大規模生產A型肝炎病毒的方法

2023-10-18 07:04:39 5

專利名稱：大規模生產A型肝炎病毒的方法
技術領域：
本發明涉及在與微載體結合的VERO細胞中大規模生產A型肝炎病毒(HAV)的方法。本發明也提供從HAV感染的VERO細胞的細胞培養物上清液中分離HAV的方法。
背景技術：
A型肝炎持續引起傳染病、地方病、偶然死亡的散發病例並且是全世界的公共衛生問題。感染是由一組小的無包膜RNA病毒，細小核糖核酸病毒家族的成員A型肝炎病毒(HAV)引起的。病毒顆粒直徑為27-32nm並由單個多肽前體分子切割而成的三個多肽組成。成熟的病毒由多肽VP1、VP2和VP3組成。衣殼蛋白VP1和VP3含有主要的抗原位點並能誘導中和抗體(Lemon等人，1989，在Semler等人編輯的細小核糖核酸病毒的分子狀況和檢測(Molecular aspects ofpicornavirus and detection.)華盛頓特區ASM第193-208頁中)。
A型肝炎病毒(HAV)是可從細胞培養物中分離的唯一嗜肝病毒，但該病毒通常伴隨較長的培養期和無致細胞病變效應而難以繁殖。Binn等人(1984，臨床微生物學雜誌(J.Clincal.Microbiol.)，2028-33)測試了用於複製HAV的幾種靈長類細胞類型和用於分離和生產大量病毒的最適條件。HAV的無血清生產顯示在異雙倍體細胞系BSC-1細胞中，該細胞系直到現在也未用於製備施用於人類的疫苗。在滾瓶中培養21天後，可在上清液和細胞部分中發現病毒抗原。培養在無血清培養基中的細胞與含血清培養的細胞同樣支持病毒的生長。候選HAV疫苗從培養於無血清培養基的感染的BSC-1細胞的細胞和上清液體中獲得(Binn等人，1986，傳染疾病雜誌(J.Infect.Diseases)，153749-756)。然而，Simmonds等人(1985，環境微生物學應用(Appl.Enviromental Microbiol.)，49749-755)發現在2％-15％的不同濃度血清的培養基中持續感染的細胞BSC-1或AGMK細胞的HAV產量沒有顯著差異。初級AGMK細胞中的病毒產量是BSC-1細胞中產量的兩倍，但是產生的HAV主要保持細胞伴隨狀態並且只在培養液體中發現了少許病毒。Nasser等人(1987，環境微生物學應用(Appl.EnviromentalMicrobiol.)，532967-2971)報導在FRhK-4細胞培養物中以BSC-1培養物所需時間的一半或更少的時間產生了約七倍於BSC-1培養物的更多HAV，其中與細胞結合的HAV相對於BSC-1細胞釋放的HAV的比率分別計算為80％對20％。
Flehmig等人(1987，醫學病毒學雜誌(J.Medical Virol.)，227-16)從生長於含血清的培養基中的持續感染的正常人胚胎成纖維細胞的細胞培養物上清液中製備HAV。使用這些方法，在NUNC細胞工廠裡生產了大量的上清液並且從上清液分離和經多重步驟純化的HAV抗原可用於接種疫苗測試。
即使已經報導了幾種靈長類細胞類型支持HAV的複製，例如胎性恆河猴腎細胞系(FRhK-4)、原代非洲綠猴腎細胞(AGKM)、傳代非洲綠猴腎細胞(BCS-1)，這些細胞通常不被用於人類疫苗，因為已知猴腎經常具有高含量的潛伏猿猴病毒。其他細胞系由於這些細胞的致瘤特性而不能使用。大量生產原代人上皮細胞、成纖維細胞或腎細胞或細胞株以繁殖HAV也受限於這些細胞在培養中的低傳代數量。事實上，世界衛生組織(WHO)的適用方針指出只有少數的細胞系被允許用於病毒疫苗的生產。
目前被接受並被批准用於生產適用於人類的疫苗的細胞系是VERO細胞。VERO細胞是已被許可用於人類疫苗製造和目前用於生產脊髓灰質炎和狂犬病疫苗的傳代猴腎細胞系。已經嘗試利用VERO細胞生產HAV，但是已發現VERO細胞中HAV的複製受到限制，因為VERO具有病毒生長的溫度限制。此外，從未在感染細胞的上清液體中發現病毒(Locarnini等人，1981，病毒學雜誌(J.Virol.)，37216-225)。美國專利號4,783,407公開了在不高於33℃的溫度下於滾瓶中的VERO細胞中生產HAV以克服溫度限制。通過凍融培養的細胞並釋放細胞內生產的病毒而獲得HAV。基於在VERO細胞中繁殖HAV的商業化疫苗從未被描述。
