於40ml煮沸除去二氧化碳的水中，配成混合鹽溶液。稱取0.486g(12mmol)naoh,溶於40ml去二氧化碳水中，配成鹼液。稱取1g無水nano3，溶於20ml去二氧化碳水中，配成水溶液。常溫(15℃-30℃)，在氮氣保護及強力機械攪拌的條件下，將混合鹽溶液與鹼液緩慢滴入nano3水溶液中，嚴格控制滴速，使混合鹽溶液與鹼液的滴加速度完全一致。滴加完畢後，提高反應液溫度至50-70℃，老化1-3h。老化完畢，將反應液倒入高溫高壓反應釜中，在120℃下水熱6-12h，再用去二氧化碳水洗三次，洗掉鹽分。將亮白色沉澱在40℃下真空乾燥，得到的白色固體即為鋅鋁水滑石。最後將所得白色固體用研缽研磨至細粉狀，隔絕空氣保存在放有變色矽膠的乾燥器內。

(2)鋅鋁水滑石在甲醯胺中的剝離：稱取步驟(1)得到的鋅鋁水滑石0.4g倒入玻璃試管內，加入20-30ml甲醯胺，放到數控超聲波清洗器內超聲15-35min，然後再將試管放置在冰浴中，控制溫度不超過30，℃用細胞超聲波粉碎機強力超聲15-35min，所得透明溶液靜置後，形成無色的鋅鋁水滑石納米片凝膠。

(3)原卟啉-鋅鋁水滑石複合物的製備：稱取12.4mg原卟啉鈉溶於20ml無水乙醇中，並用0.01mol/l的naoh溶液調表觀ph＝10，得到原卟啉的無水乙醇溶液。用移液槍取步驟(2)製備好的鋅鋁水滑石納米片凝膠5ml(凝膠濃度20mg/ml)，溶於15ml甲醯胺中，得到鋅鋁水滑石的甲醯胺溶液，將鋅鋁水滑石的甲醯胺溶液倒入100ml三徑燒瓶，固定在帶有磁力攪拌裝置的恆溫油浴鍋內。將原卟啉的無水乙醇溶液倒入50ml恆壓滴液漏鬥中。常溫(15℃-30℃)，在氮氣保護並在磁力攪拌下，將原卟啉的無水乙醇溶液液緩慢滴加到鋅鋁水滑石的甲醯胺溶液中。滴完後，將混合液溫度提升至40-50℃，反應1-2h。反應完畢，將所得的棕紅色泥漿液，通過高速離心機用純水清洗，直至上清液無色。將沉澱物在40℃真空乾燥12h，得到的棕紅色固體即為原卟啉-鋅鋁水滑石複合物。最後將該棕紅色固體用研缽研磨至細粉狀，置於棕色乾燥器內避光保存。

實施例2

本實施例測試了硝酸根型鋅鋁水滑石和剝離後鋅鋁水滑石納米片凝膠的x射線衍射峰，分別見圖1和2。從圖1看出，所製得的材料是典型的鋅鋁水滑石。

根據文獻《chemicalcommunications》,2014,50(70):10130-2，可知水滑石如果在甲醯胺中成功的被剝離成單片，對所形成的凝膠做x射線衍射，水滑石特徵峰(003)、(006)會消失，並且在2θ等於25°左右會出現一個寬而強度較弱的衍射峰。將形成的凝膠均勻的塗抹在載玻片上，儘量保證凝膠面平滑，做xrd表徵，所得結果見圖2，與文獻報導完全一致，說明已獲得鋅了鋁水滑石納米片。xrd表徵的測試參數全部為：cu靶，kα射線，掃描速度10°/min。

實施例3

原卟啉鈉napp含有的陰離子基團-coo-是弱酸根離子。如果溶液的ph值太低，大量的-coo-就會轉化為cooh。就算在中性溶液，-coo-也會發生水解作用，部分轉化為-cooh。必須保證有足量的-coo-，才能和帶正電荷的鋅鋁水滑石納米片發生靜電吸附作用，而製備出複合物。為了保持-coo-解離度，溶液必須調成偏鹼性，但是如果溶液鹼性太強，鋅鋁水滑石(zn2-al-no3--ldhs)結構會被破壞。

為了探索溶液ph值對鋅鋁水滑石-卟啉複合物合成的影響，分別將napp無水乙醇溶液的表觀ph值調到9、10、11，與鋅鋁水滑石納米片進行三組平行實驗。如果napp無水乙醇溶液的表觀ph值為9，離心(離心速度15000r/min)所得反應液並不能得到沉澱，如果用雷射筆照射反應混合液，會有明顯的丁達爾效應，說明napp中-cooh就沒有足夠的解離度，不能有效地和水滑石納米片發生靜電引力破壞水滑石納米片的膠體體系。如果napp無水乙醇溶液的表觀ph值為11，將反應多得的紅棕色粉末做x射線衍射，幾乎沒有xrd衍射峰，說明該粉末基本沒有晶體結構，水滑石已經遭到破壞。只有當napp無水乙醇溶液的表觀ph值為10時，既能保證ppix中-cooh有足夠的解離度，又能保護水滑石特有的層狀晶體結構不受破壞。

