一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法
2023-10-23 01:12:02 1
一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法
【專利摘要】一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，涉及一種毛果楊不定芽誘導及植株再生的方法。本發明是要解決現有毛果楊組織培養器官發生困難、植株再生率低以及目前用毛果楊莖段做外植體不定芽誘導率低和周期長的問題。方法：一、材料的採集及處理；二、接種培養及無菌苗的擴繁：將自來水衝洗過的莖段經無菌處理後接種培養，繁殖無菌苗；三、不定芽分化誘導；四、不定芽伸長誘導：將帶有不定芽的愈傷組織切成塊放入不定芽伸長培養基中培養；五、不定芽生根培養；六、煉苗和移栽。本發明以毛果楊無菌苗葉片做外植體，不定芽誘導率和成活率高達100％，從外植體培養至成苗僅用60天左右時間。用於植物組織培養領域。
【專利說明】一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種毛果楊不定芽誘導及植株再生的方法。
【背景技術】
[0002]毛果楊(Populustrichocarpa Torr.Gray)也叫做測序楊，是楊屬(Populus L.)青楊派樹種，原產地主要分布在北美洲西部地區。2006年毛果楊的全部基因組測序完成，研究成果在當年9月15日出版的《Science》期刊上發表(Tuskan et al.，2006),近年來毛果楊已成為學術界備受重視的一個林木模式樹種。但對於2006年已經基因組測序完成的木本模式植物毛果楊來說，成功建立組織培養體系及遺傳轉化的案例卻很少，2009年張紅梅等人發表的《毛果楊的組織培養與快速繁殖》中，利用節間莖段做外植體，將腋芽處萌發出的嫩芽進行增殖培養，此方法僅是應用組織培養進行毛果楊的快速繁殖，並不屬於植株再生體系的範疇。在Plant Cell Phys1l.47 (11): 1582 - 1589 (2006)中，所用的外植體是溫室內苗齡6個月的節間莖段，農桿菌侵染後，經過30-45d誘導愈傷組織(40% )，再經過20-30d芽分化誘導，再經40d芽的伸長培養，才能轉到生根培養基上。該方法雖然利用莖段外植體誘導出毛果楊再生芽，但誘導效率低，耗時較長。在Plant Molecular B1logyReporter.22:1 - 9(2004)中，外植體仍為節間莖段，出芽率低且耗時，轉基因植株的誘導率僅為4%。植株再生率低是限制遺傳轉化的關鍵條件之一。
【發明內容】
[0003]本發明是要解決現有毛果楊組織培養器官發生困難、植株再生率低以及目前用毛果楊莖段做外植體不定芽誘導率低和周期長的問題，提供一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法。
[0004]本發明毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，按以下步驟進行:
[0005]一、材料的採集及處理:選擇溫室內培養的生長健壯、無病蟲害的毛果楊植株，採集新萌生的枝條，剪去枝條上的葉片，將剩餘枝條剪成長度為9?Ilcm且帶有3?4個芽點的莖段，用自來水衝洗I?2h ;
[0006]二、接種培養及無菌苗的擴繁:將自來水衝洗過的莖段經無菌處理後，接種到生根培養基WPM3中培養，繁殖無菌苗；
[0007]三、不定芽分化誘導:以步驟二培養得到的毛果楊無菌苗葉片做外植體，選取生長健壯的毛果楊無菌苗葉片，剪掉葉尖，僅保留長為0.8?1.1cm的葉基部分及0.2?0.3mm的葉柄，將葉背朝下接種於不定芽誘導培養基WPMl中，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h，光照強度30?40μπιο1.πΓ2.s—1的條件下培養，15?20d即可誘導出不定芽；
[0008]四、不定芽伸長誘導:將帶有不定芽的愈傷組織切成塊放入不定芽伸長培養基WPM2中，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h，光照強度30?40μπιο1.πΓ2.s—1的條件下培養15d ；
[0009]五、不定芽生根培養:將莖長超過1.5cm的不定芽從基部剪下，分割成單株接種於生根培養基WPM3中，在溫度為23?25 °C，每日光照12?16h，光照強度30?40 μ mo I.m_2.s_l的條件下培養7?1d生根；
[0010]六、煉苗和移栽:將根長超過2cm的植株經煉苗2?3d後移栽到溫室培養。
[0011]本發明以毛果楊無菌苗葉片做外植體，不定芽誘導率和成活率高達100 %，從外植體培養至成苗僅用60d左右時間，操作步驟簡便可行，不僅解決了毛果楊組織培養時器官發生困難及目前用毛果楊莖段做外植體不定芽誘導率低的難題，而且極大地縮短了植株再生時間，葉片不定芽分化僅需15-20d，小植株生根僅需7?10d。本發明對於毛果楊的組培快繁及基因工程育種研究具有重要意義，應用前景廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為實驗I步驟三中誘導出的毛果楊不定芽的照片；圖2為實驗I步驟四毛果楊不定芽伸長的照片；圖3為實驗I步驟五毛果楊不定芽生根的照片；圖4為實驗I步驟六中移栽後的毛果楊植株照片。