迄今為止，甲醛溶液滅活的HAV疫苗已被生產以用於臨床試驗(Andre等人，1990，在Melnick編輯的醫學病毒學進展(Prog.Med.Virol.)，Basel，Karger 3772-95中，Armstrong等人，1993，肝臟學雜誌(J.Hepatology)，1820-26)並且能從初次感染中誘導長時間持久免疫和保護的兩種疫苗已是商業化適用的。目前適用的滅活HAV全病毒疫苗的生產方法使用人胚胎肺成纖維細胞系MRC-5作為Nunc細胞工廠(NCF)中的宿主細胞，其中用於疫苗生產的HAV抗原是從細胞內產生的病毒的細胞裂解物獲得的，因為HAV抗原不能有效地釋放到培養物的上清液中，而且濃縮大體積液體的方法是昂貴的(Bishop等人，1994，病毒學方法雜誌(J.Virol.Meth.)，47203-216)。來自細胞裂解物和細胞培養物上清液含有病毒體和原病毒體混合群HAV的大規模製劑(Bishop等人，1997，Arch.Virol.1422147-2160)以及商業化適用的疫苗包含完全成熟的病毒體和空的原病毒體顆粒(Andre 1990同上，Armstrong 1993同上)。此外，MRC-5細胞在組織培養中生長緩慢且需要胎牛血清。
在細胞培養中使用血清和/或使用衍生自動物或人來源的蛋白質添加劑出現的問題(例如，不同批次的變化的品質和組成以及受支原體、病毒或BSE試劑汙染的風險)是已知的。一般來說，血清或衍生自如白蛋白、運鐵蛋白或胰島素的物質的血清可能含有會汙染培養物和衍生自它們的生物產品的不需要的試劑。此外，必須測試人血清衍生的添加劑中能夠由血清傳染的所有已知病毒，如肝炎或HIV。牛血清或其衍生產品，例如胰蛋白酶，要承受BSE汙染的風險。此外，所有血清衍生產品都可能被未知試劑汙染。因此，作出許多嘗試以提供不需要血清或其他血清衍生的化合物的有效宿主系統和培養條件。
生產方法和培養基一樣重要。經濟上可行的唯一方法是反應器方法，因為可適應於市場的大小和所需疫苗的劑量按比例擴大規模。對於貼壁細胞使用經典微載體的載體方法是目前用於病毒繁殖所需的細胞的大規模培養的最好選擇。目前基於微載體培養的方法容許使用高達幾千升大小的發酵罐生產病毒抗原。
Widell等人(1984，病毒學方法雜誌(J.Virol.Methods)，863-71)使用FRhK-4細胞的微載體細胞培養系統來大規模生產HAV並發現了細胞內和細胞外病毒。每個使用微載體系統的細胞的病毒產量與生長於培養瓶中的常規培養物相似。另一方面，Junker等人(1992，細胞工程學(Cytotechnol.)，9173-187)顯示HAV感染的與常規Cytodex微載體結合的MRC-5細胞由於MRC-5細胞傾向於形成微載體和細胞的凝集物而與生長於培養瓶中的細胞相比只生產30％的HAV抗原。WO95/24468公開了在灌流系統中MRC-5細胞生長於凝集的玻璃包被的微載體上以用於HAV生產，其中在細胞中發現了大量的病毒。在所描述的系統中，2-10％的較高濃度的血清容許比0.5-2％的低水平濃度的血清生產更多的HAV。然而，當Aunins等人(1997，在Carrondo等人編輯的動物細胞工程學(Animal Cell Technology)第175-183頁中)比較了不同的製造技術例如Nunc細胞工廠(NCF)、微載體、靜置混合反應器和CellCubes，他們發現如WO95/24468中所描述的玻璃包被的微載體容許形成穩定的凝集物並生產HAV。但是單分散的微載體懸液不能維持培養物的生存期，並且在相似的條件下玻璃凝集微載體方法的生產率只有靜置培養的大約一半。Aunins等人1997(同上)得出結論使用HAV毒株的微載體培養是不可行的。
