一種利迪鏈菌素髮酵工藝的製作方法

2023-10-22 18:39:07 2

專利名稱：一種利迪鏈菌素髮酵工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於工業微生物領域，是涉及一種利迪鏈黴菌發酵工藝。
背景技術：
利迪鏈黴菌Streptomyces luteogriseus為我實驗室從土壤分離篩選得到，並於2006年4月13日，經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，(保藏地址北京市海澱區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC1692。利迪鏈黴菌CGMCC1692所產生的利迪鏈黴素是一個聚酮抗生素，具有抗腫瘤，抗HIV蛋白酶以及抗G+細菌活性，尤其是作為RNA聚合酶抑制劑，近幾年受到了越來越多的重視，2005年Cell雜誌就有兩篇相關的論文。國內目前沒有相關產品及文獻報導。國外也沒有利迪鏈黴素大規模生產的文獻報導。國外的文獻資料顯示，利迪鏈黴素的發酵水平都比較低，只能得到很少量的晶體，影響其進一步的研究及應用。因此，有必要放大生產規模，改進發酵控制工藝，提高利迪鏈黴菌的生產能力，獲得更多的利迪鏈黴素晶體。

發明內容
本發明的目的是提供一种放大生產規模，確定種子和發酵培養基成分及配比，結合菌株的特性，改進發酵過程控制條件，提高利迪鏈黴菌CGMCC1692的生產水平，得到更多的利迪鏈黴素晶體的利迪鏈黴素發酵工藝。
本發明的技術方案概述如下1.一種利迪鏈菌素髮酵工藝，由如下步驟組成(1)配製培養基①搖瓶種子培養基的配製取澱粉4～8g，優選6g，葡萄糖5～15g，優選7.5g，蛋白腖1～5g，優選3g，Mg2SO4·7H2O 0.3～1g，優選0.75g，NaCl 0.3～1g，優選0.75g，加水至100～300ml，優選150ml，分裝於3個錐形瓶，滅菌；②種子培養基的配製取澱粉20～60g，優選45g，葡萄糖5～15g，優選7.5g，黃豆餅粉6～15g，優選13.5g，玉米漿3～10g，優選8g，K2HPO40.2～0.7g，優選0.6g，Mg2SO4·7H2O 0.3～0.8g，優選0.75g，NaCl 0.3～0.8g，優選0.75g，泡敵0.1～0.4g，優選0.3g，加水至1.5L，調節pH為6.0～7.5，優選6.8，滅菌；③發酵培養基的配製取澱粉300～900g，優選600g，葡萄糖50～200g，優選100g，黃豆餅粉150～250g，優選200g，玉米漿30～90g，優選60g，K2HPO44～8g，優選6g，Mg2SO4·7H2O 8～12g，優選10g，NaCl 8～12g，優選10g，花生油2～10g，優選6g，泡敵2～8g，優選4g，加水至20L，調節pH為6.0～7.5，優選6.8，滅菌；(2)發酵①搖瓶種子培養將利迪鏈黴菌(Streptomyces luteogriseus)CGMCC1692接入搖瓶種子培養基中，25～35℃，優選28℃，培養20～70小時，優選培養48小時，製得搖瓶種子液100～300ml；②種子培養將製得的搖瓶種子液接入種子培養基中，在2L種子罐中，通氣量2～6L/h，優選通氣量為4L/h，攪拌轉速400～600rpm，優選500rpm，25～35℃培養20～70小時，優選制28℃培養36小時，得種子培養液；③發酵培養將種子培養液接入裝有10～28L無菌發酵培養基的30L發酵罐中，通氣量1300～2000L/h，優選1600L/h，攪拌轉速400～600rpm，優選500rpm，25～35℃，優選28℃，在0～24小時，用濃氨水或NaOH水溶液調節8.0≥pH≥5.8；優選調節7.5≥pH≥6.0，發酵從24小時開始至終點，連續流加質量比為30～50％的葡萄糖水溶液，純葡萄糖流加率為0.40～0.70g/l·h，優選0.55g/l·h，硫酸銨0.002～0.005g/l·h，優選0.0035g/l·h，用濃氨水或NaOH水溶液調節8.0≥pH≥6.50，優選7.5≥pH≥6.80，從36～72小時流加丙酸鈉0.5～1mg/l·h，優選0.8mg/l·h培養72～120小時，優選培養時間為96小時；(3)將發酵液過濾後，經純化得利迪鏈菌素。
