修飾絲氨酸蛋白酶抑制劑的方法

2023-10-18 17:44:29 2

專利名稱：修飾絲氨酸蛋白酶抑制劑的方法
技術領域：
本發明涉及修飾絲氨酸蛋白酶抑制劑以獲得或增強多種理想性質中的任一項的方法。本發明還涉及此類修飾的產物和此類產物的用途，尤其是，它們在治療中的用途。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶，也稱作絲氨酸內肽酶，是在活性位點包含絲氨酸殘基的蛋白消化酶。這些酶在自然界是廣泛的，並且在多種生物學功能、包括消化、血液凝固、免疫系統和炎症中發揮作用。由於絲氨酸蛋白酶的廣泛分布和功能，這些酶的抑制劑是常見的。在自然界可以發現很多蛋白性的絲氨酸蛋白酶抑制劑，並且已經開發了用於研究和治療的很多合成的、 化學的絲氨酸蛋白酶抑制劑。凝血酶是在血液凝固中發揮重要作用的絲氨酸蛋白酶家族的成員；通過該過程， 響應於血管損傷，絲氨酸蛋白酶的循環酶原通過有限蛋白水解被依次激活以產生纖維蛋白凝塊。凝血酶與多數酶原和它們的輔因子相互作用，在血液凝固中發揮多種促凝劑和抗凝劑作用(Huntington000 ，和Di Cera(2003))。作為促凝劑蛋白酶，在起始期產生的最初的痕量凝血酶激活因子V(FV)和因子VIII (FVIII)以提供陽性回饋，引起凝血酶的爆發。 凝血酶也可以激活因子XI，激發內在途徑。凝血酶將纖維蛋白原切割為纖維蛋白，形成不可溶的凝塊。通過凝血酶激活的因子XIII驅動的共價交聯，纖維蛋白聚合物被進一步加固和穩定化。凝血酶還促成血小板栓的產生，可能是通過兩個機制(a)其通過與蛋白酶激活的受體(PAR)和糖蛋白V相互作用而激活血小板；和(b)通過滅活ADAMTS13，其防止血小板栓的脫穩定化，ADAMTS13是具有1型凝血酶敏感蛋白基序的解離素和金屬蛋白酶，其切割von Willebrand因子(VWF)。作為抗凝劑蛋白酶，凝血酶在存在輔因子血栓調節蛋白的情況下激活蛋白C(APC)。APC滅活因子Va(FVa)和因子VlIIa(FVIIIa)，下調凝血酶的產生(Huntington Q005)，Di Cera (2003)，Davie 等人(1991)，Davie (2003)和 Lane 等人 (2005))ο由於凝血酶的重要作用，其是抑制以控制凝結級聯的主要靶標，很多凝血酶抑制劑已經被用於治療和研究很多年了。肝素是原型的凝血酶抑制劑，其作為凝血酶的間接抑制劑發揮作用，意思是其通過抗凝血酶複合物作用，不與凝血酶的活性位點直接相互作用。 凝血酶的間接抑制劑僅能與可溶性凝血酶相互作用，因此，一旦形成凝塊，則不能抑制凝血酶。更近期以來，已經分離和/或開發了多種凝血酶直接抑制劑，包括蛭素 (hirudin)、比伐盧定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和達比加群酯(dabigatran etexilate)。這些具有能夠抑制可溶形式和與纖維蛋白結合的形式的凝血酶的治療性優點。然而，此類直接抑制劑具有某些性質，遠遠達不到最佳。例如，蛭素引起出血風險、依賴於腎功能的藥代動力學、缺乏解毒藥、有免疫原性和反跳性高凝性。比伐盧定被蛋白水解和腎途徑的組合清除，其具有可忽略的免疫原性潛能，但仍具有亞適治療性質。
鑑於絲氨酸蛋白酶抑制劑在治療上的重要性，需要鑑定顯示出改進的性質的另外的絲氨酸蛋白酶抑制劑。特別地，需要鑑定這樣的凝血酶直接抑制劑具有抑制可溶形式和與纖維蛋白結合形式的凝血酶的能力但不具有與目前可獲得的凝血酶直接抑制劑相關的缺點。

發明內容
本發明提供了修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑，產生修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑的方法，以及使用修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑例如抑制受試者中的靶絲氨酸蛋白酶的方法。因此，在第一方面，本發明提供了產生顯示出靶絲氨酸蛋白酶(SP)的增強的抑制的修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)的方法，包括修飾所述SPI以使所述SPI與其靶SP 的結合移位靶SP的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基，或所述胺基酸殘基的一個或多個原子。在該方面的一個實施方式中，該方法包括將能夠移位靶SP的催化三聯體的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子的一個或多個胺基酸殘基導入 SPI0在另一個實施方式中，方法產生修飾的SPI，其顯示出延長的抑制持續時間。在一個實施方式中，所述的一個或多個導入的胺基酸殘基是通過置換或插入導入的。在該方面的另一個實施方式中，所述的能夠移位靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基或其一個或多個原子的一個或多個胺基酸殘基包括組氨酸殘基。在一個實施方式中，所述一個或多個導入的胺基酸包括甲硫氨酸-組氨酸序列。在另一個實施方式中，所述一個或多個導入的胺基酸包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸序列。在另一個實施方式中，所述一個或多個導入的胺基酸包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸-蘇氨酸序列。在一個實施方式中，靶絲氨酸蛋白酶的催化三聯體中被移位的一個或多個殘基包括催化性絲氨酸殘基。在該方面的另一個實施方式中，該方法進一步包括修飾SPI使其能被中和的步驟，包括將離子電荷區域導入SPI，其中所述離子電荷區域能夠與中和試劑上的相反離子電荷區域相互作用。在一個實施方式中，將所述導入的離子電荷區域導向SPI的羧基末端。 在另一個實施方式中，所述導入的離子電荷區域是陰離子電荷區域。在一個實施方式中，所述導入的離子電荷區域包括一個或多個酸性殘基。在另一個實施方式中，所述一個或多個酸性殘基包括一個或多個穀氨醯胺殘基。在另一個實施方式中，所述中和試劑是硫酸精蛋白。在前述方法的示例性實施方式中，SPI是凝血酶抑制劑。在另一個示例性實施方式中，SPI選自由SEQ ID NO 14和17-153中的任一項組成的組。在另一個方面，本發明提供了通過任意前述方法可獲得的或獲得的修飾的SPI，或其片段或功能等同物。在一個實施方式中，所述修飾的SPI是凝血酶抑制劑。在示例性實施方式中，修飾的SPI包含下列共有序列N-末端肽PX1-H-X2-(G)n-(外部位點I結合肽) (SEQ ID NO 771)。在另一個方面，本發明提供了顯示出靶SP的增強的抑制的修飾的SPI，其中SPI與其靶SP的結合移位靶SP的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基，或所述胺基酸殘基的一個或多個原子。在該方面的一個實施方式中，修飾的SPI包括能夠移位靶SP的催化三聯體的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子的一個或多個胺基酸殘基。在另一個實施方式中，修飾的SPI顯示出延長的抑制持續時間。在該方面的另一個實施方式中，能夠移位靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基或其一個或多個原子的一個或多個胺基酸殘基包括組氨酸殘基。在另一個實施方式中，能夠移位靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基的一個或多個胺基酸殘基包括甲硫氨酸-組氨酸序列。在另一個實施方式中，能夠移位靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基的一個或多個胺基酸殘基包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸序列。在另一個實施方式中，能夠移位靶 SP的催化三聯體的一個或多個殘基的一個或多個胺基酸殘基包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸-蘇氨酸序列。在另一個實施方式中，靶絲氨酸蛋白酶的催化三聯體中被移位的一個或多個胺基酸殘基包括催化性絲氨酸殘基。在該方面的另一個實施方式中，修飾的SPI進一步包括離子電荷區域，其中所述離子電荷區域能夠與中和試劑上的相反離子電荷區域相互作用。在一個實施方式中，離子電荷區域向SPI的羧基末端放置。在另一個實施方式中，離子電荷區域是陰離子電荷區域。 在一個實施方式中，離子電荷區域包括一個或多個酸性殘基。在另一個實施方式中，所述一個或多個酸性殘基包括一個或多個穀氨醯胺殘基。在示例性實施方式中，所述中和試劑是硫酸精蛋白。在另一個示例性實施方式中，前述修飾的SPI是凝血酶抑制劑。在一個實施方式中，修飾的SPI含有下列共有序列N-末端肽)-X1-H-X2- (G)n-(外部位點I結合肽)(SEQ ID NO 771)。在另一個方面，本發明提供了包含選自SEQ ID NO :158-770任一項的序列的修飾的SPI，或其片段或功能等同物。在另一個方面，本發明提供了由選自SEQ ID NO :158-770 任一項的序列組成的修飾的SPI，或其片段或功能等同物。在另一個方面，本發明提供了編碼本文描述的修飾的SPI的核酸分子。在另一個方面，本發明提供了在高度嚴格雜交條件下與編碼本文描述的修飾的SPI的核酸分子雜交的反義核酸分子。在一個實施方式中，本發明包括載體，其包含編碼本文描述的修飾的SPI的核酸序列，或在高度嚴格雜交條件下與編碼本文描述的修飾的SPI的核酸分子雜交的反義核酸分子。在另一個實施方式中，本發明提供了包含前述載體和/或前述核酸分子的宿主細胞。在另一個方面，本發明提供了抑制靶SP的方法，包括施用如本文描述的修飾的 SPL·在另一個方面，本發明提供了治療患有凝血病的受試者或預防患者患上凝血病的方法，包括施用如本文描述的修飾的SPI，例如凝血酶抑制劑。在另一個實施方式中，本發明提供了在受試者中中和凝血酶抑制的方法，包括施用如本文描述的修飾的凝血酶抑制劑，然後向所述受試者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。本發明的其它特徵和優點將通過如下的詳細描述和權利要求變得明顯。