世界範圍的市場每年需要1億劑量量級的HAV疫苗。有效的疫苗生產需要大規模數量的病毒的生長以從宿主系統中獲得高產量。方法和病毒毒株生長的培養條件對於獲得令人滿意的高產量毒株極其重要。因此，為了獲得所需病毒的最大產量，必須對系統和培養條件進行特異地調適以提供有利於所需病毒生產的環境。因此，存在對生產病毒和抗原的安全有效的方法的連續需求。此外，也需要病毒繁殖的方法，使用已經可利用的材料並且需要最少數量的耗時操作，其中對宿主細胞、培養基、生長條件和生產系統的組合進行篩選對於獲得有效的生產方法是很重要的。
發明概述本發明的一個目的是提供生產HAV抗原的方法。
本發明的另一個目的是提供在無血清或無血清和蛋白質的培養基中生產HAV的方法。
本發明的另一個目的是提供在細胞培養的傳代培養和傳代中不使用衍生自動物的蛋白酶的HAV生產。
本發明的另一個目的是提供完全HAV顆粒的分離。
本發明還有一個目的是提供用HAV感染的無血清或無血清和蛋白質的連續產生HAV抗原的VREO細胞培養物。
優選實施方案的詳述根據這些和其他目的，本發明提供用於連續生產A型肝炎病毒生產的方法，包括下列步驟提供與微載體結合的VERO細胞的無血清細胞培養物，用HAV感染該VERO細胞的無血清細胞培養物，孵育用HAV感染的該VERO細胞的無血清細胞培養物以繁殖所述的HAV，其中將HAV連續地釋放到細胞培養基中；以及收穫所述的釋放到細胞培養基中的HAV。
根據本發明的方法，與微載體結合的VERO細胞於約37℃的溫度下生長在無血清培養基的條件下。該細胞從原始安瓿瓶的VERO細胞生長至用於在無血清培養基中大規模生產的發酵罐中的大規模生物量。用HAV感染前，將細胞培養的溫度減低至約34℃並且進一步在此溫度下進行病毒的繁殖。
VERO細胞可在細胞培養物生長的過程中結合於球形或多孔的微載體上。該微載體可選自基於葡聚糖、膠原蛋白、塑料、明膠和纖維素以及其他如Butler描述(1988，在CpierGriffiths，動物細胞生物工程學(Animal cell Biotechnology)3283-303中)的微載體。在細胞培養物生長和病毒感染過程中可使用相同的微載體類型。因此，根據本發明的一個實施方案，無血清VERO細胞在球形微載體上培養並感染。根據本發明的另一個實施方案，無血清VERO細胞在多孔的微載體上培養並感染。也可以在球形微載體上生長細胞至一定的生物量並且當其達到發酵罐的最終生物量時以及在多孔的微載體上感染之前傳代培養細胞或反之亦然。根據本發明的這個方面，無血清的VERO細胞在球形微載體上培養並且當細胞結合到多孔的微載體上時用病毒感染該細胞。球形微載體選自有光滑表面的微載體，例如CytodexI、CytodexII、CytodexIII(都為Pharmacia)而多孔微載體選自例如Cytopore、Cytoline(都為Pharmacia)。
結合微載體的VERO細胞用HAV以約0.01-約5的感染複數(m.o.i.)感染。
已經發現在上述條件下，HAV連續釋放到細胞培養基的上清液中。這是未預見到的，因為使用VERO細胞作為HAV宿主的現有技術公開了HAV只能在細胞內發現並且必須從細胞中才能獲得所產生的病毒(US4,783,407)。
本發明的方法提供了HAV的生產，其中HAV連續產生並釋放到細胞培養物的上清液中。在本發明的方法中HAV能生產至少60天。現有技術未描述可連續生產HAV如此長時間的細胞培養系統。通過使用微載體培養系統和細胞培養物灌流，含有病毒的培養基連續地從細胞培養物中移去，加入新鮮培養基並連續地灌流。本發明的方法提供了含有能從細胞培養物上清液中收穫和純化的HAV的大體積培養基。
最適細胞培養條件的參數是pH為約6.5-約8.0，O2濃度為約15％-約40％，攪拌速度為約20-約70rpm，以及溫度為34℃±0.2℃或37℃±0.2℃。優選地，培養條件在病毒生產的整個過程中保持恆定。