純化過程可以是濾液用乙酸乙酯或乙酸丙酯或乙酸丁酯或二氯甲烷或二氯乙烷或氯仿或丁醇或戊醇或甲基戊酮萃取2～5次，所加溶劑的量是過濾液量的0.5～3倍，於-0.05～-0.15MPa，20～60℃減蒸，濃縮至100～500ml，加濃縮液3～5倍丁烷結晶，過濾乾燥，得利迪鏈菌素。
優選的是所述濾液用乙酸乙酯萃取，所述萃取次數為3次，於-0.10MPa，溫度為30℃減蒸，濃縮至200ml，丁烷的加入量為濃縮液的4倍。
本發明的優點是本發明確定了一種適合利迪鏈菌素大規模生產的新工藝，包括種子和發酵培養基成分及配比的確定，新的發酵控制工藝，以及下遊的分離純化。新工藝的實施，大幅度提高了利迪鏈菌素的生產水平，得到了預期的利迪鏈黴素純品。在國內，第一次製得了利迪鏈黴素。


圖1為利迪鏈菌素隨發酵時間的變化曲線，圖中為利迪鏈黴菌CGMCC1692優化後的發酵生產(Optimized)及搖瓶培養(Control)對比。
圖2為利迪鏈黴菌CGMCC1692發酵生產萃取液的HPLC譜。
圖3為LC-ESI-MS分析的總離子流譜及其主峰對應的質量色譜圖，樣品為利迪鏈黴菌CGMCC1692發酵96小時所得。
圖4為圖3中的主峰對應的負離子質量色譜ESI-MS圖。
圖5為圖3中主峰的UV吸收波長譜。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明實施例1種子培養①搖瓶種子培養基的配製取澱粉6g，葡萄糖7.5g，蛋白腖3g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，加水至150ml，分裝於三個錐形瓶，121℃保溫20分鐘滅菌；②種子培養基的配製取澱粉45g，葡萄糖7.5g，黃豆餅粉13.5g，玉米漿8g，K2HPO40.6g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，泡敵0.3g，加水至1.5L，調pH6.8，121℃保溫20分鐘滅菌；③搖瓶種子培養將利迪鏈黴菌CGMCC1692接入搖瓶種子培養基中，28℃，培養48小時，製得搖瓶種子液；④種子培養將製得的搖瓶種子液150ml接入種子培養基中，在2L種子罐中，通氣量4L/h，攪拌轉速500rpm，28℃培養36小時，得種子培養液。
實施例2發酵培養①發酵培養基的製備取澱粉600g，葡萄糖100g，黃豆餅粉200g，玉米漿60g，K2HPO46g，Mg2SO4·7H2O 10g，NaCl 10g，花生油6g，泡敵4g，加水至20L，調pH6.8，121℃保溫20分鐘滅菌；②發酵將實施例1製得的種子培養液1.5L接入裝有20L無菌發酵培養基的30L發酵罐中，通氣量1600L/h，500rpm，28℃培養96小時；發酵過程控制在0～24小時，用濃氨水調節7.5≥pH≥6.0，發酵24小時開始至終點，連續流加補入40％的葡萄糖水溶液，純葡萄糖流加率為0.55g/l·h，硫酸銨流加率為0.0035g/l·h，控制發酵液7.5≥pH≥6.80，由流加濃氨水來實現，36～72小時丙酸鈉流加率為0.8mg/l·h；③96小時取樣進行HPLC測定，利迪鏈菌素的效價為312μg/ml。
實施例3代謝產物的分析取發酵96小時的培養液少量，過濾除菌絲體，取樣20ml，用同體積的乙酸乙酯萃取三次，匯總萃取液，於-0.08MPa，30℃減蒸至幹，加4ml甲醇溶解，用於HPLC及LC-ESI-MS分析。總離子譜(TIC)及質量色譜圖(ESI-MS)對比顯示，增加的產物為利迪鏈菌素。