實施例4

圖3是原卟啉-鋅鋁水滑石複合物(ppix-ldhs)、原卟啉(napp)、鋅鋁水滑石(zn2-al-no3-ldhs)粉末與無水kbr壓片所作的ft-ir光譜圖。在3400cm-1處出現的寬而強的峰是水滑石層間水分子或者層板上-oh伸縮振動的特徵峰，napp是鈉鹽，故無此峰。在1383cm-1處是no3-的特徵吸收峰。在700cm-1和616cm-1位置的吸收峰歸屬於zn-o和al-o的晶格振動。424cm-1是水滑石類化合物的特徵吸收峰。napp上的1617cm-1和1563cm-1吸收峰分別來自c＝o和芳香環上的伸縮振動。

分析此紅外光譜，可以觀察到：(1)ppix-ldhs在1383cm-1處no3-的特徵吸收峰比zn2-al-no3-ldhs要弱；(2)ppix-ldhs上並沒有c＝o的特徵吸收峰，只剩下位於1580cm-1處芳香環的伸縮振動峰；(3)ppix-ldhs和zn2-al-no3-ldhs都具有在424cm-1處水滑石類化合物的特徵峰。我們可以得出以下結論：napp取代部分ldhs上的no3-，使其的特徵吸收峰變弱，napp上的c＝o與ldhs上的-oh產生氫鍵，使ppix-ldhs上c＝o伸縮振動消失，napp被成功的複合到了ldhs上。

實施例5

滴加一定量ppix-ldhs到2ml的dmso內，測uv-vis光譜。加入20μl1mol/l的鹽酸將水滑石破壞，再加入20μl1mol/l的氫氧化鈉，再測uv-vis光譜，先加酸是破壞水滑石結構，再加鹼是將釋放出來的ppix轉化為鈉鹽napp。附圖4可見，ppix從ppix-ldhs釋放出來後，其紫外可見吸收光譜不會發生任何改變，說明其性質不會發生任何的改變。用相同方法，做螢光光譜實驗，會得到相似結果，見，圖5。結合圖4，可以充分的證明，napp與zn2-al-no3-ldhs形成了穩定的複合物。同時，此方法也是標定ppix-ldhs溶液中所含ppix濃度的方法。

實施例6

負載率的測定是進行後續ph釋放實驗的前提。具體方法是：稱取1mg的複合物粉末，分散在dmso中，加一定體積1mol/l的鹽酸破壞水滑石，再加一定體積的1mol/l的氫氧化鈉調節ph值，然後稀釋一定倍數測吸光度。根據方程式：w％＝navm/εm計算出負載率。其中w％是藥物在複合物中的質量百分比(即負載率)，n是稀釋倍數，a是測量的吸光度，ε是摩爾吸光係數，m是藥物的相對分子量，v是比色皿中液體的體積，m是所稱取複合物的質量

實施例7

在飯後，胃內的ph值在2.0-3.0之間。配製ph＝2.4的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩衝溶液，稱取5mgppix-ldhs倒入30ml緩衝溶液中，放在磁力攪拌器上充分攪拌，並控制溫度在37.5。℃取時間點5min、10min、20min、30min、40min、50min，分別取2ml液體，在16000r/min的轉速下，離心2min，取上清液10μl加到dmso中測紫外吸收光譜，測q帶吸光度。通過上述方法測得的ppix在複合物中的負載量，可以計算出複合物中ppix全部釋放時q帶的吸光度，進而計算出釋放百分比。結果見附圖6，可以看到，ppix-ldhs在ph＝2.4的環境下，能夠維持50min才能全部釋放。所以把原卟啉鈉(napp)與鋅鋁水滑石製備成複合物，飯後服用，在胃裡具有較好的緩釋性能，可以有效地降低對胃部的刺激。

實施例8

原卟啉在光照下可以產生單線態氧，而單線態氧具有較強的細胞毒性，所以原卟啉具有光毒性。我們採用dpbf探針法來測試原卟啉-鋅鋁水滑石複合物的光毒性。dpbf的中文名稱叫1,3-二苯基異苯並呋喃，它對於單線態氧極為不穩定，在單線態氧存在的環境中會迅速分解。

使用紫外分光光度計測量相同濃度的原卟啉鈉在複合前後，能使同一濃度的dpbf降解的情況。為了減小系統誤差，額外加上(1)只加dpbf，(2)加dpbf以及根據負載量換算的相同濃度的鋅鋁水滑石，(3)只加napp三組空白對照。實驗在二甲基亞碸(dmso)中進行，用日光燈投過絕熱水池照射，選取30s、60s、90s、120s、150s五個時間點，測量dpbf在最大吸收波長(415nm)處的吸光度。並通過dpbf的紫外吸收光譜的變化計算出dpbf的殘存百分比。

napp在dpbf最大吸收波長415nm處有較強的吸收峰，只要napp對光穩定，並不會影響實驗的結果，只需要減掉它的固定吸收值即可。實驗結果表明，在150s內napp自身並不會因為光照而降解，因此可以斷定415nm處吸收峰強度的變化，全部來自於dpbf。為了直觀地看到napp在複合前後，遇光產生單線態氧能力的變化，以dpbf的殘留百分比為縱坐標，以照射時間為橫坐標作圖7。可以看到napp和zn2-al-no3-ldhs形成複合物以後，產生單線態氧的能力降低了77.9％。因此napp與zn2-al-no3-ldhs形成複合物以後，可以有效地降低其光毒性。