使用直接從用於病毒疫苗生產的初級感染的細胞培養物獲得的病毒分離物承受了被其他病毒或未知試劑汙染的風險。病毒原種和細胞培養物的汙染可通過使用衍生自確定的HAV原種的病毒原種而得以避免。
任何HAV毒株可根據本發明的方法生產。根據本發明的一個實施方案，用通過使用全長HAV cDNA體外轉錄成HAV RNA並感染VERO細胞而獲得的HAV種病毒感染細胞。通過使用編碼用於種病毒生產的HAV的cDNA，獲得了確定的同種病毒原種。用作種病毒和病毒原種的HAV可以是例如HAV HM175/7。
除了用於細胞培養的血清或其他蛋白質添加劑外，添加衍生自動物來源的胰蛋白酶承受了未知試劑汙染細胞培養物的風險。通常，在細胞培養物的傳代培養和傳代過程中使用來自動物來源的胰蛋白酶以獲得細胞生物質。為了在HAV病毒的生產過程中避免衍生自未知試劑和來源的任何汙染，在本發明的方法中，優選地使用源自於微生物來源的蛋白酶用於生產來自於原始安瓿瓶的細胞生物質。
根據本發明的一個方面，將用於本發明的HAV生產中的細胞培養物由原始安瓿瓶傳代培養為工作細胞庫並通過使用微生物蛋白酶或具有胰蛋白酶樣活性的微生物蛋白酶進行傳代。
根據一個優選的實施方案，使用純化的微生物蛋白酶的胰蛋白酶樣酶。特別的，該胰蛋白酶樣酶是灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseus)胰蛋白酶(SGT)，使用鏈黴蛋白酶的純化級分。純化的SGT優選地通過在苯甲脒上的親和層析方法和用含有約0.5-約1.2M精氨酸的洗脫劑洗脫純化的SGT獲得。已發現通過該方法純化的SGT非常有效並且由於其高比活性，使用時可相應減少加入培養基的蛋白質。通過本領域公知的其他方法從鏈黴蛋白酶純化所得的SGT也可以用於本發明的方法中。這樣的方法包括由Yokosawa等人(1976，生物化學雜誌(J.Biochem.)79757-763)描述的方法或其他層析方法。
根據本發明的另一個優選的實施方案，無血清和蛋白質的培養基被用於細胞培養和生長中。通過只使用被確定過來源的，例如未添加用於細胞生物質生產和病毒繁殖的作為生長添加劑的血清或蛋白質的最小培養基，提供了安全的病毒疫苗的生產方法。
根據另一個方面，本發明提供了分離完全的A型肝炎病毒顆粒的方法，包括下列步驟提供與微載體結合的VERO細胞的無血清細胞培養物，用HAV感染該細胞培養物，孵育用HAV感染的細胞培養物以繁殖HAV，其中將HAV連續地釋放到細胞培養基中；收穫所產生的並釋放到細胞培養基中的HAV，以及從所述細胞培養物的上清液的HAV收穫物中分離完全的HAV顆粒。
術語「完全的HAV顆粒」是指含有RNA的HAV成熟顆粒，包含衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的感染性HAV病毒體顆粒，以及含有VP1、VP3和VP0前體多肽的未成熟原病毒體。
完全的HAV顆粒可通過本領域公知的方法，例如過濾、離心、沉降或層析方法分離。離心可在蔗糖梯度或CsCl梯度上進行。離心前可通過例如過濾除去較大的細胞碎片。
根據另一個方面，本發明提供了HAV感染的與微載體結合的無血清VERO細胞培養物，其中與載體結合的細胞連續地生產和釋放HAV至細胞培養基中。本發明的HAV感染的細胞培養物可連續釋放HAV至少60天。
根據本發明的一個優選方面，提供了HAV感染的與微載體結合的VERO細胞的無血清和蛋白質的細胞培養物，其中與載體結合的細胞連續地生產和釋放HAV抗原至細胞培養基中。
現已大概描述了本發明，通過參考下述的實施例將理解本發明，除非特別指出，在此提供這些實施例的目的只是在於說明而不是想要限制本發明。
實施例1在VERO宿主細胞系統中HAV的繁殖檢測HAV毒株HM175/7(由Robert Purcell提供，國家健康學院，Bethesda，馬裡蘭州)在VERO細胞微載體培養物中的繁殖，該毒株最初分離自臨床樣本並已在原代非洲綠猴細胞中連續傳代，這種傳代導致了對該病毒毒株的減毒作用。