具體實施例方式本發明提供了產生顯示出靶絲氨酸蛋白酶(SP)的增強的抑制的修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)的方法，包括修飾所述SPI以使所述SPI與其靶SP的結合移位靶SP的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基，或所述胺基酸殘基的一個或多個原子。如上文所討論，絲氨酸蛋白酶是切割肽的酶。本領域中接受這些酶通過催化三聯體發揮作用，所述催化三聯體存在於酶的活性位點中並且包括絲氨酸殘基、組氨酸殘基和天冬氨酸殘基。組氨酸和天冬氨酸殘基的功能是通過電荷中繼系統激活絲氨酸殘基，使其變為親核性的並能夠切割底物的裂解鍵(scissile bond)。典型的絲氨酸蛋白酶中的催化三聯體的殘基之間的相互作用顯示於圖1。本發明人已經令人驚奇地證明除了通過常規競爭性抑制劑的方式空間阻斷活性位點之外，variegin，一種絲氨酸蛋白酶凝血酶的直接抑制劑，也通過打亂凝血酶的催化三聯體的殘基之間的相互作用而發揮作用，從而抑制其催化活性。Variegin是具有 SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列的蛋白質。其是源自蜱的蛋白，最早描述於W003/09U84。 在TO08/155658中描述了 variegin與凝血酶結合的能力。然而，這兩篇文獻都沒有暗示variegin打亂凝血酶的催化三聯體中的胺基酸之間的相互作用。W003/091284和 W008/155658的內容通過引用方式全文併入本文。圖9A顯示了凝血酶的催化三聯體的殘基的位置和這些殘基之間的相互作用，它們發揮激活催化性絲氨酸殘基的功能。圖9B顯示了 variegin的與催化三聯體相互作用的殘基，以及該相互作用對於催化三聯體的殘基的定位的影響。該示性地顯示了預料不到的發現^ariegin的組氨酸殘基發揮使絲氨酸的Y 0移位l.lA的功能，打亂催化三聯體的絲氨酸與組氨酸殘基之間的相互作用，並顯著降低凝血酶的活性。據本發明人所知， variegin是已發現的通過移位靶SP的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子而發揮作用的第一個SPI。本發明人意識到，variegin的有力的抗凝血酶活性至少部分是由於凝血酶的活性位點中的催化三聯體的打亂，並且，實現這一點的機理可以適用於其它絲氨酸蛋白酶抑制劑，包括凝血酶抑制劑。特別地，可以通過修飾來改善已知的絲氨酸蛋白酶抑制劑的性質， 從而它們打亂靶絲氨酸蛋白酶的催化三聯體的殘基之間的相互作用。此類修飾發揮了改善絲氨酸蛋白酶抑制劑性質的功能，並且克服了現有的絲氨酸蛋白酶抑制劑、尤其是已知的凝血酶直接抑制劑的很多缺點。術語「靶絲氨酸蛋白酶」或「靶SP，，涉及通常被給定的絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制的絲氨酸蛋白酶。靶SP的一個實例是凝血酶。根據本發明的靶SP的其它實例包括凝固因子 FXa、FVIIa、FXIIa、FXIa 和 FIXa。通過本發明的方法修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑或SPI可以是直接SPI或間接SPI。 術語「直接SPI 」意思是SPI在SP的活性位點與其靶SP相互作用，不以抗-SP複合物的一部分存在或通過中間體發揮作用。術語「間接SPI，，意思是SPI不與靶SP的活性位點直接相互作用。間接SPI可以與靶SP上的不同於活性位點的位點相互作用，或者間接SPI可以通過包含間接SPI的抗-SP複合物而與靶SP上的活性位點或另一個位點相互作用。可以通過本發明的方法修飾的SPI的實例包括蛭素類似物(hirulog) (SEQ ID NO 14)、Kunitz/BPTI-型抑制劑(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制劑，顯示於SEQ ID NO :776)、蛭素-相關凝血酶抑制劑、serpins、肝素輔因子、α 1-抗胰蛋白酶樣serpins、kazal型直接抑制劑和kimitz型/STI (大豆胰蛋白酶抑制劑)抑制劑。可以通過本發明的方法修飾的 SPI的另外的實例顯示於SEQ ID N0:17-153。「移位的」意思是，靶SP中的胺基酸殘基或所述胺基酸殘基內的一個或多個原子佔據的空間構象不同於在不存在任何外部影響的情況下其通常採納的空間構象。應該認識到，此類移位可以是任何方向的。
在一個方面，移位可以使靶SP的催化三聯體的胺基酸殘基之間的相互作用被打亂。此類打亂可以是完全的，即，催化三聯體的殘基不再相互作用；或者其可以是部分的， 即，殘基之間的相互作用僅為催化三聯體的一個或多個殘基不被移位時的相互作用強度的 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %或更低。催化三聯體的胺基酸殘基之間的相互作用的存在可以通過本領域已知的任何方法來測定，例如結晶學或NMR，計算性方法，包括但不限於分子力學、分子動力學和對接、氫/氘交換和質譜法。靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子的移位可以打亂靶SP的催化三聯體的電荷中繼系統。在本發明的一個方面，靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基的移位可以包括催化三聯體的絲氨酸殘基的移位。在一個方面，催化三聯體的絲氨酸殘基的YO原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的絲氨酸殘基的β C可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的絲氨酸殘基的αC可以被移位。在一個方面，催化三聯體的絲氨酸殘基的原子可以被移位0.1Α。在其它方面，催化三聯體的絲氨酸殘基的原子可以被移位0.2Α, 0.3Α, 0.4Α,
0.5Α, 0.6Α, 0.7Α, 0.8Α, 0.9Α, 1.0Α, 1.1 A, 1.2A, 1.3A, 1.4A, 1.5A, 1.6A, 1.7A, 1.8A, 1.9A, 2.0A, 2.5A, 3.0A或更多。在本發明的一個方面，催化三聯體的一個或多個殘基的移位可以包括催化三聯體的組氨酸殘基的移位。在一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的YC原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的S C原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的ε N2原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的ζ C原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的S N1原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的S N1原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的β C可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的α C可以被移位。在一個方面，催化三聯體的組氨酸殘基的原子可以被移位0.1Α。在其它方面，催化三聯體的組氨酸殘基的原子可以被移位0.2Α, 0.3Α, 0.4Α,
0.5Α, 0.6Α, 0.7Α, 0.8Α, 0.9Α, 1.0Α, 1.1 A, 1.2A, 1.3A, 1.4A, 1.5A, 1.6A, 1.7A, 1.8A, 1.9A, 2.0A, 2.5A, 3.0A或更多。在本發明的一個方面，催化三聯體的一個或多個殘基的移位可以包括催化三聯體的天冬氨酸殘基的移位。在一個方面，催化三聯體的天冬氨酸殘基的YO原子可以被移位。 在另一個方面，催化三聯體的天冬氨酸殘基的β C原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的天冬氨酸殘基的α C原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的天冬氨酸殘基的YC原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的天冬氨酸殘基的SO1原子可以被移位。在另一個方面，催化三聯體的絲氨酸殘基的S O2原子可以被移位。在一個方面，催化三聯體的天冬氨酸殘基的原子可以被移位0.1Α。在其它方面，催化三聯體的天冬氨酸殘基的原子可以被移位0.2Α, 0.3Α, 0.4Α,
0.5Α, 0.6Α, 0.7Α, 0.8Α, 0.9Α, 1.0Α, 1.1 A, 1.2A, 1.3A, 1.4A, 1.5A, 1.6A, 1.7A, 1.8A, 1.9A, 2.0A, 2.5A, 3.0A或更多。靶SP的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子的移位可以通過本領域已知的任何方法來測定，例如結晶學或NMR，計算性方法，包括但不限於分子力學、分子動力學和對接、氫/氘交換和質譜法。在本發明的一個方面，SPI是蛋白質並且修飾包括將能夠移位靶SP的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子的一個或多個胺基酸殘基導入SPI。這些胺基酸殘基可以通過與催化三聯體中的胺基酸殘基相互作用而使它們移位。導入的胺基酸殘基可以包括組氨酸殘基。此組氨酸殘基可以作為除了該組氨酸殘基之外的可導入SPI中的任何其它序列的一部分而存在。在一個實施方式中，導入的胺基酸可以包括甲硫氨酸-組氨酸(MH)序列。在另一個實施方式中，導入的胺基酸可以包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸(MHK)序列。在另一個實施方式中，導入的胺基酸可以包括甲硫氨酸-組氨酸-精氨酸(MHR)序列。在另一個實施方式中，導入的胺基酸可以包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸-蘇氨酸(MHKT)序列。在另一個實施方式中，導入的胺基酸可以包括甲硫氨酸-組氨酸-精氨酸-蘇氨酸(MHRT)序列。在另一個實施方式中，導入的胺基酸可以包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-丙氨酸(MHKTA)序列。在另一個實施方式中， 導入的胺基酸可以包括甲硫氨酸-組氨酸-精氨酸-蘇氨酸-丙氨酸(MHRTA)序列。也可以導入備選的胺基酸殘基，只要它們能夠移位靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基或其一個或多個原子。當考慮MHKT序列時，可以使用例如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或丙氨酸替代甲硫氨酸和/或賴氨酸，可以使用精氨酸或酪氨酸替代組氨酸，和/或，可以使用絲氨酸或丙氨酸替代蘇氨酸。在另一個方面，導入的一個或多個胺基酸殘基可以包括連接區域。在另一個方面， 連接區域可以包括一個或多個胺基酸，例如甘氨酸或丙氨酸。在另一個方面，接頭區域可以包括1、2、3、4、或5個甘氨酸殘基。在另一個方面，接頭區域可以由1、2、3、4或5個甘氨酸殘基組成。在本發明的涉及靶SP是凝血酶的方面，產生修飾的SPI的方法可以包括導入或維持能夠與凝血酶的外部位點I相互作用的肽序列。「維持此類肽序列」意指所述肽序列在修飾之前已經存在於SPI序列中，並且該序列不通過修飾被打亂或除掉。在一個方面，能夠與凝血酶的外部位點I相互作用的肽序列可以包括下列序列FEEIPEEYL ；YEPIPEEA ；NGDFEEIPEEYL ；或APPFDFEAIPEEYL。相對於未修飾的SPI，通過本發明的任何方法產生的修飾的SPI顯示出其靶SP的增強的抑制。對於本領域技術人員明顯的是，可以使用多種測定法中的任一個來測定SP的抑制程度，並確認該修飾增強靶SP的抑制。舉例而言，當SP是凝血酶時，此類測定法可以是胺裂解測定，其中檢測在存在S2238的情況下，將凝血酶與修飾的凝血酶抑制劑一起溫育之後，對硝基苯胺的形成。