共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶製備門冬氨酸鳥氨酸的方法
2023-10-23 15:05:47
專利名稱：共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶製備門冬氨酸鳥氨酸的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術生產門冬氨酸鳥氨酸的技術領域，涉及通過基因工程共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶，繼而微生物酶法轉化生產門冬氨酸鳥氨酸的方法。
背景技術：
門冬氨酸鳥氨酸，化學名稱為(S)-2，5-二氨基戊酸-(S)-2-氨基丁二酸鹽，是L-天門冬氨酸與L-鳥氨酸經過化學反應而形成的鹽，分子式為C9H19N306。門冬氨酸鳥氨酸在體內形成門冬氨酸和鳥氨酸，直接參與尿素循環。鳥氨酸是尿素循環中的起始底物，是鳥氨酸氨基甲醯轉移酶和氨基甲醯磷酸合成酶的活化劑，與血液循環中氨等有毒代謝物結合，促進尿素合成，加速體內有毒物質特別是氨的代謝；天門冬氨酸則參與幹細胞中穀氨醯胺和核酸的合成，既可促進肝臟內穀氨醯胺的合成，又間接參與三磷酸循環和核酸的合成，並提供能量代謝的中間產物，促進肝細胞自身的修護和再生，回復肝臟功能，增強肝臟解毒功能，從而能迅速降低體內異常升高的血氨濃度。門冬氨酸鳥氨酸有顆粒劑和注射劑兩種劑型，最先於20世紀70年代在德國用於臨床，1991年收載德國藥典，並被美國FDA批准用於治療肝性腦病。目前門冬氨酸鳥氨酸的製備方法主要可以歸納為兩大類第一類，是以L-精氨酸為初始原料，採用化學或生物催化方法製備L-鳥氨酸中間體，繼而加入L-天門冬氨酸，製備門冬氨酸鳥氨酸。德國專利(DE4020980)採用精氨酸酶催化精氨酸生成鳥氨酸，再與L-天門冬氨酸反應而得。但其所採用的精氨酸酶價格昂貴，工藝成本高，不具備工業化價值。中國專利(CN101843587A)以精氨酸為原料，加入氫氧化鋇使精氨酸水解為鳥氨酸，再加入天門冬氨酸，攪拌反應後，加入鋇離子沉澱劑以去除鋇離子，再用有機溶劑進行重結晶。該方法引入鋇離子和有機溶劑，汙染環境且成本較高。第二類，是以L-鳥氨酸鹽酸鹽或硫酸鹽為初始原料，採用樹脂柱或化學方法獲得游離L-鳥氨酸，繼而與L-天門冬氨酸成鹽。英國專利(GB965637)方法一是將L-鳥氨酸鹽酸鹽溶解於水，通過陽離子交換樹脂獲得游離L-鳥氨酸，再與L-天門冬氨酸在水溶液中，通過加入甲醇析出結晶，但此方法採用了離子交換樹脂，操作複雜；方法二是梯度結晶，採用消旋的游離DL-鳥氨酸與L-天門冬氨酸先在水溶液中溶解，再加入甲醇析出D-鳥氨酸門冬氨酸鹽，過濾後的母液繼續加入甲醇，析出L-門冬氨酸-L-鳥氨酸鹽，此方法梯度結晶不容易控制，得到的產品純度較差，且成鹽拆分收率低。英國專利(GB1067742)採用強酸性離子交換樹脂來使L-鳥氨酸鹽酸鹽游離，再與L-天門冬氨酸成鹽，經過結晶處理，最後得收率52%的L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽一水合物。該方法採用樹脂脫鹽，且收率較低，不環保。歐洲專利(EP477991)將L-鳥 氨酸鹽酸鹽水溶液通過Diaion SKIB樹脂吸附，氨水解吸附，脫氨後與L-天門冬氨酸成鹽，加入甲醇回流處理，獲得結晶，該方法同樣具有汙染環境、成本高等缺點。中國專利(CNlO 1798275A)將L-鳥氨酸醋酸鹽溶解於水後，加入L-天門冬氨酸，然後用氨調PH至6-9，活性炭脫色，極性有機溶劑重結晶，該方法引入了大量的有機溶劑，成本較高。中國專利(CN101100435A)將L-鳥氨酸硫酸鹽溶解於水中，加入L-天門冬氨酸，加熱溶解後，用過量氫氧化鋇中和硫酸，過濾，用樹脂螯合殘餘的鋇離子，過濾除去樹脂，減壓濃縮溶液，活性炭脫色，無水乙醇結晶製得，該方法引入了劇毒的鋇離子，且需採用樹脂去除金屬離子，操作工藝複雜，耗時長。