實施例4利迪鏈菌素的分離純化將實施例2得到的發酵液過濾，去除菌絲體，用同體積的乙酸乙酯萃取3次，匯總萃取液，於-0.10MPa，30℃減蒸濃縮至200ml，加4倍丁烷結晶，過濾乾燥，得利迪鏈菌素結晶4.2g。
實施例5種子培養①搖瓶種子培養基的配製取澱粉4g，葡萄糖15g，蛋白腖5g，Mg2SO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，加水至100ml，分裝於三個錐形瓶，121℃保溫20分鐘滅菌；②種子培養基的配製取澱粉20g，葡萄糖5g，黃豆餅粉15g，玉米漿8g，K2HPO40.6g，Mg2SO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.8g，泡敵0.1g，加水至1.5L，調pH6.0，121℃保溫20分鐘滅菌；③搖瓶種子培養將利迪鏈黴菌CGMCC1692接入搖瓶種子培養基中，25℃，培養70小時，製得搖瓶種子液100ml；④種子培養將製得的搖瓶種子液100ml接入種子培養基中，在2L種子罐中，通氣量2L/h，攪拌轉速600rpm，35℃培養20小時，得種子培養液。
實施例6①搖瓶種子培養基的配製取澱粉8g，葡萄糖5g，蛋白腖1g，Mg2SO4·7H2O 1g，NaCl1g，加水至300ml，分裝於三個錐形瓶，121℃保溫20分鐘滅菌；②種子培養基的配製取澱粉60g，葡萄糖15g，黃豆餅粉6g，玉米漿3g，K2HPO40.2g，Mg2SO4·7H2O 0.8g，NaCl 0.8g，泡敵0.4g，加水至1.5L，調pH6.0，121℃保溫20分鐘滅菌；③搖瓶種子培養將利迪鏈黴菌CGMCC1692接入搖瓶種子培養基中，35℃，培養20小時，製得搖瓶種子液300ml；
④種子培養將製得的搖瓶種子液300ml接入種子培養基中，在2L種子罐中，通氣量6L/h，攪拌轉速400rpm，25℃培養70小時，得種子培養液。
實施例7①搖瓶種子培養基的配製取澱粉7g，葡萄糖10g，蛋白腖3g，Mg2SO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，加水至200ml，分裝於三個錐形瓶，121℃保溫20分鐘滅菌；②種子培養基的配製取澱粉30g，葡萄糖10g，黃豆餅粉11g，玉米漿10g，K2HPO40.7g，Mg2SO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.3g，泡敵0.2g，加水至1.5L，調pH7.5，121℃保溫20分鐘滅菌；③搖瓶種子培養將利迪鏈黴菌CGMCC1692接入搖瓶種子培養基中，30℃，培養40小時，製得搖瓶種子液200ml；④種子培養將製得的搖瓶種子液200ml接入種子培養基中，在2L種子罐中，通氣量4L/h，攪拌轉速500rpm，30℃培養50小時，得種子培養液。
實施例8發酵培養①發酵培養基的製備取澱粉900g，葡萄糖50g，黃豆餅粉250g，玉米漿90g，K2HPO48g，Mg2SO4·7H2O 8g，NaCl 12g，花生油10g，泡敵8g，加水至20L，調pH7.5，121℃保溫20分鐘滅菌。②發酵將實施例6製得的種子培養液1.5L接入裝有10L無菌發酵培養基的30L發酵罐中，400rpm，通氣量2000L/h，25℃培養120小時；發酵過程控制在0～24小時，用NaOH水溶液調節8.0≥pH≥5.8，發酵24小時開始至終點，連續流加補入30％的葡萄糖水溶液，純葡萄糖流加率為0.70g/l·h，硫酸銨流加率為0.002g/l·h，控制發酵液8.0≥pH≥6.50，由流加NaOH水溶液調節來實現，36～72小時丙酸鈉流加率為0.5mg/l·h。