本發明的修飾的SPI可以具有下列IC50 小於30nM,小於25nM，小於20nM,小於 15nM,小於14nM，小於13nM，小於12nM，小於llnM，小於ΙΟηΜ，小於9nM，小於8nM，小於7nM， 小於6nM，小於5nM，小於^M，小於3nM，小於2nM或小於InM。通過本發明的方法產生的SPI可以具有下歹Ij Ki小於15nM,小於IOnM,小於5nM,小於InM,小於750pM,小於500pM,小於 400pM,小於 300pM,小於 250pM,小於 200pM,小於 150pM,小於 IOOpM,小於 50pM,小於 30pM, 小於25pM,小於20pM,小於15pM,小於IOpM,小於5pM,小於IpM,或小於IOOpMo已經證明常規的直接SPI通過與靶SP的至少活性位點結合而發揮作用，其中它們可能被靶SP切割，從而與靶SP的底物競爭結合，並競爭性抑制靶SP。通過這種方式作用的SPI的實例是蛭素類似物-1。雖然此類競爭性抑制可以是有效的抑制性機制，但其具有某些缺點，尤其是就抑制的短暫性和SPI的迅速消除而言。如在生物化學雜誌，2007，沘2(40) 29101-29113 (Cho Yeow Koh, Maria Kazimirova, Adama Trimnell, Peter Takac, Milan Labuda, Patricia A. Nuttal1, 禾口 R. Manjunatha Kini)中所描述，variegin通過與其它直接SPI相同的方式以競爭性抑制劑發揮作用。然而，在variegin被凝血酶切割之後，variegin的片段被稱作MH22的片段(顯示為SEQ ID NO :3)仍然保持與凝血酶結合，並作為凝血酶的非競爭性抑制劑發揮功能。這增加了 variegin的抑制潛力，並克服了其它直接SPI的一些缺點。在分析了與凝血酶結合的variegin的晶體結構之後，本發明人驚奇地發現:MH22與凝血酶的活性位點結合。這是不尋常的，因為非競爭性抑制劑一般結合於與酶活性位點不同的位點。此外，晶體結構揭示負責移位凝血酶的催化三聯體的一個或多個殘基的variegin的組氨酸殘基是MH22序列的一部分，因此，在variegin被切割之後，該variegin片段打亂凝血酶的催化三聯體，導致增加的抑制持續時間。因此，本發明的方法可以產生修飾的SPI，在修飾的SPI被靶SP切割之後，所述修飾的SPI保持與靶SP結合。此類修飾的SPI顯示出增加的抑制持續時間。術語「延長的作用持續時間」意指靶SP的抑制持續時間相對於使用非修飾的SPI 時的抑制持續時間增加。在一個方面，作用持續時間可以增加至少2倍。在另一方面，相對於使用非修飾的SPI時的抑制持續時間，作用持續時間可以增加至少3倍，至少4倍，至少5 倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或更多。修飾的SPI的抑制持續時間可以大於 5分鐘，大於10分鐘，大於15分鐘，大於20分鐘，大於25分鐘，大於30分鐘，大於1小時， 大於2小時，大於3小時，大於4小時，大於5小時，大於6小時，大於12小時，大於1天，大於2天，大於3天或更多。上文已經描述了用於測定靶SP的抑制程度的方法。在本發明的一些方面，上文描述的一個或多個導入的胺基酸殘基可以向被靶SP切割之後保留在活性位點中的修飾的SPI的部分的氨基末端放置。「向胺基酸末端」意指一個或多個導入的殘基在被靶SP切割之後的SPI的保留部分的氨基末端的5個胺基酸之內。在一些方面，一個或多個導入的殘基可以在被靶SP切割之後保留在活性位點中的修飾的直接SPI的部分的氨基末端的1個殘基之內、2個殘基之內、3個殘基之內、4個殘基之內或5個殘基之內。對本領域技術人員明顯的是，為了使一個或多個導入的殘基「向被靶SP切割之後保留在活性位點中修飾的直接SPI的部分的氨基末端」，一個或多個導入的殘基必須在修飾的直接SPI的切割位點的5個殘基之內。在一個方面，本發明的方法可以包括修飾SPI以使其能夠被中和的另外的或備選的步驟，包括將離子電荷區域導入SPI，其中所述離子電荷區域能夠與中和試劑上的相反離子電荷區域相互作用，從而修飾的SPI與中和試劑之間的所產生的離子相互作用中和修飾的SPI抑制活性，從而，修飾的SPI不再使靶SP的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子移位。基於variegin的序列和從結合於凝血酶的variegin的晶體結構獲得的數據，本發明人驚奇地發現variegin的抑制活性可以被中和。該中和機理是基於發現了 variegin 的羧基末端上的離子電荷區域與中和試劑上的相反離子電荷區域之間的離子相互作用。 variegin與中和試劑之間的離子相互作用似乎通過打亂variegin上的離子電荷區域與凝血酶上的相反離子電荷區域之間的離子相互作用而中和variegin的抑制活性。從結合於凝血酶的variegin的結構的分析認為凝血酶上的離子電荷區域在外部位點_1內。該信息允許對其它SPI進行修飾，從而使它們能夠被中和。鑑於SPI的治療用途 (上文已討論)，能夠被中和的修飾的SPI將具有重要的治療益處。「能夠被中和」意思是 能夠通過加入中和試劑全部或部分解除SPI的活性，即，在加入中和試劑之後能夠恢復SP 的活性。在該定義下，可以恢復 10%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90%,95%, 99%或100%的SP活性。換言之，在打亂了修飾的SPI與靶SP之間的離子相互作用之後， 可以保留 90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,10%,5%,1%W SPI 抑制活性。對本領域技術人員明顯的是由於在結合的與未結合的抑制劑之間建立的內在平衡，多數通過與其靶標結合而發揮作用的抑制劑(包括但不限於競爭性抑制劑)的作用可以在一定程度上被中和。在加入某些物質之後，該平衡位置被改變；所述物質在本文中被稱作「中和試劑」，其使所述平衡偏向有利於未結合的抑制劑；因此，解除抑制劑的抑制效應。 然而，在「非可中和」抑制劑的情況下，該平衡嚴重偏向結合的抑制劑，中和試劑的加入不擾亂平衡。圖8顯示了 variegin與凝血酶結合的平衡示意圖。該示意圖僅以舉例方式提供。在本發明的上下文中，術語「中和」意指僅涉及通過加入中和試劑而引起的中和， 其打亂平衡；不指作為內在平衡的副產物的內在中和。中和試劑可以通過擁有與導入到修飾的SPI上的離子電和區域相反的離子電荷區域而發揮中和修飾的SPI的抑制活性的功能。修飾的SPI與中和試劑之間的離子相互作用的形成可能導致修飾的SPI上的離子電荷區域與靶SP上的相反離子電荷區域之間的相互作用被打亂。靶SP上的離子電荷區域可以在外部位點之一以內。在另一個方面，離子電荷區域可以在外部位點-I以內。在本發明的一個方面，中和試劑上的離子電荷區域可以是陽離子電荷區域。因此，在本發明的該方面，通過本發明的方法導入到SPI中的離子電荷區域可以是陰離子電荷區域。在本發明的另一方面，靶SP上的離子電荷區域可以是陽離子電荷區域。導入到SPI中的離子電荷區域可以導向SPI的羧基末端。「向羧基末端」意指導入的離子電荷區域位於修飾的SPI的羧基末端的10個胺基酸之內。導入的離子電荷區域可以在修飾的SPI的羧基末端的1個殘基之內、2個殘基之內、3個殘基之內、4個殘基之內、5 個殘基之內、6個殘基之內、7個殘基之內、8個殘基之內、9個殘基之內或10個殘基之內。中和試劑可以是陽離子物質。此類陽離子物質可以與SP競爭與靶SPI上的陰離子電荷區域的結合，引起修飾的SPI的移位，和靶SP的抑制的喪失。中和試劑可以是陽離子肽，例如硫酸精蛋白。導入到SPI中的離子電荷區域可以包括一個或多個酸性殘基。一個或多個酸性殘基可以包括1、2、3、4、5或更多個酸性殘基。術語「酸性殘基」可以包括天冬氨酸和穀氨酸。一個或多個酸性殘基可以包括穀氨酸殘基和/或天冬氨酸殘基。可以導入的離子電荷區域的具體實例包括兩個穀氨酸胺基酸殘基和兩個天冬氨酸胺基酸殘基。在另一個具體實例中，可以導入的離子電荷區域包括序列 glu-glu-X-X-asp-asp，其中X是任意胺基酸殘基。在另一個實例中，可以導入的離子電荷區域包括·歹ll glu-glu-tyr-lys-asp-asp。一般內容現在將描述本發明的一些一般性方面。該部分中包括的特徵和方法適用於上文描述的本發明的任何方法。 如在前面的部分中所描述，本發明的方法可以包括將一個或多個殘基導入SPI。在一個方面，此類導入的殘基可以通過插入導入。在另一個方面，可以通過置換導入殘基。置換或插入的方法對於本領域技術人員將是明顯的。舉例而言，但不限於此這些可以包括定點誘變、PCR誘變、轉位子誘變、定向誘變、插入誘變、靶向誘變和化學蛋白合成 (Sambrook 等人(2000))。在本發明的一些方面，修飾SPI的方法可以包括一個或多個另外的步驟。在一些實施方式中，一個或多個另外的步驟可以是最初的另外步驟，意思是這些步驟發生在修飾方法的其它步驟之前。在一個方面，本發明的方法可以包括下列的另外步驟分析SPI的結構以確定要對SPI進行的修飾。分析可以包括分析SPI的胺基酸序列和/或SPI的結構的計算機模擬。另外或備選地，方法可以包括分析SP的結構或與SP結合的SPI的結構。此類結構可以是晶體結構、紅外譜、圓形二色性數據、紫外譜、NMR光譜的形式，計算性方法包括但不限於分子力學、分子動力學和對接、或氫/氘交換和質譜法。分析可以包括確定負責SP與SPI之間的相互作用(該相互作用將通過修飾SPI 的方法被改變)的SPI的區域。例如，修飾SPI以增強如上文描述的靶SP的抑制的方法可以包括鑑定SPI中的與靶SP的催化三聯體相互作用的殘基的最初步驟。然後，可以修飾與催化三聯體相互作用的胺基酸殘基以移位催化三聯體的一個或多個殘基或其一個或多個原子，例如，通過在該位置導入MHKT序列。本發明可以包括下列的另外步驟分析靶SP的結構以確定要對SPI進行的修飾。 分析可以包括確定負責靶SP與SPI之間的相互作用(該相互作用將通過修飾SPI的方法被改變)的靶SP的區域和/或殘基。分析可以包括SP的結構分析，其可以是晶體結構、紅外譜、圓形二色性數據、紫外譜、NMR光譜的形式，或來自計算性方法的數據。上述分析可以包括將SPI的結構與另一個結構和/或功能在之前已經被分析了的SPI的結構進行比較。此類分析可以在關於待修飾的SPI與另一 SP所產生的任何數據上進行。特別地，此類數據可以源自晶體結構、紅外譜、圓形二色性數據或紫外譜和NMR光譜或來自計算性方法的數據。在本發明的另一個方面，結構和/或功能在之前已經被分析了的SPI可以是凝血酶抑制劑。在本發明的另一個方面，結構和/或功能在之前已經被分析了的SPI可以是 Variegin0在本發明的一個方面，要通過本發明的方法修飾的SPI可以是凝血酶抑制劑。根據本發明的另一個方面，要通過本發明的方法修飾的SPI可以選自蛭素類似物(SEQ ID NO 14)、Kunitz/BPTI-型抑制劑(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制劑，顯示於SEQ ID NO :776)、蛭素-相關凝血酶抑制劑、serpins、肝素輔因子、α 1-抗胰蛋白酶樣serpins、kazal型直接抑制劑和kimitz型/STI (大豆胰蛋白酶抑制劑)抑制劑。在另一個方面，要通過本發明的方法修飾的SPI可以是SEQ ID NO :17-153的任一項。修飾的SPI本發明還包括通過本發明的方法可獲得或獲得的修飾的SPI。在另一個方面，本發明涉及通過任何方法獲得的修飾的SPI。例如，通過本發明的方法可獲得的修飾的SPI也可以通過本領域已知的任何方法來產生。