中國專利(CN102475697A)以L-鳥氨酸鹽酸鹽為原料，加入氫氧化鈉，然後加入天門冬氨酸反應後，採用納濾技術一步實現脫鹽、濃縮，濃縮液加入極性有機溶劑進行重結晶。酶法生產鳥氨酸是利用動植物或微生物體內的精氨酸酶作催化劑，水解精氨酸，生成鳥氨酸和尿素，反應式見圖1。不過，精氨酸酶的來源不易。傳統的酶法採用的精氨酸酶一般提取自動物的肝臟，或者來自某些微生物菌株體內，直接以微生物細胞作為轉化體系來生產鳥氨酸。這些菌株的生長周期一般不少於24h，且由於其自身表達酶活水平有限，在轉化體系中添加一定量的酶源細胞後，勢必轉化後的分離提取工藝相對繁瑣。生物酶法是目前工業上合成L-天門冬氨酸的主要方法。其原理見圖2，是利用天門冬氨酸酶催化延胡索酸和氨加成反應生成L-天門冬氨酸。該方法具有收率高、光學純度 高的優點。生物酶法又可分為固定化細胞法(也稱固定化酶法)和游離細胞法(游離酶法)。與固定化細胞法生產L-天門冬氨酸相比，游離細胞法工藝流程簡潔、設備投資少、生產成本低，具有較強的市場競爭力。綜上，現有的天門冬氨酸鳥氨酸的製備方法存在以下不足化學合成方法，都經過了一個鳥氨酸鹽酸鹽、醋酸鹽或硫酸鹽的中間體，增加了反應的操作過程，降低了收率。且由於引入的C1_、CH3C00_或S042_等離子雜質，給產物的分離純化帶來麻煩，增加了成本。而以L-精氨酸為初始原料的方法中，酶法所採用的精氨酸酶價格昂貴，工藝成本高，不具備工業化價值。化學法引入鋇離子和有機溶劑，汙染環境且成本較高。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的上述不足，提供一種新的天門冬氨酸鳥氨酸製備方法，該方法操作簡便、成本低廉、綠色環保。本發明提供的共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶製備門冬氨酸鳥氨酸的方法包括首先PCR擴增來源於枯草芽孢桿菌的天門冬氨酸酶基因，採用基因工程方法構建重組表達質粒pET-20b (+) -asp ;然後以pET-20b (+) -asp為模板，PCR擴增獲得產物為5 』端帶有T7啟動子和rbs序列的天門冬氨酸酶基因，採用基因工程方法，將該基因克隆到pET-24a(+) -arg中，獲得重組質粒pET_24a(+)-arg-asp ;將重組表達載體轉化至E. coliBL21 (DE3)，獲得共表達基因工程菌株BL21 (DE3)-pET24a (+)-arg-asp。以該重組菌為酶源，在同一個反應體系中，分別催化底物L-精氨酸和延胡索酸銨，其中底物L-精氨酸的用量為O.1至lmol/L，延胡索酸銨的用量為O.1至lmol/L，菌體的添加量為4_6g/L，在30至45°C下，pH8至10,以lmmol/L無水硫酸鎂為輔助因子,經酶法轉化反應4至12h,生成L-鳥氨酸和L-天門冬氨酸；收集轉化液後，通過I萬截留分子量中空纖維素柱去除大分子量雜質及活性炭脫色，最後減壓濃縮，加入3倍體積無水乙醇，冰水浴攪拌冷卻析出，收集沉澱得天門冬氨酸鳥氨酸。酶促反應液中，底物L-精氨酸的用量優選為lmol/L，底物延胡索酸銨的用量優選為lmol/L，菌體細胞的添加量優選為5g/L，優選轉化溫度為37°C，優選轉化pH9，優選轉化時間12h。所述的共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶的基因工程重組菌為大腸桿菌BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp,表達載體為 pET24a (+) -arg-asp 重組表達載體,重組菌體細胞能同時表達有高活性的精氨酸酶和天門冬氨酸酶。其中，菌體細胞的精氨酸酶活力可達560U/g，天門冬氨酸酶活力可達490U/g。本發明的優點和有益效果本發明利用自行構建的高效共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶的大腸桿菌基因工程菌株BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp的發酵菌體為酶源，在同一個反應體系中，雙酶分別催化底物L-精氨酸和延胡索酸銨，生成L-鳥氨酸和天門冬氨酸。產物經過中空纖維素柱過濾和活性炭脫色、減壓濃縮，最後加入無水乙醇結晶析出天門冬氨酸鳥氨酸。該方法具 有生產成本低、條件溫和、周期短、產物分離提取方便、工藝步驟簡單、操作安全等優點，為天門冬氨酸鳥氨酸提供了新的綠色環保製備方法，具有很好的產業化應用前景。