實施例9發酵培養①發酵培養基的製備取澱粉300g，葡萄糖200g，黃豆餅粉150g，玉米漿30g，K2HPO44g，Mg2SO4·7H2O 12g，NaCl 8g，花生油2g，泡敵2g，加水至20L，調pH6.0，121℃保溫20分鐘滅菌；②發酵將實施例5製得的種子培養液1.5L接入裝有28L無菌發酵培養基的30L發酵罐中，600rpm，通氣量1300L/h，35℃培養72小時；發酵過程控制在0～24小時，用濃氨水調節8.0≥pH≥5.8，發酵從24小時開始至終點，連續流加質量百分比為50％的葡萄糖水溶液，純葡萄糖流加率為0.40g/l·h，硫酸銨流加率為0.005g/l·h，控制發酵液8.0≥pH≥6.50，由流加濃氨水調節來實現，36～72小時丙酸鈉流加率為1mg/l·h。
實施例10利迪鏈菌素的分離純化將實施例2得到的發酵液過濾，去除菌絲體，用2倍體積的乙酸丙酯萃取2次，匯總萃取液，於-0.05MPa，20℃減蒸濃縮至100ml，加3倍丁烷，過濾乾燥，得利迪鏈菌素結晶。
實施例11利迪鏈菌素的分離純化將實施例8得到的發酵液過濾，去除菌絲體，用3倍體積的乙酸丁酯萃取5次，匯總萃取液，於-0.15MPa，60℃減蒸濃縮至500ml，加3倍丁烷，過濾乾燥，得利迪鏈菌素結晶。
實施例12利迪鏈菌素的分離純化將實施例8得到的發酵液過濾，去除菌絲體，用0.5倍體積的二氯甲烷萃取4次，匯總萃取液，於-0.10MPa，40℃減蒸濃縮至200ml，加5倍丁烷，過濾乾燥，得利迪鏈菌素結晶。
實施例13利迪鏈菌素的分離純化將實施例2得到的發酵液過濾，去除菌絲體，用1倍體積的二氯乙烷萃取3次，匯總萃取液，於-0.10MPa，40℃減蒸濃縮至250ml，加4倍丁烷，過濾乾燥，得利迪鏈菌素結晶。
實施例14步驟同實施例10，所用溶劑為氯仿。
實施例15步驟同實施例10，所用溶劑為丁醇。
實施例16步驟同實施例10，所用溶劑為戊醇。
實施例17步驟同實施例10，所用溶劑為甲基戊酮。
權利要求
1.一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是由如下步驟組成(1)配製培養基①搖瓶種子培養基的配製取澱粉4～8g，葡萄糖5～15g，蛋白腖1～5g，Mg2SO4·7H2O0.3～1g，NaCl 0.3～1g，加水至100～300ml，分裝於3個錐形瓶，滅菌；②種子培養基的配製取澱粉20～60g，葡萄糖5～15g，黃豆餅粉6～15g，玉米漿3～10g，K2HPO40.2～0.7g，Mg2SO4·7H2O 0.3～0.8g，NaCl 0.3～0.8g，泡敵0.1～0.4g，加水至1.5L，調節pH為6.0～7.5，滅菌；③發酵培養基的配製取澱粉300～900g，葡萄糖50～200g，黃豆餅粉150～250g，玉米漿30～90g，K2HPO44～8g，Mg2SO4·7H2O 8～12g，NaCl 8～12g，花生油2～10g，泡敵2～8g，加水至20L，調節pH為6.0～7.5，滅菌；(2)發酵①搖瓶種子培養將利迪鏈黴菌(Streptomyces luteogriseus)CGMCC 1692接入搖瓶種子培養基中，25～35℃培養20～70小時，製得搖瓶種子液100～300ml；②種子培養將製得的搖瓶種子液接入種子培養基中，在2L種子罐中，通氣量2～6L/h，攪拌轉速400～600rpm，25～35℃培養20～70小時，製得種子培養液；③發酵培養將種子培養液接入裝有10～28L無菌發酵培養基的30L發酵罐中，通氣量1300～2000L/h，攪拌轉速400～600rpm，25～35℃，在0～24小時，用濃氨水或NaOH水溶液調節8.0≥pH≥5.8；發酵從24小時開始至終點，連續流加質量比為30～50％的葡萄糖水溶液，純葡萄糖流加率為0.40～0.70g/l·h，硫酸銨0.002～0.005g/l·h，用濃氨水或NaOH水溶液調節8.0≥pH≥6.50，從36～72小時流加丙酸鈉0.5～1mg/l·h，培養72～120小時；(3)將發酵液過濾後，經純化得利迪鏈菌素。