用於產生本文描述的修飾的SPI的示例性技術包括化學肽合成、固相或溶液相肽合成、從編碼修飾的SPI的核酸分子進行體外翻譯，或基於細胞的生產方法，其利用原核或真核重組表達系統。在示例性實施方式中，修飾的SPI是包含如SEQ ID NO :158-770所示的任意序列的多肽。此類修飾的 SPI成分可用於本發明的方法，包括抑制SP的方法，如下文所描述。在本發明的一個方面， 通過本發明的方法可獲得或獲得的修飾的SPI可以是修飾的凝血酶抑制劑。在本發明的一個方面，通過本發明的方法可獲得或獲得的修飾的SPI可以是蛭素類似物(SEQ ID NO :14)、Kunitz/BPTI-型抑制劑(例如，牛胰腺胰蛋白酶抑制劑，顯示於SEQ ID NO :776)、蛭素-相關凝血酶抑制劑、serpins、肝素輔因子、α -抗胰蛋白酶樣 serpins, kazal型直接抑制劑和kunitz型/STI (大豆胰蛋白酶抑制劑)抑制劑的修飾的形式。在另一個方面，通過本發明的方法修飾的SPI可以是SEQ ID NO :17-153的任一項。通過本發明的方法可獲得或獲得的修飾的蛭素類似物的修飾的形式可以具有下列共有序列(N-末端肽)-X1-H-X2- (G)n_ (外部位點 I 結合肽)(SEQ ID NO :771)。在一個方面，N-末端肽可以包括序列苯丙氨酸、苯丙氨酸-脯氨酸、苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸，或苯丙氨酸-脯氨酸，賴氨酸。在另一個方面，氨基末端苯丙氨酸殘基可以是修飾的苯丙氨酸殘基。在一個實例中，該修飾的殘基可以是D-苯丙氨酸殘基。在一個方面，X1可以是任意胺基酸。在另一個方面，X1可以是甲硫氨酸殘基。在一個方面，X2可以是任意胺基酸。在另一個方面，&可以是賴氨酸或精氨酸殘基。在一個方面，η可以是一個或多個甘氨酸胺基酸殘基。在另一個方面，η可以是2、 3、4、5或更多個甘氨酸胺基酸殘基。在一個方面，修飾的SPI可以包括一個或多個硫酸化胺基酸殘基。在另一個方面， SPI可以包括一個或多個硫酸化酪氨酸殘基。在一個方面，外部位點I結合肽可以包括下列序列之一FEEIPEEYL(SEQ ID NO :772)；YEPIPEEA(SEQ ID NO :773)；NGDFEEIPEEYL(SEQ ID NO :774)；或APPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO :775)。外部位點I結合肽還可以包括含有一個或多個酸性殘基的離子電荷區域。所述一個或多個酸性殘基可以包括1、2、3、4、5或更多個酸性殘基。術語「酸性殘基」可以包括天冬氨酸和穀氨酸。一個或多個酸性殘基可以包括穀氨醯胺殘基和/或天冬氨酸殘基。離子電荷區域可以包括兩個穀氨酸胺基酸殘基和兩個天冬氨酸胺基酸殘基。離子電荷區域可以包括序列glu-glu-X-X-asp-asp，其中X是任意胺基酸殘基。在另一個實例中，離子電荷區域可以包括·歹ll glu-glu-tyr-lys-asp-asp。在一個方面，修飾的SPI可以包括選自SEQ ID NO :158-770的序列。在另一個方面，修飾的SPI由SEQ ID NO :158-770的一個或多個序列組成。本發明的修飾的SPI可以通過化學肽合成、通過重組肽合成或使用宿主細胞細胞
來產生。本發明還包括根據本發明的修飾的SPI的功能等同物，其保留抑制SP的增強的能力，如上文所述。在一個方面，術語「功能等同物」意在包括與根據本發明的方法產生的修飾的SPI具有至少50%序列同一性的肽分子。在另一個方面，功能等同物可以與根據本發明的方法產生的修飾的SPI具有60 %，70 %，85 %，90 %，95 %，98 %，99 %或更高的序列同一性。此類功能等同物保留抑制靶SP的增強的能力，如上文所述。術語「功能等同物」還包括與本發明的修飾的SPI相比，包含一個或多個保守性置換的任意多肽。在一個方面，多肽包含一個或多個保守性置換。在另一個方面，與本發明的修飾的SPI相比，多肽包含兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個，或五個或更多個保守性置換。保守性置換是這樣的胺基酸置換其中被置換的胺基酸的性質相對於在該位置通常存在的胺基酸而言不發生實質上的變化。保守性置換包括酸性胺基酸置換為另一酸性胺基酸，鹼性胺基酸置換為另一鹼性胺基酸，不帶電荷的胺基酸置換為另一不帶電荷的胺基酸，非極性胺基酸置換為另一非極性胺基酸，小胺基酸置換為另一小胺基酸，或大胺基酸置換為另一大胺基酸。酸性胺基酸是天冬氨酸和穀氨酸。鹼性胺基酸是精氨酸、組氨酸和賴氨酸。不帶電荷的胺基酸是天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。非極性側鏈是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。在非極性胺基酸的類別內，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和甘氨酸被認為是小胺基酸，脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸被認為是大胺基酸。在另一個方面，本發明包括通過本發明的方法產生的SPI的片段。在另一個方面， 片段可以包括2個或更多個胺基酸。在另一個方面，片段可以包括3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45 或 50 個胺基酸。在另一個方面，片段可以由2個或更多個胺基酸組成。在另一個方面，片段可以由2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1， 14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45或50個胺基酸組成。此類片段保留抑制靶SP的增強的能力，如上文所述。在另一個方面，功能等同物可以是融合蛋白，其通過例如將編碼本發明的修飾的 SPI或其變體或片段的多核苷酸在框內克隆於異源蛋白序列的編碼序列而獲得。如本文使用的術語「異源的」意指除了修飾的SPI或其功能等同物之外的任意多肽。構成融合蛋白的異源序列(在N-末端或在C-末端)的實例是下列與膜結合的蛋白的細胞外結構域、人免疫球蛋白恆定區(Fe區)、多聚體結構域、細胞外蛋白的結構域、信號序列、輸出序列，或允許通過親和色譜純化的序列。很多這些異源序列可通過商業途徑獲得(在表達質粒中)， 因為這些序列通常包括在融合蛋白中以提供另外的性質而不顯著破壞融合於它們的蛋白的特定生物活性(Terpe 000；3))。此類另外的性質的實例是體液中的持續較長的半衰期、 細胞外定位，或由於標籤例如組氨酸或HA標籤而允許更容易地純化程序。
異源蛋白也可以是標記物結構域。在一個方面，標記物結構域可以是螢光標籤、允許通過親和結合純化的表位標籤、允許組織化學或螢光標記的酶標籤，或放射性化學標籤。 在另一實施方式中，標記物結構域可以是放射性化學標籤。此類融合蛋白可用作診斷工具。用於產生融合蛋白的方法是本領域中的標準技術，是本領域技術人員已知的。例如，多數一般性的分子生物學、微生物、重組DNA技術和免疫技術可以見於Sambrook等人 (2000)。一般地，融合蛋白可以最方便地從核酸分子重組產生，在所述核酸分子中兩個核酸序列在框內融合在一起。這些融合蛋白將由含有所討論的融合蛋白的相關編碼序列的核酸分子編碼。在一個方面，根據本發明的修飾的SP的功能等同物可以包括包含適合移位靶SP 的催化三聯體的殘基的之一的部分的任意分子。在一個方面，該分子可以是蛋白分子，適合移位催化三聯體的殘基之一的部分可以是胺基酸殘基。對本領域技術人員明顯的是，該定義不包括單獨的任何殘基，因為殘基將需要另外的殘基的存在以使適合移位靶SP的催化三聯體的殘基之一的殘基定位於適合於移位催化三聯體的殘基之一的方向和位置。在一個方面，功能等同物可以包括蛋白分子內的組氨酸殘基，其以適合移位靶SP的催化三聯體的殘基之一的方式定位和定向。本發明還包括如上所述的修飾的SPI的合成類似物。通過本發明的方法產生的修飾的SPI的片段或功能等同物能夠作為SPI發揮作用。「能夠作為SPI發揮作用」意思是該片段或功能等同物能夠抑制SP的SP活性。在另一個方面，片段或功能等同物能夠抑制靶SP的SP活性。對本領域技術人員明顯的是，可以使用多種測定法來測定片段或功能等同物是否能夠作為SPI發揮作用。舉例而言，但不限於此，此類測定法可以是SP胺裂解測定，如上文所述，其中檢測在存在S2238的情況下，將靶SP與修飾的SPI —起溫育之後，對硝基苯胺的形成。當在此類SP胺裂解測定法中測定時，本發明的修飾的SPI可以具有下列IC5tl 小於30nM，小於25nM，小於20nM，小於15nM，小於14nM，小於13nM，小於12nM，小於llnM，小於ΙΟηΜ，小於9nM，小於8nM，小於7nM，小於6nM，小於5nM，小於4nM，小於3nM，小於2nM或小於InM。當在此類SP胺裂解測定法中測定時，通過本發明的方法產生的SPI可以具有下列Ki 小於15nM,小於IOnM,小於5nM,小於InM,小於750pM,小於500pM,小於400pM,小於 300pM,小於250pM,小於200pM,小於150pM,小於IOOpM,小於50pM,小於30pM,小於25pM,小於20pM,小於15pM,小於IOpM,小於5pM,小於IpM或小於IOOpMo在一個方面，本發明包括編碼根據本發明的方法產生的修飾的SPI的核酸分子。 在另一個方面，本發明包括與編碼根據本發明的方法產生的修飾的SPI的核酸分子具有至少50%序列同一性的核酸分子。在另一個方面，本發明包括與編碼根據本發明的方法產生的修飾的SPI的核酸分子具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少98%、至少99%或更高的序列同一性的核酸分子。本發明還包括編碼根據本發明的方法產生的修飾的SPI的核酸分子的片段。在一個方面，所述片段可以包括10個或更多個核苷酸。在另一個方面，所述片段可以包括12個或更多個、14個或更多個、16個或更多個、18個或更多個、10個或更多個、25個或更多個、30個或更多個、40個或更多個、50個或更多個、60個或更多個、70個或更多個、80個或更多個、90個或更多個，或100個或更多個核苷酸。根據本發明的核酸分子可以是任意形式，包括雙鏈和單鏈RNA、DNA和cDNA。在另一個方面，本發明包括在高度嚴格雜交條件下與根據本發明的核酸分子雜交的反義核酸分子。高度嚴格雜交條件在本文中定義為在42°C在包含50%甲醯胺、 5XSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7. 6)、5X Denhardts 溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml變性的、剪切的鮭魚精DNA的溶液中過夜溫育，然後在0. IX SSC中在大約65 °C洗滌濾液。本發明還包括含有本發明的核酸分子的克隆和表達載體。此類表達載體可以包含與本發明的核酸分子在框內連接的適當的轉錄和翻譯控制序列，包括但不限於增強子元件、啟動子-操縱子區域、終止序列、mRNA穩定性序列、起始和終止密碼子或核糖體結合位點。另外，使本發明的修飾的SPI從某些宿主中分泌出來可能是方便的。因此，此類載體的另外的成分可以包括編碼分泌、信號和處理序列的核酸序列。根據本發明的載體包括質粒和病毒(包括噬菌體和真核病毒)，以及其它的線性或環形DNA載體，例如利用可轉位元件或同源重組技術的那些。