【具體實施方式】
[0013]本發明技術方案不局限於以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0014]【具體實施方式】一:本實施方式毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，按以下步驟進行:
[0015]一、材料的採集及處理:選擇溫室內培養的生長健壯、無病蟲害的毛果楊植株，採集新萌生的枝條，剪去枝條上的葉片，將剩餘枝條剪成長度為9?Ilcm且帶有3?4個芽點的莖段，用自來水衝洗I?2h ;
[0016]二、接種培養及無菌苗的擴繁:將自來水衝洗過的莖段經無菌處理後，接種到生根培養基WPM3中培養，繁殖無菌苗；
[0017]三、不定芽分化誘導:以步驟二培養得到的毛果楊無菌苗葉片做外植體，選取生長健壯的毛果楊無菌苗葉片，剪掉葉尖，僅保留長為0.8?1.1cm的葉基部分及0.2?0.3mm的葉柄，將葉背朝下接種於不定芽誘導培養基WPMl中，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h，光照強度30?40μπιο1.πΓ2.s—1的條件下培養，15?20d即可誘導出不定芽；
[0018]四、不定芽伸長誘導:將帶有不定芽的愈傷組織切成塊放入不定芽伸長培養基WPM2中，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h，光照強度30?40μπιο1.πΓ2.s—1的條件下培養15d ；
[0019]五、不定芽生根培養:將莖長超過1.5cm的不定芽從基部剪下，分割成單株接種於生根培養基WPM3中，在溫度為23?25 °C，每日光照12?16h，光照強度30?40 μ mo I.πΓ2.s_1的條件下培養7?1d生根；
[0020]六、煉苗和移栽:將根長超過2cm的植株經煉苗2?3d後移栽到溫室培養。
[0021]本發明以毛果楊葉片為外植體進行不定芽分化誘導，誘導率達到100%，且每個外植體形成的不定芽數量都在8個以上，與已報導的用莖段作外植體的文獻相比，不定芽誘導率提高10倍以上，且大大縮短了成苗時間，本研究對於毛果楊的大量擴繁和轉基因育種研究具有廣泛的應用價值。
[0022]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟二中所述接種培養及無菌苗的擴繁的具體方法是:將自來水衝洗過的莖段用無菌水清洗I遍，再將莖段放入體積百分濃度為70%的酒精中消毒30sec，取出莖段用無菌水清洗3遍，然後用體積濃度為2%的次氯酸鈉消毒7min，再次用無菌水清洗3遍，最後用無菌濾紙吸乾莖段表面的水分，用無菌剪刀將莖段兩端已被消毒液氧化的部分剪掉，再將剩餘莖段剪成僅包含一個芽點的小段，接種到生根培養基WPM3上，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h，光照強度30?40μηιο1.πΓ2.s_1的條件下培養15d,再將從腋芽處萌發的無菌綠芽剪下,插入新的生根培養基WPM3中繼續擴繁，得到無菌苗。其它與【具體實施方式】一相同。
[0023]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟三中不定芽誘導培養基 WPMl 由 400mg/L KN03、370mg/L MgS04、96mg/L CaC12、8.6mg/L ZnS04、0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、990mg/L K2SO4'170mg/L KH2PO4'22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3BO3'0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L 鹽酸吡哆辛、0.5mg/L 煙酸、2.0mg/L 甘氨酸、100mg/L 肌醇、25mg/L 鹿糖、5.6mg/L 瓊脂、0.01 ?1.0mg/L6-節基腺嘌呤、0.01?1.0mg/L卩引哚丁酸、0.0001?0.01mg/L噻苯隆和蒸懼水製成,pH值為5.8。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0024]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟四中不定芽伸長培養基 WPM2 由 400mg/L KN03、370mg/L MgS04、96mg/L CaC12、8.6mg/L ZnSO4,
0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、990mg/L K2SO4'170mg/L KH2PO4'22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L 鹽酸批口多辛、0.5mg/L煙酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.01?