利用VERO細胞(非洲綠猴，Cercopthecus aethiops，腎)作為生產細胞系。該細胞從馬裡蘭州洛克菲勒的美國典型培養物保藏中心獲得，傳代數為124，保藏號為ATCC CCL 81。如Kistner等人(1998，疫苗(Vaccine)16960-968)或WO96/15231中所描述的，細胞適應於生長在有血清、無血清或無血清和蛋白質的培養基中。對於在無血清培養基中的生長，使用補充有無機鹽、胺基酸、碳酸氫鈉(2g/l)和酵母或大豆提取物(1-10g/l)的DMEM HAM’s F12基本培養基。製備工作細胞庫未使用任何動物衍生的培養基成分。
將存在於與Ham’s F12營養混合物以1∶1的比例混合的DMEM培養基中的一安瓿瓶工作細胞庫(WCB)的VERO細胞重懸於含有血清的培養基中和補充有大豆或酵母提取物(0.1-10％)的無血清培養基中。利用純化的灰色鏈黴菌胰蛋白酶(1μg/ml)進行傳代培養以避免衍生自可能包含任何致病試劑的動物來源的任何試劑。在扁瓶(Roux)和滾瓶中傳代培養後，6-8×107細胞/克微載體(CytodexIII，Pharmacia)被接種入12L攪拌的發酵罐中。細胞於37℃生長6-8天。氧飽和度為20％+/-10％，pH7.1+/-0.2的培養條件保持恆定以及攪拌速度為30-60rpm。接種後的第二天，細胞密度為6×105-1×106細胞/ml時將HAV HM175/7的病毒懸浮液以0.1-1.0的感染複數(m.o.i.)，以34℃或37℃的溫度泵入發酵罐。兩小時後，容許病毒吸附，開始灌流培養基。每天交換發酵罐一半體積的新鮮培養基。將微載體和貼附的細胞通過濾網保留在發酵罐中。在發酵過程中控制pH7.1，O2(30％)，攪拌速度(30-60rpm)以及溫度為34℃或37℃。


圖1A顯示在無血清培養基和含血清(FCS)培養基中在34℃下VERO細胞中生產的HAV。圖1B顯示在無血清培養基和含血清(FCS)培養基中在37℃下VERO細胞中生產的HAV。感染後7、14、21和28天，在細胞培養物的上清液和細胞顆粒中的抗原產量通過HAV特異的ELISA測定(Mediagnost)的方式確定。確定細胞培養物上清液中每107個VERO細胞的抗原濃度。計算ELISA單位(EU)，以在ELISA檢測中給出陽性反應的最高抗原稀釋度的倒數值表示。
在VERO細胞中HAV毒株HM175/7在34℃的較低溫度下比在37℃下複製得好，並且無血清的比有血清的好(圖1A和1B)。在37℃的含血清的培養基中不能觀察到病毒抗原生產，而在37℃的無血清的培養基中(較高的感染複數)產生了病毒。用0.1或1的HAV感染複數感染無血清VERO細胞後，從在34℃下感染後第三周的上清液和細胞顆粒中檢測到抗原產量升高了(圖1A)。在生長於34℃的含血清培養基中的細胞培養物中，病毒抗原絕大多數存在於細胞顆粒中，而於34℃的無血清培養基中培養的VERO細胞中病毒抗原連續地釋放到細胞培養物的上清液中，其中約50％的病毒抗原出現在培養基上清液中。
實施例2用於大規模生產的HAV病毒原種的製備在細菌質粒pHAV/7(Cohen等人，1987，病毒學雜誌(J.Virol.)613035-3039)中克隆的減毒毒株HN175/7基因組的全長cDNA經體外轉錄而被用於製備全長基因組RNA。將34℃的無血清VERO細胞用體外轉錄的HAV RNA轉染以產生無外來試劑的病毒原種。6周後，在感染細胞的裂解物中檢測到HAV的特異性抗原，該細胞被進一步用於在無血清條件下的VERO細胞中繁殖HAV。表1顯示連續傳代後所產生的抗原和病毒的滴度。感染細胞將大約50％的病毒抗原釋放到細胞上清液中。在第4代後，病毒原種具有8×107TCID50/ml的滴度。
表1HAV毒株HM175/7在轉染無血清VERO細胞後連續傳代的抗原和病毒的滴度