很多此類載體和表達系統對於本領域技術人員將是明顯的。特別適宜的病毒載體包括基於杆狀病毒、腺病毒和牛痘病毒的載體。用於重組表達的適宜的宿主包括通常使用的原核物種，例如大腸桿菌，或者可以被操作以表達高水平的重組蛋白並且可以容易地大量生長的真核酵母。在體外生長的哺乳動物細胞系也是適宜的，尤其是當使用病毒驅動的表達系統時。另一個適宜的表達系統是杆狀病毒表達系統，其包括使用昆蟲細胞作為宿主。表達系統也可以包括在其基因組中導入了 DNA的宿主細胞。蛋白或蛋白片段也可以在體內表達，例如在昆蟲幼蟲或哺乳動物組織中。可以使用多種技術將載體導入原核或真核細胞中。適宜的轉化或轉染技術在文獻中有完備的描述(Sambrook等人QOOO))。在真核細胞中，表達系統可以是短暫的(例如，游離體)或永久的(染色體整合)，視系統的需要而定。治療方法本發明還包括根據本發明可獲得的或獲得的修飾的SPI在治療中的用途。也可以使用通過任何方法獲得的修飾的SPI來執行用途和方法。本發明包括抑制SP的方法，包括向受試者施用本發明的分子。「本發明的分子」意思是根據本發明的方法可獲得的或獲得的修飾的SPI分子，編碼根據本發明的方法可獲得的或獲得的修飾的SPI的核酸，包含編碼通過本發明的方法可獲得的或獲得的修飾的SPI的核酸的載體，和包含含有編碼通過本發明的方法可獲得的或獲得的修飾的SPI的核酸的載體的宿主細胞。「本發明的分子」還包括通過本發明的方法可獲得的、但通過任何方法產生的修飾的SPI。因此，本發明的修飾的SPI分子可以使用本領域已知的任何方法產生，例如，化學肽合成、固相或溶液相肽合成、從編碼修飾的SPI的核酸分子進行體外翻譯，或基於細胞的生產方法，其利用原核或真核重組表達系統。在示例性實施方式中，「本發明的分子」包括含有如SEQ ID NO :158-770所示的任意序列的多肽。此類修飾的SPI分子可用於本發明的方法，包括本文所述的任意治療方法。受試者一般是動物。術語「動物」包括分類為動物界的成員的任意生物。一般地， 動物是哺乳動物，例如人、母牛、綿羊、豬、駱駝、馬、狗、貓、猴子、小鼠、大鼠、倉鼠和兔子。方法可以包括施用治療有效量的本發明的分子。術語「治療有效量」是指治療或緩解靶疾病或病況所需的化合物的量。如本文使用的術語「預防有效量」是指預防靶疾病或病況所需的化合物的量。精確劑量一般將取決於給藥時受試者的狀態。當確定劑量時可以考慮的因素包括受試者中的疾病狀態的嚴重性、受試者的一般健康、年齡、體重、性別、膳食、 給藥時間和頻率、藥物組合、反應敏感性和受試者對於治療的耐受或應答。精確的量可以通過常規實驗確定，但最終可以根據臨床醫生或獸醫的判斷。一般地，有效劑量將是0. Olmg/ kg(藥物質量比受試者的質量)至50mg/kg，優選0. 05mg/kg至10mg/kg。本發明的分子可以聯合藥學上可接受的載體以藥物組合物的形式提供。如本文使用的術語「藥學上可接受的載體」包括基因、多肽、抗體、脂質體、多糖、 聚乳酸、聚乙醇酸和無活性的病毒顆粒或事實上任何其它試劑，只要賦形劑本身不誘導毒性效應或引起對接受藥物組合物的個體有害的抗體的產生。藥學上可接受的載體可以另外包括液體，例如水、鹽水、甘油、乙醇，或輔助性物質，例如潤溼劑或乳化劑，PH緩衝物質等。賦形劑能夠使藥物組合物配製為片劑、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿料、懸浮液以輔助受試者攝取之。關於藥學上可接受的載體的詳細討論可以見Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)。在一個方面，本發明提供了涉及通過本發明的方法可獲得或獲得的修飾的凝血酶抑制劑的治療方法。本發明包括治療患有凝血病的受試者或預防患者患上凝血病的方法，包括施用通過本發明的方法可獲得或獲得的修飾的凝血酶抑制劑。本發明還包括用於治療患有凝血病的受試者或預防患者產生凝血病的通過本發明的方法可獲得或獲得的修飾的凝血酶抑制劑。「凝血病」意指血液凝固的任意病症。當需要抗凝時的處理包括，為了診斷或治療原因的涉及經皮、透過血管或透過器官的導管插入的程序。此類程序可以包括但不限於冠狀動脈血管成形術；血管內支架程序；通過動脈或靜脈導管直接施用血栓溶解劑，例如在中風或冠狀動脈血栓症之後；電心律轉變法；心臟起搏器導線的放置；血管內和心臟內監控壓力、氣體飽和或其它診斷參數； 涉及經皮或透過器官的導管插入的放射學和其它程序；以確保長期、留置的、血管內胃腸外營養導管的效能；以確保長期或短期血管接入埠的效能。本發明的方法的另外的體內應用包括血栓栓塞事件之後的緊急抗凝，所述血栓栓塞事件包括但不限於急性心肌梗塞；血栓形成性中風；深度靜脈血栓；血栓性靜脈炎；肺栓塞；栓和微栓發作，其來源可以是心臟、動脈粥樣硬化斑、瓣膜或人造血管或未知的來源； 彌散性血管內凝血(DIC)。本發明的方法也可用於預防在器官灌注程序例如心肺分流術(cardiopulmonary bypass)、肝臟分流術(h印atic bypass)中以及作為器官移植的附屬來預防凝固。由於心肺分流術而促成的大量血栓形成反應不能通過間接凝血酶抑制劑例如肝素及其類似物完全拮抗(Edmunds & Colman (2006))。另外的需要抗凝的情況包括血液透析、血液過濾或血漿交換程序。在涉及血管的交叉夾緊的手術程序時也可能需要抗凝，以使末梢循環中的凝固風險最小化。此類程序可以包括但不限於動脈內膜切除術、人造血管的插入、主動脈和其它動脈瘤的修復。另外，方法和根據本發明可獲得或獲得的修飾的凝血酶抑制劑可用於在肝素抗性受試者中誘導抗凝。方法和根據本發明的方法可獲得或獲得的修飾的凝血酶抑制劑也可用於治療或預防肝素誘導的血小板減少症。可以向患有或具有換HIT以及具有或不具有活性血栓的受試者施以此類治療，並且可以施用直至血小板計數恢復至正常範圍內或直至不再有血栓風險(Girolami & Girolami(2006), Lewis & Hursting(2007))。本發明的分子可以通過任意合適途徑施用。優選的施用途徑包括靜脈內、肌肉內或皮下注射，口服施用，舌下施用和經皮施用。可以通過靜脈內輸注持續給予治療或作為單一或重複的推注注射進行。本發明的分子可以單獨向受試者施用，或者可以與其它試劑、藥物或激素組合施用。例如，本發明的分子可以與口服抗凝劑例如香豆素(coumarin)衍生物一起施用，直至受試者變得穩定，然後可以單獨以香豆素衍生物治療該受試者。本發明還提供了 通過本發明的方法產生的修飾的SPI可用於診斷。由於這些方法涉及通過與靶SP的相互作用特異性抑制SP活性，所以它們可用於檢測靶SP的存在， 從而診斷由SP的累積而引起的病況，例如纖維蛋白或血小板血栓，其由凝血酶的累積而引起。因此，本發明提供了診斷由SP累積引起的病況的方法，該方法是通過向受試者或分離自受試者的組織施用如上文描述的本發明的修飾的SPI，並檢測所述SPI或其片段或功能等同物的存在，其中所述修飾的SPI或其片段或功能等同物與靶SP的結合的檢測指示所述疾病或病況。修飾的SPI或功能等同物可以是包含標記物結構域的融合蛋白的形式，如上文更詳細地所描述，以促進檢測。在一個方面，標記物結構域可以是放射化學標籤，從而可以使用已知的成像方法進行檢測。根據本發明的另一個方面，本發明的體內方法可用於治療惡性疾病或與惡性疾病相關的病況。數十年以來已經認識到，惡性疾病經常與血栓栓塞發作的增加的傾向相關，其是由SP凝血酶的增加的水平引起的。例如，Trousseau症候群的特徵在於短暫的血栓性靜脈炎和潛在的惡性質，凝血酶抑制劑例如肝素已經用於其管理(VarkU2007))。更近期以來， 已經顯而易見的是，促凝血因子包括凝血酶的產生可能是惡性疾病的某些方面的誘因而非結果(Nierodzik & Karpatkin Q006))。有很多這樣的情況其中需要抑制SP，然後中和此類抑制。舉例而言，但不限於此，此類抑制和中和在手術中可能是有利的，其中，當手術正在進行時，需要靶SP抑制以防止凝血酶誘導的凝固；在完成手術之後，撤銷抑制是有利的，以允許傷口癒合。當SPI是凝血酶抑制劑時，可以通過施用陽離子肽例如硫酸精蛋白來中和凝血酶活性。因此，涉及如本文描述凝血酶抑制的任何治療方法可以描述向受試者施用一定量的陽離子肽以引起凝血酶抑制的中和的另外的步驟。在一個方面，所施用的陽離子肽的量可以是0. 01mg/ml至lmg/ml。在另一個方面，所施用的陽離子肽的量可以是0. 01mg/ml或更多，0. 02mg/ml 或更多，0. 03mg. ml 或更多，0. 04mg/ml 或更多，0. 05mg/ml 或更多，0. 06mg/ ml或更多，0. 07mg/ml或更多，0/08mg/ml或更多，0. 09mg/ml或更多，0. lmg/ml或更多， 0. 1 lmg/ml 或更多，0. 12mg/ml 或更多，0. 13mg. ml 或更多，0. 14mg/ml 或更多，0. 15mg. ml 或更多，0. 16mg/ml 或更多，0. 18mg/ml 或更多，0. 19mg/ml 或更多，0. 2mg/ml 或更多，0. 3mg. ml 或更多，0. 4mg. ml或更多,0. 5mg. ml或更多,或lmg/ml。現在將通過舉例方式更詳細地描述本發明的各個方面和實施方式。將認識到，可以不脫離本發明的範圍進行細節的修飾。


圖1顯示了典型的SP的催化反應圖解。多肽底物與SP結合，從而裂解鍵被插入到酶的活性位點，並且其羰基碳位於SP的親核絲氨酸附近。絲氨酸-OH攻擊羰基碳，並且 SP的組氨酸的氮接受來自絲氨酸的-OH的氫，從而產生四面體中間體。接下來，肽鍵中的氮-碳斷裂，產生醯基酶中間體，水加入其中，產生另一種四面體中間體。在最後的反應中， 肽的C-末端被射出，SP恢復至其原始狀態。圖2顯示了凝血酶-variegin複合物的結構，與其它凝血酶抑制劑結構相對比。(A)凝血酶-variegin複合物的結構。凝血酶A鏈骨架顯示為淺藍色帶狀物，B鏈顯示為白色帶狀物，s-variegin骨架和側鏈原子顯示為粉色的棍。(B)凝血酶-蛭素類似物-1複合物的結構(PDB :2HGT)。蛭素類似物_1顯示為紅色的棍。(C)凝血酶-蛭素類似物-3複合物的結構(PDB :1ABI)。蛭素類似物_3顯示為黃色的棍。(D)凝血酶-蛭素原(hirugen)複合物的結構(PDB =IHGT)。蛭素原顯示為綠色的棍。(E)凝血酶-PPACK複合物的結構(PDB =IPPB)。PPACK顯示為橙色的棍。(F)野生型、不含抑制劑、不含Na+的凝血酶(PDB :2AFQ)。結構代表「慢」形式的凝血酶，並且無抑制劑。圖3顯示了在37°C和凝血酶對s-variegin的切割的分析。通過積分RP-HPLC 分析中的峰下面積而計算未切割的s-variegin的相對百分比(■)、質量為1045的切割產物的相對百分比(代表N-末端片段SDQGDVAEH( ；SEQ ID NO :2) (□)和質量為2582的切割產物的相對百分比(代表C-末端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES ；MH22 ；SEQ ID NO 3) (■)。切割在37°C比在室溫進行得快(η = 2，誤差條代表S. D.)。(A)通過在37°C溫育s-variegin與凝血酶而獲得的結果。完成切割僅需要180 分鐘。(B)通過在溫育s-variegin與凝血酶而獲得的結果。完成 90%的切割需要360分鐘。圖4顯示被凝血酶切割後s-variegin和EP25保留了它們的活性。(A) S-variegin與凝血酶(3. 33nM)在室溫溫育M小時，在多個時間點測定抑制凝血酶在100 μ M S2238上的胺裂解活性的能力(n = 3，誤差條代表S. D.)。(B)以ΕΡ25代替s-variegin進行類型的實驗(n = 3，誤差條代表S. D.)。圖5顯示MH22、s-variegin和蛭素類似物_1抑制人血漿凝血酶。使用活性位點定向底物S2238 (100 μ Μ)測定ΜΗ22、s-variegin和蛭素類似物_1抑制源自人血漿的凝血酶的胺裂解活性的能力。當它們以相似的摩爾濃度與凝血酶一起存在時，MH22(〇)、 s-variegin (A )和蛭素類似物_1 ( ■)抑制凝血酶(1. 65nM)的劑量應答曲線均顯示出抑制。用於MH22 ( ■)和 s-variegin 的濃度分別是 0. 03nM, 0. InM, 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, 100nM，300nM 和 ΙΟΟΟηΜ。抑制的 IC5。分別是 11. 46士0. 71nM禾Π 8. 25士0. 45ηΜ(η =3，誤差條代表S.D.)。