圖1是精氨酸酶催化L-精氨酸生成L-鳥氨酸的反應示意圖；圖2是天門冬氨酸酶催化延胡索酸銨生成L-天門冬氨酸的反應示意圖；圖3是以本發明構建的基因重組菌菌體為酶源考察底物L-精氨酸和延胡索酸銨的轉化率；A :反應溫度與底物轉化率的關係；B :pH與底物轉化率的關係；C :反應時間與底物轉化率的關係；D :菌體添加量與底物轉化率的關係；E :底物濃度與轉化率的關係。圖4是天門冬氨酸鳥氨酸的薄層層析圖譜。其中，第I道L_鳥氨酸標準品；第2道=L-天門冬氨酸標準品；第3道天門冬氨酸鳥氨酸標準品；第4道樣品。
具體實施例方式一、L-精氨酸酶活力的測定採用化學顯色法測定L-精氨酸酶活力，原理是在一定條件下，L-精氨酸酶催化L-精氨酸，生成L-鳥氨酸，利用鳥氨酸能與茚三酮反應生成一種紅色物質，該物質在510nm處有最高吸收峰。在一定範圍內，紅色的深淺與L-鳥氨酸含量成正比，與同樣處理的L-鳥氨酸標準液比色，求得酶活力。具體操作過程如下( I)標準曲線的建立用50mL混酸溶液(6M磷酸醋酸=1 :3)溶解1. 25g茚三酮配製O. 25g/L的顯色溶液，分別配製0、0. 04,0. 08,0. 12,0. 16,0. 2mM的L-鳥氨酸500 μ L，加入2mL茚三酮顯色溶液，沸水浴Ih後510nm測定吸光度，以L-鳥氨酸濃度為橫坐標，510nm吸光度為縱坐標，繪製標準曲線。(2)精氨酸酶活力的測定催化體系25mMGlycine-NaOH pH9. 5, ImM MnCl2,0_20mM 的 L-精氨酸,一系列梯度濃度的實施例2得到的溼菌體，37°C催化反應lh。
酶活力定義在上述反應條件下，於37°C，lmin催化形成Ιμπιο L-鳥氨酸所需要的酶量為一個酶活力單位。二、L-天門冬氨酸酶活力的測定於20mM PBS pH8. 5，ImM MgCl2, 20mM的延胡索酸銨，加入一系列梯度濃度的實施例2得到的溼菌體，37°C催化反應30min。然後立即置於沸水中煮沸5min以終止反應。空白樣品採用預先煮沸過的大腸桿菌細胞代替酶源細胞進行同樣操作。離心，取0.2mL上清液，加入20mL蒸餾水，5mL濃硫酸，混勻後加熱至沸騰，然後用O.1M的KMnO4標準溶液滴定至30s不褪色為終點。空白和樣品滴定值之差為延胡索酸的消耗量。根據不同濃度延胡索酸標準液繪製的標準曲線計算出延胡索酸的轉化量。酶活力定義在上述反應條件下，於37°C，Imin催化消耗I μ mo I延胡索酸所需要 的酶量為一個酶活力單位。三、天門冬氨酸鳥氨酸的薄層層析法檢測薄層層析條件分別為，展開劑是正丙醇氨水=2 :1，顯色液是4g/L的茚三酮乙醇溶液，顯色溫度105°C，顯色時間5min。實施例1共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶的大腸桿菌基因工程菌的構建根據NCBI資料庫收錄的大鼠的精氨酸酶基因序列，設計上遊引物argl 5』-GGAATTCCATAT GAG CTC CAAGCC AMGCC-3』和下遊引物arg2 :5』_CCC GAATTC TTATTTCGGTGG TTT A-3』。提取大鼠肝臟總RNA，反轉錄製備cDNA。以大鼠肝臟cDNA為模板，PCR擴增得到精氨酸酶基因。採用基因工程方法，構建重組表達質粒pET-24a(+)-arg。將重組表達載體pET-24a(+)-arg轉化至E. coli BL21 (DE3)，獲得基因工程菌株Argl。根據NCBI資料庫收錄的枯草芽孢桿菌的天門冬氨酸酶基因序列，設計上遊引物 aspl :5』 -GGG AAT TCC ATA TGT TAA ACG GCC AAA AAG-3』 和下遊引物 asp2 :5』 -CCGCTCGAG TTA TTT TTC TAA TAG TTC-3，。