將連續傳代後獲得的病毒原種HM175/7用於在微載體系統中大規模生產HAV抗原。
實施例3在無血清培養基的VERO細胞中繁殖HAV HM175/7將根據實施例2獲得的HAV HM175/7於34℃在無血清VERO細胞中進行連續傳代。在感染後7、14和21天測定感染性滴度和抗原的數量(表2)。
表2在34℃無血清的VERO細胞中HAV毒株HM175/7的繁殖
11分別在細胞顆粒和細胞培養物的上清液中獲得每5×107個細胞為5×108和2×109的病毒滴度。這證明病毒抗原由無血清VERO細胞持續不斷地釋放到細胞培養物的上清液中。感染後(p.i.)三周細胞培養物的上清液中病毒抗原的百分數為約50％，同時大約75％的感染性定位於此(表2)。
實施例4在微載體上繁殖的無血清VERO細胞中生產HAV將包含生長於微載體(CytodexIII，Pharmacia)上的無血清培養基中的2×1010VERO細胞的6L發酵罐用根據實施例2獲得的HAV毒株HM175/7以0.5的m.o.i進行感染。在34℃的長時間發酵過程中重複檢測細胞和細胞培養物上清液中的抗原數量。為了檢測細胞內產生的HAV，收穫來自細胞培養物的VERO細胞並在PBS中將細胞密度調節為2×107細胞/ml，再經三個循環的凍融裂解。低速離心後，經ELISA測定檢測細胞碎片和細胞培養物的上清液中的感染性滴度和抗原數量。
從感染後11天起，在細胞培養物上清液中檢測到HAV抗原數量逐步向上升高。發酵過程連續進行並且在35天期間內取樣(表3)。此時細胞仍能存活並生產HAV抗原。匯合23至25天的上清液並經計算產生的HAV抗原總數量為2.5×106ELISA單位。
表3感類的VERO微載體細胞培養物的抗原產量
實施例5大規模HAV生產方法的建立為了建立大規模的發酵方法，研究了繁殖HAV的不同策略。
將在無血清條件下繁殖並分匯合的VERO細胞接種於不同類型的球形或多孔的微載體上，例如CytodexIII、Cytoline或Cytopore上，所有的類型都適於長期培養過程。
在將細胞接種於不同類型的微載體上兩天後，將VERO細胞用HAV以1.0的m.o.i.感染。在10L發酵罐中在34℃用無血清或無血清和蛋白質的生長培養基連續灌流進行細胞繁殖。在培養期間針對細胞培養物的上清液測試HAV抗原。
將數據總結在表4中。
表4在不同的微載體上VERO繁殖後HAV抗原的產量(EU/ml)
表4的數據顯示與多孔微載體結合的細胞連續生產HAV抗原至少83天的長時間。接種於光滑微載體上的細胞最初生產較高的病毒抗原滴度，但在一段時間後細胞表現得趨向於凝集。
實施例6與微載體結合的無血清或無血清和蛋白質的VERO細胞的長期繁殖為了大規模地生產HAV病毒，在無血清或無血清和蛋白質的培養基條件下生長至1×1011生物量的VERO細胞被接種於多孔微載體上。用HAV以0.1的m.o.i.感染細胞。於34℃用細胞培養基持續灌流，感染細胞的繁殖進行了多達350天。當在培養基中檢測到病毒抗原時，收集含有病毒的上清液並於4℃保存。在感染後35-45天開始收穫無血清細胞培養物的上清液。計算所得病毒抗原在100l發酵罐中每升培養基每60天的疫苗劑量的平均產量並總結在表5中。
表5VERO細胞中HAV的產量和100L規模的生產率的計算
實施例7從細胞培養物的上清液中純化HAV抗原將從實施例6中所描述的灌流培養基收集的包含HAV抗原的細胞培養物的上清液通過低速離心或深度過濾器從細胞碎片中分離，並通過利用50K Omega膜(截止值50000Da，Filtron)超過濾濃縮。濃縮物通過20％-60％蔗糖梯度離心進一步純化並分級分離。通過定性的ELISA測定(Mediagnost)每個級分來測試HAV抗原。HAV抗原匯集在兩個峰級分中。分別匯集各個峰級分並通過高速離心濃縮。
在上述過程中，確定抗原的數量和蛋白質的含量。將兩個峰的匯集級分通過使用HAV多肽VP0、VP1和VP3及其混合物的特異性抗體的蛋白質印跡分析進行檢測。峰的匯集級分12-19由成熟病毒體組成(由於存在衣殼蛋白VP2和缺失VP0)。峰匯集級分22-25含有原病毒體和/或前原病毒體。