用於蛭素類似物-1(▲)的濃度是 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, IOOnM, 300nM, ΙΟΟΟηΜ，3000nM 和 ΙΟΟΟΟηΜ。抑制的 IC5tl 是 72. 6 士 3. 9nM(n = 3 誤差條代表 S. D)。圖6顯示了 MH22的表觀抑制常數(Ki，)。由於MH22作為緊密結合抑制劑發揮其作用，所以使用不同濃度的S2238作為底物，檢測了不同濃度(0. 195nM,0. 391nM,0. 781nM, 1. 56nM, 3. 12nM, 6. 25nM, 12. 5nM, 25nM, 50nM, IOOnM)的 MH22 對於凝血酶(1. 65nM)的抑制。 加入凝血酶時反應起始。圖中顯示了以ΙΟΟμΜ S2238進行的實驗。將獲得的數據擬合入等式以得出表觀抑制常數(Ki』)(平均值士 S.D.)是14.31 士 0. 26nM(n = 3，誤差條代表 S. D.)。圖7顯示了 MH22的抑制常數Ki。使用6種不同濃度的底物S2238 (12. 5 μ M，25 μ M， 50 μ Μ，75 μ Μ，100 μ M禾口 150 μ Μ)測定ΜΗ22的表觀抑制常數(Ki，)。Ki針對底物濃度的曲線一直保持恆定，這表明MH22非競爭性地(K/ =盼Km)/[(KnAi)+ (S/α Ki)]並且K/ = Ki)抑制凝血酶在S2238上的胺裂解活性。通過線性回歸擬合Ki』值，得出抑制常數Ki是 14. 11 士0. 29nM (對於每個S2238濃度，η = 3，誤差條代表S. D.)。圖8顯示了 variegin抑制凝血酶的平衡方案。在不存在variegin的情況下， S2238結合凝血酶(Ks是凝血酶-S2238解離的平衡常數，顯示為藍色箭頭)，並且被凝血酶水解以釋放有色產物pNA(Kp是形成pNA的正向速率常數，綠色箭頭)。在存在variegin的情況下，凝血酶結合variegin (Ki_v是variegin的抑制常數， 顯示為棕色箭頭)，因此，S2238的水解被完全抑制。結合之後，凝血酶將variegin切割為 MH22(kc是切割的正向速率常數，顯示為紫色箭頭)。MH22保持與凝血酶結合，作為凝血酶的經典的非競爭性抑制劑(Ki_m是MH22的抑制常數)。MH22以相同的親和性與游離的凝血酶或結合於S2238的凝血酶結合，α = 1, 因此Ki-m= aKi-m(顯示為紅色箭頭)。類似地，Ks = a Ks，S2238與凝血酶的結合不受 MH22的影響。圖9顯示了結合於s-variegin和結合於蛭素原的凝血酶的結構中的催化三聯體。(A)當在凝血酶-蛭素原結構中未被佔據時(綠色)，凝血酶的催化三聯體Mis57、 TAspl02*Serl95具有完整的電荷中繼氫結合系統。在凝血酶-s-variegin結構中(粉色)，TSerl95 Oy被移位1.10 A (青色箭頭)。THis57 N ε與Serl95 Oy之間的距離是 3.77 A，因此不形成氫鍵，電荷中繼系統被破壞。(B)TSerl95 Oy的移位是由於s-variegin (顯示為灰色)與凝血酶的催化三聯體之間的相互作用。vHisl2骨架N (供體)通過氫鍵(2.77 Λ)嚙合TSerl95的Oy (受體)，而 vHisl2側鏈Νδ (受體)僅能與Serl95 0 γ (供體)形成弱的氫鍵(3.68 A)。vHisl2骨架 N也與％lyl93骨架N*TCys42 Sy通過水分子(淺藍色)形成氫鍵。因此，Serl95 Oy 被賦予弱親核性，並且不能攻擊底物的骨架碳。由於TGlyl93骨架N參與該氫鍵網絡，氧負離子孔的形成也被破壞。圖10顯示了凝血酶與s-variegin之間的首要次位點相互作用。對於s-variegin， 僅顯示了殘基P2，至P5，(vHisl2至vAlal5)。在結構中不能描繪s-variegin Pl，vMetll的密度。凝血酶 S2』次位點(紅色)(由 TCys42,THis57,TTrp60D,TLys60F,TGlul92 和 TSerl95 形成)與蛭素類似物-3中保守的Si』次位點部分重疊。s-variegin P3』 vLysl3側鏈與 %lul92側鏈靠近且平行，並且其骨架與TLeu41接觸，形成S3』次位點(青色)。S-varieginP4』 vThrl4側鏈朝向自我裂解環的底部，佔據由Mlyl42，TAsnl43, TGlul92, TGlyl93和形成的小袋，形成了 S4』次位點(粉色)。底部的TLeu40沿著凝血酶S5』次位點 (綠色)，這允許s-variegin P5』 vAlal5將其側鏈埋於界面處。圖11顯示=S-Variegin緊密適合凝血酶的峽谷樣裂口。(A)凝血酶具有深谷樣裂口(加框)，起始於活性位點，延伸至外部位點-I。(B)整個s-variegin(粉色的CPK模型)緊密適合於延伸的構象中峽谷樣裂口的底部，覆蓋催化袋、首要次位點和外部位點-I。裂口的底部主要由非極性殘基組成。裂口的壁由凝血酶活性位點附近的60-環和自我裂解環以及外部位點-I處的34-和70-環形成。(C)根據位置以顏色顯示了與s-variegin相互作用的凝血酶殘基催化袋—— 藍色；60-環——紅色；自我水解環——青色；34-環——黃色；70-環——綠色；裂口底部——橙色。以粉色顯示了 s-variegin的球棍模型。(D) s-variegin通過特定側鏈的接觸與凝血酶相互作用。除了 5個殘基(vPhel8， vAsp 19, vAla22, VG1M6和vTyr27，均以白色顯示)之外，s-variegin上的所有殘基的側鏈都埋於與凝血酶的界面處。圖12顯示了新的variegin變體的設計。設計了新的variegin變體以改善凝血酶-variegin相互作用。方法為首先優化variegin的長度，然後優選variegin上的數個關鍵位置。圖13顯示了 variegin變體EP21對凝血酶的抑制，EP21是慢的緊密結合的競爭性抑制劑。(A)EP21(0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM,IOOOnM,3000nM 禾Π IOOOOnM) 對於凝血酶(1.65nM)胺裂解活性[使用S2238(100yM)]的抑制顯示出預溫育時間依賴性偏移，這是由於結合緩慢的緣故。無預溫育時，IC5tl值是176. 9士6. SnM(實線)；有20分鐘預溫育時，IC50值是16. 2士2. 9nM(虛線)(n = 3，誤差條代表S. D.)。(B)以 ΙΟΟμΜ S2238，不同濃度的 ΕΡ21(18. 8ηΜ，25ηΜ，37. 5ηΜ，50ηΜ，75ηΜ，100ηΜ 和150ηΜ)抑制凝血酶(1. 65ηΜ)的進程曲線(未顯示)擬合入等式P = Vft+(Vi-Vf) (l-e_kt)/ k+P。(該等式描述了慢結合抑制劑)，以獲得針對所用的每個EP21濃度的k值。k針對EP21 濃度的曲線(實線)是由等式k = K4+K3It/[It+V (1+S/KJ]描述的雙曲線，因此，擬合進入等式以得出Kf為1. 66士0. 36nM，其代表了最初的碰撞複合物EI的解離常數。從等式Ki = K廣[K4/(K3+K4)]計算得出總體抑制常數(Ki)是0. 315 士0. 024nM(n = 3，誤差條代表S. D.)。圖14顯示了 variegin變體MH18對凝血酶的抑制；MH18是快的緊密結合的非競爭性抑制劑。(A)以 ΙΟΟμΜ S2238,測定了 MH18(0. InM, 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, IOOnM, 300nM，ΙΟΟΟηΜ，3000nM和IOOOOnM)抑制凝血酶(1. 65nM)的胺裂解活性的能力。劑量應答曲線不依賴於預溫育時間。無預溫育時，IC5tl值是10.9士 1.2nM(實線)；有20分鐘預溫育時，IC50值是11.7士 1.9nM(虛線)(n = 3，誤差條代表S. D.)。(B)由於ΜΗ18作為快且緊密結合抑制劑發揮作用，所以在ΙΟΟμΜ ofS2238下，以 0. 39nM,0. 78nM,1. 56nM,3. 13nM,6. 25nM,12. 5nM,25nM,50nM,IOOnM 和 200nM MH18 測定了 對凝血酶(1. 65nM)的抑制(實線)。通過將數據擬合入等式Vs = ^^{[(Κ,'+Ι,-Ε,)2 +4Κ/EJv2-OV+It-EtM而獲得的表觀抑制常數(Ki』)是14.9±3.5nM。基於等式K/ =(S+Kj/TOVK^S/aig]和 K/ =Ki 計算的抑制常數(Ki)是 14. 9 士 3. 5ηΜ (η = 3，誤差條代表S. D.)。圖15顯示了 variegin變體DVM對凝血酶的抑制；DVM是快的緊密結合的競爭性抑制劑。(A)以 100 μ M S2238, DV24(0. InM,0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM, IOOOnM和3000nM)對於凝血酶(1. 65nM)的抑制的劑量應答曲線顯示出隨著預溫育時間的增加而右移，這是由於切割造成的。沒有溫育時，IC5tl值是7. 49士OJSnM(實線)；有20分鐘預溫育時，IC50值是10. 07士0. 60nM(虛線)(n = 3，誤差條代表S. D.)。(B)由於DVM作為快且緊密結合的抑制劑發揮作用，以100yMS2238，測定了 0. 39ηΜ,0. 78nM,1. 56nM,3. 13nM,6. 25nM,12. 5nM,25nM,50nM,IOOnM 和 200nM DV24 對於凝血酶(1. 65nM)的抑制(實線)。通過將數據擬合進入等式Vs = (V。/2Et) {[(K/ +It-Et)2+ 4K/EJv2-OV+It-EtM而獲得的表觀抑制常數(Ki，)是9.74 士 0.91nM。基於等式K/ = Ml+S/Kj計算的抑制常數(Ki)是0. 306士0.029nM(n = 3，誤差條代表S. D.)。圖16顯示了 variegin變體DVMK10R對凝血酶的抑制；DVMK10R是快的緊密結合的競爭性抑制劑。(A)以100 μ M S2238,DV24K10R(0. InM,0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM, IOOOnM和3000nM)對於凝血酶(1. 65nM)的抑制的劑量應答曲線顯示出隨著預溫育時間的增加而右移，這是由於切割造成的。