提取枯草芽孢桿菌的基因組，PCR擴增得到天門冬氨酸酶基因。採用基因工程方法，構建重組表達質粒pET-20b(+)-asp。將重組表達載體pET-20b (+) -asp 轉化至 Ε· coIi BL21 (DE3)，獲得基因工程菌株 Aspl。為了同時實現精氨酸酶和天門冬氨酸酶在重組大腸桿菌中的高水平表達，首先以 pET-20b(+)-asp 為模板，設計上遊引物為 T7f :5』 -AAG GAAGAG CTC TAATAC GACTCACTATAG-3』 和下遊引物 asp2 :5』 -CCG CTC GAG TTATTT TTC TAATAG TTC-3』。PCR 擴增獲得產物為5』端帶有T7啟動子和rbs序列的天門冬氨酸酶基因。然後採用基因工程方法，將該基因克隆到pET-24a (+) -arg中，獲得重組質粒pET_24a (+) -arg-asp。將重組表達載體轉化至 E. co I i BL21 (DE3)，獲得共表達基因工程菌株 BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp。將陽性重組菌株接種於4mL含有卡那黴素100 μ g/mL的LB培養基中過夜培養，隨後以1%轉接量接入IOOmL含有卡那黴素100 μ g/mL的新鮮LB培養基中，37°C振蕩培養3h，然後，加入終濃度為ImM的IPTG誘導液，特異性誘導精氨酸酶和天門冬氨酸酶的表達。所得培養液於4°C下6，OOOrpm離心lOmin，收集菌體，獲得共表達L-精氨酸酶和天門冬氨酸酶的基因工程重組菌，用50mM的磷酸緩衝液(pH8. O)懸浮洗滌後再離心，收集菌體作為酶源細胞。實施例2共表達基因工程重組菌的發酵將實施例1中的共表達基因工程菌株BL21 (DE3)_pET24a(+)-arg-asp接種於4mL含100 μ g/mL卡那黴素的LB培養基中過夜培養作為一級種子液；隨後以1%轉接量接入IOOmL含100μ g/mL卡那黴素的LB培養基中，於37°C，200rpm培養8-12h作為二級種子液；二級種子液以1%接種量轉接於100L發酵罐中，發酵培養基為新鮮的LB培養基，培養溫度37°C，初始轉速300rpm，初始pH7. 2。定時取樣，菌液0D600nm達到1. 0-1. 2時，加入終濃度為ImM的IPTG誘導液誘導。下罐發酵液4°C下3，OOOrpm離心15min收集菌體細胞，得到共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶的基因工程重組菌的發酵菌體細胞。按方法一測定，精氨酸酶活力可達560U/g ;按方法二測定,天門冬氨酸酶活力可達490U/g。實施例3共催化體系中溫度的考察以上述實施例2製備的發酵菌體細胞作為酶原，分別在每升的轉化體系中，加入菌體5g/L,底物L-精氨酸100mmol/L,延胡索酸銨100mmol/L,無水硫酸鎂lmmol/L,轉化pH值9，轉化時間lh。考察轉化溫度30-45°C時兩個催化反應各自底物L-精氨酸和延胡索酸的轉化率的影響。結果見圖3A。實施例4共催化體系中pH的考察 以上述實施例2製備的發酵菌體細胞作為酶原，分別在每升的轉化體系中，加入菌體5g/L，底物L-精氨酸lOOmmol/L，延胡索酸銨lOOmmol/L，無水硫酸鎂ImM，轉化溫度為37°C，轉化時間lh。考察轉化pH值8-10時兩個催化反應各自底物L-精氨酸和延胡索酸的轉化率的影響。結果見圖3B。實施例5共催化體系中反應時間的考察以上述實施例2製備的發酵菌體細胞作為酶原，分別在每升的轉化體系中，加入菌體5g/L，底物L-精氨酸lmol/L，延胡索酸銨lmol/L，無水硫酸鎂lmmol/L，轉化溫度為37°C，轉化pH值為9。考察轉化時間對兩個催化反應各自底物L-精氨酸和延胡索酸的轉化率的影響。結果見圖3C。實施例6共催化體系中菌體量的考察以上述實施例2製備的發酵菌體細胞作為酶原，分別在每升的轉化體系中，加入底物L-精氨酸lmol/L，延胡索酸銨lmol/L，無水硫酸鎂lmmol/L，轉化溫度為37°C，轉化pH值為9，轉化時間12h。