1.0mg/L 6-節基腺嘌呤、0.01?1.0mg/L卩引哚丁酸、0.0001?0.01mg/L噻苯隆和蒸懼水製成，pH值為5.8。其它與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0025]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟二和步驟五中的生根培養基 WPM3 由 400mg/L KN03、990mg/L K2SO4,370mg/L MgS04、96mg/L CaCl2,8.6mg/L ZnS04、0.25mg/L CuSO4>27.8mg/L FeS04、170mg/L KH2P04> 22.4mg/L MnS04、6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L 鹽酸批口多辛、0.5mg/L煙酸、lOOmg/L肌醇、2.0mg/L甘氨酸、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.01?1.0mg/L吲哚丁酸和蒸餾水製成，pH值為5.8。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0026]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟六中煉苗移栽的具體方法是:將生根後的組培苗敞口放在溫室中煉苗2?3天，然後將組培苗移栽到育苗盆中，完成瓶苗從人工控制條件給養到幼苗自養的過程，具體方法是:將瓶中的幼苗取出，用自來水清洗黏在根表面的培養基，移植到填滿基質的育苗盆中，每盆一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質，移植完成後澆透水，空氣相對溼度控制在95%以上，基質相對溼度控制在60%?80%,培養溫度控制在25?28°C,所述基質是由泥炭土和蛭石按體積比3:1的比例混合得到的。其它與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0027]為驗證本發明的效果，進行以下實驗:
[0028]實驗1:
[0029]本實驗毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，按以下步驟進行:
[0030]一、材料的採集及處理:選擇溫室內培養的生長健壯、無病蟲害的毛果楊植株，採集新萌生的枝條，剪去枝條上的葉片，將剩餘枝條剪成長度為1cm且帶有4個芽點的莖段，用自來水衝洗1.5h ;
[0031]二、接種培養及無菌苗的擴繁:將自來水衝洗過的莖段用無菌水清洗I遍，再將莖段放入體積百分濃度為70%的酒精中消毒30sec，其間充分震蕩，使酒精與莖段表面充分接觸，取出莖段用無菌水清洗3遍，然後用2%的次氯酸鈉消毒7min，充分震蕩使次氯酸鈉與莖段表面充分接觸，再次用無菌水清洗3遍，最後用無菌濾紙吸乾莖段表面的水分，用無菌剪刀將莖段兩端已被消毒液氧化的部分剪掉，再將剩餘莖段剪成僅包含一個芽點的小段，接種到生根培養基WPM3上，在溫度為25°C，每日光照14h，光照強度35 μ mo I.m_2.s-1的條件下培養15d，再將從腋芽處萌發的無菌綠芽剪下，插入新的生根培養基WPM3中繼續擴繁，得到無菌苗。
[0032]三、不定芽分化誘導:以步驟二培養得到的毛果楊無菌苗葉片做外植體，選取生長健壯的毛果楊無菌苗葉片，剪掉葉尖，僅保留長為Icm的葉基部分及0.2mm的葉柄，將葉背朝下接種於不定芽誘導培養基WPMl中，在溫度為25°C，每日光照16小時，光照強度40 μ mo I.m_2.s—1的條件下培養，15天即誘導出不定芽；
[0033]四、不定芽伸長誘導:將帶有不定芽的愈傷組織切成塊放入不定芽伸長培養基WPM2中，在溫度為24°C，每日光照16小時，光照強度40 μ mo I.m-2.s-1的條件下培養，誘導不定芽伸長，培養2周不定芽伸長I?1.5cm ；
[0034]五、不定芽生根培養:將伸長超過1.5cm的不定芽從基部剪下，分割成單株接種於生根培養基WPM3中，在溫度為25°C，每日光照16小時，光照強度40 μ mo I.m_2.s—1的條件下培養6天，苗基部開始生根，培養15天，平均根數4?5根，平均根長2?3cm ;
[0035]六、煉苗移栽:將生根後的組培苗敞口放在溫室中煉苗3天，然後將組培苗移栽到育苗盆中，完成瓶苗從人工控制條件給養到幼苗自養的過程，具體方法是:將瓶中的幼苗小心取出，洗淨黏在苗上的培養基，移植到填滿基質的育苗盆中，每盆一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質，使苗根與基質緊密接觸，移植完成後澆透水。空氣相對溼度控制在95%以上，防止葉片失水，基質相對溼度控制在60%?80%，培養溫度控制在25°C。所述基質是由泥炭土和蛭石按體積比3:1的比例混合得到的。
[0036]本實驗步驟三中誘導出的不定芽的照片如圖1所示，步驟四不定芽伸長的照片如圖2所示，步驟五不定芽生根的照片如圖3所示，步驟六中移栽後的毛果楊植株照片如圖4所示。