沒有溫育時，IC5tl值是6.98士0.76nM(實線)；有20分鐘預溫育時，IC50值是12.01士0.41碰(虛線)(11 = 3，誤差條代表S. D.)。(B)由於DVMK10R作為快且緊密結合的抑制劑發揮作用，以100 μ MS2238，測定了 0. 39ηΜ,0. 78ηΜ,1. 56ηΜ,3. 13ηΜ,6. 25ηΜ,12. 5ηΜ,25ηΜ,50ηΜ,IOOnM 和 200ηΜ DV24K10R 對於凝血酶(1. 65ηΜ)的抑制(實線)。通過將數據擬合進入等式Vs = (ν。/2Κ){[(ν+Ι「Ε J^Ki'EJ^-(Κ,'+Ι,-Ε,)}而獲得的表觀抑制常數(Ki，)是8.27士0·85ηΜ。基於等式⑷ 計算的抑制常數(Ki)是0. 259士0.015nM(n = 3，誤差條代表S.D.)。圖17顯示=S-Variegin中的二肽序列vProl6-vftx)17 (黃色)的存在導致其骨架中的紐結。基於它們的凝血酶結構的s-variegin(粉色，僅顯示了 Ca的位置)和蛭素類似物-3(綠色，僅顯示了 Ca的位置)的覆蓋圖揭示了 vPhelS和vAspl9從蛭素類似物-3 的它們的對應殘基GlylO和Aspll移位3.16 A和1.70 A (通過Ca位置測定)(青色的雙箭頭)。因此，vAspl9側鏈以相反方向指向蛭素類似物-3中的類似的Aspll側鏈。蛭素類似物-3中的該Aspll與TArg73形成強離子對(白色)。由於vAsp 19的移位，TArg73NH2與 vAspl9 ODl之間的最接近的可能距離是9.22 A，這使得凝血酶-s-variegin結構中的這種相互作用不可能發生。圖18顯示了 variegin變體DV23對凝血酶的抑制；DV23是快的緊密結合的競爭性抑制劑。(A)以 100 μ M S2238, DV23(0. InM,0. 3nM,InM,3nM,IOnM,30nM,IOOnM,300nM, IOOOnM和3000nM)對於凝血酶(1. 65nM)的抑制的劑量應答曲線顯示出隨著預溫育時間的增加而右移，這是由於切割造成的。沒有溫育時，IC5tl是45.4士 1.6nM(實線)；有20分鐘預溫育時，IC50值是77. 8士6. InM(虛線)(n = 3，誤差條代表S. D.)。(B)以 100 μ M S2238,測定了 3. 91nM, 7. 81ηΜ, 15. 6ηΜ, 31. 3ηΜ, 62. 5ηΜ, 125ηΜ,250nM和500nM DV23對於凝血酶(1. 65nM)的抑制。通過將數據擬合進入等式Vs = (V。/2Et) {[(V+It-Et) MK/Et]"2-(K/+It-EtM 而獲得的表觀抑制常數(Ki')是 69.6 士 7·8ηΜ。基於等式K/= Ki(HSzKm)計算的抑制常數(Ki)是2. 19士0. 23ηΜ(η = 3，誤差條代表S. D.)。圖19顯示了 variegin變體DV23K10R對凝血酶的抑制；DV23K10R是快的緊密結合的競爭性抑制劑。(A)在存在 100 μ M S2238 的情況下，DV23K10R(0. InM, 0. 3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, IOOnM, 300nM, IOOOnM和3000nM)抑制凝血酶(1. 65nM)。切割後活性的喪失是迅速的， 如劑量應答曲線的強烈右移所示。沒有溫育時，IC5tl值是12. 9士 LOnM(實線)；有20分鐘預溫育時，IC50值是101.9士1.2碰(虛線)(11 = 3，誤差條代表S. D.)。(B)以 100 μ M S2238,測定了 3. 91nM, 7. 81ηΜ, 15. 6ηΜ, 31. 3ηΜ, 62. 5ηΜ, 125ηΜ, 250ηΜ和500ηΜ DV23K10R對於凝血酶(1. 65ηΜ)的抑制(實線)。通過將數據擬合進入等式 Vs = (V。/2Et) {[(K/ +It-Et)2+4Ki，EJ1MKi，+It-Et)}而獲得的表觀抑制常數(Ki')是 19. 1 士 1.9nM。基於等式 K/ = K^I+S/KJ 計算的抑制常數(Ki)是 0. 600士0. OlOnM(n = 3，誤差條代表S.D.)。圖20顯示了注射了不同肽的斑馬魚幼蟲的延遲阻塞時間(time-to-occlusion， ΤΤ0)。向斑馬魚4dpf (受精後天數)幼蟲中注射10η1500μΜ的不同肽或IOnl PBS作為對照。通過在注射肽或PBS之後雷射切除20分鐘使幼蟲尾靜脈損傷。記錄雷射切除之後的 ΤΤ0，持續150秒，以比較不同肽的抗血栓效應。PBS、蛭素類似物-1、s-variegin、EP25和 MH22 的 TTO 分別是 19. 0士3. 2 秒、45. 0士5. 5 秒、120. 8士7. 4 秒、22. 5士6. 2 秒和 33. 3士2. 9 秒。在150秒內，在注射了 DV24K10RYsulf的幼蟲中沒有形成血栓。除了慢結合抑制劑EP25 之外，肽的延長TTO的能力大體上與它們的Ki相關(n = 4誤差條代表S. D.)。圖21顯示了硫酸精蛋白的中和肽對於凝血酶胺裂解活性的抑制的能力使用發色底物 S2238 進行測定。將硫酸精蛋白(3mg/ml，lmg/ml，0. 3mg/ml，0. lmg/ml，0. 03mg/ ml，0. 0lmg/ml,0. 003mg/ml和0. 00lmg/ml)與濃度為其IC50的肽一起溫育10分鐘(實線)-8. 25nM s-variegin ( ■ )，11. 5nMMH22 ( ·)和 1. 4nM DV24K1 ORYsulf ( ▲)，然後加入凝血酶(1.65nM)。以100 μ M S2238測定凝血酶的胺裂解活性。比較了存在和不存在硫酸精蛋白的情況下的抑制百分比，以計算撤銷百分比。s-variegin和ΜΗ22可以被撤銷至相似程度，但是需要更高濃度的硫酸精蛋白以有效撤銷DV24K10RYsulf。以濃度為其IC90的肽進行了類似的實驗(虛線)對於s-variegin是 167nM( □)，對於 MH22 是 224nM(〇)，對於 DV24K10RYsulf 是 13. 6ηΜ( Δ )。需要更高濃度的硫酸精蛋白以撤銷所有3種肽。s-variegin和MH22仍然被中和至相同的程度，中和 DV24K10RYsulf則更難。因此，肽的酸性C-末端殘基最有可能負責與硫酸精蛋白的結合。本發明通過以下實施例進一步詮釋，以下實施例不應被解釋為限制性的。在本申請中引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容通過引用方式併入本文。
實施例在全部實施例中使用以下參數的實例和定義V= (VfflaxS)/(S+KJ其中V是反應的最初速率，S是底物S2238的濃度，Km是底物對於酶(凝血酶)的Michaelis-Menten 常數。y = A2+(A1-A2)/[l+(x/x0)H]其中y是抑制百分比，A2是右水平漸近線，A1是左水平漸近線，χ是抑制劑濃度的 loglO, X0是拐點，H是曲線的斜率。通過將『50』代入y計算IC5(1。Vs = (V。/2Et) {[(K/ +It-Et) ，Ej1/2- (Ki，+It-Et)}其中Vs是在存在抑制劑的情況下的穩態速率，V。在不存在抑制劑的情況下觀察到的速率，Et是總酶濃度，It是總抑制劑濃度，K/是表觀抑制常數。Ki' = K^I+S/KJ其中K/隨著S線性增大，Ki是抑制常數，S是底物濃度，Kffl是對於S2238的 Michaelis-Menten 常數。 V = (S+Km) / [ (VKi) + (S/ α Ki)]其中α是抑制劑對於酶針對酶底物的親和性的修飾常數，同樣地，底物對於酶針對抑制劑的親和性的效應。當一個的結合支持另一個時，α 1 ；當α = 1時，一個的結合對於另一個無影響。對於混合類型的非競爭性抑制齊IJ，α 1。Ki' = Ki其中K/隨著S增大而保持恆定，Ki是抑制常數，S是底物S2238的濃度，Km是 S2238 的 Michaelis-Menten 常數。P = Vft+ (Vi-Vf) (l_e-kt)/k+P。k = K4+K3It/ [It+lV (1+S/Km)]其中Ki是總體抑制常數。Ki = Ki" [K4/(K3+K4)]其中P是形成的產物的量，P。是產物的最初的量，Vf是最終穩態速率，Vi是初速率， t是時間，k是表觀一級速率常數。實施例1-結合於凝血酶的s-variegin的晶體結構的測定材料s4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPEQ、HEPES鈉鹽和聚乙二醇(PEG) 8000來自 Sigma Aldrich (St. Louis，Missouri，USA)。結晶託盤和油脂購自 Hampton Research (Aliso Vie jo, California, USA)。肽的合成、純化和質譜使用固相肽合成方法在 Applied Biosystems Pioneer Model 433AP印tide Synthesizer (Foster City, California, USA)上合成本研究中使用的所有肽。在預裝載了各個C-末端胺基酸的支持物樹脂上組裝合成的肽，其切割以釋放在C-末端具有游離羧酸的肽。通過DMF中的20% ν/ν哌嗪除掉胺基酸的Fmoc基團，並使用HATU/DIPEA以原位中和化學法偶聯。合成的肽從樹脂上的切割以及側鏈保護基團的切割通常使用TFA/1，2-乙二硫醇/茴香硫醚/水(90 4 4 2% ν/ν)的混合物在室溫進行，持續2小時。使用冷的乙醚沉澱合成的肽。將沉澱的肽溶解於水或0. 1% TFA中並凍幹，然後純化。通過RP-HPLC 在AKTATM純化系統(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上使用 SunFireTM C18(100 Α,δμπι ;250mm χ 10mm) (Waters,MiIford,Massachusetts)柱將合成的粗肽純化至勻質。通常使用由兩種溶劑的組合產生的優化的線性洗脫梯度(溶劑A^K 中的0. 1 % TFA ；溶劑B 水中的0. 1 % TFA和80%乙腈)洗脫肽。要特別注意的是含有硫代酪氨酸的肽(DV24Ysulf、DV24K10RYsulf和MH18Ysulf)，其中硫酸酯基團是酸不穩定的。使用90%含水TFA在冰上進行這些肽的切割，持續5小時，如之前所描述過的(Kitagawa等人，2001)。使用含有0. 1 % FA作為離子配對劑而非TFA的溶劑進行含有硫代酪氨酸的肽(DV24Ysulf、DV24K10RYsulf和MHlSYsulf)和含有磷酸酪氨酸的肽(DV24Yph°s和DVMK10RYph°s)的純化。在質譜分析的離子化過程中，Tyr27上的硫酸酯部分不穩定的，因此觀察到非硫酸化的物質。硫酸化肽的鑑定是基於(1)肽的非硫酸化的物質；(2)與酪氨酸殘基在^Onm吸收UV不同，硫代酪氨酸殘基不吸收；和(3)硫酸化和非硫酸化肽在RP-HPLC不共同洗脫。凝血酶α -凝血酶的兩種不同來源——重組α -凝血酶(基於人α -凝血酶的序列)和源自人血漿的凝血酶，均為 Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (KAKETSUKEN, Japan) ； 貝曾。α -HiTrap Desalting Column(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上以20mM碳酸氫銨(NH4HCO3)脫鹽並凍幹，然後用於結晶。