考察菌體添加量對兩個催化反應各自底物L-精氨酸和延胡索酸的轉化率的影響。結果見圖3D。從結果可見，以ImM無水硫酸鎂為輔助因子，在30-45°C，pH值為8_10，菌體量為4_6g/L，反應4-12h，共表達系統的精氨酸酶和天門冬氨酸酶可以分別催化各自底物，生產L-鳥氨酸和L-天門冬氨酸。同時，通過分析實驗結果，結合考慮實際操作以及成本，優選的轉化條件為L-精氨酸1M，延胡索酸銨1M，無水硫酸鎂ImM，菌體量5g/L，反應溫度37°C，pH值9，反應時間12h。在該優選條件下進行驗證實驗，L-精氨酸和延胡索酸的轉化率分別為99% 和 98. 5%ο實施例7天門冬氨酸鳥氨酸鹽的提取分離轉化液反應結束後，於4000rpm離心15min收集上清液；然後採用I萬截留分子量的中空纖維素柱去除大分子量雜質；收集液按照0. 5% (質量體積比)加入活性炭，於60°C脫色30min ;過濾去除活性炭後，在75°C下旋轉蒸發至飽和溶液，然後加入3倍體積的無水乙醇，冰水浴中攪拌；採用真空泵抽濾樣品，將析出物真空乾燥，得到天門冬氨酸鳥氨酸 』最後，稱重，採用薄層層析法檢測產品，結果見附圖4。
權利要求
1.一種共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶製備門冬氨酸鳥氨酸的方法，其特徵在於該方法包括 首先PCR擴增來源於枯草芽孢桿菌的天門冬氨酸酶基因，採用基因工程方法構建重組表達質粒pET-20b (+) -asp ;然後以pET-20b (+) -asp為模板，PCR擴增獲得產物為5 』端帶有T7啟動子和rbs序列的天門冬氨酸酶基因，採用基因工程方法，將該基因克隆到pET-24a (+) -arg中，獲得重組質粒pET_24a (+)-arg-asp ;將重組表達載體轉化至E. coliBL21 (DE3)，獲得共表達基因工程菌株BL21 (DE3)-pET24a(+) -arg-asp,該重組菌體細胞能同時表達有高活性的精氨酸酶和天門冬氨酸酶； 以該重組菌為酶源，在同一個反應體系中，分別催化底物L-精氨酸和延胡索酸銨，其中底物L-精氨酸的用量為O.1至lmol/L，延胡索酸銨的用量為O.1至lmol/L，菌體的添加量為4-6g/L，在30至45°C下，pH8至10，以lmmol/L無水硫酸鎂為輔助因子，經酶法轉化反應4至12h，生成L-鳥氨酸和L-天門冬氨酸，收集轉化液後，通過I萬截留分子量中空纖維素柱去除大分子量雜質及活性炭脫色，最後減壓濃縮，加入3倍體積無水乙醇，冰水浴攪拌冷卻析出，收集沉澱得天門冬氨酸鳥氨酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於酶促反應液中，底物L-精氨酸的用量優選為lmol/L，底物延胡索酸銨的用量優選為lmol/L，菌體細胞的添加量優選為5g/L，優選轉化溫度為37°C，優選轉化pH9，優選轉化時間12h。
全文摘要
一種共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶製備門冬氨酸鳥氨酸的方法。本發明採用基因工程方法，構建能高效共表達精氨酸酶和天門冬氨酸酶的重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET24a(+)-arg-asp，以發酵菌體細胞為酶源，在同一個反應體系內，雙酶分別催化底物L-精氨酸、延胡索酸銨反應，生成L-鳥氨酸和L-天門冬氨酸，轉化液收集後通過1萬截留分子量中空纖維素柱去除大分子量雜質及活性炭脫色、減壓濃縮，加入無水乙醇，冰水浴攪拌冷卻析出得天門冬氨酸鳥氨酸。本發明提供了一種新的門冬氨酸鳥氨酸的綠色生產工藝方法，該方法具有條件溫和、周期短、酶促體系中雜質少、產物分離提取方便、工藝步驟簡單、操作安全等優點，有很好的產業化應用前景。
文檔編號C12N15/63GK103014087SQ201210575299
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者高智慧, 丁國鈺 申請人:天津啟仁醫藥科技有限公司