[0037]本實驗以毛果楊無菌苗葉片做外植體，不定芽誘導率和成活率高達100%，從外植體培養至成苗僅用60天左右時間，操作步驟簡便可行，不僅解決了毛果楊組織培養時器官發生困難及目前用毛果楊莖段做外植體不定芽誘導率低的難題，而且極大地縮短了植株再生時間，葉片不定芽分化僅需15d，小植株生根僅需5?10d。
[0038]步驟三中不定芽誘導培養基WPMl由 400mg/L KN03、370mg/L MgS04、96mg/L CaC12、8.6mg/L ZnS04、0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、990mg/L K2SO4'170mg/L KH2PO4'22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸卩比卩多辛、0.5mg/L煙酸、2.0mg/L甘氨酸、lOOmg/L肌醇、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.01?1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01?1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001?0.01mg/L噻苯隆和蒸餾水製成，pH值為5.8。
[0039]步驟四中不定芽伸長培養基WPM2由 400mg/L KN03、370mg/L MgS04、96mg/L CaC12、8.6mg/L ZnS04、0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、990mg/L K2SO4'170mg/L KH2PO4'22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸卩比卩多辛、0.5mg/L煙酸、2.0mg/L甘氨酸、lOOmg/L肌醇、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.0l?1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.0l?1.0mg/L吲哚丁酸、0.0OOl?0.0lmg/L噻苯隆和蒸餾水製成，pH值為5.8。
[0040]步驟二和步驟五中的生根培養基WPM3由400mg/L KN03、990mg/L K2SO4,370mg/L MgS04、96mg/L CaCl2,8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、170mg/L KH2PO4,22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/LNa2EDTA、1.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸批B多辛、0.5mg/L煙酸、100mg/L肌醇、2.0mg/L甘氨酸、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.01?1.0mg/L Π引哚丁酸和蒸懼水製成，pH值為5.8。
[0041]培養基中所添加的激素都在培養基高溫滅菌後加入。
【權利要求】
1.一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，其特徵在於該方法按以下步驟進行: 一、材料的採集及處理:選擇溫室內培養的生長健壯、無病蟲害的毛果楊植株，採集新萌生的枝條，剪去枝條上的葉片，將剩餘枝條剪成長度為9?Ilcm且帶有3?4個芽點的莖段，用自來水衝洗I?2h ; 二、接種培養及無菌苗的擴繁:將自來水衝洗過的莖段經無菌處理後，接種到生根培養基WPM3中培養，繁殖無菌苗； 三、不定芽分化誘導:以步驟二培養得到的毛果楊無菌苗葉片做外植體，選取生長健壯的毛果楊無菌苗葉片，剪掉葉尖，僅保留長為0.8?1.1cm的葉基部分及0.2?0.3mm的葉柄，將葉背朝下接種於不定芽誘導培養基WPMl中，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h，光照強度30?40 μ mo I.πΓ2.s—1的條件下培養，15?20d即可誘導出不定芽； 四、不定芽伸長誘導:將帶有不定芽的愈傷組織切成塊放入不定芽伸長培養基WPM2中，在溫度為23?25°C,每日光照12?16h,光照強度30?40μηιο1.πΓ2.s_1的條件下培養 15d ； 五、不定芽生根培養:將莖長超過1.5cm的不定芽從基部剪下，分割成單株接種於生根培養基WPM3中，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h，光照強度30?40 μ mo I.πΓ2.s—1的條件下培養7?1d生根； 六、煉苗和移栽:將根長超過2cm的植株經煉苗2?3d後移栽到溫室培養。