源自人血漿的凝血酶用於測定肽對於凝血酶的抑制活性。凝血酶-s-variegin複合物的結晶修改並優化了已報導的用於結晶人α -凝血酶的凝血酶-蛭素原和凝血酶-蛭素類似物-I複合物的結晶條件(Skrzypczak-Jankun等人，1991)。將凍幹的s-variegin溶解於含有375mM NaCl的5OmM HEPES緩衝液(pH 7.4)中，達到8. ；34 μ M(3mg/ml)的濃度。然後，將脫鹽的、凍幹的、重組的α -凝血酶溶解於該s-variegin溶液中，達到5. 56yM(20mg/ ml)的終濃度。該混合物中的s-variegin的量相對於凝血酶為1. 5倍過量。使用懸滴氣相擴散法進行凝血酶-s-variegin複合物的結晶。通常而言，將1 μ 1蛋白溶液與1 μ 1沉澱劑緩衝液(IOOmM HEPES緩衝液pH 7. 4，其中含有20%-25% (w/v)PEG 8000)混合，然後在 4°C以Iml沉澱劑緩衝液進行平衡。在大約4周之後出現晶體，2周後收穫之以進行數據收集。設立、生長和收穫晶體的整個過程在冷室中進行，因為晶體在室溫是不穩定的。數據收集在數據收集之前，將晶體簡單地浸於含有母液的補充了 25% (ν/ν)甘油的冷凍保護溶液中，並閃冷於100Κ的氮(氣)冷流(Cryostream cooler, Oxford Cryosystem, Oxford, United Kingdom)。 在 Beamline X29(National Synchrotron Light Source, Brookhaven, USA)中測定同步加速器數據。使用Quantum 4-CCD檢測器收集數據集(表 1)。使用程序HKL2000 (Otwinowski and Minor，1997)處理衍射數據。晶體屬於單斜晶系空間組C2並衍射最大至2.7 A的解析度，a = 124.66 A，b = 50.83 A，c= 61.54 A和 V = 385390.59A3 Da-I，並對應於59. 09%的溶劑含量。結構之解決和精修使用MolR印程序(Vagin and Teplyakov, 2000)，通過分子替代法解決凝血酶-s-variegin複合物的結構。使用凝血酶_蛭素類似物_3結構的坐標(PDB代碼1ABI) Oiiu等人，199 作為搜索模型。旋轉搜索定位了非對稱單元中的一個凝血酶-肽複合物分子。確定轉換成分之後的剛性體精修給出了 0. 60的相關係數，並且R = O. 48。得到的電子密度圖質量很好。傅立葉和差別傅立葉圖譜清楚地顯示了 s-variegin的電子密度。使用 7. O版本的程序OCJ0nes等人，1991)進行的圖譜擬合和使用1. 1版本的程序CNS (Brunger 等人，1998)進行的精修的數個循環產生R值的收斂。結晶學和精修統計顯示於表1。使 用PR0CHECK(Laskowsi等人，1993)驗證該模型的空間化學的正確性。使用在線伺服器 PISA(Krissinel and Henrick, 2007)分析蛋白(圖 2)。表1-來自當前模型的結晶學數據和精修統計
結晶學數據和精修統計*
權利要求
1.產生修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)的方法，所述修飾的絲氨酸蛋白酶抑制劑顯示出靶絲氨酸蛋白酶(SP)的增強的抑制，所述方法包括修飾所述SPI以使所述SPI與其靶SP的結合使所述靶SP的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子移位。
2.權利要求1的方法，其中所述方法包括將能夠使所述靶SP的催化三元組的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子移位的一個或多個胺基酸殘基導入 SPI。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述方法產生修飾的SPI，其顯示出延長的抑制持續時間。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述的一個或多個導入的胺基酸殘基是通過置換或插入導入的。
5.權利要求2-4任一項的方法，其中所述的能夠使靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基或其一個或多個原子移位的一個或多個胺基酸殘基包括組氨酸殘基。
6.權利要求5的方法，其中所述一個或多個導入的胺基酸包括甲硫氨酸-組氨酸序列。
7.權利要求6的方法，其中所述一個或多個導入的胺基酸包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸序列。
8.權利要求7的方法，其中所述一個或多個導入的胺基酸包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸-蘇氨酸序列。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中靶絲氨酸蛋白酶的催化三聯體中被移位的一個或多個殘基包括催化性絲氨酸殘基。
10.權利要求1-8任一項的方法，其中所述方法進一步包括修飾SPI使其能被中和的步驟，包括將離子電荷區域導入SPI，其中所述離子電荷區域能夠與中和試劑上的相反離子電荷區域相互作用。
11.權利要求10的方法，其中將所述導入的離子電荷區域導向SPI的羧基末端。
12.權利要求10或權利要求11的方法，其中所述導入的離子電荷區域是陰離子電荷區域。
13.權利要求10-12任一項的方法，其中所述導入的離子電荷區域包括一個或多個酸性殘基。
14.權利要求13的方法，其中所述一個或多個酸性殘基包括一個或多個穀氨醯胺殘基。
15.權利要求10-14任一項的方法，其中所述中和試劑是硫酸精蛋白。
16.根據權利要求1-15任一項的修飾SPI的方法，其中所述SPI是凝血酶抑制劑。
17.根據權利要求16的修飾SPI的方法，其中所述SPI選自由SEQID NO: 14和17-153 中的任一項組成的組。
18.通過前述權利要求任一項的方法可獲得的或獲得的修飾的SPI，或其片段或功能等同物。
19.根據權利要求18任一項的修飾的SPI，其中所述修飾的SPI是凝血酶抑制劑。
20.權利要求19的修飾的SPI，其包含下列共有序列N-末端肽PX1-H-X2-(G)n-(外部位點 I 結合肽)(SEQ ID NO 771)。
21.根據權利要求19或權利要求20的修飾的SPI或其片段或功能等同物，其包含選自 SEQ ID NO :158-770任一項的序列或由選自SEQ ID NO 158-770任一項的序列組成。
22.編碼根據權利要求18-21任一項的修飾的SPI的核酸分子，或在高度嚴格雜交條件下與編碼權利要求18-21任一項的修飾的SPI的核酸分子雜交的反義核酸分子。
23.包含權利要求22的核酸序列的載體。
24.包含權利要求23的載體或權利要求22的核酸分子的宿主細胞。
25.抑制靶SP的方法，包括向受試者施用權利要求18-21任一項的修飾的SPI。
26.治療患有凝血病的受試者或預防受試者患上凝血病的方法，包括施用權利要求19 的修飾的凝血酶抑制劑。
27.在受試者中中和凝血酶抑制的方法，包括a)施用根據權利要求19的修飾的凝血酶抑制劑；和b)然後向受試者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。
28.顯示出靶SPI的增強的抑制的修飾的SPI，其中SPI與其靶SP的結合使所述靶SP 的催化三聯體中的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子移位。
29.權利要求28的修飾的SPI，其包括能夠使所述靶SP的催化三聯體的一個或多個胺基酸殘基或所述胺基酸殘基的一個或多個原子移位的一個或多個胺基酸殘基。
30.權利要求四的修飾的SPI，其中所述SPI顯示出延長的抑制持續時間。
31.權利要求四的修飾的SPI，其中所述能夠使靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基或其一個或多個原子移位的一個或多個胺基酸殘基包括組氨酸殘基。
32.權利要求四的修飾的SPI，其中所述能夠使靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基移位的一個或多個胺基酸殘基包括甲硫氨酸-組氨酸序列。
33.權利要求32的修飾的SPI，其中所述能夠使靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基移位的一個或多個胺基酸殘基包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸序列。
34.權利要求33的修飾的SPI，其中所述能夠使靶SP的催化三聯體的一個或多個殘基移位的一個或多個胺基酸殘基包括甲硫氨酸-組氨酸-賴氨酸-蘇氨酸序列。
35.權利要求觀-34任一項的修飾的SPI，其中所述靶絲氨酸蛋白酶的催化三聯體中被移位的一個或多個胺基酸殘基包括催化性絲氨酸殘基。
36.權利要求觀-34任一項的修飾的SPI，其進一步包括離子電荷區域，其中所述離子電荷區域能夠與中和試劑上的相反離子電荷區域相互作用。
37.權利要求36的修飾的SPI，其中所述離子電荷區域向SPI的羧基末端放置。
38.權利要求36的修飾的SPI，其中所述離子電荷區域是陰離子電荷區域。
39.權利要求36的修飾的SPI，其中所述離子電荷區域包括一個或多個酸性殘基。
40.權利要求39的修飾的SPI，其中所述一個或多個酸性殘基包括一個或多個穀氨醯胺殘基。
41.權利要求36-40任一項的修飾的SPI，其中所述中和試劑是硫酸精蛋白。
42.權利要求觀-41任一項的修飾的SPI，其中所述修飾的SPI是凝血酶抑制劑。
43.權利要求42的修飾的SPI，其含有下列共有序列N-末端肽 PX1-H-X2-(G)n-(外部位點 I 結合肽)(SEQ ID NO :771)。
44.修飾的SPI或其片段或功能等同物，其包含選自SEQID NO 158-770任一項的序列或由選自SEQ ID NO :158-770任一項的序列組成。
45.編碼根據權利要求觀-44任一項的修飾的SPI的核酸分子，或在高度嚴格雜交條件下與編碼根據權利要求觀-44任一項的修飾的SPI的核酸分子雜交的反義核酸分子。
46.包含權利要求45的核酸序列的載體。
47.包含權利要求46的載體或權利要求45的核酸分子的宿主細胞。
48.抑制靶SP的方法，包括施用權利要求觀-44的修飾的SPI。
49.治療患有凝血病的受試者或預防受試者患上凝血病的方法，包括施用權利要求42 的修飾的凝血酶抑制劑。
50.在受試者中中和凝血酶抑制的方法，包括a)施用根據權利要求42的修飾的凝血酶抑制劑；和b)然後向受試者施用足以引起凝血酶抑制的中和的量的硫酸精蛋白。
全文摘要
本發明涉及修飾絲氨酸蛋白酶抑制劑以獲得或增強多種理想性質中的任一項的方法，所述性質包括抑制程度、絲氨酸蛋白酶抑制劑被靶絲氨酸蛋白酶切割之後抑制的維持、與絲氨酸蛋白酶的結合速度、中和以及結合親和性。本發明還涉及此類修飾的產物和此類產物的用途，尤其是，它們在治療中的用途。
文檔編號C07K14/435GK102574909SQ201080030096
公開日2012年7月11日 申請日期2010年5月5日 優先權日2009年5月5日
發明者R·曼朱納塔·基尼, 庫瑪·順德拉墨爾西, 昆奇塔帕丹姆·斯瓦米納坦, 許祖堯 申請人:自然環境研究會