這顯示通過上述的方法，在大規模的生產過程中HAV被生長在無血清或無血清和蛋白質的培養基中的持久感染的VERO細胞連續地釋放到細胞培養基中。
分別收集級分12-19和22-25，讓病毒製品接受病毒滅活方法處理並且將滅活的製品配製在疫苗組合物中。
實施例8從鏈黴蛋白酶純化灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶a)離子交換層析將30g鏈黴蛋白酶(Boehringer Ingelheim)溶解於緩衝液A(0.02吡啶，pH5.0)中至鏈黴蛋白酶的終濃度為40mg/ml。將25ml該溶液在用緩衝液A平衡的CM Sepharose C1 6B(Pharmacia)上接受陽離子交換層析處理。利用5倍於柱體積的緩衝液A(0.02M吡啶)和緩衝液B(0.75M吡啶pH5.0)的線性梯度在室溫下進行洗脫。
通過以1∶1的比例混合級分樣品和大豆抑制劑(例如1mg大豆抑制劑/100μg蛋白質)隨後使用S2222進行層析底物測定來測試所收集的級分的抑制特性。結果以每分鐘的Δ吸光度單位(ΔA/min)表示。對大豆抑制劑具有最高抑制活性的級分經SDS-PAGE進一步分析並用考馬斯染色。
胰蛋白酶的活性通過使用N-苯甲醯基-精氨酸乙酯(BAEE，Tris緩衝液pH8.0，20mM CaCl2中，25℃)作為底物的顯色測定法進行檢測並確定每分鐘的Δ吸光度單位。使用具有13×103U/mg比活性的豬胰蛋白酶溶液(1mg/ml)作為對照參考。將比活性定義為每mg蛋白質的胰蛋白酶酶活力單位。結果總結在表1中。
胰凝乳蛋白酶活性通過使用3-羧甲氧基丙醯基-L-精氨醯基-L-丙基-L-酪氨酸-對-硝基苯胺鹽酸鹽(S-2586，Chromogenix)的顯色測定法進行檢測。結果以每分鐘的Δ吸光度單位表示(ΔA/min)。
表6通過離子交換層析純化鏈黴蛋白酶
*n.d.不確定表6顯示經用大豆抑制劑進行的抑制試驗測定，含有具有胰蛋白酶樣活性的蛋白質的級分可通過離子交換層析純化並具有高於鏈黴蛋白酶約10倍的比活性且回收率約為70％。然而，該蛋白質不穩定並且在SDS-PAGE中不顯示為單一條帶，而是多條帶。這指示了蛋白質的斷裂和自動切割。
b)在固定化的苯甲脒上的親和層析在用緩衝液A(50mM Tris，0.5M NaCl pH7.0)平衡的苯甲脒瓊脂糖凝膠6B速流(Pharmacia)柱上加載40ml鏈黴蛋白酶溶液(75mg/ml，緩衝液A)。用緩衝液B(50mM Tris，0.5M NaCl pH7.0，10mM苯甲脒鹽酸鹽pH7.0)、緩衝液C(0.5M NaCl，0.6M精氨酸，pH5.5)或緩衝液D(0.5M NaCl，1M精氨酸，pH5.5)進行洗脫。
如實施例8A中所描述，利用大豆抑制劑測試所收集級分的抑制特性，以及胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性。確定比活性，以每mg蛋白質的酶活力單位表示。
表7通過在固定化的苯甲脒上的親和層析來純化鏈黴蛋白酶並用苯甲脒洗脫
表7中總結的結果顯示通過用苯甲脒進行競爭性洗脫，回收到60％的純化的鏈黴蛋白酶的胰蛋白酶樣活性，比活性為約140U/μg蛋白質。然而，優選地進一步純化含有純化的胰蛋白酶樣蛋白酶的級分並且在用於涉及細胞培養生長或應用於人的生物製品的生產過程之前除去苯甲脒。
表8通過在固定化的苯甲脒上的親和層析純化鏈黴蛋白酶並用0.6M精氨酸和1M精氨酸洗脫
(C.2)Ba2+形式的SAC樹脂分離用第二次Ba2+形式的SAC樹脂分離純化由前一步驟(分離C.1)獲得的甘露糖級分。使用與以上的分離(C.1)相同的分離條件。
由分離獲得的甘露糖級分具有以DS表示63％的純度，甘露糖的產率為68％。以DS百分數表示的甘露糖和木糖級分的組成列於表4中。
表4.