2.根據權利要求1所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述搖瓶種子培養基的配製是取澱粉6g，葡萄糖7.5g，蛋白腖3g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，加水至150ml，滅菌；
3.根據權利要求1所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述種子培養基的配製是取澱粉45g，葡萄糖7.5g，黃豆餅粉13.5g，玉米漿8g，K2HPO40.6g，Mg2SO4·7H2O 0.75g，NaCl 0.75g，泡敵0.3g，加水至1.5L，調節pH為6.8，滅菌；
4.根據權利要求1所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述發酵培養基的配製是取澱粉600g，葡萄糖100g，黃豆餅粉200g，玉米漿60g，K2HPO46g，Mg2SO4·7H2O 10g，NaCl 10g，花生油6g，泡敵4g，加水至20L，調節pH為6.8，滅菌；
5.根據權利要求1至4之一所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述搖瓶種子培養溫度為28℃，所述培養時間為48小時。
6.根據權利要求1至4之一所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述種子培養的通氣量為4L/h，攪拌轉速為500rpm，培養溫度28℃，所述培養時間為36小時。
7.根據權利要求1至4之一所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述發酵培養的通氣量為1600L/h，攪拌轉速為500rpm，培養溫度為28℃，培養時間為96小時，在0～24小時，調節7.5≥pH≥6.0，發酵從24小時開始至終點，連續流加葡萄糖0.55g/l·h，硫酸銨0.0035g/l·h，用濃氨水或NaOH水溶液調節，7.5≥pH≥6.80，從36～72小時流加丙酸鈉0.8mg/l·h。
8.根據權利要求1至4之一所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述發酵液過濾後純化過程為濾液用乙酸乙酯或乙酸丙酯或乙酸丁酯或二氯甲烷或二氯乙烷或氯仿或丁醇或戊醇或甲基戊酮萃取2～5次，所加溶劑的量是過濾液量的0.5～3倍，於-0.05～-0.15MPa，20～60℃減蒸，濃縮至100～500ml，加濃縮液3～5倍丁烷結晶，過濾乾燥，得利迪鏈菌素。
9.根據權利要求8所述的一種利迪鏈菌素髮酵工藝，其特徵是所述濾液用乙酸乙酯萃取，所述萃取次數為3次，所述壓力為-0.10MPa，所述溫度為30℃，濃縮至200ml，所述丁烷的加入量為濃縮液的4倍。
全文摘要
本發明公開了一種利迪鏈菌素髮酵工藝，由如下步驟組成(1)配製培養基；(2)發酵將利迪鏈黴菌(Streptomyces luteogriseus)CGMCC 1692，經搖瓶種子培養基培養和種子培養後接入發酵培養基，在通氣，攪拌下，25～35℃，在0～24小時，調節pH，發酵從24小時開始至終點，葡萄糖流加率為0.40～0.70g/l·h，硫酸銨0.002～0.005g/l·h，從36～72小時流加丙酸鈉0.5～1mg/l·h，培養72～120小時；(3)經純化得利迪鏈菌素，本發明確定了一種適合利迪鏈菌素大規模生產的新工藝，大幅度提高了利迪鏈菌素的生產水平，得到了預期的利迪鏈黴素純品。
文檔編號C12P17/10GK1970775SQ200610015570
公開日2007年5月30日 申請日期2006年9月1日 優先權日2006年9月1日
發明者元英進, 李小兵, 葛志強 申請人:天津大學