2.根據權利要求1所述的一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，其特徵在於步驟二中所述接種培養及無菌苗的擴繁的具體方法是:將自來水衝洗過的莖段用無菌水清洗I遍，再將莖段放入體積百分濃度為70%的酒精中消毒30sec，取出莖段用無菌水清洗3遍,然後用體積濃度為2%的次氯酸鈉消毒7min，再次用無菌水清洗3遍,最後用無菌濾紙吸乾莖段表面的水分，用無菌剪刀將莖段兩端已被消毒液氧化的部分剪掉，再將剩餘莖段剪成僅包含一個芽點的小段，接種到生根培養基WPM3上，在溫度為23?25°C，每日光照12?16h,光照強度30?40 μ mo I.πΓ2.s_1的條件下培養15d,再將從腋芽處萌發的無菌綠芽剪下，插入新的生根培養基WPM3中繼續擴繁，培養30?40d，即得到無菌苗。
3.根據權利要求1或2所述的一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，其特徵在於步驟三中不定芽誘導培養基WPMl由400mg/L KN03、370mg/L MgS04、96mg/L CaCl2,8.6mg/L ZnS04、0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、990mg/L K2SO4'170mg/L KH2PO4'22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸卩比卩多辛、0.5mg/L煙酸、2.0mg/L甘氨酸、lOOmg/L肌醇、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.01?1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01?1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001?0.01mg/L噻苯隆和蒸餾水製成，pH值為5.8。
4.根據權利要求1或2所述的一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，其特徵在於步驟四中不定芽伸長培養基WPM2由400mg/L KN03、370mg/L MgS04、96mg/L CaCl2,8.6mg/L ZnS04、0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、990mg/L K2SO4'170mg/L KH2PO4'22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸卩比卩多辛、0.5mg/L煙酸、2.0mg/L甘氨酸、lOOmg/L肌醇、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.01?1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01?1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001?0.01mg/L噻苯隆和蒸餾水製成，pH值為5.8。
5.根據權利要求2所述的一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，其特徵在於步驟二和步驟五中的生根培養基WPM3由400mg/L KN03、990mg/L K2S04、370mg/LMgS04、96mg/L CaCl2,8.6mg/L ZnSO4、0.25mg/L CuSO4,27.8mg/L FeS04、170mg/L KH2PO4,22.4mg/L MnSO4,6.2mg/L H3B03、0.25mg/L NaMoO2.2H20、37.3mg/L Na2EDTA、l.0mg/L 鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸卩比卩多辛、0.5mg/L煙酸、100mg/L肌醇、2.0mg/L甘氨酸、25mg/L鹿糖、5.6mg/L瓊脂、0.01?1.0mg/L吲哚丁酸和蒸餾水製成，pH值為5.8。
6.根據權利要求1或2所述的一種毛果楊葉片不定芽誘導及植株再生的方法，其特徵在於步驟六中煉苗和移栽的具體方法是:將生根後的組培苗敞口放在溫室中煉苗2?3天，然後將組培苗移栽到育苗盆中，完成瓶苗從人工控制條件給養到幼苗自養的過程，具體方法是:將瓶中的幼苗取出，用自來水清洗黏在根表面的培養基，移植到填滿基質的育苗盆中，每盆一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質，移植完成後澆透水，空氣相對溼度控制在95 %以上，基質相對溼度控制在60 %?80 %，培養溫度控制在25?28°C，所述基質是由泥炭土和蛭石按體積比3:1的比例混合得到的。
【文檔編號】A01H4/00GK104396754SQ201410691391
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月25日 優先權日:2014年11月25日
【發明者】李淑娟, 程玉祥, 甄成, 嚴善春, 張雅奎 申請人:東北林業大學