用Ba2+形式的SAC樹脂進行的第二次分離的甘露糖和木糖級分組成
木糖級分還含有40％的甘露糖。
分離(C.2)的濃度曲線如圖3所示。
權利要求
1.一種用於連續生產A型肝炎病毒的方法，包括下列步驟提供與微載體結合的VERO細胞的無血清細胞培養物，用HAV感染該VERO細胞的無血清細胞培養物，孵育用HAV感染的該VERO細胞的無血清細胞培養物以繁殖所述的HAV，其中HAV被連續地釋放到細胞培養基中；以及收穫所述釋放到細胞培養基中的HAV。
2.根據權利要求1的方法，其中所述細胞在約37℃的溫度下生長。
3.根據權利要求1或2的方法，其中在感染前將所述溫度降低到約34℃。
4.根據權利要求1至3中任意一項的方法，其中所述微載體選自球形或多孔的微載體。
5.根據權利要求1至4中任意一項的方法，其中所述微載體包括葡聚糖、明膠、膠原蛋白、塑料或纖維素。
6.根據權利要求1至5中任意一項的方法，其中用HAV毒株HM175/7的接種病毒感染所述細胞。
7.根據權利要求1至6中任意一項的方法，其中用HAV以約0.01-約5.0的感染複數感染所述細胞。
8.根據權利要求1至7中任意一項的方法，其中從工作細胞庫中傳代培養所述的細胞培養物，並通過使用微生物蛋白酶或微生物來源的胰蛋白酶樣的酶對所述的細胞培養物進行傳代。
9.根據權利要求8的方法，其中所述的微生物蛋白酶是灰色鏈黴菌鏈黴蛋白酶的胰蛋白酶樣的酶。
10.根據權利要求1至9中任意一項的方法，其中連續生產HAV至少60天。
11.根據權利要求1至10中任意一項的方法，其中所述VERO細胞的無血清細胞培養物是VERO細胞的無血清和蛋白質的細胞培養物。
12.根據權利要求1至11中任意一項的方法，進一步包括從所述細胞培養物的上清液的HAV收穫物中分離完全的HAV顆粒的步驟。
13.根據權利要求12的方法，其中所述的完全的HAV顆粒是通過等密度離心而得到分離的。
14.一種HAV感染的與微載體結合的VERO細胞的無血清細胞培養物，其中與所述載體結合的所述細胞連續地將HAV抗原釋放到細胞培養基中。
15.一種HAV感染的與微載體結合的VERO細胞的無血清和蛋白質的細胞培養物，其中與所述載體結合的所述細胞連續地將HAV抗原釋放到細胞培養基中。
全文摘要
本發明提供在與微載體結合的VERO細胞中大規模生產A型肝炎病毒(HAV)的方法。本發明也提供從HAV感染的VERO細胞的細胞培養物的上清液中分離HAV的方法。
文檔編號A61K39/29GK1617923SQ02827636
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月10日 優先權日2001年12月10日
發明者H·邁爾, M·賴特爾, W·蒙德特, N·巴雷特, F·多納 申請人:巴克斯特健康護理股份有限公司